CN110845449A - 一种红豆杉提取紫杉醇的方法 - Google Patents

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李坤
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Abstract

本发明提供了一种红豆杉提取紫杉醇的方法，包括步骤；首先将硝酸铵溶液与甲醇复配后制成混合溶液M1；将红豆杉属植物的组织加入溶液M1，搅拌浸提、压滤除去糟渣后，将滤液加入萃取相M2(乙酸乙酯：丙酮＝1：1)，搅拌，静置；待完全分层后，去除下部杂质部分，留上层油相溶液；收集上层油相溶液减压浓缩，在浓缩液中加入反萃取相溶剂石油醚，当石油醚加完后，出现絮状沉淀，离心去除溶剂后收集沉淀物；使用两次硅胶柱层析，得到紫杉醇粗品，最后用反相高压液相色谱分离法得到99.6％以上的高纯度紫杉醇。该方法工艺简单、成本低、溶剂、洗脱剂可以回收，适合于工业化生产，且保护了植物资源。

Description

一种红豆杉提取紫杉醇的方法
技术领域
本发明涉及药物提取技术领域，具体涉及一种红豆杉提取紫杉醇的方法。
背景技术
紫杉醇，英文名称Paclitaxel，别名泰素，紫素，特素，化学名称5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R，3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]，分子量853.92，分子式C47H51NO14。它是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。紫杉醇目前主要应用于卵巢癌和乳腺癌的治疗，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤和脑瘤也都有一定疗效。因此，紫杉醇原料药的生产具有广阔的市场前景。
对于红豆杉提取紫杉醇的分离纯化多为使用低级醇溶剂浸提树皮，提取液先进行脱脂后氯仿萃取；氯仿层浓缩，经柱层析得到紫杉醇及其类似物。常用的色谱柱层析法需要多次正、反相液相色谱法、离心分配色谱法等，还包括结晶法、氧化去杂质法。分离过程步骤繁琐，达到99％以上纯度的紫杉醇一次得率较低。溶剂、洗脱液等毒性大，造成严重的污染。此外，紫杉醇与三尖杉宁碱、7-表-紫杉醇和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的性质相似，难以分离，从紫杉醇样品中有效剔除这些结构类似物是提取高纯度紫杉醇的关键所在。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红豆杉提取紫杉醇的方法，该方法工艺简单，易于分离掉紫杉醇的结构类似物，所得的紫杉醇纯度高。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种红豆杉提取紫杉醇的方法，包括如下步骤：
(1)用纯净水配制浓度为6-32％的硝酸铵溶液D1，调节pH值6.0±0.2，加入甲醇(≥98％)混合，制成混合溶液M1，备用：所述M1中按体积比计，D1：甲醇＝1：1-8；
(2)将红豆杉树皮或枝叶干燥粉碎至80-90目，加入其质量2-4倍的溶液M1，进行进行浸提3-4次，每次将提取液搅拌浸提2-4小时后，将压滤除去糟渣，将滤液加入其体积0.8-1.2倍的萃取相M2(按体积比计，乙酸乙酯：丙酮＝1：1)，搅拌0.5-2小时，静置；
(3)待完全分层后，去除下部杂质部分，留上层油相溶液；
(4)收集上层油相溶液，50-55℃下减压浓缩，当浓缩液体积为所收集的油相体积的1/6-1/4倍时，停止浓缩；
(5)在浓缩液中加入其体积3-6倍的反萃取相溶剂石油醚，边加边搅拌；石油醚加完后，出现絮状沉淀，离心去除溶剂，收集沉淀物，置于40-45℃真空干燥；
(6)200～300目硅胶干法装柱，将步骤(5)干燥后所得的产品掺入与产品等质量的200～300目硅胶上样，氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，所得洗脱流份减压回收至油状，再用丙酮溶解、过滤，滤液加正己烷搅拌均匀，放置后抽滤，抽滤所得滤饼减压干燥，再用正己烷溶解，加等量硅胶拌样，减压干燥后粉碎；
