EA015973B1 - Способ селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений - Google Patents
Способ селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений Download PDFInfo
- Publication number
- EA015973B1 EA015973B1 EA200970282A EA200970282A EA015973B1 EA 015973 B1 EA015973 B1 EA 015973B1 EA 200970282 A EA200970282 A EA 200970282A EA 200970282 A EA200970282 A EA 200970282A EA 015973 B1 EA015973 B1 EA 015973B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- dione
- water
- mixture
- steroid compounds
- miscible
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 54
- -1 steroid compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 40
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000010956 selective crystallization Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 54
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 43
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 39
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 39
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 34
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 32
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 19
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 18
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 18
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 17
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- UAEPNZWRGJTJPN-UHFFFAOYSA-N methylcyclohexane Chemical compound CC1CCCCC1 UAEPNZWRGJTJPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- YKYONYBAUNKHLG-UHFFFAOYSA-N propyl acetate Chemical compound CCCOC(C)=O YKYONYBAUNKHLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 11
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- GYNNXHKOJHMOHS-UHFFFAOYSA-N methyl-cycloheptane Natural products CC1CCCCCC1 GYNNXHKOJHMOHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 6
- 150000008280 chlorinated hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 6
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 5
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 3
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 2
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N dodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 claims 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 claims 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 claims 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 claims 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 39
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 27
- OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N formestane Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1O OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N 0.000 description 26
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- SHFGJEQAOUMGJM-UHFFFAOYSA-N dialuminum dipotassium disodium dioxosilane iron(3+) oxocalcium oxomagnesium oxygen(2-) Chemical compound [O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[O--].[Na+].[Na+].[Al+3].[Al+3].[K+].[K+].[Fe+3].[Fe+3].O=[Mg].O=[Ca].O=[Si]=O SHFGJEQAOUMGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 8
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- SNMVJSSWZSJOGL-PLOWYNNNSA-N 9alpha-hydroxyandrost-4-en-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@@]3(O)CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 SNMVJSSWZSJOGL-PLOWYNNNSA-N 0.000 description 6
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005471 androstenedione Drugs 0.000 description 6
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 4
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N Aromasine Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(=C)C2=C1 BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 3
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- 229960000255 exemestane Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 3
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- LUJVUUWNAPIQQI-UHFFFAOYSA-N (+)-androsta-1,4-diene-3,17-dione Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 LUJVUUWNAPIQQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OOAKHZRGUIGECT-XYAZLAKYSA-N (8r,9s,10s,13s,14s)-2,6-bis(hydroxymethyl)-10,13-dimethyl-7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1C(CO)=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(CO)C2=C1 OOAKHZRGUIGECT-XYAZLAKYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N androsta-1,4-diene-3,17-dione Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N 0.000 description 2
- 238000010533 azeotropic distillation Methods 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 229960004976 desogestrel Drugs 0.000 description 2
- RPLCPCMSCLEKRS-BPIQYHPVSA-N desogestrel Chemical compound C1CC[C@@H]2[C@H]3C(=C)C[C@](CC)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RPLCPCMSCLEKRS-BPIQYHPVSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- METQSPRSQINEEU-UHFFFAOYSA-N dihydrospirorenone Natural products CC12CCC(C3(CCC(=O)C=C3C3CC33)C)C3C1C1CC1C21CCC(=O)O1 METQSPRSQINEEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004845 drospirenone Drugs 0.000 description 2
- METQSPRSQINEEU-HXCATZOESA-N drospirenone Chemical compound C([C@]12[C@H]3C[C@H]3[C@H]3[C@H]4[C@@H]([C@]5(CCC(=O)C=C5[C@@H]5C[C@@H]54)C)CC[C@@]31C)CC(=O)O2 METQSPRSQINEEU-HXCATZOESA-N 0.000 description 2
- 229960005352 gestodene Drugs 0.000 description 2
- SIGSPDASOTUPFS-XUDSTZEESA-N gestodene Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](CC)([C@](C=C4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 SIGSPDASOTUPFS-XUDSTZEESA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DAXJNUBSBFUTRP-LVWDTYCVSA-N (6S,8R,9S,10R,13S,14S)-6-(hydroxymethyl)-10,13-dimethyl-7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3C[C@H](CO)C2=C1 DAXJNUBSBFUTRP-LVWDTYCVSA-N 0.000 description 1
- MYKMKUGZFQKMOZ-CKDIOHLVSA-N (8r,9s,10r,13s,14s,15s)-15-hydroxy-10,13-dimethyl-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(C[C@@H]4O)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MYKMKUGZFQKMOZ-CKDIOHLVSA-N 0.000 description 1
- NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N Isooctane Chemical compound CC(C)CC(C)(C)C NHTMVDHEPJAVLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001124569 Lycaenidae Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 description 1
- 229910000272 alkali metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910001860 alkaline earth metal hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 229940076810 beta sitosterol Drugs 0.000 description 1
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- JVSWJIKNEAIKJW-UHFFFAOYSA-N dimethyl-hexane Natural products CCCCCC(C)C JVSWJIKNEAIKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001640 fractional crystallisation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 1
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
- C07J1/0003—Androstane derivatives
- C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
- C07J1/0051—Estrane derivatives
- C07J1/0059—Estrane derivatives substituted in position 17 by a keto group
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Объектом настоящего изобретения является новый способ селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений из раствора, полученного предпочтительно микробиологическим путем, содержащего смесь стероидных соединений, посредством селективной экстракции, очистки и селективной кристаллизации стероидных соединений путем обработки несколькими растворителями.
Description
Изобретение относится к способу селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений из раствора, полученного предпочтительно микробиологическим путем, содержащего смесь стероидных соединений, посредством селективной экстракции, очистки и селективной кристаллизации стероидных соединений.
Предшествующий уровень техники
Моногидроксилированные 3,17-дикетостероидные соединения, например 13в-этил-11а-гидрокси-4гонен-3,17-дион, 13в-этил-15а-гидрокси-4-гонен-3,17-дион, 15а-гидрокси-4-андростен-3,17-дион и 9αгидрокси-4-андростен-3,17-дион, а также 6ξ-гидроксиметил-1,4-андростадиен-3,17-дион (который представляет собой смесь 6α- и όβ-стереоизомеров) являются важными ключевыми промежуточными соединениями в химическом синтезе активных ингредиентов, таких как дезогестрел, гестоден, дроспиренон, а также гидрокортизон, преднизолон и экземестан.
