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Hintergrund
der Erfindung
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Lovastatin,
Pravastatin, Mevastatin, Simvastatin, ihre Derivate und Analoga
sind als HMG-CoA-Reduktase-Hemmer (bzw. HMG-CoA Reductase Inhibitoren)
bekannt und werden als Antihypercholesterinämie-Mittel verwendet. Sie werden durch
Fermentation hergestellt, unter Verwendung von Mikroorganismen verschiedener
Arten, identifiziert als Arten, die zu den Genera Aspergillus, Monascus,
Nocardia, Amycolatopsis, Mucor oder Penicillium gehören.
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Die
Reinheit des Wirkstoffs ist ein wichtiger Faktor für die Herstellung
eines sicheren und wirksamen Arzneimittels. Die höchste mögliche Reinheit des
Produkts ist insbesondere wichtig, wenn das Arzneimittelprodukt
für einen
längeren
Zeitraum genommen werden soll, wie es im Fall der Behandlung oder der
Vorbeugung von hohem Plasmacholesterin der Fall ist. Die Akkumulierung
der Verunreinigungen der Arzneimittel von geringerer Reinheit kann
viele Nebenwirkungen während
der medizinischen Behandlung verursachen.
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Die
Verfahren für
die Isolierung und Reinigung von Antihypercholesterinämie-Mitteln,
die in früheren
Patentanmeldungen offenbart sind, umfassen verschiedene Kombinationen
von Extraktion, Chromatographie, Laktonisierung und Kristallisierungsverfahren.
Die Reinheit des durch diese Vorgänge erhältlichen Endprodukts ist geringer
als 99,6. Der Erhalt des Produkts mit höherer Reinheit durch die Verwendung
dieser Verfahren ist möglich,
aber die Ausbeute des erwünschten
Produkts ist bei der Verwendung dieser Verfahren in einem großen industriellen
Maßstab
unakzeptabel gering,
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Das
in der Patentanmeldung WO 92/16276 offenbarte Isolationsverfahren
stellt die Lösung
für den
Erhalt von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern
von einer Reinheit mehrr als 99,5 zur Verfügung, aber die Verwendung von
technisch sehr anspruchsvollen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC-) Ausstattung
ist erforderlich. Gemäß der WO 92/16276
wird der ungereinigte(krude, rohe) HMG-CoA-Reduktase-Hemmer mit
etwa 85%iger oder höherer
Reinheit in einem organischen Lösungsmittel
oder in einer Lösung
eines organischen Lösungsmittels
und Wasser gelöst.
Die Mischung wird dann auf einen pH zwischen 2 und 9 gepuffert und
auf eine HPLC-Säule
gegeben. Nachdem der interessierende Peak des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers
gesammelt ist, wird ein Teil des Lösungsmittels entfernt und dann
wird Wasser zugegeben, oder alternativ werden zwei Drittel der Lösungsmittelmischung
entfernt, um den HMG-CoA-Reduktase-Hemmer zu kristallisieren. Am
Ende ist die Reinheit des durch dieses Verfahren erhaltenen Produkts tatsächlich wenigstens
99,5 mit einer Ausbeute von etwa 90%.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues industrielles Verfahren
für die
Isolierung und Reinigung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern mit einer
Reinheit von mehr als 99,6%, und bevorzugt mehr als 99,7% aus einem
Fermentationsmedium (bzw. einer Fermentationsbrühe). Um dieses Ziel zu erreichen,
wurde eine ausführliche
Untersuchung der während
der Fermentation erzeugten chemischen Verbindungen unter Verwendung
verschiedener Arten von Mikroorganismen, die zu den Genera Aspergillus,
Monascus, Nocardia, Mucor, Amycolatopsis oder Penicillium gehören, ihre
chemischen Eigenschaften und ihr Verhalten in verschiedenen Lösungsmitteln
bei verschiedenen pH durchgeführt. Folglich
wurde die vorher erwähnte
Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfahren
gelöst,
welches die folgenden Schritte umfasst:
- – Klärung eines
Myzelmediums und Konzentrierung des geklärten Mediums auf ein geringeres Volumen,
- – Ansäuern des
Konzentrats auf einen pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 7,5, gefolgt
durch Extraktion des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers mit Ethylacetat,
- – Optional
Durchführung
von Laktonisierung,
- – Durchführung von
Kristallisierung des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers aus einem wassermischbaren oder
wasserlöslichen
organischen Lösungsmittel,
und
- – Durchführung von
Kristallisierung des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers aus einem organischen Lösungsmittel
mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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In
Bezug auf die Zeichnungen,
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zeigt
die 1 die Abhängigkeit
des Verteilungskoeffizienten eines HMG-CoA-Reduktase-Hemmers (Lovastatin)
beziehungsweise von Verunreinigungen in dem Ethylacetatextraktionsschritt vom
pH, und
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die 2, 3 und 4 zeigen
HPLC-Diagramme von Proben von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern nach Ethylacetat-Extraktion
als eine ungereinigte Zusammensetzung, nach Kristallisation aus
einem wassermischbaren oder wasserlöslichen organischen Lösungsmittel,
beziehungsweise nach weiterer Kristallisation aus einem organischen
Lösungsmittel
mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser.
