DE69925459T2

DE69925459T2 - Verfahren zur herstellung von hochreinen hmg-coa reductase inhibitoren

Info

Publication number: DE69925459T2
Application number: DE69925459T
Authority: DE
Inventors: Zlatko Pflaum; Dusan Milivojevic; David Senica
Original assignee: Lek Pharmaceuticals and Chemical Co dd
Current assignee: Lek Pharmaceuticals dd
Priority date: 1998-02-18
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2019-02-18
Also published as: CZ297093B6; HRP20000541A2; DE69925459D1; BG104696A; AU3438499A; US6825015B1; RO120922B1; SK11852000A3; YU50100A; PL193510B1; KR20010041024A; EP1054993A1; WO1999042601A1; HUP0100820A2; JP2002504345A; SI9800046A; JP2005110693A; HUP0100820A3; KR100582620B1; CA2321052A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Lovastatin, Pravastatin, Mevastatin, Simvastatin, ihre Derivate und Analoga sind als HMG-CoA-Reduktase-Hemmer (bzw. HMG-CoA Reductase Inhibitoren) bekannt und werden als Antihypercholesterinämie-Mittel verwendet. Sie werden durch Fermentation hergestellt, unter Verwendung von Mikroorganismen verschiedener Arten, identifiziert als Arten, die zu den Genera Aspergillus, Monascus, Nocardia, Amycolatopsis, Mucor oder Penicillium gehören.
Die Reinheit des Wirkstoffs ist ein wichtiger Faktor für die Herstellung eines sicheren und wirksamen Arzneimittels. Die höchste mögliche Reinheit des Produkts ist insbesondere wichtig, wenn das Arzneimittelprodukt für einen längeren Zeitraum genommen werden soll, wie es im Fall der Behandlung oder der Vorbeugung von hohem Plasmacholesterin der Fall ist. Die Akkumulierung der Verunreinigungen der Arzneimittel von geringerer Reinheit kann viele Nebenwirkungen während der medizinischen Behandlung verursachen.
Die Verfahren für die Isolierung und Reinigung von Antihypercholesterinämie-Mitteln, die in früheren Patentanmeldungen offenbart sind, umfassen verschiedene Kombinationen von Extraktion, Chromatographie, Laktonisierung und Kristallisierungsverfahren. Die Reinheit des durch diese Vorgänge erhältlichen Endprodukts ist geringer als 99,6. Der Erhalt des Produkts mit höherer Reinheit durch die Verwendung dieser Verfahren ist möglich, aber die Ausbeute des erwünschten Produkts ist bei der Verwendung dieser Verfahren in einem großen industriellen Maßstab unakzeptabel gering,
Das in der Patentanmeldung WO 92/16276 offenbarte Isolationsverfahren stellt die Lösung für den Erhalt von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern von einer Reinheit mehrr als 99,5 zur Verfügung, aber die Verwendung von technisch sehr anspruchsvollen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC-) Ausstattung ist erforderlich. Gemäß der WO 92/16276 wird der ungereinigte(krude, rohe) HMG-CoA-Reduktase-Hemmer mit etwa 85%iger oder höherer Reinheit in einem organischen Lösungsmittel oder in einer Lösung eines organischen Lösungsmittels und Wasser gelöst. Die Mischung wird dann auf einen pH zwischen 2 und 9 gepuffert und auf eine HPLC-Säule gegeben. Nachdem der interessierende Peak des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers gesammelt ist, wird ein Teil des Lösungsmittels entfernt und dann wird Wasser zugegeben, oder alternativ werden zwei Drittel der Lösungsmittelmischung entfernt, um den HMG-CoA-Reduktase-Hemmer zu kristallisieren. Am Ende ist die Reinheit des durch dieses Verfahren erhaltenen Produkts tatsächlich wenigstens 99,5 mit einer Ausbeute von etwa 90%.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues industrielles Verfahren für die Isolierung und Reinigung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern mit einer Reinheit von mehr als 99,6%, und bevorzugt mehr als 99,7% aus einem Fermentationsmedium (bzw. einer Fermentationsbrühe). Um dieses Ziel zu erreichen, wurde eine ausführliche Untersuchung der während der Fermentation erzeugten chemischen Verbindungen unter Verwendung verschiedener Arten von Mikroorganismen, die zu den Genera Aspergillus, Monascus, Nocardia, Mucor, Amycolatopsis oder Penicillium gehören, ihre chemischen Eigenschaften und ihr Verhalten in verschiedenen Lösungsmitteln bei verschiedenen pH durchgeführt. Folglich wurde die vorher erwähnte Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst, welches die folgenden Schritte umfasst:

