CZ297093B6 - Zpusob izolace a cistení inhibitoru HMG-CoA reduktasy - Google Patents

Zpusob izolace a cistení inhibitoru HMG-CoA reduktasy Download PDF

Info

Publication number
CZ297093B6
CZ297093B6 CZ20002856A CZ20002856A CZ297093B6 CZ 297093 B6 CZ297093 B6 CZ 297093B6 CZ 20002856 A CZ20002856 A CZ 20002856A CZ 20002856 A CZ20002856 A CZ 20002856A CZ 297093 B6 CZ297093 B6 CZ 297093B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hmg
water
coa reductase
reductase inhibitor
crystallization
Prior art date
Application number
CZ20002856A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20002856A3 (cs
Inventor
Pflaum@Zlatko
Milivojevic@Dusan
Senica@David
Original Assignee
Lek Pharmaceutical And Chemical Company D. D.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20432203&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ297093(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lek Pharmaceutical And Chemical Company D. D. filed Critical Lek Pharmaceutical And Chemical Company D. D.
Publication of CZ20002856A3 publication Critical patent/CZ20002856A3/cs
Publication of CZ297093B6 publication Critical patent/CZ297093B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42Hydroxy-carboxylic acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06Antihyperlipidemics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12Antihypertensives
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07DHETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/16Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D309/28Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/30Oxygen atoms, e.g. delta-lactones
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62Carboxylic acid esters

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

Je popsán zpusob izolace a cistení inhibitoru HMG-CoA reduktasy z myceliové biomasy, který obsahuje: vycirení myceliového kultivacního média a koncentrování vycireného média na mensí objem; okyseleníkoncentrátu na pH v rozmezí 4,5 az 7,5, po kterémnásleduje extrakce inhibitoru HMG-CoA reduktasy ethylacetátem; krystalizaci inhibitoru HMG-CoA reduktasy z organického rozpoustedla rozpustného ve vode nebo mísitelného s vodou; a krystalizaci inhibitoru HMG-CoA reduktasy z organického rozpoustedla majícího omezenou rozpustnost nebo mísitelnost s vodou. Stupne krystalizace se mohou provádet také vopacném poradí. Postup vyuzívající kombinování specifických stupnu krystalizace muze být také pouzit pro precistení surových inhibitoru HMG-CoA reduktasy.