В промышленных способах микробиологическое гидроксилирование является испытанной практикой, поскольку во многих случаях только специальный микроорганизм способен гидроксилировать данную молекулу в желаемом положении. В большинстве случаев химический синтез (если он осуществим) для решения этой проблемы является очень сложным, дорогостоящим, выходы являются низкими и образуется много побочных продуктов. Микробиологическое гидроксилирование в практике фармацевтической промышленности осуществляют следующим образом: сначала путем скриннинга выбирают микроорганизм, который способен гидроксилировать данную молекулу в желаемом положении, затем определяют такие оптимальные параметры (компоненты питательного вещества, рН, температуру, растворенный кислород и т. д.), которые должны поддерживаться для осуществления биоконверсии с хорошим превращением.
В конце вышеупомянутой сложной процедуры образуется большой объем ферментационного бульона, и желаемый продукт, в данном случае моногидроксилированное стероидное соединение, должно быть выделено из этого раствора. Ферментационный бульон является гетерогенным как с физической, так и с химической точки зрения, он содержит микробные клетки, а также клеточные компоненты, высвобождающиеся из микробных клеток, оставшийся субстрат, оставшиеся компоненты питательного вещества, продукты метаболизма, образовавшийся продукт и побочные продукты, пеногасители, детергенты и т.д. Концентрация продукта в ферментационном бульоне составляет обычно от 1 до 10 г/дм3, поэтому ферментационный бульон представляет собой разбавленный раствор, содержащий большое количество примесей и естественно желаемый продукт в наибольшей концентрации.
Как можно видеть, последовательная переработка ферментационных бульонов - выделение желаемого продукта - представляет собой очень сложную процедуру. Желаемый продукт и оставшиеся компоненты питательного вещества, продукты метаболизма микроорганизма, добавки (пеногасители, детергенты), оставшийся субстрат, образовавшиеся побочные продукты и другие примеси должны быть разделены. Ситуация является еще более сложной, поскольку обычно растворимость стероидных соединений в воде является очень низкой, поэтому образовавшийся продукт находится частично в растворе, частично осаждается на поверхности биомассы. В случае использования более высокой концентрации субстрата желаемый продукт должен быть выделен из двух различных сред: из фильтрата ферментационного бульона и с поверхности биомассы.
Для решения вышеупомянутых проблем было предпринято несколько попыток. Например, согласно патенту Японии № 54-105294, для разделения стероидных смесей гидроксильные группы стероидных соединений подвергают ацилированию, затем очищают с помощью колоночной хроматографии с использованием силикагеля или оксида алюминия, и в конце после фракционной кристаллизации получают желаемый продукт. Публикация не содержит числовых данных относительно эффективности данного способа, но последовательная обработка ацилированем в промышленном масштабе - с использованием пиридина в качестве растворителя - может вызвать множество проблем. В этом способе с несколькими стадиями эксплуатационные потери продукта являются неизбежно высокими, поэтому промышленное применение этого способа является неэкономичным.
В описании изобретения к ЕР 245985 раскрыто выделение биологически активных соединений в лабораторном масштабе. Согласно данному способу забуференный раствор водорастворимых биологически активных соединений экстрагируют соответствующим специальным растворителем, который не смешивается с водой (например, полиэтиленгликолем), в присутствии микрогранулированного (0,01-10 мкм) адсорбента, содержащего функциональную группу. Продукт обратимо связывается с адсорбентом, из которого после осуществления процессов разделения фаз может быть выделен известными способами. Промышленная осуществимость этого способа является очень сомнительной.
В описании изобретения к патенту Венгрии № 192668 раскрыт микробиологический синтез 15αгидрокси-4-андростен-3,17-диона. Во время способа биоконверсия осуществляется грибками РешсШшт тейпл или Еикатшт охукрогит Г. уампГесйпп. В описании этого изобретения также кратко описан способ выделения стероидных соединений, согласно которому ферментационный бульон экстрагируют три раза изобутилметилкетоном (общая экстракция), объединенные экстракты концентрируют на пленочном ис
- 1 015973 парителе и упаривают досуха на роторном испарителе с использованием водяной бани. Остаток промывают гексаном для удаления пеногасителя, и в конце стероидные соединения кристаллизуют из изобутилметилкетона. Недостаток этого способа состоит в том, что он дает только сырые (неочищенные) кристаллы. Описание изобретения не дает какой-либо инструкции относительно дополнительной очистки продукта и разделения образовавшихся стероидных побочных продуктов и оставшегося субстрата.
Согласно способу, опубликованному в описании изобретения к патенту Венгрии № 217624, гидроксилированные стероиды выделяют из фильтрата ферментационного бульона, содержащего низкие концентрации (1 г/дм3), с использованием макросетчатых адсорбционных смол и градиентного элюирования. Соотношение адсорбата и адсорбента составляет 1:20, т.е. 20 г смолы требуется для связывания 1 г стероида. Ограничение способа состоит в том, что в случае более высокой концентрации (6-10 г/дм3) субстрата при производстве в промышленном масштабе (20-50 м3) следует использовать максимальное количество адсорбента, поэтому и набивка, и оборудование были бы дорогостоящими, способ был бы неэкономичным.
Как было упомянуто ранее, различные гидроксилированные стероидные соединения, например 13 βэтил-11а-гидрокси-4-гонен-3,17-дион, 13в-этил-15а-гидрокси-4-гонен-3,17-дион, 15а-гидрокси-4андростен-3,17-дион и 9а-гидрокси-4-андростен-3,17-дион, а также 6ξ-гидроксиметил-1,4-андростадиен3,17-дион - целевые соединения изобретения - являются важными ключевыми промежуточными соединениями в химическом синтезе активных ингредиентов, таких как дезогестрел, гестоден, дроспиренон, а также гидрокортизон, преднизолон и экземестан. Химический синтез представляет собой сложные способы в несколько стадий, поэтому эксплуатационные потери продукта являются неизбежно высокими при осуществлении в промышленном масштабе. Обычно для синтеза 1 кг активного ингредиента требуется применение 8-10 кг ключевого промежуточного соединения. Согласно этим фактам при крупномасштабном производстве (иногда несколько кг/партию) должен осуществляться синтез гидроксилированных стероидных соединений.
Микробиологическое гидроксилирование стероидных соединений обычно может быть осуществлено с 60-90% биоконверсией. Самая большая проблема во время выделения продукта состоит в разделении оставшегося субстрата и образовавшегося побочного продукта, поскольку на следующих стадиях синтеза активного промежуточного соединения могут быть использованы только те продукты, в которых содержание субстрата ниже заданного предела. Этот предел зависит от продукта, обычно он составляет от 1 до 2,5%.