– Klärung eines Myzelmediums und Konzentrierung des geklärten Mediums auf ein geringeres Volumen,
– Ansäuern des Konzentrats auf einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 7,5, gefolgt durch Extraktion des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers mit Ethylacetat,
– Optional Durchführung von Laktonisierung,
– Durchführung von Kristallisierung des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers aus einem wassermischbaren oder wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, und
– Durchführung von Kristallisierung des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers aus einem organischen Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In Bezug auf die Zeichnungen,
zeigt die 1 die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten eines HMG-CoA-Reduktase-Hemmers (Lovastatin) beziehungsweise von Verunreinigungen in dem Ethylacetatextraktionsschritt vom pH, und
die 2, 3 und 4 zeigen HPLC-Diagramme von Proben von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern nach Ethylacetat-Extraktion als eine ungereinigte Zusammensetzung, nach Kristallisation aus einem wassermischbaren oder wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, beziehungsweise nach weiterer Kristallisation aus einem organischen Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser.
Da HMG-CoA-Reduktase-Hemmer typischerweise sowohl intra- als auch extrazelluläre Produkte sind, ist es nicht zwingend erforderlich, aber bevorzugt, sie wirkungsvoll aus dem Myzel in die Fermentationsflüssigkeit zu lösen. Das in der Patentanmeldung WO 97/20834 offenbarte Verfahren für die Lösung umfasst die Behandlung des Fermentationsmediums mit einer alkalischen Base auf pH 11,5 und Rühren für 3 Stunden. Die WO 97/06128 lehrt, dass Lösung durch Alkalisierung des Fermentationsmediums auf einen pH zwischen 10 und 13 erfolgen kann. Ebenfalls wird eine Temperatur zwischen 60 und 95° C angewendet. HMG-CoA-Reduktase-Hemmer können sehr wirkungsvoll aus dem Myzel bei einem pH höher als 9 gelöst werden, aber ein zu langes Aussetzen mit so rigorosen Bedingungen verursacht den Abbau der Esterbindung zwischen der Hydroxylgruppe am Naphthalenskelett und der Carbonsäure. Das Gleichgewicht zwischen HMG-CoA-Reduktase-Hemmern und deacylierten HMG-CoA-Reduktase-Hemmern bewegt sich bei rigoroseren Bedingungen in Richtung der deacylierten Produkte. Wir haben unerwarteterweise gefunden, dass die Effizienz der Lösung durchgeführt in einem Temperaturbereich von 10 bis 40° C, bevorzugt in dem Bereich von 18 bis 25° C, wie etwa Raumtemperatur, für weniger als eine Stunde, bevorzugt weniger als eine halbe Stunde, z.B. etwa 10 Minuten, bei einem pH zwischen 9,5 und 13, am bevorzugtesten zwischen 9,5 und 11,5, wird gleich wirkungsvoll zu der Effizienz ist, die in weniger ökonomischen und zeitaufwendigeren Verfahren, durchgeführt bei höheren Temperaturen, beschrieben in den früheren Patentanmeldungen, erzielt wird. Die Lösung kann ebenfalls bei einem pH von weniger als 9,5 und insbesondere weniger als 6 durchgeführt werden, aber die Verwendung einer großen Menge von organischen Lösungsmitteln ist in diesem Fall notwendig.
Wenn diese bevorzugte Ausführungsform der Lösung des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers durchgeführt wurde, wird das Fermentationsmedium nachfolgend mit einem ansäuernden Mittel behandelt, geeigneterweise mit einer Mineralsäure, um den pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5 einzustellen. Geeignete Mineralsäuren sind Phosphorsäure, Schwefelsäure und Chlorwasserstoffsäure. HMG-CoA-Reduktase-Hemmer sind in diesem pH-Bereich stabil und das Fermentationsmedium kann ebenfalls für eine Weile nach diesem Schritt gelagert werden, wenn dies notwendig oder erwünscht ist.