Description

Oblast techniky
Vynález popisuje způsob izolace a čištění inhibitorů HMG-CoA reduktasy z myceliové biomasy.
Dosavadní stav techniky
Lovastatin, pravastatin, mevastatin, simvastatin, jejich deriváty a analogy jsou známé jako inhibitory HMG-CoA reduktasy a jsou používané jako antihypercholesterolemická činidla. Jsou vyráběny fermentací za použití mikroorganismů různých druhů, jako jsou druhy náležící do rodu Aspergillus, Monascus, Nocardia, Amycolatopsis, Mucor nebo Penicillinum.
________Čistota aktivní složky je významným faktorem při výrobě bezpečných a účinných farmaccutic-_________________ kých činidel. Nejvyšší možná čistota výrobku je zejména významná v případech, kdy má být lék užíván dlouhodobě, jak je tomu v případě léčby nebo prevence vysokých plasmatických koncentrací cholesterolu. Akumulace nečistot z farmaceutických prostředků nízké čistoty může způsobit mnoho vedlejších účinků během léčby.
Způsoby izolace a přečištění antihypercholesterolemických činidel popsané ve dřívějších patentových přihláškách obsahují různé kombinace metod extrakce, chromatografíe, laktonizace a kiystalizace. Čistota konečného materiálu získaného těmito postupy je nižší než 99,6 %. Získá25 ní materiálů vyšší čistoty je za použití těchto metod možné, ale výtěžek požadovaného produktu je potom nepřijatelně nízký pro použití těchto metod v průmyslové výrobě.
Postup izolace popsaný v patentové přihlášce WO 92/16276 umožňuje získání roztoku pro přípravu inhibitorů HMG-CoA reduktasy v čistotě vyšší než 99,5 %, ale tento postup vyžaduje 30 použití značně složitého vybavení pro průmyslovou vysoce-výkonnou kapalinovou chromatografíi (HPLC). Podle WO 92/16276 je surový inhibitor HMG-CoA reduktasy o čistotě přibližně 85 % nebo vyšší, rozpuštěn v organickém rozpouštědlu nebo v roztoku organického rozpouštědla a vody. Směs se potom pufruje na pH 2 až 9 a vnese se do HPLC kolony. Po odběru vybraného píku představujícího inhibitor HMG-CoA reduktasy se část rozpouštědla odstraní a přidá se 35 voda, nebo se - alternativně - odstraní 2/3 směsi rozpouštědel za krystalizace inhibitoru HMGCoA reduktasy. Na konci procesu je čistota získaného materiálu skutečně alespoň 99,5 %, za výtěžku přibližně 90 %.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká nového průmyslového způsobu izolace a čištění inhibitorů HMGCoA reduktasy čistoty vyšší než” 99,6 %, výhodně vyšší než 99,7%, z fermentáčňího média. Pro dosažení tohoto cíle bylo provedeno intenzivní studium chemických sloučenin produkova45 ných během fermentace za použití mikroorganismů různých druhů, jako jsou druhy náležící do rodu Aspergillus, Monascus, Nocardia, Amycolatopsis, Mucor nebo Penicillinum, jejich chemických vlastností a jejich chování v různých rozpouštědlech při různém pH. Tak byl výše uvedený předmět vyřešen způsobem podle předkládaného vynálezu, který obsahuje následující stupně:
- vyčiření myceliového kultivačního média a koncentrování vyčiřeného média na menší objem;
- okyselení koncentrátu na pH v rozmezí 4,5-7,5, po kterém následuje extrakce inhibitoru HMG-CoA reduktasy ethylacetatem;
- 1 CZ 297093 B6
- volitelně provedení laktonizace;
- provedení krystalizace inhibitoru HMG-CoA reduktasy z organického rozpouštědla rozpustného ve vodě nebo mísitelného s vodou; a
- provedení krystalizace inhibitoru HMG-CoA reduktasy z organického rozpouštědla mající- í ho omezenou rozpustnost nebo mísitelnost s vodou.
o Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje závislost distribučního koeficientu inhibitoru HMG-CoA reduktasy (lovastatinu) a nečistot (v příslušném pořadí) na pH, ve stupni extrakce ethylacetátem; a
Obr. 2, 3 a 4 ukazují HPLC diagramy vzorků inhibitorů HMG-CoA reduktasy po extrakci ethyl________________________acetátem ve formě surových sloučenin, po krystalizaci z organického rozpouštědla mísitelného s vodou nebo rozpustného ve vodě, a po další krystalizaci z organického rozpouštědla majícího omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě, v příslušném pořadí.
j Podrobný popis vynálezu
F Protože inhibitory HMG-CoA reduktasy jsou obvykle jak intra-, tak extracelulámí produkty, je '? výhodné, ale nikoliv nezbytné, jejich rozpuštění zmycelia do fermentační kapaliny. Způsob použití pro rozpuštění popsaný v patentové přihlášce WO 97/20834 obsahuje zpracování fermentační kapaliny, s alkalickou bází pro dosažení pH 11,5 a míšení po dobu 3 hodin. WO 97/06128 popisuje, že rozpouštění může být provedeno alkalizací fermentační kapaliny na pH 10 až 13. Také se použije teploty mezi 60 až 95 °C. Inhibitory HMG-CoA reduktasy mohou být velmi účinně rozpouštěny z mycelia při pH vyšším než 9, ale dlouhodobá expozice takovýmto rigoróz30 ním podmínkám způsobuje degradaci esterové vazby mezi hydroxylovou skupinou na naftaleno5 vém skeletu a karboxylovou kyselinou. Rovnováha mezi inhibitory HMG-CoA reduktasy ( a deacylovanými inhibitory HMG-CoA reduktasy se za přísnějších podmínek posouvá směrem
Ě· k deacylovaným produktům. Neočekávaně jsme zjistili, že účinnost rozpouštění provedeného při teplotě v rozmezí od 10 do 40 °C, výhodně v rozmezí od 18 do 25 °C, jako je například teplota 35 okolí, po dobu méně než jedné hodiny, lépe méně než půl hodiny, například přibližně 10 minut, při pH mezi 9,5 a 13, nejlépe mezi 9,5 a 11,5, je stejná jako účinnost dosažená za použití méně ekonomických a časově náročnějších metod provedených při vyšších teplotách popsaných v předešlých patentových přihláškách. Rozpouštění může být také provedeno při pH nižším než 9,5 t a zejména nižším než 6, ale v tomto případě je nutné použití ohromného množství organických ý 40 rozpouštědel.
Pokud je prováděno toto výhodné rozpouštění inhibitoru HMG-CoA reduktasy, tak je fermentační kapalina potom zpracována acidifíkačním činidlem, obvykle anorganickou kyselinou, pro úpravu hodnoty pH nebo 7,5 než 8,5. Vhodnými anorganickými kyselinami jsou kyselina fosfo45 řečná, sírová a chlorovodíková. Inhibitory HMG-CoA reduktasy jsou stabilní v tomto rozmezí pH a fermentační kapalina může být po tomto stupni také po určitou dobu skladována, pokud je to vhodné nebo žádoucí.
