JP3445209B2 - 粗リプスタチンからのリプスタチンの精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、リプスタチンの精製方法に関す
る。更に詳細には、本発明は、例外的に高い収率及び純
度で粗リプスタチンからリプスタチンを単離する手段と
しての、複流抽出の形の液−液抽出と、向流抽出の形の
再抽出とを組合せた方法に関する。

【０００２】リプスタチンは、肥満に伴う疾患の予防及
び治療において有用な、テトラヒドロリプスタチン（Ｔ
ＨＬ、オルリスタット（Orlistat））の製造の重要な中
間体として相当に重要である。

【０００３】リプスタチン、その産生のための発酵法、
微生物からのその単離方法及びテトラヒドロリプスタチ
ンへのその水素化法は、既知であり、そして例えば米国
特許第４，５９８，０８９号明細書に記載されている。

【０００４】リプスタチンは、下記式（Ｉ）のように描
かれる：

【０００５】

【化１】

【０００６】粗リプスタチンの製造方法はまた、ヨーロ
ッパ特許出願第９６１０６５９８号明細書に記載されて
いる。この方法は、放線菌（actinomycetes）の目の微
生物、例えば、ストレプトミセス・トキシトリチニ（St
reptomyces toxytricini）を好気的に培養することを特
徴とするが、この菌は、初期増殖相が実質的に終わり、
かつ充分な細胞量が産生されるまで、実質的に油脂を含
まず、かつ適切な炭素及び窒素源、並びに無機塩を含有
する水性培地中にリプスタチンを産生する。次に抗酸化
剤と一緒に（及び場合によりカプリル酸と一緒に）リノ
レン酸、及びＮ−ホルミル−Ｌ−ロイシン又は好ましく
はＬ−ロイシンがブロスに加えられる。発酵の完了後、
発酵ブロスを抽出する。産生される粗リプスタチンは、
例えば、米国特許第４，５９８，０８９号明細書に記載
されるクロマトグラフィー法により、更に濃縮及び精製
することができる。

【０００７】純粋なリプスタチンを入手するための、多
工程クロマトグラフィープロトコール又は多工程クロマ
トグラフィーと組合せたリプスタチンを濃縮するための
液−液抽出は、粗リプスタチンの精製のための先行技術
の方法に特色を与える。これらの方法は、典型的には実
験室規模での発酵代謝物の単離のために使用される。し
かし、これらの方法は、一般に経済的な大規模なプロセ
スには適していない。

【０００８】蒸留により粗リプスタチンを精製するため
の試みは失敗に終わった。リプスタチンは、６０℃で数
時間安定であるが、その低い蒸気圧（７×１０^-7mbar）
のため、この温度での真空蒸留（＜２mbar）は実現可能
ではない。より高温では、リプスタチンは二酸化炭素の
脱離により分解される。

【０００９】粗リプスタチンはまた、−２０℃未満の温
度でのリプスタチンの結晶化により精製することができ
る。しかし低温結晶化のための高価な専門装置を必要と
し、この結晶化の収率は、粗リプスタチンの品質に強く
依存している。特に低い品質の粗リプスタチンでは、リ
プスタチンは結晶化により低い収率で得られる。

【００１０】本発明は、低い品質の粗原料であっても、
高い収率及び純度で粗リプスタチンからリプスタチンを
精製するための、新規で単純かつ安価な方法を提供す
る。

【００１１】粗リプスタチンからリプスタチンを精製す
るための本発明の方法は、 ａ）脂肪族又は芳香族炭化水素から選択される非極性溶
媒から、カルボン酸、アルコール、Ｏ−モノ置換のモノ
−もしくはオリゴエチレングリコール、ジオール又は双
極性非プロトン性溶媒から選択される極性溶媒へのリプ
スタチンの液−液抽出工程、続いて ｂ）水による極性溶媒相の希釈又は相比の変更、及び新
しい非極性溶媒へのリプスタチンの再抽出工程、 を含む。