(7)200～300目硅胶干法装柱，用步骤(6)所得的产品上样，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC及HPLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，减压回收至干得紫杉醇粗品；
(8)将2％以上紫杉醇粗粗品同硅胶混合制备干样，填充了干样到硅胶(300～400目)的色谱柱上端，分别用4∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶5的石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯洗脱，按段将紫杉醇含量在15％～40％之间的洗脱液馏分集中起来，经浓缩、干燥，制得中间产品；
(9)将步骤(8)所得的中间产品用体积比为30∶70的乙腈和含0.1％三氟醋酸水溶解，用高压液相色谱分离，色谱柱为C18硅胶填料，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的乙腈和含0.1％三氟醋酸水为流动相，收集洗脱液，浓缩，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。
(10)所得的混合物经离心，水洗，再离心，水洗，过滤，冷冻干燥，得到纯度为99.6％以上的紫杉醇。
优选地，所述步骤(1)中，D1：甲醇＝1：4。
优选地，所述步骤(1)中，硝酸铵溶液的浓度为15-25％，更优选地，所述硝酸铵溶液的浓度为20％。
进一步的，所述步骤(2)中的红豆杉为曼地亚红豆杉、云南红豆杉或东北红豆杉。
进一步的，所述的步骤(9)中的三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐浓度为2～15mg/mL。
进一步的，所述的步骤(9)中的流动相乙腈-0.1％三氟醋酸水的体积比为30∶70。
进一步的，所述的步骤(9)所得到的三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐，经过水洗，离心过滤，冷冻干燥后可重复使用。
本发明通过试验表明：硝酸铵溶液与甲醇混合液M1中D1：甲醇＝1：4最稳定，油相与水相分层最好，产率最高，因此，该配比为稳定值。而不同仅硝酸铵含量对紫杉醇提取指标的影响是不同的，见表1。
表1不同仅硝铵含量对紫杉醇提取指标的影响(红豆杉树皮)
D1(％) 5 10 15 20 25 30
P1(％) 6.85 6.69 6.57 6.44 6.22 5.93
P2(％) 0.084 0.091 0.095 0.098 0.098 0.099
收率(％) 84.2 88.6 91.5 92.4 89.2 85.9
*D1为硝酸铵在水溶液含量，P1为浸膏占红豆杉干重质量分数，P2为紫杉醇占浸膏质量分数。
从表1可以看出：硝酸铵含量为20％时，所得浸膏仅为植物干重的6.44％，紫杉醇的含量平均高达浸膏的0.098％。而目前单用甲醇提取所得浸膏为植物干重的20.98％，紫杉醇的含量为浸膏的0.027％，尚需要多次抽提才能得到紫杉醇含量较高的浸膏。综上，本发明得硝酸铵含量在20％左右时提取效果最好，且粗提物的紫杉醇含量高达0.098％，远高于单用甲醇的提取效果。
与现有技术相对，本发明具有以下有益效果：
本发明采用溶剂提取法从红豆杉中制备紫杉醇，避免了现有超临界提取方法操作条件严格等较难工业化生产的弊端，通过创造性地理论分析结合正交试验得出从红豆杉中提取紫杉醇的最佳工艺条件。本发明采用硝酸铵和甲醇混配得到浸提液，从而为红豆杉浸膏工艺提供适宜的工艺条件，并经乙酸乙酯和丙酮萃取得到提取物；使用两次硅胶柱层析除去极性杂质，分离得到含紫杉醇粗提物；最后用反相高压液相色谱分离法得到99.6％以上的高纯度紫杉醇，工艺转移率为80％以上，能很好地解决目前紫杉醇医药临床应用存在的技术难题。
本发明的提取方法中使用的所有试剂均为工业级，创新性强，且工艺步骤简单，分离成本较低，产品收率较大，对于紫杉醇的工业分离制备生产具有创新性的应用价值。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种红豆杉提取紫杉醇的方法，包括如下步骤：