Вышеупомянутый способ может быть осуществлен в лабораторном и полупромышленном масштабе с использованием силикагеля или макросетчатых адсорбционных смол при хроматографическом разделении. В случае количества вещества в несколько сотен килограмм, ни один из этих путей не может быть использован, поскольку количество хроматографической набивки и растворителей, необходимое для этого способа, было бы очень большим, способ не был бы экономичным в промышленном масштабе.
Задача авторов изобретения состояла в том, чтобы разработать экономичный, промышленно применимый способ, который устраняет недостатки известных способов и позволяет выделить большое количество желаемого продукта с высокой чистотой и хорошим выходом.
Сущность изобретения
Во время экспериментов авторы изобретения должны были учитывать, что желаемые соединения по изобретению, упомянутые выше гидроксилированные стероидные соединения, имеют очень похожие химические, физические и физико-химические свойства, их полярности также различаются лишь незначительно. Это означает, что все эти соединения ведут себя весьма похожим образом во время заданной манипуляции (например, растворения, экстракции, осаждения).
Во время экспериментов авторы изобретения обнаружили, что продукт, образовавшийся в ферментационном способе, оставшийся субстрат и побочные продукты - согласно их растворимости - могут быть обнаружены как растворенными в ферментационном бульоне, так и осажденными на поверхности биомассы. Исключением является случай, когда концентрация добавленного субстрата ниже 1,5 г/дм3, в этом случае продукт остается в растворе. Соответственно, стероидные соединения должны быть выделены и из раствора, и из твердой фазы.
Было обнаружено, что практичным является удаление биомассы из ферментационного бульона путем фильтрации, затем стероидные соединения могут быть выделены из фильтрата с помощью органического растворителя, не смешивающегося или частично смешивающегося с водой (алифатический сложный эфир или алифатический кетон). Также обнаружили, что примеси нестероидного типа биологического происхождения могут быть селективно удалены путем обработки органической фазы водным раствором основного характера, имеющим соответствующую ионную силу, затем может быть получен сырой (неочищенный) продукт, содержащий стероидные соединения, после добавления воды, путем выпаривания растворителя. Стероидные соединения растворяют из профильтрованной биомассы алифатическими спиртами или кетонами, смешивающимися с водой, с использованием экстракции твердого вещества растворителем, и после выпаривания растворителя получают кристаллический сырой продукт.
Сырые кристаллические продукты, полученные из двух сред, смешивают, растворяют в алифатиче
- 2 015973 ском спирте или кетоне, смешивающемся с водой, и раствор обрабатывают древесным углем и/или перфилом. Флокулянт фильтруют, и растворитель выпаривают с получением однородных сырых кристаллов. Полученные таким образом однородные сырые кристаллы содержат продукт, от 8 до 25% оставшегося субстрата в зависимости от биоконверсии, а также несколько процентов других стероидов. Эти соединения также должны быть разделены, как упомянуто ранее, предпочтительно не хроматографически.
Обычные способы кристаллизации, используемые в промышленной практике (например, кристаллизация из органического растворителя, из воды или осаждение водой), не были успешными, поскольку удаление одной единицы субстрата вызывало потерю 2-4 единиц продукта, т.е. растворимость продукта была лучше в этих смесях, чем растворимость основной примеси, субстрата.
Во время экспериментов неожиданно обнаружили, что при растворении однородных сырых кристаллов в хлорированном углеводороде и осаждении продукта путем добавления алифатического или ароматического углеводорода соотношение растворимостей меняется. В этой системе растворимость неполярного компонента (субстрата) в 10-60 раз лучше, чем растворимость полярного соединения (продукта), в зависимости от количества субстрата. Соответственно, более неполярная примесь может быть удалена этой селективной кристаллизацией без потери большого количества продукта (потеря продукта составляет менее 1%). Целесообразно растворять сырой кристаллический материал в хлорированном углеводороде и осаждать продукт алифатическим или ароматическим углеводородом. В этом случае основная часть субстрата может быть обнаружена в маточной жидкости. Если биоконверсия является низкой (20-30% оставшегося субстрата), то желаемого качества можно достичь повторением вышеописанного способа.
Согласно вышеуказанным фактам настоящее изобретение относится к способу селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений из раствора, полученного предпочтительно микробиологическим путем, содержащего смесь стероидных соединений, посредством селективной экстракции, очистки и селективной кристаллизации стероидных соединений, который состоит из следующих стадий:
а) удаление биомассы из ферментационного бульона, в заданном случае (то есть, необязательно) после обработки фосфорной кислотой, путем фильтрации или центрифугирования, выделение стероидных соединений из фильтрата органическим растворителем, не смешивающимся или частично смешивающимся с водой, предпочтительно алифатическим кетоном или сложным эфиром алифатического спирта, селективное удаление примесей нестероидного типа из органической фазы путем обработки водным раствором основного характера и получение сырого кристаллического продукта, содержащего гидроксилированные стероиды, путем добавления воды и выпаривания растворителя и
б) растворение стероидных соединений с поверхности профильтрованной биомассы, полученной на стадии (а), путем обработки С1 -С4 алифатическими спиртами или кетонами или их водным раствором и получение сырого кристаллического продукта, содержащего гидроксилированные стероиды, после выпаривания растворителя, затем
в) растворение продукта, полученного на стадии (а), или в заданном случае (то есть, необязательно) - смеси двух сырых продуктов, полученных на стадиях (а) и (б), в С1-С4 алифатическом спирте или кетоне, смешивающемся с водой, или его водном растворе, обесцвечивание раствора и выделение очищенных однородных сырых кристаллов после выпаривания растворителя; и
г) перекристаллизация очищенных однородных сырых кристаллов, полученных на стадии (в), из смеси хлорированного углеводорода/алифатического или циклоалифатического углеводорода и выделение чистого продукта.
Согласно настоящему изобретению органический растворитель, не смешивающийся или частично смешивающийся с водой, может предпочтительно представлять собой алифатические сложные эфиры, такие как этилацетат, н-пропилацетат и тому подобное, а также алифатические кетоны, такие как изобутилметилкетон и тому подобное.
Основность и ионную силу водного раствора, используемые для удаления нестероидных примесей, регулируют путем добавления соответствующего количества гидроксидов щелочных металлов или щелочно-земельных металлов и/или их основных солей, таких как карбонаты, гидрокарбонаты, гидрофосфаты, ацетаты и тому подобное.