【００１２】本明細書において本発明を記述するために
使用される種々の用語の意味及び範囲を説明及び定義す
るために、以下の定義が示される。

【００１３】「複流抽出」という用語は、２溶媒向流抽
出を意味する。この抽出は、下記の図に示されるように
行われる：

【００１４】

【化２】

【００１５】相互溶解度が低い２つの溶媒は、抽出ユニ
ットの頂上部と底部に導入する。分離すべき混合物（供
給材料）は、洗浄溶媒と組合せることを除いてどこにで
も、好ましくは抽出ユニットの中央に導入することがで
きる。上図において、抽出は、抽出溶媒及び抽出物が、
それぞれ高密度の溶媒を含有（重相）し、かつ洗浄溶媒
及びラフィネートが、それぞれ低密度の溶媒を含有（軽
相）する形で行われる。

【００１６】「向流抽出」という用語は、抽出すべき物
質（供給材料）が、使用される溶媒の１つと一緒に加え
られることを意味する。この場合に、洗浄区画が省かれ
るため、精製すべき化合物からの不純物の分離は、複流
抽出の場合ほど高くない。

【００１７】向流抽出は、下記の図に示されるように行
われる：

【００１８】

【化３】

【００１９】供給材料と一緒に１つの溶媒及び相互溶解
度が低い別の溶媒は、抽出ユニットの頂上部及び底部に
導入する。一方の出口で、標的物質が濃縮された抽出溶
媒がカラムから出る（抽出物）。もう一方の出口で、供
給材料を導入するために使用した、標的物質の減少した
溶媒（ラフィネート）がカラムから出る。上図におい
て、抽出は、供給材料及びラフィネートが、それぞれ高
密度の溶媒を含有（重相）し、かつ抽出に使用された溶
媒及び抽出物が、それぞれ低密度の溶媒を含有（軽相）
する形で説明される。

【００２０】「粗リプスタチン」という用語は、発酵プ
ロセスから細胞塊の分離、抽出及び濃縮後に生じる、リ
プスタチンと不純物とを含有する粗生成物を意味する。

【００２１】本発明は、高純度及び実際上定量的収率で
粗リプスタチンからリプスタチンを単離する手段とし
て、２つの液−液抽出を組合せた方法に関する。

【００２２】一般に、粗リプスタチンからのリプスタチ
ンの精製方法は、脂肪族又は芳香族炭化水素から選択さ
れる非極性溶媒から、カルボン酸、アルコール、Ｏ−モ
ノ置換のモノ−もしくはオリゴエチレングリコール、ジ
オール又は双極性非プロトン性溶媒から選択される極性
溶媒へのリプスタチンの液−液抽出、続いて水による極
性溶媒相の希釈又は相比の変更、及び新しい非極性溶媒
へのリプスタチンの再抽出を含む。

【００２３】液−液抽出は、下記の溶媒系で行われる：
非極性溶媒は、脂肪族又は芳香族炭化水素から選択され
る。好ましい脂肪族炭化水素は、Ｃ₅−Ｃ₈脂肪族炭化水
素；更に好ましくはヘキサン又はヘプタンのようなＣ₆
−Ｃ₇脂肪族炭化水素である。芳香族炭化水素は、場合
により１〜３個のメチル基により置換されている、ベン
ゼンから選択することができる。好ましい芳香族炭化水
素は、ベンゼン及びトルエンである。

【００２４】極性溶媒は、カルボン酸（例えば、ギ酸又
は酢酸もしくはプロピオン酸のようなＣ₁−Ｃ₃アルキル
カルボン酸）、又はメタノール、エタノール、プロパノ
ールのようなＣ₁−Ｃ₃アルコール、又はエチレングリコ
ールモノメチルエーテルのようなＯ−モノ置換のモノ−
もしくはオリゴエチレングリコール、又はエタンジオー
ルもしくは１，３−プロパンジオールのようなＣ₂−Ｃ₃
ジオール、又はフルフリル−もしくはテトラヒドロフル
フリルアルコールから選択することができる。双極性非
プロトン性溶媒は、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル
ピロリドン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、
スルホラン、ニトロメタンなどのような溶媒を含む。好
ましい極性溶媒は、水溶性有機カルボン酸、アルコール
又はＯ−モノ置換のモノ−もしくはポリエチレングリコ
ール、例えば、酢酸、メタノール又はエチレングリコー
ルモノメチルエーテルであり、特に好ましいのは、酢酸
である。

【００２５】極性溶媒は、直接又は水との混合物として
使用することができる。

【００２６】第１の抽出工程において粗リプスタチンの
非極性不純物、及び第２の抽出工程において極性不純物
が除去される。極性溶媒へのリプスタチンの抽出によっ
て、非極性不純物の除去が行われ、そして非極性溶媒へ
のリプスタチンの抽出によって、極性不純物の除去が行
われる。