(1)用纯净水配制浓度为15％的硝酸铵溶液D1，调节pH值6.0±0.2，加入甲醇(≥98％)混合，制成混合溶液M1，备用：所述M1中按体积比计，D1：甲醇＝1：4；
(2)将红豆杉树皮或枝叶干燥粉碎至80-90目，加入其质量2倍的溶液M1，进行进行浸提3次，每次将提取液搅拌浸提2小时后，将压滤除去糟渣，将滤液加入其体积0.8倍的萃取相M2(按体积比计，乙酸乙酯：丙酮＝1：1)，搅拌0.5小时，静置；
(3)待完全分层后，去除下部杂质部分，留上层油相溶液；
(4)收集上层油相溶液，50℃下减压浓缩，当浓缩液体积为所收集的油相体积的1/6倍时，停止浓缩；
(5)在浓缩液中加入其体积3倍的反萃取相溶剂石油醚，边加边搅拌；石油醚加完后，出现絮状沉淀，离心去除溶剂，收集沉淀物，置于40℃真空干燥；
(6)200～300目硅胶干法装柱，将步骤(5)干燥后所得的产品掺入与产品等质量的200～300目硅胶上样，氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，所得洗脱流份减压回收至油状，再用丙酮溶解、过滤，滤液加正己烷搅拌均匀，放置后抽滤，抽滤所得滤饼减压干燥，再用正己烷溶解，加等量硅胶拌样，减压干燥后粉碎；在本实施例中，取200～300目硅胶40g干法装柱，用氯仿预平衡。上样后用氯仿-甲醇梯度洗脱，具体为：氯仿300mL，氯仿-甲醇(100:1，v/v)400mL，氯仿-甲醇(100:1.5，v/v)300mL。用TLC检测流份，TLC条件：硅胶预制板；以氯仿-甲醇(94:6，v/v)展开；5％(体积比浓度)硫酸：水溶液吹热风显##色。每15mL收集一个流份，共收集了71个流份。紫杉醇主要集中在49到60流份中，即氯仿-甲醇(100:1.5，v/v)洗脱下来的溶液。合并上述流份，减压回收至干得到紫杉醇粗提物170.38mg。
(7)200～300目硅胶干法装柱，用步骤(6)所得的产品上样，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC及HPLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，减压回收至干得紫杉醇粗品；在本实施例中，取200～300目硅胶15g干法装柱，用正己烷预平衡，然后用上述紫杉醇流份上样。以正己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)洗脱300mL，约10mL一个流份，收集29个流份；正己烷-乙酸乙酯(8:3，v/v)洗脱100mL，约5mL一个流份，收集了17个流份；正己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)洗脱160mL，约8mL一个流份，收集了20个流份；正己烷-乙酸乙酯(6:4，v/v)洗脱100mL，约10mL一个流份，收集了11个流份；正己烷-乙酸乙酯(5:5，v/v)洗脱300mL，约10mL一个流份，收集了38个流份。TLC检识流份，发现紫杉醇主要集中在94到120流份中，即正己烷-乙酸乙酯(5:5，v/v)洗脱下来的部分流份中。合并流份，减压回收至干，丙酮-正己烷重结晶，分离得到紫杉醇粗品50.2mg。HPLC-UV法检测，二次柱层析分离得到紫杉醇粗品中紫杉醇含量约47.90％。
(8)将2％以上紫杉醇粗粗品同硅胶混合制备干样，填充了干样到硅胶(300～400目)的色谱柱上端，分别用4∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶5的石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯洗脱，按段将紫杉醇含量在15％～40％之间的洗脱液馏分集中起来，经浓缩、干燥，制得中间产品；在本实施例中，分别用0.3L的石油醚-乙酸乙酯(4∶1)、0.3L的石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、0.5L的石油醚-乙酸乙酯(1∶5)和0.2L乙酸乙酯洗脱，用相同体积的容器接收得到相同体积的馏分1-20。馏分6-8中，含有较多7-表-10-去乙酰基紫杉醇及7-表紫杉醇，馏分9-15蒸干后，为黄色或绿黄色固体粉末。馏分9-15中紫杉醇含量在15.0％～35.0％之间。
