CN106589073A - 提纯纽莫康定b0的方法 - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid

Abstract

本发明公开了一种经过工艺优化的纽莫康定B0的纯化方法，包括(1)将纽莫康定B0的发酵液酸化，过滤，浸提，得浸提液；(2)浸提液浓缩混合物中加入硅藻土裹晶，加去离子水离心得到含有纽莫康定B0的白色固体；(3)离心固体加入乙醇溶解，充分搅拌，再加入活性炭，充分搅拌脱色，过滤得到无色滤液；(4)无色滤液浓缩至干，加入甲醇，使浓缩至干的滤液溶解，再加入水，搅拌，使溶清，再加入乙酸乙酯，搅拌析晶，得到潮晶；(5)将所得的潮晶再次使用上述析晶方法，得到潮晶，干燥。该方法在纯度保持不变的基础上，不仅简化了工艺步骤，且降低了生产成本，更有利于工业化大规模生产。

Description

提纯纽莫康定B0的方法
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及纽莫康定B0的工业化生产，具体涉及一种提纯纽莫康定B0的工业化方法。
背景技术
纽莫康定B0是由霉菌Glarea lozoyensis发酵合成的次级代谢产物。Glarealozoyensis发酵产物除目标产物之外，有C0等组份，还包括有大量的色素等其他杂质，因此纽莫康定B0的提取纯化工艺难度较大。
纽莫康定B0 Cas：135575-42-7
纽莫康定C0 Cas：144074-96-4
中国发明专利200910133118.0公开了制备纽莫康定B0的方法，主要步骤是：a)离心纽莫康定B0发酵液，取菌丝体，用甲醇浸提纽莫康定B0；b)降甲醇浸提液蒸干，再用正丁醇浸提纽莫康定B0；c)将正丁醇浸提液蒸干，再用70～80％甲醇浸提纽莫康定B0，过酸性氧化铝柱，收集流出液；d)将纽莫康定B0收集蒸干后，用60～70％甲醇溶解，上HP20吸附树脂，用85～95％甲醇洗脱，收集洗脱液纽莫康定B0纯度在50～65％间；e)将纽莫康定B0收集液蒸干，溶于反相树脂YPR-II，用85～95％甲醇洗脱，收集纽莫康定B0纯度大于90％；f)将纽莫康定B0收集液蒸干后，用甲醇溶解，滴加少量水使之过饱和结晶析出，制得纽莫康定B0，纯度可达到96％。
中国发明专利201110266790.4公开了一种纽莫康定B0的提取纯化方法，主要包括：a)将含有纽莫康定B0的发酵液pH值调至2.0～4.0，过滤，菌渣用低分子醇浸提，得浸提液；b)调整浸提液的醇浓度至30～50％(V/V),pH为6.0～8.0；c)用吸附树脂吸附浸提液后，依次用水、30～50％(V/V)丙酮-水溶液冲洗树脂，然后用pH值为3.0～5.0的50％～80％(V/V)丙酮-酸溶液洗脱树脂，收集富含纽莫康定B0的洗脱液；d)纽莫康定B0洗脱液加水稀释至丙酮浓度为30～50％(V/V),用吸附树脂吸附，用水冲洗树脂后用低分子醇洗脱，收集富含纽莫康定B0的洗脱液；e)以常规方法结晶得纽莫康定B0。
现有技术主要采用的是树脂柱工艺，均未对相关物质C0的检测和控制进行描述，C0是纽莫康定B0的异构体，在结构上的差异表现为一个羟基位置的不同；C0杂质不能在反相色谱中与纽莫康定B0分离，只有通过正相色谱分离。发酵液中的C0杂质一般10％，如果不能得到有效的控制，最后得到的是纽莫康定B0和C0的混合物。C0杂质能参与后续反应，严重影响醋酸卡泊芬净的质量。
中国发明专利201410051009.5公开了一种提纯纽莫康定B0的新方法，通过该方法，能够有效的控制C0的含量，降到C0≤0.2％。该方法为本申请人公司母公司下属的子公司博瑞生物医药泰兴市有限公司开发，但在进行工艺交接时，本发明人发现该方法虽然能够有效的控制C0的含量，使得纽莫康定B0的纯度能够达到99％以上，但在整个工艺中，需要柱层析，柱层析应用于工业化生产时，费时，溶剂使用量大，易造成环境污染，且原料损耗大，使得生产成本大幅提高。
发明内容
为克服中国发明专利201410051009.5所公开的提纯纽莫康定B0的方法的缺点，本发明人优化了该提纯工艺。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种提纯纽莫康定B0的方法，包括以下步骤：
(1)将含有纽莫康定B0的发酵液pH调至2.0～4.0，过滤，菌渣用低分子醇浸提，得浸提液；
(2)将步骤(1)所得的浸提液蒸馏出低分子醇，并浓缩至浓缩混合物中液体所含的纽莫康定B0≤100mg/L，然后向浸提液浓缩混合物中加入硅藻土裹晶，加去离子水离心得到含有纽莫康定B0的白色固体；
(3)将步骤(2)所得的离心固体加入乙醇溶解，充分搅拌，再加入活性炭，充分搅拌脱色，过滤得到无色滤液；
(4)将步骤(3)所得的无色滤液浓缩至干，加入非均相溶剂体系，溶解，析晶，得到潮晶；
(5)将步骤(4)所得的潮晶再次加入非均相溶剂体系，溶解，析晶，得到潮晶，并在温度45.0～50.0℃，真空度≤-0.07MPa的条件下干燥得成品。
所述步骤(1)，优选将pH调节至3.0，优选使用草酸进行调节，低分子醇为乙醇。
所述步骤(2)中硅藻土的目数为100～150，所述硅藻土的加入重量为浸提液浓缩混合物重量的3～6倍，并使硅藻土充分吸附浸提液浓缩混合物中的纽莫康定B0；所述去离子水的加入重量为浸提液浓缩混合物与硅藻土的重量之和，加入去离子水后并充分搅拌。
所述步骤(3)中加入的乙醇的重量为离心固体重量的2～4倍；所述活性炭的目数为140～200，所述活性炭的加入重量为离心固体重量的0.05～0.1倍。
所述步骤(4)和(5)中，非均相溶剂体系为甲醇：水：乙酸乙酯。其中，甲醇：乙酸乙酯：水的体积比优选3：8：1。控制温度为0-5摄氏度，先加入甲醇，使浓缩至干的滤液溶解，再加入水，搅拌，使溶清，再加入乙酸乙酯，搅拌析晶。
所述步骤(5)中干燥时间为18～24h；干燥后固体水份≤2％。
步骤(2)、(4)中的所述的浓缩为真空条件下，浓缩温度≤50℃，真空度≤-0.07MPa。
本发明所提供的优化过的提纯纽莫康定B0的方法，具有以下有益效果：
1.将原发明步骤(1)纽莫康定B0的发酵液的pH值做了进一步的优化，使得浸提液的纯度上升。
2.将原发明步骤(4)的柱层析和步骤(5)中的多相溶剂体系结晶改为在非均相溶剂体系中溶解析晶，简化了纯化步骤，同时降低了生产成本。
本发明人发现经过优化的纯化方法，在纯度基本能保持同原发明一样的基础上，不仅简化了工艺步骤，且降低了生产成本，更有利于工业化大规模生产。
具体实施例
实施例1
11吨发酵液先转移到酸化罐，用草酸将发酵液的pH值调至3.0，板框压滤。得菌渣1200kg，加入6吨75％的乙醇溶液，搅拌6小时，再次板框压滤，得浸提液6吨。
浸提液再次转移到1000L搪瓷釜中，控制温度≤50℃，真空度≤-0.07MPa真空浓缩，浓缩过程中，观察料液变浑浊后，取样离心，清液送检含量，当清液中纽莫康定B0含量48mg/L时停止浓缩，得浸提液浓缩混合物50kg；浸提液浓缩混合物中加入200kg规格为100目的硅藻土充分吸附，裹晶，再加入250kg去离子水搅拌，离心，得到含有纽莫康定B0的白色固体，收集离心固体260kg。
将260kg离心固体用800kg的乙醇溶解，搅拌1小时，加入20kg规格为140目的活性炭，搅拌2小时，脱色，过滤得无色滤液。无色滤液在釜内控制温度≤50℃，真空度≤-0.07MPa下浓缩，浓缩至干后，控制温度为0-5摄氏度，加入210L甲醇，使使浓缩至干的滤液溶解，再加入70L的水，搅拌，使溶清，再加入560L的乙酸乙酯，搅拌析晶，得到潮晶，再次使用上述析晶方法，得到潮晶15.0kg。
将潮晶放入真空干燥箱，控制浓缩温度45.0～50.0℃，真空度≤-0.07MPa，干燥20h，即得到成品13.5kg，水份1.05％，相关物质C0正相纯度0.03％，纽莫康定B0正相纯度99.97％，反相纯度99.2％。