【００２７】好ましい実施態様では、両方の抽出におい
て同じ溶媒が使用される。第１の抽出に続いて、リプス
タチンの分布を変化させるために、水による極性溶媒の
希釈又は相比の変更を含む第２の工程が行われる。

【００２８】更に別の好ましい実施態様では、第１の抽
出は、リプスタチンが極性溶媒中に抽出されるように行
われ、続いて非極性溶媒（好ましくは第１の抽出工程に
使用されたものと同じ非極性溶媒）により極性溶媒から
リプスタチンが再抽出される。

【００２９】好ましい実施態様では、第１工程の液−液
抽出は、極性溶媒が、約１〜約２０％の水、更に好まし
くは約５％の水を含有する。

【００３０】更に別の好ましい実施態様では、非極性溶
媒は、脂肪族炭化水素である。特に好ましいのは、ヘプ
タンである。

【００３１】本発明の最も好ましい実施態様では、第１
工程の液−液抽出は、複流抽出として行われ、リプスタ
チンは、極性溶媒中に抽出される。供給材料は、粗リプ
スタチンであり、これを使用される溶媒の１つにより希
釈してもよい。リプスタチンは、極性（重）相に抽出さ
れ；脂肪酸又はグリセリドのような非極性不純物は、非
極性（軽）相に残る。リプスタチンと不純物の分配係数
は、濃度、２つの溶媒の相比に依存するため、抽出シス
テムの理論段数及び溶媒に対する供給材料の比は、適切
な方法で調整する必要がある（Lo,TC,Bairds,MHI,Hafe
z,M,Hanson,C(1983):Handbook of solvent extraction.
Wiley,New York)。濃度への分配係数の依存関係は、抽
出システムに使用される極性溶媒の種類により大きく変
化する。酢酸水性液は、高濃度を達成し、そのため高い
スループットを達成し、かつ使用される溶媒を最少にす
るのに非常に良好な結果を与える。

【００３２】抽出は、ミキサーセトラーシステムのよう
な連続抽出装置、又はパルス濾板抽出器（pulsed sieve
plate extractor）もしくは撹拌カラムのような抽出カ
ラムのいずれかを使用することにより行うことができ
る。

【００３３】好ましい実施態様では、再抽出（精製の第
２工程）の前に、極性溶媒は、水の添加により約７０％
〜９０％まで、好ましくは約８０％まで希釈される。

【００３４】本発明の最も好ましい実施態様では、第２
精製工程の再抽出は、向流抽出として行われ、リプスタ
チンは、非極性溶媒に抽出される。この場合に第１の抽
出の抽出物は、直接使用することができる。濃縮リプス
タチン供給材料を必要とする複流抽出とは対照的に、連
続プロセスにおいて向流抽出として第２の抽出を行う場
合には、第１の抽出後のリプスタチンの濃縮は必要では
ない。リプスタチンは、非極性（軽）相に抽出され、極
性不純物は、極性（重）相に残る。

【００３５】発酵中に、リプスタチンの幾つかのアミノ
酸類似体が形成される。リプスタチン自体は、側鎖とし
てＮ−ホルミル（Ｓ）ロイシンを含有するが、一方副産
物は、他のＮ−ホルミルアミノ酸を含有する。これらの
副産物の１つは、メチオニン類似リプスタチンである。
粗リプスタチンは、リプスタチンに対して３％までのこ
の副産物を含有する。リプスタチンの精製のために、こ
の不純物を除去することは非常に重要である。さもなけ
れば、次の水素化は、この硫黄含有化合物により阻害さ
れてしまうであろう。本発明による粗リプスタチンの精
製は、粗リプスタチン中のメチオニン類似リプスタチン
が抽出の前に酸化されるならば、更に改善される。対応
するスルホキシド又はスルホンへの酸化後でなければ、
リプスタチンの結晶化又は抽出的精製により、メチオニ
ン類似リプスタチンを直接除去することはできない。こ
の酸化は、従来法、例えば酢酸中の過酢酸を使用するこ
とにより行われる。メチオニン類似リプスタチンは、ス
ルホキシド又はスルホンのいずれかに酸化することがで
きる：