Das Myzel wird aus dem Fermentationsmedium mittels geeigneter Trennschritte entfernt, wie etwa Filtration und/oder Zentrifugation. Filtration ist bevorzugt, und als eine Filtrationstechnik, neben der klassischen Filtration kann ebenfalls Ultra- und Diafiltration geeigneterweise verwendet werden. Das geklärte Medium wird dann auf ein geringeres Volumen konzentriert, am bevorzugtesten fünf- bis zehnfach, mittels Umkehrosmose oder einiger anderer Verfahren zur Verringerung des Volumens.
Die im Folgenden beschriebene Ansäuerung und der Ethylacetatextraktionsschritt ist ein signifikanter Punkt des Reinigungsverfahrens.
Das Konzentrat wird durch ein Ansäuerungsmittel angesäuert, geeigneterweise mit Mineralsäure, auf einen pH-Wert zwischen 4,5 und 7,5. Mineralsäuren, die bereits vorher als Beispiele genannt wurden, können verwendet werden. Dann wird der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer aus dem pH-eingestellten Konzentrat mit Ethylacetat extrahiert. Extraktion wird geeigneterweise unter Verwendung einer Gegenstrom-Extraktionssäule durchgeführt. Das Verhältnis zwischen den Verteilungskoeffizienten von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern und an in Ethylacetat löslichen Verunreinigungen ist das größte bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5, und insbesondere bei einem pH-Wert von 6,0 bis 7,0 und ein Teil der polaren Verunreinigungen wird bereits in diesem Schritt entfernt. Eine bei einem geringeren pH-Wert als 5,0 bzw. insbesondere weniger als 4 durchgeführte Extraktion, ist wirksamer aufgrund des höheren Verteilungskoeffizienten von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern, aber sie resultiert in einem höherem Grad an polaren Verunreinigungen. Die Verteilungskoeffizienten von in Ethylacetat löslichen Verunreinigungen sind ebenfalls bei diesem pH-Wert hoch, wie in der 1 gezeigt. Die Extraktion in Ethylacetat, durchgeführt bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 7,5, speziell oberhalb 5,0 und insbesondere oberhalb 5,5, resultiert in einem geringeren Grad an polaren Verunreinigungen, aufgrund ihrer geringen Verteilungskoeffizienten. Die schlechte Verteilung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern aus dem Konzentrat in Ethylacetat bei diesem pH-Wert kann mit einer längeren Gegenstromextraktionssäule kompensiert werden.
Wenn erwünscht, wird der resultierende Ethylacetatextrakt dann konzentriert und der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer wird optional in diesem Prozessstadium laktonisiert. Bei einem pH zwischen 5,5 und 7,5 ist der Hauptteil des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers in der freien Säureform. Daher kann die Konzentrierung und Laktonisierung weggelassen werden, wenn der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer nicht in einem Arzneimittel als ein Lakton verwendet wird. Die Laktonisierung wird geeigneterweise durch in Kontakt bringen des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers mit einer katalytischen Menge einer Mineral- oder organischen Säure durchgeführt, am meisten bevorzugt Trifluoressigsäure (TFA). Der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, welcher optional laktonisiert ist, kann dann direkt aus dem Ethylacetat kristallisiert werden, wie es im Folgenden beschrieben wird. Alternativ wird das Ethylacetat entfernt, geeigneterweise durch Verdampfen, und ein ungereinigtes HMG-CoA-Reduktase-Hemmerprodukt, welches optional laktonisiert ist, wird erhalten.