Согласно настоящему изобретению органический растворитель, смешивающийся с водой, может предпочтительно представлять собой С|-С3 алифатические спирты, такие как метанол, этанол, а также алифатические кетоны, такие как ацетон и тому подобное.
На стадии селективной кристаллизации органический растворитель, не смешивающийся с водой, может предпочтительно представлять собой хлорированные углеводороды, такие как дихлорметан, дихлорэтан и тому подобное, а в качестве осаждающего растворителя могут быть использованы алифатические или ароматические углеводороды, такие как н-гексан, н-октан, изооктан, 1-додекан, циклогексан, метилциклогексан и тому подобное.
Способ согласно настоящему изобретению может быть использован во время выделения 13в-этил11а-гидрокси-4-гонен-3,17-диона, 13в-этил-15а-гидрокси-4-гонен-3,17-диона, 15а-гидрокси-4
- 3 015973 андростен-3,17-диона и 9а-гидрокси-4-андростен-3.17-диона. а также 61-гидроксиметил-1.4андростадиен-3.17-диона.
Преимущества способа по настоящему изобретению состоят в следующем:
его осуществление не требует дорогостоящих капиталовложений;
эффективный. дешевый способ разделения;
он обеспечивает высокую селективность;
потеря продукта является очень низкой;
способ является быстрым. воспроизводимым и легко осуществимым;
количество используемых растворителей является низким. например 450-500 кг сырого продукта может быть селективно кристаллизовано из 6 м3 растворителя.
Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
Пример 1. Выделение 15а-гидрокси-4-андростен-3.17-диона.
Биоконверсию осуществляют известным способом. например. согласно описанию изобретения к патенту Венгрии № 192668. с помощью грибка РешеШшш ше1шп. в полезном объеме 900 дм3. Количество добавленного 4-андростен-3.17-дионового субстрата составляет 9 г/дм3. биоконверсия составляет 75%. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и рН ферментационного бульона доводят до 3.5-4.0 путем добавления 10%-ной фосфорной кислоты для повышения эффективности фильтрации. добавляют 9 кг перфила в качестве вспомогательного средства при фильтрации. Температуру ферментационного бульона увеличивают до 100°С для разрушения микроорганизмов. Затем смесь охлаждают до температуры 40-45°С. и биомассу фильтруют с помощью центрифуги типа С-10. оснащенной техническими тканями.
Масса профильтрованной биомассы составляет 36 кг.
Фильтрат охлаждают до температуры до 20-25°С и смесь экстрагируют 500 дм3 н-пропилацетата в аппарате. снабженном мешалкой. После разделения фаз водную фазу повторно экстрагируют 250 дм3 нпропилацетата. После экстракции следуют методы ТЬС (тонкослойная хроматография) и НРЬС (высокоэффективная жидкостная хроматография). Органические фазы. содержащие стероидные соединения. объединяют и концентрируют в дубликаторе до объема примерно 200 дм3. Органическую фазу уменьшенного объема дважды экстрагируют 100 дм3 5%-ного раствора гидроксида натрия для того. чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 40 дм3 воды и смесь переносят в аппарат. который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой. и органический растворитель выпаривают. Полученные таким образом сырые кристаллы (содержащие стероидный продукт) фильтруют и сушат.
Биомассу переносят в аппарат. который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой. и добавляют 400 дм3 60 мас.% водного этанола. Смесь перемешивают в течение 30 мин и биомассу фильтруют с помощью центрифуги типа С-10. Затем биомассу повторно экстрагируют 300 дм3 60 мас.% водного этанола и разделяют центрифугированием. Профильтрованную биомассу сжигают. Два фильтрата объединяют и этанол отгоняют в дубликаторе. Остаток охлаждают до 20°С и осажденные стероиды. содержащие второй сырой продукт. фильтруют и сушат.
Два сырых кристаллических продукта. полученных вышеописанными способами. переносят в аппарат. снабженный мешалкой. и растворяют в смеси 36 дм3 ацетона и 4 дм3 воды при 45-50°С. Затем добавляют 1 кг Νοήΐ и 1 кг перфила. и смесь перемешивают в течение 30 мин. затем флокулянт фильтруют и промывают смесью 1 дм3 ацетона и 3 дм3 воды. Фильтрат и промывку объединяют и концентрируют до половины объема в дубликаторе. Остаток охлаждают до 10°С. осажденные очищенные сырые кристаллы фильтруют и сушат.
Масса полученных таким образом кристаллов составляет 6.4 кг. и согласно НРЬС их состав является следующим:
15а-гидрокси-4-андростен-3,17-дион 85,0%
4-андростен-3,17-дион 10,9% другие стероиды 1,9%
Для того чтобы разделить продукт и субстрат. к вышеописанному продукту добавляют 64 дм3 метилциклогексана. и воду удаляют из смеси азеотропной перегонкой. Затем к смеси добавляют 25.6 дм3 (объем в четыре раза больше массы кристаллов) дихлорметана с получением прозрачного раствора. который осветляют с помощью 2 кг оксида алюминия. Осветленный раствор концентрируют при атмосферном давлении до объема 70 дм3 и охлаждают до 25°С. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат.
Масса полученного таким образом кристаллического 15а-гидрокси-4-андростен-3.17-диона составляет 5.6 кг. и согласно НРЬС его состав является следующим (выход составляет 89% в пересчете на ферментационный бульон):
- 4 015973
15а-гидрокси-4-андростен-3,17-дион 96,2%
4-андростен-3,17-дион 1,4% другие стероиды 1,4%
В заданном случае (то есть, при необходимости, но необязательно) количество субстратной примеси может быть дополнительно снижено путем повторения последней стадии кристаллизации.
Пример 2. Выделение 13в-этил-15а-гидрокси-4-гонен-3,17-диона.
Биоконверсию осуществляют известным способом, например, согласно патенту Венгрии № 221745, с помощью грибка Ризалит ес.|Ш5е1г в полезном объеме 20 м3. Количество добавленного 13в-этил-4гонен-3,17-дионового субстрата составляет 1,5 г/дм3, биоконверсия составляет 77%. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и основное количество стероидных соединений обнаруживают в растворе, осаждение на поверхности биомассы является лишь минимальным.
Ферментационный бульон фильтруют согласно способу, описанному в примере 1, отличающемуся тем, что вместо центрифуги используют фильтр-пресс с полезной поверхностью фильтрации 30 м2. Масса фильтрованной влажной биомассы составляет 500 кг (ее сжигают из-за низкого содержания в ней стероидов).