【００３６】

【化４】

【００３７】酸化剤は、もしスルホキシドが必要であれ
ば、メチオニン類似リプスタチンの量に対して等モル量
又は１．５当量までの量で、あるいはもしスルホンが必
要であれば、その二倍量で使用される。リプスタチンの
酸化分解を防ぐために、大過剰量は回避すべきである。
酸化は、０〜５０℃、好ましくは室温で行われる；反応
は数分で完了する。酸化のために使用される溶媒は、決
定的に重要なものではなく、好ましくは抽出的精製プロ
セスに使用される溶媒の１つが酸化にも使用される。メ
チオニン類似リプスタチンは、粗リプスタチンの工程に
おいて、又は第１の抽出的精製工程の後に酸化すること
ができる。好ましくは酸化は、高濃度のヘプタン溶液中
の粗リプスタチンをもって行われ、生じる混合物は、第
１の抽出的精製工程の供給材料として使用される。酸化
されたメチオニン類似リプスタチンは、極性不純物であ
り、第２の抽出中に除去され、そこで極性相に残る。

【００３８】第２の抽出工程は、抽出的精製のために酢
酸水性液／ヘプタン系が使用されるならば、リプスタチ
ンと酸化されたメチオニン類似リプスタチンの分配係数
の差のため、水の添加後に第１の抽出工程からの抽出物
を直接使用して向流抽出として行われれば充分である。
したがって、最も好ましい実施態様では、粗リプスタチ
ンからのリプスタチンの精製は、約９５％酢酸／ヘプタ
ン中の粗リプスタチンの複流抽出、続いて水による約８
０％酢酸までのリプスタチン溶液の希釈及びヘプタンに
よるこの溶液の向流抽出により達成される。次に精製リ
プスタチンは、濃縮又は結晶化によりヘプタンから単離
することができる。この好ましいプロセスは、下記の図
に図解される：

【００３９】

【化５】

【００４０】上に指摘されるように、上に記載されるプ
ロセスのいずれかにより調製されるリプスタチンは、水
素化によりテトラヒドロリプスタチン（オルリスタット
（Orlistat））に変換することができる。リプスタチン
の水素化は、それ自体既知の方法により、例えば米国特
許第４，５９８，０８９号明細書に記載されるように、
適切な触媒の存在下で行うことができる。使用できる触
媒の例は、パラジウム／炭素、酸化白金、パラジウムな
どである。水素化のために使用される溶媒は、決定的に
重要ではない。最も好ましい溶媒は、最後の抽出工程に
使用される溶媒である。この場合にリプスタチン含有抽
出物は、直接使用されるか、又は水素化のために濃縮後
に使用される。他の適切な溶媒は、例えば、メタノール
及びエタノールのような低級アルコール、tert−ブチル
−メチルエーテル又はテトラヒドロフランのようなエー
テル、酢酸又はジクロロメタンのようなハロゲン化溶媒
である。水素化は、好ましくは低水素圧及び室温で行わ
れる。したがって、本発明はまた、上記抽出プロセス、
及びこれに続くテトラヒドロリプスタチンへのリプスタ
チンの水素化を含む。好ましくはこの反応は、２５℃で
低水素圧、例えば０．５〜５barで貴金属含有水素化触
媒により行われる。

【００４１】テトラヒドロリプスタチンは、結晶化によ
り精製及び単離することができる。好ましくはヘキサン
又はヘプタンのような非極性溶媒が、水素化及び結晶化
のために使用される。

【００４２】要約すると、本発明は、 ａ）メチオニン類似リプスタチンの酸化； ｂ）約９５％酢酸／ヘプタン中での粗リプスタチンの複
流抽出； ｃ）水による約８０％酢酸までのリプスタチン溶液の希
釈；及び ｄ）ヘプタンによる溶液の向流抽出、 を含む上述のプロセスに関する。

【００４３】本プロセスに続いて、テトラヒドロリプス
タチンへのリプスタチンの水素化、場合により続いてテ
トラヒドロリプスタチンの結晶化が行われていてもよ
い。

【００４４】本発明はまた、 ａ）メチオニン類似リプスタチンの酸化； ｂ）約９５％酢酸／ヘプタン中での粗リプスタチンの複
流抽出； ｃ）水による約８０％酢酸までのリプスタチン溶液の希
釈；及び ｄ）ヘプタンによる溶液の向流抽出、続いて ｅ）テトラヒドロリプスタチンへのリプスタチンの水素
化、 を含むテトラヒドロリプスタチンの製造方法を含む。