(9)将步骤(8)所得的中间产品用体积比为30∶70的乙腈和含0.1％三氟醋酸水溶解，用高压液相色谱分离，色谱柱为C18硅胶填料，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的乙腈和含0.1％三氟醋酸水为流动相，收集洗脱液，浓缩，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。在本实施例中，称取含量27.5％紫杉醇样品10克，用50ml的乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)溶解，经C18反相高压液相色谱法分离纯化，加入27.5％紫杉醇乙腈-水溶液，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐(3mg/mL)的乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)为流动相，流速为1ml/min，收集馏分1-35。馏分1-14蒸干后分析表明为杂质组分，含有较多量三尖杉宁碱，少量紫杉醇(2.8％以下)及10-去乙酰基紫杉醇。馏分15-25，浓缩到一定体积，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。
(10)所得的混合物经离心，水洗，再离心，水洗，过滤，冷冻干燥，得到纯度为99.6％以上的紫杉醇。所得到的三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐，经过水洗，离心过滤，冷冻干燥后可重复使用。
该产品为白色结晶，旋光度[α]D25＝-54.6(c＝0.2，MeOH)，熔点为236～237℃，500MHz核磁共振图谱验证与紫杉醇标样相同，高分辨质谱(HR-ESI-MS)m/z+854.3397([M+H])，相应的分子式为C47H51NO14。该产品与标准样品在HPLC分析中保留时间一致。
实施例2
一种红豆杉提取紫杉醇的方法，包括如下步骤：
(1)用纯净水配制浓度为20％的硝酸铵溶液D1，调节pH值6.0±0.2，加入甲醇(≥98％)混合，制成混合溶液M1，备用：所述M1中按体积比计，D1：甲醇＝1：4；
(2)将红豆杉树皮或枝叶干燥粉碎至80-90目，加入其质量4倍的溶液M1，进行进行浸提4次，每次将提取液搅拌浸提4小时后，将压滤除去糟渣，将滤液加入其体积1.2倍的萃取相M2(按体积比计，乙酸乙酯：丙酮＝1：1)，搅拌2小时，静置；
(3)待完全分层后，去除下部杂质部分，留上层油相溶液；
(4)收集上层油相溶液，55℃下减压浓缩，当浓缩液体积为所收集的油相体积的1/4倍时，停止浓缩；
(5)在浓缩液中加入其体积6倍的反萃取相溶剂石油醚，边加边搅拌；石油醚加完后，出现絮状沉淀，离心去除溶剂，收集沉淀物，置于45℃真空干燥；
(6)200～300目硅胶干法装柱，将步骤(5)干燥后所得的产品掺入与产品等质量的200～300目硅胶上样，氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，所得洗脱流份减压回收至油状，再用丙酮溶解、过滤，滤液加正己烷搅拌均匀，放置后抽滤，抽滤所得滤饼减压干燥，再用正己烷溶解，加等量硅胶拌样，减压干燥后粉碎；在本实施例中，取200～300目硅胶50g干法装柱，用氯仿预平衡。上样后用氯仿-甲醇梯度洗脱，具体为：氯仿400mL，氯仿-甲醇(120:1，v/v)550mL，氯仿-甲醇(120:2，v/v)350mL。用TLC检测流份，TLC条件：硅胶预制板；以氯仿-甲醇(100:6，v/v)展开；5％(体积比浓度)硫酸：水溶液吹热风显色。每20mL收集一个流份，共收集了81个流份。紫杉醇主要集中在50到65流份中，即氯仿-甲醇(120:2，v/v)洗脱下来的溶液。合并上述流份，减压回收至干得到紫杉醇粗提物179.38mg。