Фильтрат ферментационного бульона экстрагируют 4 м3 этилацетата в сепараторе типа СГЫС (сопΙίηιιοιίδ 1п1едга1е6 т1хег, комбинированный смеситель непрерывного типа) с противоточным операторным методом. Рафинат отбрасывают и органическую фазу концентрируют до объема 2 м3. Органическую фазу уменьшенного объема дважды экстрагируют 1 м3 5%-ного раствора гидроксида натрия для того, чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 600 дм3 воды и смесь переносят в аппарат, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, и органический растворитель выпаривают. Полученные таким образом сырые, содержащие стероиды, кристаллы фильтруют и сушат.
Сырой продукт переносят в аппарат, снабженный мешалкой, и растворяют в смеси 180 дм3 ацетона и 360 дм3 воды при 45-50°С. Затем добавляют 4 кг древесного угля Νοήΐ и 4 кг перфила и смесь перемешивают в течение 30 мин, затем флокулянты фильтруют и промывают смесью 20 дм3 ацетона и 60 дм3 воды. Фильтрат и промывку объединяют и органический растворитель выпаривают в дубликаторе. Остаток охлаждают до 10°С, осажденные очищенные сырые кристаллы фильтруют и сушат.
Масса полученных таким образом кристаллов составляет 21,5 кг, и согласно НРЬС их состав является следующим:
13₽-этил-15а-гидрокси-4-гонен-3,17-дион 94,6%
13р-этил-4-гонен-3,17-дион 3,3% другие стероиды 2,6%
Для того чтобы разделить продукт и субстрат, вышеописанный сырой продукт растворяют в 54 дм3 (объем составляет две с половиной массы кристаллов) дихлорметана и медленно добавляют 270 дм3 метилциклогексана из резервуара с перемешиванием в течение примерно 1 ч. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат.
Масса полученного таким образом 13в-этил-15а-гидрокси-4-гонен-3,17-диона составляет 20,8 кг, и, согласно НРЬС, его состав является следующим (выход составляет 87% в пересчете на ферментационный бульон):
13₽-этил-15а-гидрокси-4-гонен-3,17-дион 96,7%
13₽-этил-4-гонен-3,17-дион 0,5% другие стероиды 1,9%
Пример 3. Выделение 13в-этил-11а-гидрокси-4-гонен-3,17-диона.
Биоконверсию осуществляют известным способом, например, согласно патенту Венгрии № 216874, с помощью грибка Суйпбгосагроп буфтит, в полезном объеме 5 дм3. Количество добавленного 13βэтил-4-гонен-3,17-дионового субстрата составляет 4 г/дм3, биоконверсия составляет 87%. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и стероидные соединения обнаруживают как в ферментационном бульоне, так и на поверхности профильтрованной биомассы. рН ферментационного бульона доводят до 3,5-4,0 путем добавления 10%-ной фосфорной кислоты для повышения эффективности фильтрации, добавляют 50 г перфила в качестве вспомогательного средства при фильтрации и температуру ферментационного бульона увеличивают до 100°С для разрушения микроорганизмов. Затем смесь охлаждают до температуры 40-45°С, и биомассу фильтруют через керамический фильтр, оснащенный техническими тканями.
Фильтрат охлаждают до температуры 20-25°С и смесь экстрагируют 2 дм3 н-пропилацетата. После разделения фаз водную фазу повторно экстрагируют 1 дм3 н-пропилацетата. Органические фазы, содер
- 5 015973 жащие стероидные соединения, объединяют и концентрируют при пониженном давлении до объема примерно 1 дм3 в роторном испарителе с использованием водяной бани 65°С. Органическую фазу уменьшенного объема дважды экстрагируют 0,5 дм3 10%-ного раствора карбоната калия для того, чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 0,2 дм3 воды и органический растворитель выпаривают в роторном испарителе с использованием водяной бани 65°С. Полученные таким образом сырые, содержащие стероиды, кристаллы фильтруют и сушат.
Биомассу переносят в аппарат, снабженный мешалкой, и добавляют 2 дм3 60 мас.% водного ацетона. Смесь перемешивают в течение 30 мин и биомассу фильтруют через пресс-фильтр. Фильтрат переносят в роторный испаритель и растворитель отгоняют. Остаток охлаждают до 20°С и осажденные стероиды, содержащие второй сырой продукт, фильтруют и сушат.
Два сырых кристаллических продукта, полученных вышеописанными способами, переносят в аппарат, снабженный мешалкой, и растворяют в 0,7 дм3 70 мас.% метанола. Затем добавляют 4 г Νοτίΐ и 4 г перфила и смесь перемешивают в течение 30 мин, затем флокулянт фильтруют через плоский фильтр Бейх К5. К фильтрату добавляют 0,5 дм3 воды и метанол отгоняют в роторном испарителе, как описано выше. Остаток охлаждают до 20°С, осажденные очищенные однородные сырые кристаллы фильтруют через стеклянный фильтр РО-3 и сушат.
Масса полученных таким образом кристаллов составляет 18,4 г, и согласно НРБС их состав является следующим:
13р-этил-11а-гидрокси-4-гонен-3,17-дион 82,1%
13р-этил-4-гонен-3,17-дион 8,2% другие стероиды 4,1%
Для того чтобы разделить желаемый конечный продукт и исходный субстрат, вышеуказанный сырой продукт растворяют в 36 см3 (объем составляет две с половиной массы кристаллов) дихлорметана и медленно добавляют 180 см3 н-гексана из резервуара с перемешиванием в течение примерно 1 ч. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат.
Масса полученного таким образом 13в-этил-11а-гидрокси-4-гонен-3,17-диона составляет 15,2 г, и согласно НРБС его состав является следующим (выход составляет 83% в пересчете на ферментационный бульон):
13р-этил-11 а-гидрокси-4-гонен-3,17-дион 95,2%
13р-этил-4-гонен-3,17-дион 0,8% другие стероиды 2,4%
Пример 4. Выделение 9а-гидрокси-4-андростен-3,17-диона.
Биоконверсию осуществляют известным способом, например, согласно описанию изобретения в патенте США 4065236, с помощью бактерии МусоЬас1епиш Гойийиш, в полезном объеме 5 дм. Количество добавленного β-ситостеринового субстрата составляет 30 г/дм3, и, согласно НРБС. концентрация 9а-гидрокси-4-андростен-3,17-диона в ферментационном бульоне составляет 12 г/дм3, когда биоконверсия завершается. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и 1,5 г/дм3 продукта обнаруживают в ферментационном бульоне, а остаток находится на поверхности профильтрованной биомассы. Профильтрованный ферментационный бульон выделяют, как описано в примере 3, за исключением того, что растворитель, используемый в экстракции, представляет собой изобутилметилкетон, с получением 6 г сырого кристаллического продукта.