【００４５】加えて本発明は、リプスタチン及びテトラ
ヒドロリプスタチンの調製のための上記方法の使用に関
する。

【００４６】

【実施例】以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様
を例示するが、これらは本発明の範囲を限定しようとす
るものではない。

【００４７】実施例１：発酵からの粗リプスタチンは、
バイオマスの分離及び抽出の後に濃縮した。使用した材
料は、５８％（w/w）リプスタチン（ＨＰＬＣ分析）及
び０．９％（w/w）メチオニン類似リプスタチン（¹Ｈ−
ＮＭＲ分析）を含有していた。

【００４８】ａ．メチオニン類似リプスタチンの酸化：
粗リプスタチン５５．７ｇをヘプタン７７mlで希釈し
た。酢酸中の過酢酸の３７％溶液２１２μlを加えて、
混合物を室温で３０分間撹拌した。

【００４９】ｂ．ヘプタン／９５％酢酸水性液による複
流抽出：７分離段による抽出器のシミュレーションのた
めに、７つの分液ロートを使用した。

【００５０】ａ．に記載された酸化手順から得られた混
合物を６つに分割して、各分割液を第４の分液ロート
（ｓｆ−４）に供給した。ｓｆ−４供給材料から開始し
て、ヘプタン５０ml及び９５％酢酸水性液１００mlを加
えたが、これは１／２のヘプタン／酢酸水性液の相比に
相当する。混合物を振盪して、相を分離した。上相を次
の分液ロートに移して、下相を前の分液ロートに移し
た。始めは新しい溶媒を使用し、これを段々に前の分液
ロート及び次の分液ロートからの相で置換した。すべて
の分液ロートをこうして満たしたら、ヘプタンを第１の
分液ロートに、酢酸水性液を第７の分液ロートだけに加
えた。リプスタチン含有抽出物をプールした。ラフィネ
ート中のリプスタチンは、薄層クロマトグラフィーによ
り監視して、その含量を１リットル当たり１ｇ未満に維
持し、前もって計算された相比及び濃度を制御した。

【００５１】すべての粗リプスタチンを供給したら、両
方の未充填溶媒を、すべてのリプスタチンがシステムか
ら洗い流されるまで加えた。下記の図によりこの抽出を
図解する：

【００５２】

【化６】

【００５３】抽出物は、減圧下で溶媒を留去することに
より、約６００mlの容量まで濃縮した。カール・フィッ
シャー法（Karl Fischer method）により測定した含水
量は、３．５％であった。

【００５４】ｃ．向流抽出：７分離段による抽出器のシ
ミュレーションのために、再度７つの分液ロートを使用
した。

【００５５】ｂ．から得られた抽出物（６００ml）を６
つに分割（各１００ml）して、各分割液を水３０mlと一
緒に第７の分液ロートに供給した。ヘプタン１３０mlを
第１の分液ロートに加えた。抽出は、上相を次の分液ロ
ートに移し、下相を前の分液ロートに移すことにより、
セクションｂ）に類似した連続プロセスのシミュレーシ
ョンとして行った。ラフィネート中のリプスタチンは、
薄層クロマトグラフィーにより監視して、その含量を１
リットル当たり１ｇ未満に維持し、前もって計算された
相比及び濃度を制御した。第１の抽出工程からのすべて
の抽出溶液を供給したら、両方の溶媒を、すべてのリプ
スタチンが洗い流されるまで加えた。下記の図によりこ
の抽出を図解する：

【００５６】

【化７】

【００５７】ヘプタン中の精製リプスタチン（抽出物）
をプールして、減圧下で濃縮して２５０mlの容量にし
た。この溶液は、９０％（w/w）の純度（ＨＰＬＣ）の
精製リプスタチン３５．３ｇを含有していた。これは、
粗生成物中のリプスタチンに対して、精製生成物中のリ
プスタチンの含量に基づいて計算した収率９８％に相当
する。