(7)200～300目硅胶干法装柱，用步骤(6)所得的产品上样，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC及HPLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，减压回收至干得紫杉醇粗品；在本实施例中，取200～300目硅胶20g干法装柱，用正己烷预平衡，然后用上述紫杉醇流份上样。以正己烷-乙酸乙酯(10:3，v/v)洗脱400mL，约20mL一个流份，收集35个流份；正己烷-乙酸乙酯(10:3，v/v)洗脱200mL，约10mL一个流份，收集了29个流份；正己烷-乙酸乙酯(10:4，v/v)洗脱180mL，约10mL一个流份，收集了30个流份；正己烷-乙酸乙酯(8:5，v/v)洗脱150mL，约15mL一个流份，收集了18个流份；正己烷-乙酸乙酯(8:5，v/v)洗脱350mL，约20mL一个流份，收集了48个流份。TLC检识流份，发现紫杉醇主要集中在95到130流份中，即正己烷-乙酸乙酯(8:5，v/v)洗脱下来的部分流份中。合并流份，减压回收至干，丙酮-正己烷重结晶，分离得到紫杉醇粗品58.2mg。HPLC-UV法检测，二次柱层析分离得到紫杉醇粗品中紫杉醇含量约60.90％。
(8)将2％以上紫杉醇粗粗品同硅胶混合制备干样，填充了干样到硅胶(300～400目)的色谱柱上端，分别用4∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶5的石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯洗脱，按段将紫杉醇含量在15％～40％之间的洗脱液馏分集中起来，经浓缩、干燥，制得中间产品；在本实施中，分别用30L的石油醚-乙酸乙酯(4∶1)、30L的石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、50L的石油醚-乙酸乙酯(1∶5)和20L乙酸乙酯洗脱液，每10L收集一个馏分，用相同体积的容器接收得到相同体积的馏分1-20。馏分9-15蒸干后，为黄色或绿黄色固体粉末。馏分9-15中紫杉醇含量在15.0％～30.0％之间。
(9)将步骤(8)所得的中间产品用体积比为30∶70的乙腈和含0.1％三氟醋酸水溶解，用高压液相色谱分离，色谱柱为C18硅胶填料，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的乙腈和含0.1％三氟醋酸水为流动相，收集洗脱液，浓缩，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。在本实施例中，)将紫杉醇含量在20.3％的样品，溶解于乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)中，经C18反相高压液相色谱法分离，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐(5mg/mL)的乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)为流动相，流速为1ml/min，收集馏分1-35。馏分15-25，浓缩，得到紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。
(10)所得的混合物经离心，水洗，再离心，水洗，过滤，冷冻干燥，得到纯度为99.7％以上的紫杉醇。
实施例3
一种红豆杉提取紫杉醇的方法，包括如下步骤：
(1)用纯净水配制浓度为18％的硝酸铵溶液D1，调节pH值6.0±0.2，加入甲醇(≥98％)混合，制成混合溶液M1，备用：所述M1中按体积比计，D1：甲醇＝1：4；
(2)将红豆杉树皮或枝叶干燥粉碎至80-90目，加入其质量3倍的溶液M1，进行进行浸提4次，每次将提取液搅拌浸提3小时后，将压滤除去糟渣，将滤液加入其体积1倍的萃取相M2(按体积比计，乙酸乙酯：丙酮＝1：1)，搅拌1.2小时，静置；
(3)待完全分层后，去除下部杂质部分，留上层油相溶液；
(4)收集上层油相溶液，52℃下减压浓缩，当浓缩液体积为所收集的油相体积的1/5倍时，停止浓缩；
(5)在浓缩液中加入其体积4倍的反萃取相溶剂石油醚，边加边搅拌；石油醚加完后，出现絮状沉淀，离心去除溶剂，收集沉淀物，置于42℃真空干燥；