Стероиды дважды растворяют с поверхности биомассы с помощью 2 дм3 60 мас.% метанола и второй сырой кристаллический продукт (68 г) получают путем выпаривания растворителя.
Два сырых кристаллических продукта, полученных вышеописанными способами, объединяют и растворяют в 1,1 дм3 70 мас.% метанола. Затем добавляют 8 г Νοτίΐ и 8 г перфила и смесь перемешивают в течение 30 мин, затем флокулянты фильтруют. К фильтрату добавляют 0,5 дм3 воды и этанол отгоняют при пониженном давлении. Осажденные очищенные однородные сырые кристаллы фильтруют и сушат.
Масса полученных таким образом кристаллов составляет 65 г, и согласно НРБС их состав является следующим:
9а-гидрокси-4-андростен-3,17-дион 87,2% другие стероиды 8,1%
Вышеописанный сырой продукт растворяют в 0,2 дм3 дихлорэтана и медленно добавляют 1 дм3 ноктана с перемешиванием в течение примерно 1 ч. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат.
Масса полученного таким образом 9а-гидрокси-4-андростен-3,17-диона составляет 58 г, и согласно НРБС его состав является следующим (выход составляет 92% в пересчете на ферментационный бульон).
- 6 015973
Эа-гидрокси-4-андростен-3,17-дион 95,6% другие стероиды 1,6%
Пример 5. Выделение 6ξ-гидроксиметил-1,4-андростадиен-3,17-диона (который представляет собой смесь 6α- и όβ-стереоизомеров).
Биоконверсию осуществляют известным способом, например, согласно заявке на патент Венгрии № Р07 00584, с помощью бактерии Аг(11гоЬас1ег 5ппр1ех. в полезном объеме 5 дм3. Количество добавленного 6ξ-гидроксиметил-4-андростен-3,17-дионового субстрата составляет 3 г/дм3, и биоконверсия составляет 70%. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и основное количество стероидных соединений обнаруживают в растворе, осаждение на поверхности биомассы является лишь минимальным. В качестве вспомогательного средства при фильтрации к ферментационному бульону добавляют 50 г перфила и температуру увеличивают до 100°С для разрушения микроорганизмов. Затем смесь охлаждают до температуры 30-35°С и биомассу фильтруют через керамический фильтр, оснащенный техническими тканями.
Фильтрат охлаждают до температуры 20-25°С и смесь экстрагируют 2 дм3 этилацетата. После разделения фаз водную фазу повторно экстрагируют 1 дм3 этилацетата. Органические фазы объединяют и экстрагируют 1,2 дм3 5%-ного раствора гидроксида натрия для того, чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 0,2 дм3 воды и органический растворитель выпаривают в роторном испарителе с использованием водяной бани 65°С. Полученные таким образом сырые, содержащие стероиды, кристаллы являются неоднородными, поэтому их растворяют в 0,2 дм3 метанола и 0,1 дм3 воды и добавляют 4 см3 5%-ного раствора гидроксида натрия. Затем органическую фазу выпаривают с получением однородных сырых кристаллов.
Масса полученных таким образом кристаллов составляет 8,8 г, и согласно НРЬС их состав является следующим:
6₽-гидроксиметил-1,4-андростадиен-3,17-дион 93,91%
6а-гидроксиметил-1,4-ацдростадиен-3,17-дион 0,67%
2,6-бис-гидроксиметил-1,4-андростадиен-3,17-дион 0,54%
6ξ-ΓΗΛροκοΗΜβτΜΗ-1,4-андро стен-3,17-дион 0,48%
1,4-андростадиен-3,17-дион 3,56%
Для того чтобы получить продукт желаемой чистоты, удаление неполярных примесей осуществляют следующим образом: вышеописанный сырой продукт растворяют в 20 см3 дихлорметана и медленно добавляют 100 см3 метилциклогексана из дополнительной воронки с перемешиванием в течение примерно 1 ч. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат.
Масса полученного таким образом 6ξ-гидроксиметил-1,4-андростен-3,17-диона составляет 8,32 г, и согласно НРЬС его состав является следующим (выход составляет 77,6% в пересчете на ферментационный бульон):
6₽-гидроксиметил-1,4-андростадиен-З,17-дион 98,10%
6а-гидроксиметил-1,4-андростадиен-3,17-дион 0,43%
2,6-бис-гидроксиметил-1,4-андростадиен-З,17-дион 0,49%
6(-гидроксиметил-1,4-андростен-3,17-дион 0,39%
1,4-андростадиен-3,17-дион 0,33%
Авторы изобретения отмечают, что в следующей реакции синтеза экземестана α- и β-изомеры дают одинаковый продукт, поэтому нет необходимости отделять их друг от друга.
Пример 6. Выделение 15а-гидрокси-4-андростен-3,17-диона в промышленном масштабе.
Биоконверсию осуществляют согласно способу, описанному в примере 1, в полезном объеме 20 м3. После завершения биоконверсии ферментационный бульон анализируют и стероидные соединения обнаруживают как в ферментационном бульоне, так и на поверхности профильтрованной биомассы. рН ферментационного бульона доводят до 3,5-4,0 путем добавления 10%-ной фосфорной кислоты для повышения эффективности фильтрации и температуру ферментационного бульона увеличивают до 100°С для разрушения микроорганизмов. Затем смесь охлаждают до температуры 40-45°С, добавляют 9 кг/м3 перфила в качестве вспомогательного средства при фильтрации и биомассу фильтруют через пресс-фильтр типа Ьеикег, оснащенный техническими тканями. Масса профильтрованной биомассы составляет 700 кг.