. Mycelium je odstraněno z fermentační kapaliny za použití vhodných separačních kroků, jako je filtrace a/nebo centrifugace. Filtrace je výhodnější a může být použita filtrační technika vybraná f vedle klasické filtrace, také mikro-, ultra- a diafiltrace se může vhodně použít. Vyčiřená kapalina [ se potom koncentruje na menší objem, nejlépe pět až deset-krát, za použití reversní osmosy nebo jiné techniky pro zmenšení objemu.
-2CZ 297093 B6
Stupně acidifíkace extrakce ethylacetátem popsané dále jsou významnými stupni procesu přečištění.
Uvedený koncentrát je okyselen acidifikačním činidlem, výhodně anorganickou kyselinou, na pH 5 v rozmezí od 4,5 do 7,5. Mohou být použity organické kyseliny, které již byly uvedeny výše.
Potom je inhibitor HMG-CoA reduktasy extrahován z uvedeného koncentrátu s upraveným pH za použití ethylacetátu. Extrakce je výhodně provedena za použití extrakční kolony s protiproudým tokem. Poměr mezi distribučními koeficienty inhibitorů HMG-CoA reduktasy a nečistot rozpustných v ethylacetátu je nej vyšší při pH v rozmezí od 5,5 do 7,5 a zejména při pH v rozmezí 10 od 6,0 do 7,0 a část polárních nečistot je odstraněna již v tomto stupni. Extrakce provedená při pH nižším než 5,0, zejména nižším než 4,0, je účinnější, z důvodu vyššího distribučního koeficientu inhibitorů HMG-CoA reduktasy, ale vede k vyšší koncentraci polárních nečistot. Distribuční koeficienty nečistot rozpustných v ethylacetátu jsou také vyšší při této hodnotě pH, jak je uveden na obr. 1. Extrakce do ethylacetátu provedená při pH v rozmezí od 4,5 do 7,5, zejména 15 při pH vyšším než 5,0, ještě lépe vyšším než 5,5, vede k dosažení nižší úrovně polárních nečistot, _______z důvodu jejich nižších distribučních koeficientů. Horší distribuce inhibitorů HMG-CoA reduktasy z koncentrátu do ethylacetátu při této hodnotě pH může být vyvážena delší extrakční kolonou s protiproudým tokem.
Pokud je to žádoucí, tak je získaný ethylacetátový extrakt potom koncentrován a inhibitor HMGCoA reduktasy je popřípadě v tomto stupni laktonizován. Při pH mezi 5,5 a 7,5 je většina inhibitorů HMG-CoA reduktasy ve formě volné kyseliny. Proto může být koncentrování a laktonizace vynecháno, pokud není inhibitor HMG-CoA reduktasy použit ve farmaceutickém prostředku ve formě laktonu. Laktonizace je výhodně provedena kontaktováním inhibitoru HMG-CoA redukta25 sy s katalytickým množstvím anorganické nebo organické kyseliny, nejlépe s kyselinou trifluoroctovou (TFA). Inhibitor HMG-CoA reduktasy, který je volitelně laktonizován, může být přímo krystalizován z ethylacetátu, jak bude popsáno dále. Alternativně může být ethylacetát odstraněn, výhodně odpařením, a tak se získá surový inhibitor HMG-CoA reduktasy, který je popřípadě laktonizován.
Takto získaný surový inhibitor HMG-CoA reduktasy může být potom popřípadě zpracován adsorpční chromatografií, výhodně chromatografií s reversní fází. Jako mobilní fáze pro adsorpční chromatografií může být použit acetonitril nebo nižší alkohol, jako je methanol, ethanol nebo propanol. Výhodně je surový inhibitor HMG-CoA reduktasy rozpuštěn v čistém acetonitrilu 35 nebo ve směsi acetonitrilu/vody s alespoň 30 % (obj./obj.) acetonitrilu, a získaný roztok se vnese do kolony pro adsorpční chromatografií. Kolona obsahuje stacionární fáze založené na oktylsilanu, dimethylsilanu, oktadecylsilanu, kyan-silanu, polystyrendivinylbenzenkopolymeru nebo akrylovém kopolymerů. Mohou být použity také další obvyklé materiály pro stacionární fázi, jako je například oxid křemičitý, alumina a podobně. Adsorbované sloučeniny jsou eluovány 40 vhodnou mobilní fází, jako je například gradient acetonitril/voda. Vybraný pík inhibitoru HMGCoA reduktasy je odebrán a rozpouštědlo mobilní fáze je odstraněno za krystalizace inhibitoru HMG-CoA reduktasy. Čistota krystalizovaných surových inhibitorů HMG-CoA reduktasy je mezi 80 % a 92 % a závisí na profilu nečistot ve fermentační kapalině. Volitelně může být adsorpční chromatografie nahrazeny normální chromatografií, rychlou chromatografií, průmyslo45 vou HPLC nebo metodami extrakce nebo krystalizace.
Kombinovaná krystalizace, která je typická pro předkládaný vynález, bude podrobněji popsána dále. Přesněji, tato krystalizace obsahuje krystalizaci inhibitoru HMG-CoA reduktasy z organického rozpouštědla mísitelného s vodou nebo rozpustného ve vodě, a krystalizaci inhibitoru 50 HMG-CoA reduktasy z organického rozpouštědla majícího omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě. Pořadí obou kroků krystalizace může být opačné. Vlastnosti organického rozpouštědla, které je buď mísitelné s vodou, nebo rozpustné ve vodě, nebo které má omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě, jsou známé v oboru a jsou popsány například v„Ullmann's Encyclopedia od Industrial Chemistry“, svazek A24, 5. vydání (1993), str. 43755 505, která je zde uvedena jako odkaz. V předkládaném vynálezu označuje termín „mísitelný
-3CZ 297093 B6 s vodou nebo rozpustný ve vodě“ organická rozpouštědla, která mají v podstatě neomezeno, výhodně 100% mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě, a termín „mající omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě“ zahrnuje také organická rozpouštědla nemísitelná s vodou a nerozpustná ve vodě. Dále, technika krystalizace podle předkládaného vynálezu také zahrnuje srážení.