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Da
HMG-CoA-Reduktase-Hemmer typischerweise sowohl intra- als auch extrazelluläre Produkte
sind, ist es nicht zwingend erforderlich, aber bevorzugt, sie wirkungsvoll
aus dem Myzel in die Fermentationsflüssigkeit zu lösen. Das
in der Patentanmeldung WO 97/20834 offenbarte Verfahren für die Lösung umfasst
die Behandlung des Fermentationsmediums mit einer alkalischen Base
auf pH 11,5 und Rühren
für 3 Stunden.
Die WO 97/06128 lehrt, dass Lösung
durch Alkalisierung des Fermentationsmediums auf einen pH zwischen
10 und 13 erfolgen kann. Ebenfalls wird eine Temperatur zwischen
60 und 95° C
angewendet. HMG-CoA-Reduktase-Hemmer können sehr wirkungsvoll aus
dem Myzel bei einem pH höher
als 9 gelöst
werden, aber ein zu langes Aussetzen mit so rigorosen Bedingungen
verursacht den Abbau der Esterbindung zwischen der Hydroxylgruppe
am Naphthalenskelett und der Carbonsäure. Das Gleichgewicht zwischen
HMG-CoA-Reduktase-Hemmern und deacylierten HMG-CoA-Reduktase-Hemmern
bewegt sich bei rigoroseren Bedingungen in Richtung der deacylierten
Produkte. Wir haben unerwarteterweise gefunden, dass die Effizienz
der Lösung
durchgeführt
in einem Temperaturbereich von 10 bis 40° C, bevorzugt in dem Bereich
von 18 bis 25° C,
wie etwa Raumtemperatur, für
weniger als eine Stunde, bevorzugt weniger als eine halbe Stunde, z.B.
etwa 10 Minuten, bei einem pH zwischen 9,5 und 13, am bevorzugtesten
zwischen 9,5 und 11,5, wird gleich wirkungsvoll zu der Effizienz
ist, die in weniger ökonomischen
und zeitaufwendigeren Verfahren, durchgeführt bei höheren Temperaturen, beschrieben
in den früheren
Patentanmeldungen, erzielt wird. Die Lösung kann ebenfalls bei einem
pH von weniger als 9,5 und insbesondere weniger als 6 durchgeführt werden,
aber die Verwendung einer großen
Menge von organischen Lösungsmitteln
ist in diesem Fall notwendig.
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Wenn
diese bevorzugte Ausführungsform der
Lösung
des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers durchgeführt wurde,
wird das Fermentationsmedium nachfolgend mit einem ansäuernden
Mittel behandelt, geeigneterweise mit einer Mineralsäure, um
den pH-Wert zwischen
7,5 und 8,5 einzustellen. Geeignete Mineralsäuren sind Phosphorsäure, Schwefelsäure und
Chlorwasserstoffsäure.
HMG-CoA-Reduktase-Hemmer sind in diesem pH-Bereich stabil und das Fermentationsmedium
kann ebenfalls für
eine Weile nach diesem Schritt gelagert werden, wenn dies notwendig
oder erwünscht
ist.