(6)200～300目硅胶干法装柱，将步骤(5)干燥后所得的产品掺入与产品等质量的200～300目硅胶上样，氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，所得洗脱流份减压回收至油状，再用丙酮溶解、过滤，滤液加正己烷搅拌均匀，放置后抽滤，抽滤所得滤饼减压干燥，再用正己烷溶解，加等量硅胶拌样，减压干燥后粉碎；在本实施例中，取200～300目硅胶45g干法装柱，用氯仿预平衡。上样后用氯仿-甲醇梯度洗脱，具体为：氯仿350mL，氯仿-甲醇(100:1，v/v)500mL，氯仿-甲醇(100:2，v/v)300mL。用TLC检测流份，TLC条件：硅胶预制板；以氯仿-甲醇(95:6，v/v)展开；5％(体积比浓度)硫酸：水溶液吹热风显色。每18mL收集一个流份，共收集了75个流份。紫杉醇主要集中在50到65流份中，即氯仿-甲醇(120:2，v/v)洗脱下来的溶液。合并上述流份，减压回收至干得到紫杉醇粗提物174.38mg。
(7)200～300目硅胶干法装柱，用步骤(6)所得的产品上样，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC及HPLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，减压回收至干得紫杉醇粗品；在本实施例中，取200～300目硅胶16g干法装柱，用正己烷预平衡，然后用上述紫杉醇流份上样。以正己烷-乙酸乙酯(9:3，v/v)洗脱350mL，约18mL一个流份，收集30个流份；正己烷-乙酸乙酯(8:3，v/v)洗脱180mL，约8mL一个流份，收集了25个流份；正己烷-乙酸乙酯(8:4，v/v)洗脱160mL，约8mL一个流份，收集了25个流份；正己烷-乙酸乙酯(8:5，v/v)洗脱150mL，约15mL一个流份，收集了18个流份；正己烷-乙酸乙酯(7:5，v/v)洗脱300mL，约15mL一个流份，收集了40个流份。TLC检识流份，发现紫杉醇主要集中在90到120流份中，即正己烷-乙酸乙酯(6:5，v/v)洗脱下来的部分流份中。合并流份，减压回收至干，丙酮-正己烷重结晶，分离得到紫杉醇粗品53.2mg。HPLC-UV法检测，二次柱层析分离得到紫杉醇粗品中紫杉醇含量约56.90％。
(8)将2％以上紫杉醇粗粗品同硅胶混合制备干样，填充了干样到硅胶(300～400目)的色谱柱上端，分别用4∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶5的石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯洗脱，按段将紫杉醇含量在15％～40％之间的洗脱液馏分集中起来，经浓缩、干燥，制得中间产品；在本实施中，分别用30L的石油醚-乙酸乙酯(4∶1)、30L的石油醚-乙酸乙酯(1∶1)、50L的石油醚-乙酸乙酯(1∶5)和20L乙酸乙酯洗脱液，每10L收集一个馏分，用相同体积的容器接收得到相同体积的馏分1-20。馏分9-15蒸干后，为黄色或绿黄色固体粉末。馏分9-15中紫杉醇含量在15.0％～30.0％之间。
(9)将步骤(8)所得的中间产品用体积比为30∶70的乙腈和含0.1％三氟醋酸水溶解，用高压液相色谱分离，色谱柱为C18硅胶填料，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的乙腈和含0.1％三氟醋酸水为流动相，收集洗脱液，浓缩，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。在本实施例中，)将紫杉醇含量在20.3％的样品，溶解于乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)中，经C18反相高压液相色谱法分离，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐(5mg/mL)的乙腈和含0.1％三氟醋酸水(30∶70)为流动相，流速为1ml/min，收集馏分1-35。馏分15-25，浓缩，得到紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。
(10)所得的混合物经离心，水洗，再离心，水洗，过滤，冷冻干燥，得到纯度为99.6％以上的紫杉醇。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种红豆杉提取紫杉醇的方法，其特征在于,包括如下步骤：