Der derartig erhaltene ungereinigte HMG-CoA-Reduktase Inhibitor kann dann optional einer Adsorptionschromatographie unterzogen werden, bevorzugt Umkehrphasenchromatographie. Als die mobile Phase für die Adsorptionschromatographie können Acetonitril oder niedere Alkohole, wie etwa Methanol, Ethanol oder Propanol, oder ein Mischung dieser Lösungsmittel mit Wasser geeigneterweise verwendet werden. Bevorzugt wird der gereinigte HMG-CoA-Reduktase-Hemmer in reinem Acetonitril oder einer Mischung aus Acetonitril/Wasser mit wenigstens 30% Volumen/Volumen (v/v) Acetonitril gelöst und die resultierende Lösung wird auf eine Adsorptionschromatographiesäule gegeben. Die Säulenkonfektionierung enthält, aber ist nicht begrenzt, auf stationäre Phasen auf der Grundlage von Octylsilan, Dimethylsilan, Octadecylsilan, Cyanosilan, Polystyroldivinylbenzol-Copolymer oder Acrylpolymer. Andere typische stationäre Phasematerialien können ebenfalls verwendet werden, z.B. Silica, Aluminiumoxid oder ähnliche. Die adsorbierten Verbindungen werden mit einer geeigneten mobilen Phase eluiert, wie etwa einem Acetonitril/Wassergradient. Der interessierende Peak des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers wird gesammelt, und das Lösungsmittel der mobilen Phase wird entfernt, um den HMG-CoA-Reduktase-Hemmer zu kristallisieren. Die Reinheit von kristallisiertem ungereinigtem HMG-CoA-Reduktase Inhibitor ist zwischen 80% und 92% und hängt von dem Verunreinigungsprofil in dem Fermentationsmedium ab. Die optionale Adsorptionschromatographie kann durch normale Chromatographie, Flashchromatographie, industrielle HPLC oder durch Extraktions- oder Kristallisierungsverfahren ersetzt werden.
Die kombinierte Kristallisierungsbehandlung, welche der vorliegenden Erfindung eigen ist, wird im Folgenden ausführlicher beschrieben.
Spezifischer, umfasst sie die Kristallisierung des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers aus einem organischen Lösungsmittel, das wassermischbar oder wasserlöslich ist, und die Kristallisierung des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers aus einem organischen Lösungsmittel mit einer begrenzten Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser. Die Reihenfolge der beiden Kristallisierungen können ebenfalls umgedreht sein. Die Eigenschaft des organischen Lösungsmittels entweder wassermischbar oder wasserlöslich zu sein, oder eine begrenzte Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser zu haben, ist an sich dem Fachmann bekannt und wird z.B. in „Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry", Vol. A24, 5. Edition (1993), Seiten 437-505 beschrieben. In vorliegenden Erfindung soll der Begriff „wassermischbar oder wasserlöslich" organische Lösungsmittel bedeuten, welche eine im Wesentlichen unbegrenzte, bevorzugt 100%ige Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser zeigen, und der Begriff „begrenzte Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser" soll ebenfalls wasserunmischbare oder wasserunlösliche organische Lösungsmittel enthalten. Ferner schließt das Konzept der Kristallisierung der vorliegenden Erfindung insbesondere ebenso die Präzipitation ein.
Beispiele für im Wesentlichen wassermischbare oder wasserlösliche organische Lösungsmittel enthalten: niedere Alkylalkohole, wie etwa Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropylalkohol, niedere Alkylketone, wie etwa Aceton und Methylethylketon, niedere Alkylglykolether, wie etwa Methylglykol, Ethylglykol, Propylglykol und Ethyldiglykol und dipolare aprotische Lösungsmittel, wie etwa N,N-Dimethylformamid (DMF), N,N-Dimethylacetamid (DMA) und Dimethylsulfoxid (DMSO), einschließlich Mischungen dieser Lösungsmittel. Als besonders bevorzugte Beispiele des wassermischbaren organischen Lösungsmittels werden Aceton und niedere Alkylalkohole erwähnt. Beispiele für ein organisches Lösungsmittel, das eine begrenzte Mischbarkeit oder Löslichkeit mit Wasser hat, enthalten: höhere Alkylalkohole, wie etwa Butanol, Isobutanolamylalkohol, Hexanol, 2-Ethylhexanol, Benzylalkohol und Cyclohexanol, höhere Alkylketone, wie etwa Methylbutylketon, Methylisobutylketon und Cyclohexanon, Ester, wie etwa Methylacetat, Ethylacetat, n-Propyl- (und Isopropyl-) acetat, n-Butyl- (und iso-Butyl- oder sec-Butyl-) acetat und Amylacetat, Ether, wie etwa Diethylether und Diisopropylether, chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie etwa Methylenchlorid und Chloroform und ähnliche, einschließlich Mischungen dieser Lösungsmittel. Besonders bevorzugt als ein Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit Wasser ist Ethylacetat.