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Das
Myzel wird aus dem Fermentationsmedium mittels geeigneter Trennschritte
entfernt, wie etwa Filtration und/oder Zentrifugation. Filtration
ist bevorzugt, und als eine Filtrationstechnik, neben der klassischen
Filtration kann ebenfalls Ultra- und Diafiltration geeigneterweise
verwendet werden. Das geklärte
Medium wird dann auf ein geringeres Volumen konzentriert, am bevorzugtesten
fünf- bis
zehnfach, mittels Umkehrosmose oder einiger anderer Verfahren zur
Verringerung des Volumens.
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Die
im Folgenden beschriebene Ansäuerung und
der Ethylacetatextraktionsschritt ist ein signifikanter Punkt des
Reinigungsverfahrens.
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Das
Konzentrat wird durch ein Ansäuerungsmittel
angesäuert,
geeigneterweise mit Mineralsäure, auf
einen pH-Wert zwischen 4,5 und 7,5. Mineralsäuren, die bereits vorher als
Beispiele genannt wurden, können
verwendet werden. Dann wird der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer aus dem pH-eingestellten
Konzentrat mit Ethylacetat extrahiert. Extraktion wird geeigneterweise
unter Verwendung einer Gegenstrom-Extraktionssäule durchgeführt. Das Verhältnis zwischen
den Verteilungskoeffizienten von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern und an in Ethylacetat
löslichen
Verunreinigungen ist das größte bei
einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5, und insbesondere bei einem pH-Wert
von 6,0 bis 7,0 und ein Teil der polaren Verunreinigungen wird bereits
in diesem Schritt entfernt. Eine bei einem geringeren pH-Wert als
5,0 bzw. insbesondere weniger als 4 durchgeführte Extraktion, ist wirksamer
aufgrund des höheren
Verteilungskoeffizienten von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern, aber sie
resultiert in einem höherem
Grad an polaren Verunreinigungen. Die Verteilungskoeffizienten von
in Ethylacetat löslichen
Verunreinigungen sind ebenfalls bei diesem pH-Wert hoch, wie in
der 1 gezeigt. Die Extraktion in Ethylacetat, durchgeführt bei
einem pH-Wert zwischen 4,5 und 7,5, speziell oberhalb 5,0 und insbesondere
oberhalb 5,5, resultiert in einem geringeren Grad an polaren Verunreinigungen,
aufgrund ihrer geringen Verteilungskoeffizienten. Die schlechte
Verteilung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern aus dem Konzentrat in Ethylacetat
bei diesem pH-Wert kann mit einer längeren Gegenstromextraktionssäule kompensiert werden.
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Wenn
erwünscht,
wird der resultierende Ethylacetatextrakt dann konzentriert und
der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer wird optional in diesem Prozessstadium
laktonisiert. Bei einem pH zwischen 5,5 und 7,5 ist der Hauptteil
des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers in der freien Säureform. Daher kann die Konzentrierung
und Laktonisierung weggelassen werden, wenn der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer nicht in einem
Arzneimittel als ein Lakton verwendet wird. Die Laktonisierung wird
geeigneterweise durch in Kontakt bringen des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers
mit einer katalytischen Menge einer Mineral- oder organischen Säure durchgeführt, am
meisten bevorzugt Trifluoressigsäure
(TFA). Der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, welcher
optional laktonisiert ist, kann dann direkt aus dem Ethylacetat
kristallisiert werden, wie es im Folgenden beschrieben wird. Alternativ
wird das Ethylacetat entfernt, geeigneterweise durch Verdampfen, und
ein ungereinigtes HMG-CoA-Reduktase-Hemmerprodukt, welches optional
laktonisiert ist, wird erhalten.