Фильтрат ферментационного бульона экстрагируют 4 м3 н-пропилацетата в сепараторе типа С1ЫС с противоточным операторным методом. Рафинат отбрасывают после нейтрализации, а органическую фазу
- 7 015973 концентрируют до объема примерно 2 м3. Органическую фазу уменьшенного объема дважды экстрагируют 1 м3 1%-ного раствора гидроксида натрия для того, чтобы удалить нестероидные примеси. После нейтрализации водные фазы отбрасывают. К органической фазе добавляют 1600 дм3 воды и смесь переносят в аппарат, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, и органический растворитель выпаривают. Остаток охлаждают до 20°С и осажденный сырой кристаллический продукт фильтруют с помощью центрифуги типа С-10, оснащенной техническими тканями. Полученные таким образом сырые кристаллы содержат большое количество полярных примесей, поэтому их перекристаллизовывают следующим образом:
В аппарате, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, 1300 дм3 40 мас.% водного этанола смешивают с полученными выше сырыми кристаллами. Затем температуру смеси увеличивают до 65°С, добавляют 5 кг древесного угля и 3 кг перфила, и смесь перемешивают в течение 1 ч при этой температуре. Флокулянты фильтруют через фильтр 8ратк1ет и отбрасывают. Фильтрат переносят в дубликатор и добавляют 200 дм3 воды, и этанол отгоняют при атмосферном давлении. Остаток охлаждают до 20°С, а осажденные очищенные кристаллы фильтруют с помощью центрифуги типа С-10, оснащенной техническими тканями. Масса полученных таким образом очищенных сырых кристаллов составляет 28 кг.
Биомассу переносят в аппарат, который может быть нагрет или охлажден и снабжен мешалкой, и добавляют 8 м3 60 мас.% водного этанола. Затем температуру смеси увеличивают до 60°С, смесь перемешивают в течение 60 мин при этой температуре и биомассу фильтруют с помощью мембранного фильтрующего устройства. Профильтрованную биомассу сжигают. Фильтрат переносят в дубликатор и этанол отгоняют при атмосферном давлении. Остаток охлаждают до 20°С и осажденные кристаллы фильтруют с помощью центрифуги типа С-10, оснащенной техническими тканями. Масса сырых кристаллов, полученных из биомассы, составляет 135 кг.
Два сырых кристаллических продукта, полученных вышеописанными способами, переносят в дубликатор, оснащенный мешалкой, и растворяют в смеси 1000 дм3 ацетона и 1600 дм3 воды при 70°С. Затем добавляют 8 кг карбоната натрия и смесь подвергают дефлегмации в течение 1 ч. Затем раствор охлаждают до 55°С, добавляют 10 дм3 уксусной кислоты, 10 кг древесного угля и 5 кг перфила и смесь перемешивают в течение 60 мин, затем флокулянты фильтруют через фильтр 8рагк1ег. Фильтрат переносят в дубликатор, добавляют 400 дм3 воды, ацетон отгоняют при атмосферном давлении. Остаток охлаждают до 20°С, и осажденные кристаллы фильтруют с помощью центрифуги типа С-10, оснащенной техническими тканями.
Масса полученных таким образом однородных кристаллов составляет 112 кг, и согласно НРЬС их состав является следующим:
15а-гидрокси-4-андростен-3,17-дион 85,0%
4-андростен-З,17-дион 12,1% другие стероиды 1,8%
Для того чтобы разделить продукт и субстрат, к вышеописанному продукту в дубликаторе добавляют 400 дм3 метилциклогексан и воду удаляют из смеси азеотропной перегонкой. Затем осажденные кристаллы фильтруют с помощью центрифуги типа С-10, оснащенной техническими тканями, переносят в аппарат, снабженный мешалкой, и растворяют в дихлорметане (объем в два раза превышает массу кристаллов). Затем добавляют метилциклогексан (объем в восемь раз превышает массу кристаллов) с медленным перемешиванием. Осажденные кристаллы фильтруют и сушат.
Масса полученного таким образом кристаллического 15а-гидрокси-4-андростен-3,17-диона составляет 98 кг, и согласно НРЬС его состав является следующим (выход составляет 70% в пересчете на ферментационный бульон):
15а-гидрокси-4-андростеи-3,17-дион 96,2%
4-андростен-3,17-дион 1,6% другие стероиды 1,2%
При необходимости количество субстратной примеси может быть дополнительно снижено путем повторения последней стадии кристаллизации, но в данном случае это не является необходимым для дальнейших химических стадий.
Claims (5)
1. Способ селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17дикетостероидных соединений из раствора, полученного микробиологическим путем, содержащего смесь стероидных соединений, посредством селективной экстракции, очистки и селективной кристаллизации стероидных соединений, отличающийся тем, что:
а) удаляют биомассу из ферментационного бульона, необязательно после обработки фосфорной ки
- 8 015973 слотой путем фильтрации или центрифугирования выделяют стероидные соединения из фильтрата органическим растворителем, не смешивающимся или частично смешивающимся с водой, селективно удаляют примеси нестероидного типа из органической фазы путем обработки водным раствором и получают сырой продукт, содержащий гидроксилированные стероиды путем добавления воды и выпаривания растворителя, и
б) растворяют стероидные соединения с поверхности профильтрованной биомассы, полученной на стадии а), путем обработки С1-С3 органическим растворителем, представляющим собой алифатический спирт или кетон, или их водным раствором, и получают твердый остаток, содержащий гидроксилированные стероиды, после выпаривания растворителя, затем
в) растворяют остаток, полученный на стадии а), или необязательно - смесь двух сырых остатков, полученных на стадиях а) и б), в С1-С3 органическом растворителе, смешивающемся с водой, представляющем собой алифатический спирт или кетон, или их водный раствор, обесцвечивают раствор активированным углем и выделяют очищенные однородные сырые кристаллы после выпаривания растворителя, и
г) перекристаллизовывают очищенные однородные сырые кристаллы, полученные на стадии в), из смеси хлорированного углеводорода/алифатического или циклоалифатического углеводорода, и выделяют чистый продукт.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют этилацетат, н-пропилацетат или изобутилметилкетон в качестве органического растворителя, не смешивающегося или частично смешивающегося с водой.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что регулируют основность и ионную силу водного раствора, используемого для удаления нестероидных примесей, путем добавления соответствующего количества гидроксидов щелочных металлов или щелочно-земельных металлов и/или их основных солей, таких как карбонаты, гидрокарбонаты, фосфаты, гидрофосфаты, ацетаты.
4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что используют метанол, этанол, пропанол или ацетон в качестве С1-С3 органического растворителя, смешивающегося с водой.