Příklady organických rozpouštědel v podstatě mísitelných s vodou nebo rozpustných ve vodě zahrnují nižší alkylalkoholy, jako je methanol, ethanol, propanol a isopropylalkohol; nižší alkylketony, jako je aceton a methylethylketon; nižší alkylglykolethery, jako je methylglykol, ethylglykol, propylglykol a ethyldiglykol; a dipolámí aprotická rozpouštědla, jako je N,N-dimethylformamid (DMF), Ν,Ν-dimethylacetamid (DMA) a dimethylsulfoxid (DMSO), včetně směsí takových rozpouštědel. Jako zejména vhodné příklady organických rozpouštědel mísitelných s vodou jsou uvedeny aceton a nižší alkylalkoholy. Příklady organických rozpouštědel majících omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě zahrnují: vyšší alkylalkoholy jako je butanol, isobutanol amylalkohol, hexanol, 2-ethylhexanol, benzylalkohol a cyklohexanol, vyšší alkylketony jako je methylbutylketon, methyl i sobutylketon a cyklohexanon, estery jako je methylacetat, ethylacetát, n-propyl (a isopropyl) acetat, n-butyl (a iso-butyl nebo sekundární butyl) acetát a amylacetát, ethery jako je diethylether a diisopropylether, chlorované uhlovodíky, jak je methylenchlorid a chloroform, acetonitril a podobně, včetně směsí takových rozpouštědel. Zejména výhodným rozpouštědlem majícím omezeno mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě je ethylacetát.
Neočekávaně jsme zjistili, že krystalizace inhibitoru HMG-CaO reduktasy z organického rozpouštědla mísitelného s vodou jako je aceton nebo nižší alkylalkohol, po které následuje další rekrystalizace ze stejného rozpouštědla, může odstranit pouze malou část nepolárních a větší část polárních nečistot, a že krystalizace z organického rozpouštědla majícího omezenou rozpustnost ve vodě nebo mísitelnost s vodou, jako v ethylacetát, po které následuje další rekrystalizace ze stejného rozpouštědla, odstraní pouze většinu nepolárních nečistot. Poslední skutečnost je zřejmá z PLC diagramů surového inhibitoru HMG-CoA reduktasy (obr. 2), inhibitoru HMG-CoA reduktasy po krystalizaci z acetonu (obr. 3) a inhibitoru HMG-CoA reduktasy získaného krystalizací z acetonu a další rekrystalizací z ethylacetátu (obr. 4). Podle tohoto neočekávaného zjištění tedy poslední stupeň podle předkládaného vynálezu, obsahující kombinovanou krystalizaci z organického rozpouštědla mísitelného s vodou nebo rozpustného ve vodě a z organického rozpouštědla majícího omezenou rozpustnost ve vodě nebo mísitelnost s vodou, nemůže být vynechán ve způsobu získání inhibitoru HMG-CoA reduktasy o vysoké čistotě.
Kombinovaná krystalizace podle předkládaného vynálezu může být provedena následujícím způsobem. Nejprve se krystaly surového inhibitoru HMG-CoA reduktasy rozpustí ve výše uvedeném organickém rozpouštědle v podstatě (nejlépe 100%) mísitelném s vodou nebo rozpustném ve vodě, konkrétně v acetonu nebo nižším alkoholu, a potom se přidá voda pro zahájení krystalizace nebo srážení inhibitoru HMG-CoA reduktasy. Alternativně se surový inhibitor HMG-CoA reduktasy rozpuštěný v organickém rozpouštědle v podstatě mísitelném s vodou nebo rozpustném ve vodě přidá do vody pro zahájení krystalizace nebo srážení. Tyto postupy mohou být opakovány se stejným nebo s jiným organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou nebo rozpustným ve vodě, pokud je tó nutné, například jednou až čtyřikrát, podle čistoty výchozího surového materiálu.
Krystaly takto získané se potom rozpustí ve výše uvedeném rozpouštědle majícím omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě, jako je ethylacetát, ve vhodné koncentraci, která výhodně leží v rozmezí od 10 do 35 g/1, lépe v rozmezí od 15 do 25g/l. Po odstranění jedné třetiny až tří čtvrtin rozpouštědla inhibitor HMG-CoA reduktasy krystalizuje. Krystalizace ze stejného nebo jiného organického rozpouštědla majícího omezenou rozpustnost ve vodě nebo mísitelnost s vodou může být opakována, pokud je to nutné, například jednou až třikrát, podle čistoty materiálu získaného krystalizaci z organického rozpouštědla mísitelného s vodou nebo rozpustné
-4CZ 297093 B6 ho ve vodě. Krystalizovaný inhibitor HMG-CoA reduktasy se potom filtruje a suší se za zisku produktu o čistotě alespoň 99,6 %.
Jak bylo uvedeno výše, pořadí krystalizace může být opačné, tj. nejprve může být provedena 5 krystalizace z organického rozpouštědla majícího omezenou rozpustnost ve vodě nebo mísitelnost s vodou a potom může být provedena krystalizace z organického rozpouštědla mísitelného s vodou nebo rozpustného ve vodě. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu se nejprve provede krystalizace z ethylacetátu jako organického rozpouštědla majícího omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě, výhodně hned po stupni extrakce ethylacetátem, nebo 10 volitelně, po stupni laktonizace popsaném výše.
Při použití způsobu podle předkládaného vynálezu je možno získat materiály o čistotě alespoň 99,6 %, dokonce i o čistotě 99,7 %.
V dalším alternativním provedení mohou být různé typy krystalizace provedeny opakovaně střídavě.
V jiném aspektu předkládaného vynálezu jsou popsané způsoby kombinované krystalizace z organického rozpouštědla mísitelného s vodou nebo rozpustného ve vodě a z organického roz20 pouštědla majícího omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě, použity jako koneč? ný přečišťovací stupeň jakéhokoliv postupu pro izolaci a/nebo čištění inhibitorů HMG-CoA reduktasy. Takový konečný přečišťovací krok může být také aplikován na surové materiály inhiI bitoru HMG-CoA reduktasy, které byly získány běžnými způsoby. Takto je možno získat inhibi‘ tory HMG-CoA reduktasy o čistotě alespoň 99,6 %, dokonce i o čistotě 99,7 %.
Způsob podle předkládaného vynálezu je zejména výhodný tehdy, je-li jako inhibitor HMG-CoA reduktasy vybrán lovastatin. V dalším aspektu vynálezu je způsob popsaný výše použit pro izolaci a/nebo přečištění lovastatinu.
V podstatě čisté inhibitory HMG-CoA reduktasy získané způsobem podle předkládaného vynálezu, jako je lovastatin, mevastatin, prevastatin a simvastatin, stejně jako jejich deriváty a analogy, f mohou být výhodně použity pro přípravu farmaceutických činidel pro prevenci a/nebo léčbu j onemocnění. Získaní inhibitory a farmaceutické prostředky jsou zejména vhodné jako léky nebo j činidla vhodná pro prevenci mrtvice, ischemických kardiálních obtíží, atherosklerosy a infarktu myokardu.