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Der
derartig erhaltene ungereinigte HMG-CoA-Reduktase Inhibitor kann
dann optional einer Adsorptionschromatographie unterzogen werden,
bevorzugt Umkehrphasenchromatographie. Als die mobile Phase für die Adsorptionschromatographie
können
Acetonitril oder niedere Alkohole, wie etwa Methanol, Ethanol oder
Propanol, oder ein Mischung dieser Lösungsmittel mit Wasser geeigneterweise
verwendet werden. Bevorzugt wird der gereinigte HMG-CoA-Reduktase-Hemmer
in reinem Acetonitril oder einer Mischung aus Acetonitril/Wasser mit
wenigstens 30% Volumen/Volumen (v/v) Acetonitril gelöst und die
resultierende Lösung
wird auf eine Adsorptionschromatographiesäule gegeben. Die Säulenkonfektionierung
enthält,
aber ist nicht begrenzt, auf stationäre Phasen auf der Grundlage
von Octylsilan, Dimethylsilan, Octadecylsilan, Cyanosilan, Polystyroldivinylbenzol-Copolymer
oder Acrylpolymer. Andere typische stationäre Phasematerialien können ebenfalls verwendet
werden, z.B. Silica, Aluminiumoxid oder ähnliche. Die adsorbierten Verbindungen
werden mit einer geeigneten mobilen Phase eluiert, wie etwa einem
Acetonitril/Wassergradient. Der interessierende Peak des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers
wird gesammelt, und das Lösungsmittel der
mobilen Phase wird entfernt, um den HMG-CoA-Reduktase-Hemmer zu kristallisieren.
Die Reinheit von kristallisiertem ungereinigtem HMG-CoA-Reduktase
Inhibitor ist zwischen 80% und 92% und hängt von dem Verunreinigungsprofil
in dem Fermentationsmedium ab. Die optionale Adsorptionschromatographie
kann durch normale Chromatographie, Flashchromatographie, industrielle HPLC
oder durch Extraktions- oder Kristallisierungsverfahren ersetzt
werden.
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Die
kombinierte Kristallisierungsbehandlung, welche der vorliegenden
Erfindung eigen ist, wird im Folgenden ausführlicher beschrieben.
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Spezifischer,
umfasst sie die Kristallisierung des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers aus einem organischen
Lösungsmittel,
das wassermischbar oder wasserlöslich
ist, und die Kristallisierung des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers aus
einem organischen Lösungsmittel
mit einer begrenzten Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser.
Die Reihenfolge der beiden Kristallisierungen können ebenfalls umgedreht sein.
Die Eigenschaft des organischen Lösungsmittels entweder wassermischbar
oder wasserlöslich
zu sein, oder eine begrenzte Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser
zu haben, ist an sich dem Fachmann bekannt und wird z.B. in „Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry",
Vol. A24, 5. Edition (1993), Seiten 437-505 beschrieben. In vorliegenden
Erfindung soll der Begriff „wassermischbar
oder wasserlöslich" organische Lösungsmittel
bedeuten, welche eine im Wesentlichen unbegrenzte, bevorzugt 100%ige
Mischbarkeit oder Löslichkeit
mit bzw. in Wasser zeigen, und der Begriff „begrenzte Mischbarkeit oder
Löslichkeit
mit bzw. in Wasser" soll
ebenfalls wasserunmischbare oder wasserunlösliche organische Lösungsmittel
enthalten. Ferner schließt
das Konzept der Kristallisierung der vorliegenden Erfindung insbesondere
ebenso die Präzipitation
ein.
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Beispiele
für im
Wesentlichen wassermischbare oder wasserlösliche organische Lösungsmittel enthalten:
niedere Alkylalkohole, wie etwa Methanol, Ethanol, Propanol und
Isopropylalkohol, niedere Alkylketone, wie etwa Aceton und Methylethylketon, niedere
Alkylglykolether, wie etwa Methylglykol, Ethylglykol, Propylglykol
und Ethyldiglykol und dipolare aprotische Lösungsmittel, wie etwa N,N-Dimethylformamid
(DMF), N,N-Dimethylacetamid (DMA) und Dimethylsulfoxid (DMSO), einschließlich Mischungen
dieser Lösungsmittel.