Wir haben unerwartet gefunden, dass die Kristallisierung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern aus einem wassermischbaren, organischen Lösungsmittel wie Aceton oder einem niederen Alkylalkohol, gefolgt durch weitere Umkristallisierungen mit dem gleichen Lösungsmittel, nur einen geringen Teil der unpolaren und einen Hauptteil der polaren Verunreinigungen entfernen kann, und dass die Kristallisierung aus dem organischen Lösungsmittel mit einer begrenzten Mischbarkeit mit Wasser, wie Ethylacetat, gefolgt durch weitere Unkristallisierungen aus dem gleichen Lösungsmittel hauptsächlich nur unpolare Verunreinigungen entfernt. Die letzte Tatsache wird aus den HPLC-Diagrammen von ungereinigtem HMG-CoA-Reduktase-Hemmer (2), HMG-CoA-Reduktase-Hemmer nach der Kristallisierung aus Aceton (3) und HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, erhalten durch die Kristallisierung aus Aceton und weiterer Umkristallisierung aus Ethylacetat ( 4), klar ersichtlich. Gemäß dieser unerwarteten Erkenntnis kann der letzte Schritt der vorliegenden Erfindung mit kombinierter Kristallisierung aus wassermischbaren oder wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel und aus einem organischen Lösungsmittel, das begrenzte Mischbarkeit oder gar Löslichkeit mit Wasser hat, nicht in dem Verfahren für den Erhalt von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern von großer Reinheit weggelassen werden.
Die kombinierte Kristallisierungsbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung kann wie folgt durchgeführt werden. Zunächst werden die Kristalle von ungereinigten HMG-CoA-Reduktase-Hemmer in dem vorher erwähnten im Wesentlichen (bevorzugt 100) wassermischbaren oder wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, insbesondere Aceton oder niederer Alkohol, gelöst, und dann wird Wasser zugegeben, um den HMG-CoA-Reduktase Inhibitor kristallisieren oder präzipitieren zu lassen. Alternativ wird der ungereinigte HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, der in dem im Wesentlichen wassermischbare oder wasserlöslichen organischen Lösungsmittel gelöst ist, zu Wasser gegeben, um kristallisiert oder präzipitiert zu werden. Diese Vorgänge können mit dem gleichen oder einem anderen wassermischbaren oder wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel falls notwendig wiederholt werden, z.B. ein- bis viermal, in Abhängigkeit von der Reinheit des ungereinigten Ausgangsmaterials.
Die dadurch erhaltenen Kristalle werden dann in dem vorher erwähnten Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser, wie etwa Ethylacetat, in einer geeigneten Konzentration gelöst, welche bevorzugt in dem Bereich von 10-35 g/l, am bevorzugtesten im Bereich von 15-25 g/l liegt. Nach der Entfernung von zwei Drittel bis drei Viertel des Lösungsmittels kristallisiert der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer. Die Kristallisierung aus dem gleichen oder einem anderen organischen Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit oder in Wasser kann, wenn notwendig, wiederholt werden, z.B. für ein bis dreimal, in Abhängigkeit von der Reinheit des durch Kristallisation aus dem wassermischbaren oder wasserlöslichen organischen Lösungsmittel erhaltenen Produkts. Der kristallisierte HMG-CoA-Reduktase-Hemmer wird dann filtriert und getrocknet, um ein Produkt mit einer Reinheit von wenigsten 99,6 zu ergeben.
Wie bereits erwähnt kann die Reihenfolge der Kristallisierungen umgedreht sein, d.h. erst Durchführung von Kristallisierung aus dem organischen Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser, und dann Durchführung von Kristallisierung aus dem wassermischbaren oder wasserlöslichen organischen Lösungsmittel. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann zunächst die Durchführung von Kristallisierung aus Ethylacetat als das organische Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser geeigneterweise direkt nach dem Ethylacetatextraktionsschritt durchgeführt werden, oder optional, nach dem vorher beschriebenen Laktonisierungsschritt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Produkte mit einer Reinheit von wenigstens 99,6, sogar wenigstens 99,7 erhältlich.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform können die verschiedenen Arten von Kristallisierungen nacheinander in einer alternierenden Art und Weise durchgeführt werden.
In einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird das vorher beschriebene Verfahren von kombinierten Kristallisierungsschritten aus einem wassermischbaren oder wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel und aus einem organischen Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser als ein letzter Feinstreinigungsschritt für ein Verfahren zur Isolierung und/oder Reinigung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern eingesetzt. Demgemäß kann ein derartiger letzter Feinstreinigungsschritt ebenfalls bei ungereinigten Materialien von HMG-CoA-Reduktase Inhibitoren angewendet werden, welche auf herkömmliche Art und Weise erhalten wurden. Die folglich erhältliche Reinheit des HMG-CoA-Reduktase Inhibitors ist wenigstens 99,6 und sogar wenigstens 99,7%.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist gut geeignet, wenn Lovastatin als der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer ausgewählt wird. Demgemäss wird in einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung das vorher beschriebene Verfahren für die Isolierung und/oder Reinigung von Lovastatin verwendet.
Die im Wesentlichen reinen HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, erhalten durch das erfindungsgemäße Verfahren, wie etwa Lovastatin, Mevastatin, Pravastatin und Simvastatin, als auch ihre Derivate und Analoga, können vorteilhaft für die Herstellung eines Arzneimittels für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Krankheiten verwendet werden. Die erhaltenen Hemmer und Arzneimittel sind insbesondere verwendbar als Medikamente oder vorbeugende Mittel für die Reduzierung des Risikos eines Schlaganfalls, einer transitorischen ischämischen Attacke, Arteriosklerose und eines myokardialen Infarkts.
Die folgenden Beispiel veranschaulichen das erfindungsgemäße Verfahren und sind nicht als begrenzend für die Erfindung auszulegen, die in den hieran angefügten Ansprüchen festgelegt ist.
BEISPIELE
Beispiel 1
Ein Fermentationsmedium (160 l) mit einer Konzentration an Lovastatin von 1 g/l, erhalten durch Fermentation mit Aspergillus terreus ATCC 20542 wurde in ein Gefäß (400 l) gegeben und auf pH 10 mit 1M wässriger Natriumhydroxidlösung eingestellt. Nach 10 Minuten intensiven Rühren bei Raumtemperatur wurde das Medium auf pH 9 mit 1 M Schwefelsäurelösung eingestellt und die Biomasse abfiltriert. Das Filtrat wurde dann mit 1 M Schwefelsäurelösung auf pH 6,5 angesäuert. 160 l Ethylacetat wurden zu dem Filtrat gegeben und die erhaltene Mischung wurde für 20 min gerührt. Die wässrigen und die Ethylacetatphasen wurden durch Extraktionszentrifugation getrennt. Der Ethylacetatextrakt wurde in einem Rotationsverdampfer auf ein Volumen von 14 l konzentriert. Die Konzentration an Lovastatin in der freien Säureform in dem Ethylacetatkonzentrat war 10 g/l.
Das Ethylacetatkonzentrat (14 l) wurde dann in einen Reaktor (40 l) gegeben und laktonisiert. Die Laktonisierung wurde durch eine katalytische Menge an TFA (0,5 ml TFA/1 l Konzentrat) initiiert. Der Laktonisierungsvorgang dauerte zwei Stunden bei 40° C. Das Konzentrat wurde nach der Laktonisierung zweimal mit 14 l wässrige 5%iger Ammoniumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde abgelassen, die organische Phase wurde weiterhin in einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit konzentriert. Das resultierende ölige Produkt (1,5 l) enthielt 133 g Lovastatin.
Das erhaltene ölige Produkt (161 ml) wurde in 80 ml Acetonitril gelöst und auf eine Chromatographiesäule (80 cm, 3,6 cm) gefüllt mit XAD-16 (XAD-16 ist ein kommerzielles Produkt der Firma Rohm & Haas, 20-50 mesh). Die Säule wurde zunächst mit 40:60 Acetonitril/Wasser (pH 3, eingestellt durch Chlorwasserstoffsäure) bei einer Geschwindigkeit von 75 ml/min eluiert. Die Elution wurde durch einen UV-Detektor (236 nm) überwacht, und nachdem der erste Tropfen eine Extinktion aufwies, wurde die Elution der Säule mit 55:45 Acetonitril Wasser (pH 3, eingestellt durch Chlorwasserstoffsäure) begonnen. Die Hauptfraktion wurde gesammelt und nach dem Abfall der Extinktion wurde die Säule mit 80:20 Acetonitril/Wasser (pH 3, eingestellt durch Chlorwasserstoffsäure) gewaschen. Das Acetonitril wurde aus der Hauptfraktion durch Rotationsverdampfung (50° C, 150 mbar) entfernt, und die resultierenden Kristalle wurden abfiltriert. Die Masse der Kristalle war 24,5 g und der Gehalt an Lovastatin war 50% Gewicht/Gewicht (w/w). Die HPLC-Reinheit war 92,5%.