(1)用纯净水配制浓度为6-32％的硝酸铵溶液D1，调节pH值6.0±0.2，加入甲醇(≥98％)混合，制成混合溶液M1，备用：所述M1中按体积比计，D1：甲醇＝1：1-8；
(2)将红豆杉树皮或枝叶干燥粉碎至80-90目，加入其质量2-4倍的溶液M1，进行进行浸提3-4次，每次将提取液搅拌浸提2-4小时后，将压滤除去糟渣，将滤液加入其体积0.8-1.2倍的萃取相M2(按体积比计，乙酸乙酯：丙酮＝1：1)，搅拌0.5-2小时，静置；
(3)待完全分层后，去除下部杂质部分，留上层油相溶液；
(4)收集上层油相溶液，50-55℃下减压浓缩，当浓缩液体积为所收集的油相体积的1/6-1/4倍时，停止浓缩；
(5)在浓缩液中加入其体积3-6倍的反萃取相溶剂石油醚，边加边搅拌；石油醚加完后，出现絮状沉淀，离心去除溶剂，收集沉淀物，置于40-45℃真空干燥；
(6)200～300目硅胶干法装柱，将步骤(5)干燥后所得的产品掺入与产品等质量的200～300目硅胶上样，氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，所得洗脱流份减压回收至油状，再用丙酮溶解、过滤，滤液加正己烷搅拌均匀，放置后抽滤，抽滤所得滤饼减压干燥，再用正己烷溶解，加等量硅胶拌样，减压干燥后粉碎；
(7)200～300目硅胶干法装柱，用步骤(6)所得的产品上样，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC及HPLC检识到紫杉醇后收集含有紫杉醇的洗脱流份，减压回收至干得紫杉醇粗品；
(8)将2％以上紫杉醇粗粗品同硅胶混合制备干样，填充了干样到硅胶(300～400目)的色谱柱上端，分别用4∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶1的石油醚-乙酸乙酯、1∶5的石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯洗脱，按段将紫杉醇含量在15％～40％之间的洗脱液馏分集中起来，经浓缩、干燥，制得中间产品；
(9)将步骤(8)所得的中间产品用体积比为30∶70的乙腈和含0.1％三氟醋酸水溶解，用高压液相色谱分离，色谱柱为C18硅胶填料，以含三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐的乙腈和含0.1％三氟醋酸水为流动相，收集洗脱液，浓缩，析出紫杉醇晶体和三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐固体的混合物。
(10)所得的混合物经离心，水洗，再离心，水洗，过滤，冷冻干燥，得到纯度为99.6％以上的紫杉醇。
2.根据权利要求1所述的一种红豆杉提取紫杉醇的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，D1：甲醇＝1：4。
3.根据权利要求1所述的一种红豆杉提取紫杉醇的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，硝酸铵溶液的浓度为15-25％，更优选地，所述硝酸铵溶液的浓度为20％。
4.根据权利要求1所述的一种红豆杉提取紫杉醇的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的红豆杉为曼地亚红豆杉、云南红豆杉或东北红豆杉。
5.根据权利要求1所述的一种红豆杉提取紫杉醇的方法，其特征在于：所述的步骤(9)中的三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐浓度为2～15mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种红豆杉提取紫杉醇的方法，其特征在于：所述的步骤(9)中的流动相乙腈-0.1％三氟醋酸水的体积比为30∶70。
7.根据权利要求1所述的一种红豆杉提取紫杉醇的方法，其特征在于：所述的步骤(9)所得到的三氟醋酸十八烷基吡啶季銨盐，经过水洗，离心过滤，冷冻干燥后可重复使用。
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