Als besonders bevorzugte Beispiele des wassermischbaren organischen
Lösungsmittels
werden Aceton und niedere Alkylalkohole erwähnt. Beispiele für ein organisches Lösungsmittel,
das eine begrenzte Mischbarkeit oder Löslichkeit mit Wasser hat, enthalten:
höhere
Alkylalkohole, wie etwa Butanol, Isobutanolamylalkohol, Hexanol,
2-Ethylhexanol,
Benzylalkohol und Cyclohexanol, höhere Alkylketone, wie etwa
Methylbutylketon, Methylisobutylketon und Cyclohexanon, Ester, wie
etwa Methylacetat, Ethylacetat, n-Propyl- (und Isopropyl-) acetat,
n-Butyl- (und iso-Butyl- oder sec-Butyl-)
acetat und Amylacetat, Ether, wie etwa Diethylether und Diisopropylether,
chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie etwa Methylenchlorid und Chloroform
und ähnliche,
einschließlich
Mischungen dieser Lösungsmittel.
Besonders bevorzugt als ein Lösungsmittel
mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit Wasser ist Ethylacetat.
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Wir
haben unerwartet gefunden, dass die Kristallisierung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern aus
einem wassermischbaren, organischen Lösungsmittel wie Aceton oder
einem niederen Alkylalkohol, gefolgt durch weitere Umkristallisierungen
mit dem gleichen Lösungsmittel,
nur einen geringen Teil der unpolaren und einen Hauptteil der polaren
Verunreinigungen entfernen kann, und dass die Kristallisierung aus
dem organischen Lösungsmittel
mit einer begrenzten Mischbarkeit mit Wasser, wie Ethylacetat, gefolgt
durch weitere Unkristallisierungen aus dem gleichen Lösungsmittel
hauptsächlich
nur unpolare Verunreinigungen entfernt. Die letzte Tatsache wird
aus den HPLC-Diagrammen von ungereinigtem HMG-CoA-Reduktase-Hemmer
(2), HMG-CoA-Reduktase-Hemmer nach der Kristallisierung
aus Aceton (3) und HMG-CoA-Reduktase-Hemmer,
erhalten durch die Kristallisierung aus Aceton und weiterer Umkristallisierung
aus Ethylacetat ( 4), klar ersichtlich. Gemäß dieser
unerwarteten Erkenntnis kann der letzte Schritt der vorliegenden
Erfindung mit kombinierter Kristallisierung aus wassermischbaren
oder wasserlöslichen,
organischen Lösungsmittel
und aus einem organischen Lösungsmittel,
das begrenzte Mischbarkeit oder gar Löslichkeit mit Wasser hat, nicht
in dem Verfahren für den
Erhalt von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern von großer Reinheit weggelassen werden.
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Die
kombinierte Kristallisierungsbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung
kann wie folgt durchgeführt
werden. Zunächst
werden die Kristalle von ungereinigten HMG-CoA-Reduktase-Hemmer in dem vorher erwähnten im
Wesentlichen (bevorzugt 100) wassermischbaren oder wasserlöslichen
organischen Lösungsmittel,
insbesondere Aceton oder niederer Alkohol, gelöst, und dann wird Wasser zugegeben,
um den HMG-CoA-Reduktase
Inhibitor kristallisieren oder präzipitieren zu lassen. Alternativ
wird der ungereinigte HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, der in dem im Wesentlichen wassermischbare
oder wasserlöslichen
organischen Lösungsmittel
gelöst
ist, zu Wasser gegeben, um kristallisiert oder präzipitiert
zu werden. Diese Vorgänge
können
mit dem gleichen oder einem anderen wassermischbaren oder wasserlöslichen,
organischen Lösungsmittel
falls notwendig wiederholt werden, z.B. ein- bis viermal, in Abhängigkeit
von der Reinheit des ungereinigten Ausgangsmaterials.
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Die
dadurch erhaltenen Kristalle werden dann in dem vorher erwähnten Lösungsmittel
mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser,
wie etwa Ethylacetat, in einer geeigneten Konzentration gelöst, welche
bevorzugt in dem Bereich von 10-35 g/l, am bevorzugtesten im Bereich von
15-25 g/l liegt. Nach der Entfernung von zwei Drittel bis drei Viertel
des Lösungsmittels
kristallisiert der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer.