5. Способ по пп.1-4, отличающийся тем, что однородные сырые кристаллы на стадии селективной кристаллизации растворяют в хлорированных углеводородах, предпочтительно в дихлорметане или в дихлорэтане, и в качестве алифатических или циклоалифатических углеводородов используют н-гексан, н-октан, додекан, циклогексан или метилциклогексан.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0600727A HU227238B1 (en) | 2006-09-15 | 2006-09-15 | Process for obtaining selectively monohydroxylated 3,17-diketo steroid compounds, purification and separation thereof |
| PCT/HU2007/000084 WO2008032131A1 (en) | 2006-09-15 | 2007-09-13 | Process for the selective isolation, purification and separation of monohydroxylated 3,17-diketo-steroid compounds |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200970282A1 EA200970282A1 (ru) | 2009-10-30 |
| EA015973B1 true EA015973B1 (ru) | 2012-01-30 |
Family
ID=89987034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200970282A EA015973B1 (ru) | 2006-09-15 | 2007-09-13 | Способ селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2069382B1 (ru) |
| AT (1) | ATE502950T1 (ru) |
| DE (1) | DE602007013426D1 (ru) |
| EA (1) | EA015973B1 (ru) |
| ES (1) | ES2363258T3 (ru) |
| HU (1) | HU227238B1 (ru) |
| PL (1) | PL2069382T3 (ru) |
| SI (1) | SI2069382T1 (ru) |
| WO (1) | WO2008032131A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU227367B1 (en) * | 2007-09-11 | 2011-04-28 | Richter Gedeon Nyrt | Method for producing 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dion |
| CN103172688B (zh) * | 2013-03-29 | 2015-04-08 | 青岛科技大学 | 氢化可的松胶体中活性成分回收方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4035236A (en) * | 1975-10-24 | 1977-07-12 | The Upjohn Company | Process for preparing 9α-hydroxyandrostenedione |
| US4036695A (en) * | 1974-11-23 | 1977-07-19 | Schering Aktiengesellschaft | Process for the preparation of estrene-3,17-dione derivatives |
| WO2004014934A2 (en) * | 2002-08-02 | 2004-02-19 | Poli Industria Chimica Spa | Process and new intermediates for the preparation of steroids with a progestogen activity |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3403862A1 (de) | 1984-02-02 | 1985-08-08 | Schering AG, Berlin und Bergkamen, 1000 Berlin | Verfahren zur herstellung von 15(alpha)-hydroxy-4-androsten-3,17-dion |
-
2006
- 2006-09-15 HU HU0600727A patent/HU227238B1/hu unknown
-
2007
- 2007-09-13 ES ES07804526T patent/ES2363258T3/es active Active
- 2007-09-13 EP EP07804526A patent/EP2069382B1/en active Active
- 2007-09-13 AT AT07804526T patent/ATE502950T1/de not_active IP Right Cessation
- 2007-09-13 WO PCT/HU2007/000084 patent/WO2008032131A1/en active Application Filing
- 2007-09-13 DE DE602007013426T patent/DE602007013426D1/de active Active
- 2007-09-13 SI SI200730603T patent/SI2069382T1/sl unknown
- 2007-09-13 PL PL07804526T patent/PL2069382T3/pl unknown
- 2007-09-13 EA EA200970282A patent/EA015973B1/ru unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4036695A (en) * | 1974-11-23 | 1977-07-19 | Schering Aktiengesellschaft | Process for the preparation of estrene-3,17-dione derivatives |
| US4035236A (en) * | 1975-10-24 | 1977-07-12 | The Upjohn Company | Process for preparing 9α-hydroxyandrostenedione |
| WO2004014934A2 (en) * | 2002-08-02 | 2004-02-19 | Poli Industria Chimica Spa | Process and new intermediates for the preparation of steroids with a progestogen activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU0600727D0 (en) | 2006-11-28 |
| EA200970282A1 (ru) | 2009-10-30 |
| PL2069382T3 (pl) | 2011-08-31 |
| EP2069382A1 (en) | 2009-06-17 |
| EP2069382B1 (en) | 2011-03-23 |
| HUP0600727A3 (en) | 2008-07-28 |
| WO2008032131A1 (en) | 2008-03-20 |
| HU227238B1 (en) | 2010-12-28 |
| HUP0600727A2 (en) | 2008-06-30 |
| DE602007013426D1 (de) | 2011-05-05 |
| ATE502950T1 (de) | 2011-04-15 |
| SI2069382T1 (sl) | 2011-07-29 |
| ES2363258T3 (es) | 2011-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ54495A3 (en) | Process for preparing and/or purification of clavulanic acid | |
| JPS633878B2 (ru) | ||
| JP5107257B2 (ja) | ケノデオキシコール酸の精製方法 | |
| CA2296996C (en) | Purification of lipstatin | |
| CN104844620B (zh) | 一种雷帕霉素的分离纯化方法 | |
| KR20030036183A (ko) | 약제학적으로 허용되는(ｓｓ-ｒｓ)-ｓ-아데노실-ｌ-메티오닌 염의 제조방법 | |
| CN110734467A (zh) | 一种从发酵液中提取纯化多杀霉素的方法 | |
| CN109438538A (zh) | 一种司坦唑醇中间体雄甾-17α-甲基-17β-羟基-3-酮的合成方法 | |
| CA2598565C (en) | Purification of mupirocin | |
| EA015973B1 (ru) | Способ селективного выделения, очистки и разделения моногидроксилированных 3,17-дикетостероидных соединений | |
| US20220372065A1 (en) | Synthesis of cholesterol and vitamin d3 from phytosterols | |
| JP2648507B2 (ja) | 非極性吸着樹脂の使用下に強心性グリコシドを増量しかつ／または単離する方法 | |
| US4198344A (en) | Process for the preparation of polyhydroxylated steroids, lysergol and ergolinic alkaloids | |
| BE1004449A4 (fr) | Procede ameliore pour la preparation de tripeptide aldehydes. | |
| RU2270202C1 (ru) | Способ получения бетулина и лупеола | |
| JP4373080B2 (ja) | ミルベマイシン類の精製法 | |
| FR2498607A1 (fr) | Nouveau procede de preparation de 17a-hydroxy 17b-hydroxyacetyle steroides, produits intermediaires correspondants et produits finals obtenus | |
| RU2644674C1 (ru) | Способ получения 3,3',3'',3'''-(3,8,13,17-тетраметилпорфирин-2,7,12,18-тетраил) тетрапропионовой кислоты (копропорфирина) | |
| CN106589073A (zh) | 提纯纽莫康定b0的方法 | |
| JP2003079391A (ja) | ステロール類及びスタノール類を含有する混合物中のスタノール類を選択的にトランスエステル化する方法 | |
| RU2196600C2 (ru) | Способ получения гликозида, обладающего кардиотоническим действием | |
| US2935520A (en) | Recovery of steroids from fermentation broth | |
| SU704458A3 (ru) | Способ выделени стеринов | |
| JPS6314797A (ja) | ２４−メチレンシクロアルタノ−ルフエルラ酸エステルの分離方法 | |
| CN114605364A (zh) | 一种赤霉素ga4的提取方法 |