【００５８】ｄ．水素化：精製リプスタチンの溶液２５
０mlは、ステンレス鋼オートクレーブ中で２５℃で５ba
rの圧力で全体で６時間５％パラジウム担持炭素３．５
ｇにより水素化した。触媒を濾過して、濾液から溶媒を
留去した。残渣をヘプタン７００mlに溶解して、テトラ
ヒドロリプスタチンを０℃で結晶化した。生成物を濾過
し、冷ヘプタンで洗浄して、真空下２５℃で乾燥した。
純度９６％（w/w）（ＨＰＬＣ）のテトラヒドロリプス
タチン２８ｇを得た。これは、精製生成物中のリプスタ
チンに対して、収率８５％に相当する。ヘキサンからの
再結晶後のテトラヒドロリプスタチンの純度は、９７％
（w/w、ＨＰＬＣによる）であった。

【００５９】実施例２：実施例１に使用したものと同じ
溶媒による連続抽出のために、７段ミキサーセトラーシ
ステムを使用した。

【００６０】使用した濃縮粗リプスタチンは、純度６５
％（w/w）であり、０．１４％（w/w）のメチオニン類似
リプスタチンを含有していた。

【００６１】ａ．ヘプタン／９５％酢酸水性液による複
流抽出：粗リプスタチン１００kgをヘプタン１００kgで
希釈して、この溶液を供給材料として使用した。ミキサ
ーセトラーに、１／２（v/v）の相比でヘプタン及び９
５％酢酸水性液を充填した。抽出的精製のために、１時
間に３７．５リットルのヘプタン、１時間に７５リット
ルの９５％酢酸水性液及び１時間に１５リットルの粗リ
プスタチンの溶液の供給材料を加えた。ヘプタンは、第
１のミキサー、リプスタチン溶液は、第４のミキサーそ
して酢酸水性液は、第７のミキサーに導入した。リプス
タチン含有抽出物及び非極性不純物含有ラフィネートを
回収した。ラフィネート中のリプスタチンの含量は、薄
層クロマトグラフィーにより監視して、１リットル当た
り１ｇ未満のレベルに維持した。すべての粗リプスタチ
ンを供給後、すべてのリプスタチンが洗い流されるまで
両方の溶媒の供給を続けた。抽出物（下相）の試料を濃
縮して、純度７１％（w/w）のリプスタチンを得た。全
体で、抽出物１５００kgを得たが、含水量は４．６％で
あった（カール・フィッシャー法（Karl Fischer metho
d））。

【００６２】ｂ．メチオニン類似リプスタチンの酸化：
前の抽出からの抽出溶液に、酢酸中の３７％過酢酸の溶
液６０mlを加えて、この混合物を室温で３０分間撹拌し
た。

【００６３】ｃ．向流抽出：水２８０リットルを加え
て、２０％の含水量に調整した。水を添加後、リプスタ
チンの油性相の分離により、この溶液をヘプタン６００
リットルで抽出した。この抽出物を分離して、後に連続
抽出のヘプタン相に加えた。

【００６４】酢酸水性液中のリプスタチンの残存溶液の
次の連続抽出のために、第１の抽出のものと同じミキサ
ーセトラーを使用した。連続抽出は、１時間に５０リッ
トルのヘプタンを第１のミキサーに、そして１時間に５
０リットルの酢酸水性液中のリプスタチンの溶液を第７
のミキサーに供給することにより行った。ヘプタン抽出
物を、前に得られた抽出物に加えて、この溶液は、減圧
下で溶媒を留去することにより、約１０００リットルの
容量まで濃縮した。試料を濃縮乾固することにより、純
度８６％（w/w）のリプスタチンを得た。

【００６５】ｄ．水素化：得られた溶液は、同じサイズ
３バッチで水素化した。水素化は、ガラス内張撹拌水素
化容器中で行った。１バッチで、５％パラジウム担持炭
素２kgを使用した。水素化は１時間後に終了した；水素
圧は５barに達した。触媒を濾過して、溶媒を留去する
ことにより濾液を濃縮した。生成物の乾燥試料は、９０
％（w/w）テトラヒドロリプスタチンを含有していた
（リプスタチンが「変換可能な」副産物（異なる位置又
は１つだけのＣ＝Ｃ二重結合を有する異性体である）を
含有しており、これらもまた水素化後テトラヒドロリプ
スタチンに転換されるため、品質は精製リプスタチンよ
りも高い）。ヘプタン６００kgを加えて、テトラヒドロ
リプスタチンを０℃で結晶化した。生成物を濾過し、冷
ヘプタンで洗浄して減圧下で乾燥した。