Die Kristallisierung aus dem gleichen oder einem anderen organischen
Lösungsmittel
mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit oder in Wasser
kann, wenn notwendig, wiederholt werden, z.B. für ein bis dreimal, in Abhängigkeit
von der Reinheit des durch Kristallisation aus dem wassermischbaren
oder wasserlöslichen organischen
Lösungsmittel
erhaltenen Produkts. Der kristallisierte HMG-CoA-Reduktase-Hemmer wird dann filtriert
und getrocknet, um ein Produkt mit einer Reinheit von wenigsten
99,6 zu ergeben.
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Wie
bereits erwähnt
kann die Reihenfolge der Kristallisierungen umgedreht sein, d.h.
erst Durchführung
von Kristallisierung aus dem organischen Lösungsmittel mit begrenzter
Mischbarkeit oder Löslichkeit
mit bzw. in Wasser, und dann Durchführung von Kristallisierung
aus dem wassermischbaren oder wasserlöslichen organischen Lösungsmittel.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann zunächst die Durchführung von
Kristallisierung aus Ethylacetat als das organische Lösungsmittel
mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser
geeigneterweise direkt nach dem Ethylacetatextraktionsschritt durchgeführt werden,
oder optional, nach dem vorher beschriebenen Laktonisierungsschritt.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
sind Produkte mit einer Reinheit von wenigstens 99,6, sogar wenigstens
99,7 erhältlich.
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In
einer weiteren alternativen Ausführungsform
können
die verschiedenen Arten von Kristallisierungen nacheinander in einer
alternierenden Art und Weise durchgeführt werden.
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In
einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird das
vorher beschriebene Verfahren von kombinierten Kristallisierungsschritten aus
einem wassermischbaren oder wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel
und aus einem organischen Lösungsmittel
mit begrenzter Mischbarkeit oder Löslichkeit mit bzw. in Wasser
als ein letzter Feinstreinigungsschritt für ein Verfahren zur Isolierung
und/oder Reinigung von HMG-CoA-Reduktase-Hemmern eingesetzt. Demgemäß kann ein
derartiger letzter Feinstreinigungsschritt ebenfalls bei ungereinigten
Materialien von HMG-CoA-Reduktase Inhibitoren angewendet werden,
welche auf herkömmliche
Art und Weise erhalten wurden. Die folglich erhältliche Reinheit des HMG-CoA-Reduktase
Inhibitors ist wenigstens 99,6 und sogar wenigstens 99,7%.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist gut geeignet, wenn Lovastatin als der HMG-CoA-Reduktase-Hemmer
ausgewählt
wird. Demgemäss
wird in einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung das
vorher beschriebene Verfahren für
die Isolierung und/oder Reinigung von Lovastatin verwendet.
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Die
im Wesentlichen reinen HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, erhalten durch
das erfindungsgemäße Verfahren,
wie etwa Lovastatin, Mevastatin, Pravastatin und Simvastatin, als
auch ihre Derivate und Analoga, können vorteilhaft für die Herstellung eines
Arzneimittels für
die Vorbeugung und/oder Behandlung von Krankheiten verwendet werden.
Die erhaltenen Hemmer und Arzneimittel sind insbesondere verwendbar
als Medikamente oder vorbeugende Mittel für die Reduzierung des Risikos
eines Schlaganfalls, einer transitorischen ischämischen Attacke, Arteriosklerose
und eines myokardialen Infarkts.
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Die
folgenden Beispiel veranschaulichen das erfindungsgemäße Verfahren
und sind nicht als begrenzend für
die Erfindung auszulegen, die in den hieran angefügten Ansprüchen festgelegt
ist.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Ein
Fermentationsmedium (160 l) mit einer Konzentration an Lovastatin
von 1 g/l, erhalten durch Fermentation mit Aspergillus terreus ATCC
20542 wurde in ein Gefäß (400 l)
gegeben und auf pH 10 mit 1M wässriger
Natriumhydroxidlösung
eingestellt. Nach 10 Minuten intensiven Rühren bei Raumtemperatur wurde
das Medium auf pH 9 mit 1 M Schwefelsäurelösung eingestellt und die Biomasse
abfiltriert. Das Filtrat wurde dann mit 1 M Schwefelsäurelösung auf
pH 6,5 angesäuert.