Následující příklady ilustrují způsob podle předkládaného vynálezu, ale nijak neomezují předkládaný vynález, jak je definován v připojených patentových nárocích.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Fermentační kapalina (1601) s koncentrací lovastatinu 1 g/1 získaná fermentací sAspergillus terreus ATCC 20542 se umístí do nádoby (400 1) a pH se upraví na pH 10 pomocí 1 M vodného roztoku hydroxidu sodného. Po 10 minutách intenzivního míšení při teplotě okolí se pH kapaliny upraví na pH 9 pomocí 1 M roztoku kyseliny sírové a biomasa se odfiltruje. Filtrát se potom 50 okyselí 1 M roztokem kyseliny sírové na pH 6,5. K filtrátu se přidá 160 1 ethylacetátu a získaná směs se mísí po dobu 20 minut. Vodná a ethylacetátová fáze se separují extrakčním odstředěním. Ethylacetátový extrakt se koncentruje na rotační odparce na objem 14 1. Koncentrace lovastatinu ve formě volné kyseliny v ethylacetátovém koncentrátu dosahuje 10 g/1.
Ethylacetátový koncentrát (141) se potom umístí do reakční nádoby (401) a laktonizuje se. Laktonizace se iniciuje katalytickým množstvím TFA (0,5 ml TFA/1 1 koncentrátu). Laktonizační procedura trvá 2 hodiny při 40 °C. Koncentrát se po laktonizaci promyje dvakrát 14 1 5% vodného roztoku hydrogenuhličitanu amonného. Vodná fáze se odstraní a organická fáze se dále koncentruje do sucha na rotační odparce. Získá se olejový materiál (1,5 1) obsahující 133 g lovastatinu.
Získaný olejový materiál (161 ml) se rozpustí v 80 ml acetonitrilu a vnese se do chromatografické kolony (80 cm, 3,6 cm) naplněné XAD-16 (XAD-16 je komerční název společnosti Rohm and Hass, 20-50 mesh). Kolona se eluuje nejprve acetonitrilem: vodou 40:60 (pH 3, upravené kyselinou chlorovodíkovou), při rychlosti 75 ml/min. Eluce se monitoruje UV detektorem (236 nm) a po prvním poklesu adsorpce se zahájí eluce kolony acetonitrilem: vodou 55:45 (pH 3, upravené kyselinou chlorovodíkovou). Hlavní frakce se odebere a po poklesu absorpce se kolona promyje acetonitrilem: vodou 80:20 (pH 3, upravené kyselinou chlorovodíkovou). Acetonitril se odstraní z hlavní frakce pomocí rotační odparky (50 °C, 150 mbar) a vzniklé krystaly se odfiltrují. Hmotnost získaných krystalů je 24,5 g a obsah lovastatinuje 50% (hmotn./hmotn). HPLC čistota je 92,5 %.
Získané krystaly (24 g) se rozpustí ve 350 ml acetonu a za stálého míšení se přidá 700 ml vody. Směs se na 30 minut umístí do prostředí o teplotě 4 °C. Vzniklé krystaly se odfiltrují a suší se ve vakuu při teplotě okolí. Hmotnost získaných krystalů je 12,7 g a obsah lovastatinu je 90 % (hmotn./hmotn). HPLC čistota je 98,8 %. Krystalizace z acetonu se opakuje za stejných podmínek a získá se 11,3 g krystalů s 97 % (hmotn./hmotn.) lovastatinu. HPLC čistota je 99,4 %.
Krystaly (11,3 g) získané po druhé krystalizaci z acetonu se rozpustí v 700 ml ethylacetátu a ethylacetátu se odpaří ve vakuu za dosažení koncentrace lovastatinu 70 g/1. Koncentrát se na jednu hodinu umístí do prostředí s teplotou 8 °C. Vzniklé krystaly lovastatinu se odfiltrují a potom se suší ve vakuu. Hmotnost získaných krystalů je 9,4 g a obsah lovastatinu je 99,6 % (hmotn./hmotn.). HPLC čistota je 99,7 %.
Příklad 2
Krystaly lovastatinu (3 g), izolované po XAD-adsorpční chromatografií, jak je popsána v příkladu 1, se rozpustí ve 170 ml ethylacetátu. Ethylacetát se odpaří ve vakuu (200 mbar) při 50 °C na objem 35 ml). Koncentrát se umístí na dobu jedné hodiny do prostředí o teplotě 10 °C. Vzniklé krystaly lovastatinu se odfiltrují a potom se suší ve vakuu. Hmotnost získaných krystalů je 2,1 g a obsah lovastatinu je 96 % (hmotn./hmotn.). HPLC čistota je 99,0 %.
Získané krystaly (2,1 g) se rozpustí v 50 ml acetonu a přidá se 85 ml vody. Směs se umístí na dobu 30 minut do prostředí o teplotě 10 °C a krystaly se odfiltrují a ve vakuu při 40 °C. Hmotnost získaných krystaly je 1,9 g a obsah lovastatinu je 99 % (hmotn./hmotn.). HPLC čistota je 99,8 %.
Příklad 3
Fermentační kapalina (30 ml v 50 1 fermentačním tanku) obsahující pravastatin (690 g na kg fermentační kapaliny, HPLC čistota pravastatinu 48,7 %) se přefiltruje a výsledné mycelium se promyje vodou. Filtrát (511) se okyselí na pH 5,0 pomocí 10% vodného roztoku kyseliny fosforečné. Aktivní substance (pravastatin) se potom extrahuje v extrakční koloně z filtrátu do 70 1 ethylacetátu. Vodná fáze (50 1) obsahující méně než 2 g pravastatinu a hlavní část nečistot se vypustí. Ethylacetátová fáze se odpaří na 800 ml a použije se v dalším procesu izolace. HPLC čistota pravastatinu v methylacetátovém extraktu je 70,3 %.
-6CZ 297093 B6
Pro další izolaci se olejový materiál zpracuje adsorpční chromatografií a ve stupních kombinované krystalizace, jak byly popsány v příkladu 1.
Příklad 4
Surový simvastatin (2,3 g) ve formě laktonu se rozpustí v acetonu (7 ml) a přidá se 15 ml vody. Vznikne olejový materiál, který krystalizuje v dalších 10 minutách. Získané krystaly se odfiltrují, promyje se vodou a suší se při 40 °C po dobu 60 minut. Získané krystaly (2,2 g) s HPLC čistotou 10 99,51 % se potom rozpustí v ethylacetátu (8 ml). Získaný roztok se zahustí na 4 ml a simvastatin se nechá krystalizovat po dobu 60 minut při 8 °C. Vzniklý materiál se přefiltruje a promyje se vodou. Krystaly se potom suší při 40 °C po dobu 60 minut. Čistota získaného simvastatinu (1,7 g) je 99,73 %.
Příklad 5 _ _ __________________________ ______ ________ ________________
Surový mevastatin (2,0 g) ve formě laktonu s HPLC čistotou 98,5 % se rozpustí v acetonu (7 ml) a přidá se 20 ml vody. Vznikne olejový materiál, který krystalizuje v dalších 10 minutách. Získané krystaly se odfiltrují, promyjí se vodou a suší se při 40 °C po dobu 60 minut. Získané krystaly (1,8 g) sHPLC čistotou 99,33 % se potom rozpustí v ethylacetátu (8 ml). Získaný roztok se zahustí na 4 ml a mevastatin se nechá krystalizovat po dobu 60 minut při 8 °C. Vzniklý materiál se přefiltruje a promyje se vodou. Krystaly se potom suší při 40 °C po dobu 60 minut. Čistota získaného mevastatinu (1,3 g) je 99,72 %.