【００６６】１バッチで、純度９７％（w/w）のテトラ
ヒドロリプスタチン１７kgを得た。これは、粗リプスタ
チン中のリプスタチンに対して、テトラヒドロリプスタ
チンの収率７６％に相当する。

【００６７】実施例３：発酵からの粗リプスタチンは、
バイオマスの分離及び抽出の後に濃縮した。材料は、６
２％（w/w）リプスタチン及び０．１％（w/w）メチオニ
ン類似リプスタチンを含有していた。

【００６８】ａ．メチオニン類似リプスタチンの酸化：
粗リプスタチン５３ｇをヘプタン７５mlで希釈した。酢
酸中の過酢酸の３７％溶液２４μlを加えて、混合物を
室温で３０分間撹拌した。

【００６９】ｂ．ヘプタン／１０％メタノール水性液に
よる複流抽出：連続抽出をシミュレートするための７つ
の分液ロートの同じシステムは、実施例１に記載された
ように使用した。ａ）に記載された酸化手順から得られ
た混合物を６つに分割して、各分割液を第４の分液ロー
トに供給した。ヘプタン１００mlを第１の分液ロートに
加え、１０％メタノール水性液１０mlを第７の分液ロー
トに加えたが、これは１０／１のヘプタン／メタノール
水性液の相比に相当する。抽出物（上相、ヘプタン中の
リプスタチン）をプールした。すべての粗リプスタチン
を供給したら、両方の新しい溶媒を、すべてのリプスタ
チンが洗い流されるまで更に加えた。減圧下で溶媒を留
去することにより、抽出物を濃縮して１１０mlの容量に
した。

【００７０】ｃ．ヘプタン／１０％メタノール水性液に
よる追加の複流抽出：上記抽出から得られた溶液を６つ
に分割した。前に使用したものと同じ７つの分液ロート
のシステムにより、異なる相比であることを除いて同種
の抽出を行った。供給材料の各分割液は、第４の分液ロ
ートに加えた。ヘプタン１００mlを第１の分液ロートに
加え、１０％メタノール水性液１００mlを第７の分液ロ
ートに加えたが、これは１／１のヘプタン／メタノール
水性液の相比に相当する。抽出物（下相、メタノール水
性液中のリプスタチン）をプールした。すべての粗リプ
スタチンを供給したら、両方の新しい溶媒を、すべての
リプスタチンが洗い流されるまで更に加えた。減圧下で
溶媒を留去することにより、抽出物を濃縮して２５０ml
の容量にした。

【００７１】ｄ．ヘプタンへのリプスタチンのバッチ抽
出：ｃ）から得られた抽出溶液に水を加えて、５０％の
含水量に調整した。混合物は、それぞれヘプタン６００
mlで２回抽出した。抽出物は、溶媒を留去することによ
り濃縮した。純度８６％（w/w）のリプスタチン３４ｇ
を得た。これは、粗生成物中のリプスタチンに対して、
精製生成物中のリプスタチンの含量に基づいて計算した
収率８９％に相当する。

【００７２】ｅ．水素化：水素化及び結晶化は、実施例
１と同様に行った。テトラヒドロリプスタチンは、精製
生成物中のリプスタチンに対して、収率９０％で純度９
７％（w/w）で得た。

【００７３】実施例４：実施例３に記載されたのと同じ
７段抽出の装備を使用して、実施例３と同じバッチから
の粗リプスタチンを精製した。あるいは、１０％エチレ
ングリコールモノメチルエーテル水性液及びヘプタンを
溶媒として使用した。実施例３に比較して、濃度及び相
比は変化しないままであった。精製後のリプスタチンの
試料は８０％（w/w）の分析評価であった。水素化及び
テトラヒドロリプスタチンの結晶化は、前の実施例に記
載されたように行った。純度９６％（w/w）のテトラヒ
ドロリプスタチンを得た。

【００７４】実施例５：５５％（w/w）リプスタチン及
び０．６％（w/w）メチオニン類似リプスタチンの分析
評価の粗リプスタチンは、撹拌ケーニ（Kuehni）カラム
で精製した。