160 l Ethylacetat wurden zu dem Filtrat gegeben und die erhaltene
Mischung wurde für
20 min gerührt.
Die wässrigen
und die Ethylacetatphasen wurden durch Extraktionszentrifugation getrennt.
Der Ethylacetatextrakt wurde in einem Rotationsverdampfer auf ein
Volumen von 14 l konzentriert. Die Konzentration an Lovastatin in
der freien Säureform
in dem Ethylacetatkonzentrat war 10 g/l.
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Das
Ethylacetatkonzentrat (14 l) wurde dann in einen Reaktor (40 l)
gegeben und laktonisiert. Die Laktonisierung wurde durch eine katalytische
Menge an TFA (0,5 ml TFA/1 l Konzentrat) initiiert. Der Laktonisierungsvorgang
dauerte zwei Stunden bei 40° C. Das
Konzentrat wurde nach der Laktonisierung zweimal mit 14 l wässrige 5%iger
Ammoniumhydrogencarbonatlösung
gewaschen. Die wässrige
Phase wurde abgelassen, die organische Phase wurde weiterhin in
einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit konzentriert. Das
resultierende ölige
Produkt (1,5 l) enthielt 133 g Lovastatin.
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Das
erhaltene ölige
Produkt (161 ml) wurde in 80 ml Acetonitril gelöst und auf eine Chromatographiesäule (80
cm, 3,6 cm) gefüllt
mit XAD-16 (XAD-16 ist ein kommerzielles Produkt der Firma Rohm & Haas, 20-50 mesh).
Die Säule
wurde zunächst
mit 40:60 Acetonitril/Wasser (pH 3, eingestellt durch Chlorwasserstoffsäure) bei
einer Geschwindigkeit von 75 ml/min eluiert. Die Elution wurde durch
einen UV-Detektor (236 nm) überwacht,
und nachdem der erste Tropfen eine Extinktion aufwies, wurde die Elution
der Säule
mit 55:45 Acetonitril Wasser (pH 3, eingestellt durch Chlorwasserstoffsäure) begonnen. Die
Hauptfraktion wurde gesammelt und nach dem Abfall der Extinktion
wurde die Säule
mit 80:20 Acetonitril/Wasser (pH 3, eingestellt durch Chlorwasserstoffsäure) gewaschen.
Das Acetonitril wurde aus der Hauptfraktion durch Rotationsverdampfung
(50° C, 150
mbar) entfernt, und die resultierenden Kristalle wurden abfiltriert.
Die Masse der Kristalle war 24,5 g und der Gehalt an Lovastatin
war 50% Gewicht/Gewicht (w/w). Die HPLC-Reinheit war 92,5%.
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Die
resultierenden Kristalle (24 g) wurden in 350 ml Aceton gelöst und 700
ml Wasser wurden unter kontinuierlichem Rühren zugegeben. Die Mischung
wurde auf 4° C
für 30
Minuten gestellt. Die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert und
im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Die Masse der Kristalle
war 12,7 g mit einem Anteil von 90% w/w Lovastatin. Die HPLC-Reinheit war 98,8.
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Die
Kristallisierung aus Aceton wurde unter der gleichen Bedingung wiederholt
und 11,3 g Kristalle mit 97% w/w Lovastatin wurden erhalten. Die HPLC-Reinheit
war 99,4.
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Die
nach der zweiten Kristallisierung aus Aceton erhaltenen Kristalle
(11,3 g) wurden in 700 ml Ethylacetat gelöst und das Ethylacetat wurde
im Vakuum zu einer Konzentration an Lovastatin von 70 g/l verdampft.
Das Konzentrat wurde für
eine Stunde auf 8° C
gestellt. Die resultierenden Kristalle an Lovastatin wurden abfiltriert
und im Vakuum getrocknet. Die Masse der Kristalle war 9,4 g mit
einem Anteil an Lovastatin von 99,6% w/w. Die HPLC-Reinheit war 99,7.