Claims (17)

1. Způsob čištění inhibitorů HMG-CoA reduktasy, vyznačující se tím, že inhibitor HMG-CoA reduktasy se zpracuje v krocích kombinované krystalizace, které zahrnují krystalizaci z organického rozpouštědla mísitelného s vodou nebo rozpustného ve vodě a krystalizaci
35 z organického rozpouštědla majícího omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě, jakožto konečné přečištění vedoucí k získání inhibitorů HMG-CoA reduktasy s čistotou vyšší než 99,6 %.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že získané inhibitory HMG-CoA 40 reduktasy mají čistotu vyšší než 99,7 %.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jako organické rozpouštědlo mísitelné s vodou nebo rozpustné ve vodě se použije aceton nebo nižší alkylalkohol.
45
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že krok krystalizace zahrnuje rozpuštění inhibitoru HMG-CoA reduktasy v acetonu a potom přidání vody do této směsi.
5. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že krok krystalizace z organického rozpouštědla majícího omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve
50 vodě zahrnuje rozpuštění inhibitoru HMG-CoA reduktasy v organickém rozpouštědle v koncentraci 10 až 35 g/1 a odstranění jedné třetiny až tří čtvrtin organického rozpouštědla.
6. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se jako organické rozpouštědlo mající omezenou mísitelnost s vodou nebo rozpustnost ve vodě použije ethyl-
55 acetát.
7. Způsob izolace a čištění inhibitorů HMG-CoA reduktasy zmyceliové biomasy, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
- výčiřeňí mýceliového kultivačního média a koncentrování vyčiřeného média na menší objem;
- okyselení koncentrátu na pH v rozmezí 4,5 až 7,5, po kterém následuje extrakce inhibitoru HMG-CoA reduktasy ethylacetátem;
- popřípadě provedení laktonizace; a
- čištění inhibitoru HMG-CoA reduktasy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že dále zahrnuje, před krokem vyčiřeňí mycelinového kultivačního média, kroky rozpouštění inhibitoru HMG-CoA reduktasy z myceliové biomasy při pH v rozmezí od 9,5 do 13 ve fermentační tekutině, a upravení pH kultivačního média na pH 7,5 až 8,5.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že krok rozpouštění se provádí při teplotě v rozmezí od 10 do 40 °C po dobu kratší než 1 hodina.
10. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 7 až 9, vyznačující se tím, že vyčiřeňí myceliového média se provádí odstraněním mycelií z média pomocí filtrace.
11. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 7 až 10, vyznačující se tím, že vyčiřeňí média se kontroluje pomocí reversní osmosy.
12. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 7 až 11,vyznačující se tím, že koncentrát se okyselí na pH v rozmezí od 5,5 do 7,5.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že koncentrát se okyselí na pH v rozmezí od 6,0 do 7,0.
14. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 7 až 13, vy z n a č u j í c í se tím, že inhibitor HMG-CoA reduktasy, který se extrahuje z ethylacetátu a který se popřípadě laktonizuje, se přečišťuje adsorpční chromatografií.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že jako mobilní fáze pro adsorpční chromatografii je použita směs acetonitrilu a vody.
16. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 7 až 15,vyznačující se tím, že pořadí kroků krystalizace je obracené.
17. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 7 až 16, vyznačující se tím, že inhibitor HMG-CoA reduktasy je lovastatin.
CZ20002856A 1998-02-18 1999-02-17 Zpusob izolace a cistení inhibitoru HMG-CoA reduktasy CZ297093B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SI9800046A SI9800046A (sl) 1998-02-18 1998-02-18 Postopek za pridobivanje inhibitorjev HMG-CoA reduktaze visoke čistosti