Claims (2)

1.一种提纯纽莫康定B0的方法，包括以下步骤：
(1)将含有纽莫康定B0的发酵液pH调至3.0，过滤，菌渣用75％乙醇浸提，得浸提液；
(2)将步骤(1)所得的浸提液蒸馏出乙醇，并浓缩至浓缩混合物中液体所含的纽莫康定B0≤100mg/L，然后向浸提液浓缩混合物中加入硅藻土裹晶，加去离子水离心得到含有纽莫康定B0的白色固体；
(3)将步骤(2)所得的离心固体加入乙醇溶解，充分搅拌，再加入活性炭，充分搅拌脱色，过滤得到无色滤液；
(4)将步骤(3)所得的无色滤液浓缩至干，加入甲醇，使浓缩至干的滤液溶解，再加入水，搅拌，使溶清，再加入乙酸乙酯，搅拌析晶，得到潮晶；
(5)将步骤(4)所得的潮晶再次使用上述析晶方法，并在温度45.0～50.0℃，真空度≤-0.07MPa的条件下干燥得成品。
所述步骤(2)中硅藻土的目数为100～150，所述硅藻土的加入重量为浸提液浓缩混合物重量的3～6倍，并使硅藻土充分吸附浸提液浓缩混合物中的纽莫康定B0；所述去离子水的加入重量为浸提液浓缩混合物与硅藻土的重量之和，加入去离子水后并充分搅拌。
所述步骤(3)中加入的乙醇的重量为离心固体重量的2～4倍；所述活性炭的目数为140～200，所述活性炭的加入重量为离心固体重量的0.05～0.1倍。
所述步骤(5)中干燥时间为18～24h；干燥后固体水份≤2％。
步骤(2)、(4)中的所述的浓缩为真空条件下，浓缩温度≤50℃，真空度≤-0.07MPa。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(4)和(5)中的甲醇：乙酸乙酯：水的体积比为3：8：1。
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