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Beispiel 2
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Lovastatinkristalle
(3 g), isoliert nach der XAD-Adsorptionschromatographie,
wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in 170 ml Ethylacetat gelöst. Das
Ethylacetat wurde im Vakuum (200 mbar) bei 50° C auf 35 ml eingedampft. Das
Konzentrat wurde für eine
Stunde auf 10° C
gestellt. Die resultierenden Kristalle an Lovastatin wurden abfiltriert
und dann im Vakuum getrocknet. Die Masse der Kristalle war 2,1 g
mit einem Anteil an Lovastatin von 96% w/w. Die HPLC-Reinheit war
99,0%.
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Die
erhaltenen Kristalle (2,1 g) wurden in 50 ml Aceton gelöst und 85
ml Wasser wurde zugegeben. Die Mischung wurde dann für 30 Minuten
auf 10° C
gestellt und die Kristalle wurden abfiltriert und im Vakuum bei
40° C getrocknet.
Die Masse der resultierenden Kristalle war 1,9 g mit 99% w/w Lovastatin.
Die HPLC-Reinheit war 99,8%.
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Beispiel 3
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Ein
Fermentationsmedium (30 l in einem 50 l-Fermentor), das Pravastatin
enthält
(690 g pro kg Fermentationsmedium; die HPLC-Reinheit von Pravastatin
war 48,70 wurde filtriert und das resultierende Myzel mit Wasser
gewaschen. Das Filtrat (51 1) wurde auf pH 5,0 mit 10% wässriger
Lösung
Phosphorsäure
angesäuert.
Der Wirkstoff (Pravastatin) wurde dann in einer Extraktionssäule aus
dem Filtrat in 70 l Ethylacetat extrahiert. Die Wasserphase (50
l) mit weniger als 2 g Pravastatin und mit dem Hauptteil der Verunreinigungen
wurde abgelassen. Die Ethylacetatphase wurde auf 800 ml eingedampft
und weiterhin in dem Isolationsverfahren verwendet. Die HPLC-Reinheit an Pravastatin
in dem Ethylacetatextrakt war 70,3. Für die weitere Isolierung wurde
das ölige
Produkt einer Adsorptionschromatographie und kombinierten Kristallisierungsschritten
in Übereinstimmung
mit Beispiel 1 unterzogen.
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Beispiel 4
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Ein
ungereinigtes Simvastatin (2,3 g) in Laktonform wurde in Aceton
(7 ml) gelöst
und 15 ml Wasser wurde zugegeben. Das Ergebnis war ein öliges Produkt,
das in den nächsten
10 Minuten kristallisierte. Die erhaltenen Kristalle wurden dann
filtriert, mit Wasser gewaschen und bei 40° C für 60 min getrocknet. Die erhaltenen
Kristalle (2,2 g) mit einer HPLC-Reinheit
von 99,51 wurden dann in Ethylacetat (8 ml) gelöst. Die resultierende Lösung wurde
auf 4 ml konzentriert und Simvastatin wurde für 60 min bei 8° C kristallisieren
gelassen. Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser gewaschen.
Die Kristalle wurden dann bei 40° C
für 60
min getrocknet. Die Reinheit des resultierenden Simvastatin (1,7
g) war 99,73%.
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Beispiel 5
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Ein
ungereinigtes Mevastatin (2,0 g) in Laktonform mit einer HPLC-Reinheit
von 98,5 wurde in Aceton (7 ml) gelöst und 20 ml Wasser wurde zugegeben.
Das Resultat war ein öliges
Produkt, das in den nächsten
10 min kristallisierte. Die erhaltenen Kristalle wurden dann filtriert,
mit Wasser gewaschen und bei 40° C
für 60
min getrocknet. Die resultierenden Kristalle (1,8 g) mit einer HPLC-Reinheit
von 99,33 wurden in Ethylacetat (8 ml) gelöst. Die resultierende Lösung wurde
auf 4 ml konzentriert und das Mevastatin wurde für 60 min bei 8° C kristallisieren gelassen.
Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Die Kristalle
wurden dann bei 40° C
für 60
min getrocknet. Die Reinheit des resultierenden Mevastatin (1,3
g) war 99,72.