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20002856A3 CZ20002856A3 (cs) 2000-11-15
CZ297093B6 true CZ297093B6 (cs) 2006-09-13

Family

ID=20432203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002856A CZ297093B6 (cs) 1998-02-18 1999-02-17 Zpusob izolace a cistení inhibitoru HMG-CoA reduktasy

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6825015B1 (cs)
EP (1) EP1054993B1 (cs)
JP (2) JP2002504345A (cs)
KR (1) KR100582620B1 (cs)
CN (1) CN1206363C (cs)
AT (1) ATE296357T1 (cs)
AU (1) AU743619B2 (cs)
BG (1) BG64289B1 (cs)
CA (1) CA2321052A1 (cs)
CZ (1) CZ297093B6 (cs)
DE (1) DE69925459T2 (cs)
HR (1) HRP20000541A2 (cs)
HU (1) HUP0100820A3 (cs)
IL (1) IL137782A0 (cs)
PL (1) PL193510B1 (cs)
RO (1) RO120922B1 (cs)
RU (1) RU2235130C2 (cs)
SI (2) SI9800046A (cs)
SK (1) SK285074B6 (cs)
WO (1) WO1999042601A1 (cs)
YU (1) YU50100A (cs)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3881240B2 (ja) * 1999-11-30 2007-02-14 テバ ジョジセルジャール ザ−トケルエン ムケド レ−スベニュタ−ルシャシャ−グ 醗酵ブロスからスタチン化合物を回収するための方法
AU779306B2 (en) 1999-12-14 2005-01-13 Teva Gyogyszergyar Reszvenytarsasag Novel forms of pravastatin sodium
YU63602A (sh) * 2000-02-24 2006-01-16 Biogal Gyogyszergyar Rt. Postupak za prečišćavanje fermentacionog bujona
US6521762B2 (en) 2000-03-03 2003-02-18 BIOGAL Gyógyszergyar RT. Process for purifying lovastatin and simvastatin with reduced levels of dimeric impurities
IN192861B (cs) * 2000-06-30 2004-05-22 Ranbaxy Lab Ltd
US6936731B2 (en) * 2000-10-05 2005-08-30 TEVA Gyógyszergyár Részvénytársaság Pravastatin sodium substantially free of pravastatin lactone and epi-pravastatin, and compositions containing same
US6716615B2 (en) 2002-02-27 2004-04-06 Yung Shin Pharmaceutical Ind. Co., Ltd. Strains of saccharaothrix, process for producing pravastatin using the strains and isolation process of (HMG)-CoA reductase
US20080293750A1 (en) * 2002-10-17 2008-11-27 Anna Helgadottir Susceptibility Gene for Myocardial Infarction, Stroke, Paod and Methods of Treatment
US20060019269A1 (en) * 2002-10-17 2006-01-26 Decode Genetics, Inc. Susceptibility gene for myocardial infarction, stroke, and PAOD, methods of treatment
WO2005051372A2 (en) 2003-11-24 2005-06-09 Teva Gyógyszergyár Zártköruen Muködo Részvénytársaság Method of purifying pravastatin
US8158362B2 (en) * 2005-03-30 2012-04-17 Decode Genetics Ehf. Methods of diagnosing susceptibility to myocardial infarction and screening for an LTA4H haplotype
US20100216863A1 (en) * 2004-01-30 2010-08-26 Decode Genetics Ehf. Susceptibility Gene for Myocardial Infarction, Stroke, and PAOD; Methods of Treatment
ES2239533B1 (es) * 2004-03-01 2006-12-16 Ercros Industrial, S.A. Procedimiento para la obtencion de compactina.
CN102384955B (zh) * 2010-09-01 2014-04-30 北京北大维信生物科技有限公司 人体血浆中HMG-CoA还原酶抑制剂的定量分析方法
RU2585233C2 (ru) * 2013-12-27 2016-05-27 Открытое акционерное общество "Красфарма" Промышленный способ получения компактина
RU2585234C2 (ru) * 2013-12-27 2016-05-27 Открытое акционерное общество "Красфарма" Способ получения компактина