Die resultierenden Kristalle (24 g) wurden in 350 ml Aceton gelöst und 700 ml Wasser wurden unter kontinuierlichem Rühren zugegeben. Die Mischung wurde auf 4° C für 30 Minuten gestellt. Die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Die Masse der Kristalle war 12,7 g mit einem Anteil von 90% w/w Lovastatin. Die HPLC-Reinheit war 98,8.
Die Kristallisierung aus Aceton wurde unter der gleichen Bedingung wiederholt und 11,3 g Kristalle mit 97% w/w Lovastatin wurden erhalten. Die HPLC-Reinheit war 99,4.
Die nach der zweiten Kristallisierung aus Aceton erhaltenen Kristalle (11,3 g) wurden in 700 ml Ethylacetat gelöst und das Ethylacetat wurde im Vakuum zu einer Konzentration an Lovastatin von 70 g/l verdampft. Das Konzentrat wurde für eine Stunde auf 8° C gestellt. Die resultierenden Kristalle an Lovastatin wurden abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Die Masse der Kristalle war 9,4 g mit einem Anteil an Lovastatin von 99,6% w/w. Die HPLC-Reinheit war 99,7.
Beispiel 2
Lovastatinkristalle (3 g), isoliert nach der XAD-Adsorptionschromatographie, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in 170 ml Ethylacetat gelöst. Das Ethylacetat wurde im Vakuum (200 mbar) bei 50° C auf 35 ml eingedampft. Das Konzentrat wurde für eine Stunde auf 10° C gestellt. Die resultierenden Kristalle an Lovastatin wurden abfiltriert und dann im Vakuum getrocknet. Die Masse der Kristalle war 2,1 g mit einem Anteil an Lovastatin von 96% w/w. Die HPLC-Reinheit war 99,0%.
Die erhaltenen Kristalle (2,1 g) wurden in 50 ml Aceton gelöst und 85 ml Wasser wurde zugegeben. Die Mischung wurde dann für 30 Minuten auf 10° C gestellt und die Kristalle wurden abfiltriert und im Vakuum bei 40° C getrocknet. Die Masse der resultierenden Kristalle war 1,9 g mit 99% w/w Lovastatin. Die HPLC-Reinheit war 99,8%.
Beispiel 3
Ein Fermentationsmedium (30 l in einem 50 l-Fermentor), das Pravastatin enthält (690 g pro kg Fermentationsmedium; die HPLC-Reinheit von Pravastatin war 48,70 wurde filtriert und das resultierende Myzel mit Wasser gewaschen. Das Filtrat (51 1) wurde auf pH 5,0 mit 10% wässriger Lösung Phosphorsäure angesäuert. Der Wirkstoff (Pravastatin) wurde dann in einer Extraktionssäule aus dem Filtrat in 70 l Ethylacetat extrahiert. Die Wasserphase (50 l) mit weniger als 2 g Pravastatin und mit dem Hauptteil der Verunreinigungen wurde abgelassen. Die Ethylacetatphase wurde auf 800 ml eingedampft und weiterhin in dem Isolationsverfahren verwendet. Die HPLC-Reinheit an Pravastatin in dem Ethylacetatextrakt war 70,3. Für die weitere Isolierung wurde das ölige Produkt einer Adsorptionschromatographie und kombinierten Kristallisierungsschritten in Übereinstimmung mit Beispiel 1 unterzogen.
Beispiel 4
Ein ungereinigtes Simvastatin (2,3 g) in Laktonform wurde in Aceton (7 ml) gelöst und 15 ml Wasser wurde zugegeben. Das Ergebnis war ein öliges Produkt, das in den nächsten 10 Minuten kristallisierte. Die erhaltenen Kristalle wurden dann filtriert, mit Wasser gewaschen und bei 40° C für 60 min getrocknet. Die erhaltenen Kristalle (2,2 g) mit einer HPLC-Reinheit von 99,51 wurden dann in Ethylacetat (8 ml) gelöst. Die resultierende Lösung wurde auf 4 ml konzentriert und Simvastatin wurde für 60 min bei 8° C kristallisieren gelassen. Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Die Kristalle wurden dann bei 40° C für 60 min getrocknet. Die Reinheit des resultierenden Simvastatin (1,7 g) war 99,73%.