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4294846A (en) * 1979-09-21 1981-10-13 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and products of preparation
US4319039A (en) * 1979-06-15 1982-03-09 Merck & Co., Inc. Preparation of ammonium salt of hypocholesteremic fermentation product
EP0251625A2 (en) * 1986-06-23 1988-01-07 Merck & Co. Inc. Novel HMG-CoA reductase inhibitors
US4965200A (en) * 1989-06-23 1990-10-23 Merck & Co., Inc. Process for the preparation of 3-keto, 5-hydroxy simvastatin analogs
WO1997006128A1 (en) * 1995-08-03 1997-02-20 Gist-Brocades B.V. Selective process for the deacylation of acylated compounds
WO1997020834A1 (en) * 1995-12-06 1997-06-12 Antibiotic Co. Method of production of lovastatin

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202029A (en) 1991-03-13 1993-04-13 Caron Kabushiki Kaisha Process for purification of hmg-coa reductase inhibitors
HUP9902352A1 (hu) 1999-07-12 2000-09-28 Gyógyszerkutató Intézet Kft. Eljárás pravasztatin mikrobiológiai előállítására

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4319039A (en) * 1979-06-15 1982-03-09 Merck & Co., Inc. Preparation of ammonium salt of hypocholesteremic fermentation product
US4294846A (en) * 1979-09-21 1981-10-13 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and products of preparation
EP0251625A2 (en) * 1986-06-23 1988-01-07 Merck & Co. Inc. Novel HMG-CoA reductase inhibitors
US4965200A (en) * 1989-06-23 1990-10-23 Merck & Co., Inc. Process for the preparation of 3-keto, 5-hydroxy simvastatin analogs
WO1997006128A1 (en) * 1995-08-03 1997-02-20 Gist-Brocades B.V. Selective process for the deacylation of acylated compounds
WO1997020834A1 (en) * 1995-12-06 1997-06-12 Antibiotic Co. Method of production of lovastatin

Also Published As

Publication number Publication date
IL137782A0 (en) 2001-10-31
CA2321052A1 (en) 1999-08-26
KR100582620B1 (ko) 2006-05-23
YU50100A (sh) 2003-07-07
US6825015B1 (en) 2004-11-30
HRP20000541A2 (en) 2001-12-31
CZ20002856A3 (cs) 2000-11-15
SK11852000A3 (sk) 2001-05-10
PL193510B1 (pl) 2007-02-28
SK285074B6 (sk) 2006-05-04
HUP0100820A2 (hu) 2001-08-28
HUP0100820A3 (en) 2003-07-28
SI1054993T1 (en) 2005-10-31
BG64289B1 (bg) 2004-08-31
JP2002504345A (ja) 2002-02-12
KR20010041024A (ko) 2001-05-15
DE69925459T2 (de) 2006-04-27
RU2235130C2 (ru) 2004-08-27
AU3438499A (en) 1999-09-06
CN1291238A (zh) 2001-04-11
EP1054993B1 (en) 2005-05-25
WO1999042601A1 (en) 1999-08-26
BG104696A (en) 2001-07-31
SI9800046A (sl) 1999-08-31
RO120922B1 (ro) 2006-09-29
DE69925459D1 (de) 2005-06-30
ATE296357T1 (de) 2005-06-15
CN1206363C (zh) 2005-06-15
EP1054993A1 (en) 2000-11-29
JP2005110693A (ja) 2005-04-28
PL342513A1 (en) 2001-06-18
AU743619B2 (en) 2002-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ297093B6 (cs) Zpusob izolace a cistení inhibitoru HMG-CoA reduktasy
AU2001236543B2 (en) Method of purifying a fermentation broth
WO1994029292A9 (en) Process for the isolation of lovastatin
AU2001236543A1 (en) Method of purifying a fermentation broth
KR20030026920A (ko) 발효 브로스로부터 스타틴 화합물의 수집 방법
US6268186B1 (en) HMG-CoA reductase inhibitor preparation process
JP3236282B1 (ja) プラバスタチンを精製する方法
EP1266905A1 (en) Process for producing purified erythromycin
RU2059638C1 (ru) Способ получения эргоалкалоидов эрготоксиновой и эрготаминовой групп
WO2004111255A1 (en) Ion-exchange filtration of fermentation broth
JP2002128739A (ja) プラバスタチンを精製する方法
JPH0582390B2 (cs)

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20130217