Beispiel 5
Ein ungereinigtes Mevastatin (2,0 g) in Laktonform mit einer HPLC-Reinheit von 98,5 wurde in Aceton (7 ml) gelöst und 20 ml Wasser wurde zugegeben. Das Resultat war ein öliges Produkt, das in den nächsten 10 min kristallisierte. Die erhaltenen Kristalle wurden dann filtriert, mit Wasser gewaschen und bei 40° C für 60 min getrocknet. Die resultierenden Kristalle (1,8 g) mit einer HPLC-Reinheit von 99,33 wurden in Ethylacetat (8 ml) gelöst. Die resultierende Lösung wurde auf 4 ml konzentriert und das Mevastatin wurde für 60 min bei 8° C kristallisieren gelassen. Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Die Kristalle wurden dann bei 40° C für 60 min getrocknet. Die Reinheit des resultierenden Mevastatin (1,3 g) war 99,72.

Claims

Verfahren für die Reinigung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern, welches das Unterziehen des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers mit kombinierten Kristallisierungsschritten umfasst, welche die Kristallisierung aus einem wassermischbaren oder wasserlöslichen Lösungsmittel und die Kristallisierung aus einem organischen Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser, als ein letzter Feinstreinigungsschritt umfasst, um HMG-CoA-Reduktase-Hemmer mit einer Reinheit von mehr als 99,6 zu erhalten, wobei die Reihenfolge der beiden Kristallisierungen ebenfalls umgekehrt sein kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erhaltenen HMG-CoA-Reduktase-Hemmer eine Reinheit von mehr als 99,7% haben.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Aceton oder ein niederer Alkylalkohol als das wassermischbare oder wasserlösliche, organische Lösungsmittel verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Kristallisierung das Lösen des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers in Aceton und dann die Zugabe von Wasser dazu umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Kristallisierung aus dem organischen Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser die Lösung des HMG-CoA-Reduktase Inhibitors in dem organischen Lösungsmittel zu einer Konzentration von 10 bis 35 g/l und die Entfernung von ein Drittel bis drei Viertel des organischen Lösungsmittels umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Ethylacetat als das organische Lösungsmittel mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser verwendet wird.
Verfahren für die Isolierung und Reinigung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern aus einer Myzelbiomasse, welches umfasst: – Klären eines Myzelmediums und Konzentration des geklärten Mediums auf ein geringeres Volumen, – Ansäuern des Konzentrats auf einen pH-Wert in dem Bereich von 4,5 bis 7,5, gefolgt durch Extraktion des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers mit Ethylacetat, – optionale Durchführung von Laktonisierung, und – Unterziehen des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers mit den Schritten nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verfahren nach Anspruch 7, ferner mit, vor dem Klären des Myzelbiomassemediums, den Schritten des Lösens des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers aus der Myzelbiomasse bei einem pH-Wert zwischen 9,5 und 13 in die Fermentationsflüssigkeit, und Einstellen des Mediums auf einen pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Lösungsschritt bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 40° C für weniger als eine Stunde durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Klären des Myzelmediums durch Entfernen des Myzels aus dem Medium mittels Filtration durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das geklärte Medium mittels Umkehrosmose konzentriert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei das Konzentrat auf einen pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 7,5 angesäuert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Konzentrat auf einen pH-Wert in dem Bereich von 6,0 bis 7,0 angesäuert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei der HMG-CoA-Reduktase Inhibitor, welcher aus Ethylacetat extrahiert und optional laktonisiert wird, einem Reinigungsschritt durch Adsorptionschromatographie unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei eine Mischung aus Acetonitril und Wasser als die mobile Phase für die Adsorptionschromatographie verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, wobei die Reihenfolge der Kristallisierungsschritte umgekehrt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 16, wobei der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer ausgewählt wird, um Lovastatin zu sein.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 für die Isolierung und/oder Reinigung von Lovastatin.