【００７５】ａ．ヘプタン／９５％酢酸水性液による複
流抽出：抽出のために下記の容積のケーニカラムＥ６０
を使用した：カラム内径：６cm、カラム高：１８０cm、
実効段数：５０、固定子極板を含まない断面積：１０
％。カラムは１３０rpmで撹拌した。新しい９５％酢酸
水性液は、カラム頂上部注入口に４．０ l/時で分散相
として供給した。新しいヘプタンは、カラム底部注入口
に１．７５ l/時で連続相として供給した。ヘプタン中
の４０％（w/w）粗リプスタチンの溶液は、第２７実効
段（底部から数えて）でカラムに０．７７５kg/時で供
給した。平衡状態で、カラム底部流出口での抽出相中の
リプスタチンの収率は＞９９％であり、そしてリプスタ
チンの純度は７０％（w/w）であった。メチオニン類似
リプスタチンの含量は０．６％（w/w）であった。

【００７６】ｂ．過酢酸による酸化：９５％酢酸水性液
抽出物中のメチオニン類似リプスタチンは、３７％過酢
酸等モル量の添加により酸化した。

【００７７】ｃ．ヘプタン／７５％酢酸水性液による向
流抽出：抽出のために、セクションａ）の下に記載され
たのと同じ容積のケーニカラムを使用した。カラムは２
０５rpmで撹拌した。９５％酢酸水性液中のリプスタチ
ン抽出物（セクションａ）により調製した純度６８％
（w/w）のリプスタチンを含む、抽出数バッチ分のプー
ル）は、カラム頂上部注入口に８．６ l/時で分散相と
して供給した。新しい脱イオン水は、カラムの第４７実
効段（底部から数えて）に２．１ l/時で供給した。新
しいヘプタンは、カラム底部注入口に６．０ l/時で連
続相として供給した。平衡状態で、カラム頂上部流出口
での抽出相中のリプスタチンの収率は９７％であり、リ
プスタチンの純度は８８％（w/w）であった。これは、
粗生成物中のリプスタチンに対して、精製生成物中のリ
プスタチンの含量に基づいて計算した収率９６〜９７％
に相当する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲルハルト・シュタインバウアー オーストリア国、アー−4470 エンス、 ロルヒ 21 (72)発明者 エーリヒ・シュタインヴェンダー オーストリア国、アー−4040 リンツ、 ラングフェルトシュトラーセ 67 (56)参考文献 特開 平10−66592（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−13777（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07D 305/12 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (20)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 粗リプスタチン（lipstatin）からのリ
   プスタチンの精製方法であって、 ａ）脂肪族又は芳香族炭化水素から選択される非極性溶
   媒から、カルボン酸、アルコール、Ｏ−モノ置換のモノ
   −もしくはポリエチレングリコール、ジオール又は双極
   性非プロトン性溶媒から選択される極性溶媒（ここで、
   該極性溶媒は、直接又は水との混合物として使用する）
   へのリプスタチンの液−液抽出工程、続いて ｂ）水による極性溶媒相の希釈又は相比の変更、及び新
   しい非極性溶媒へのリプスタチンの再抽出工程、 を含む方法。
2. 【請求項２】 工程ａ）の極性溶媒が、１〜２０％の水
   を含有する、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 工程ａ）の極性溶媒が、５％の水を含有
   する、請求項１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】 非極性溶媒が、脂肪族炭化水素である、
   請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 【請求項５】 非極性溶媒が、ヘプタンである、請求項
   ４記載の方法。
6. 【請求項６】 極性溶媒が、水溶性有機カルボン酸、ア
   ルコール又はＯ−モノ置換のモノ−もしくはオリゴエチ
   レングリコールである、請求項１〜５のいずれか１項記
   載の方法。
7. 【請求項７】 極性溶媒が、酢酸、メタノール又はエチ
   レングリコールモノメチルエーテルである、請求項６記
   載の方法。
8. 【請求項８】 請求項１記載の工程ａ）の液−液抽出
   が、複流抽出（double-current extraction）であり、
   そしてリプスタチンが、極性溶媒に抽出される、請求項
   １〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 【請求項９】 再抽出の前に極性溶媒が、水の添加によ
   り９０〜７０％まで希釈される、請求項１〜８のいずれ
   か１項記載の方法。
10. 【請求項１０】 極性溶媒が、水の添加により８０％ま
    で希釈される、請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 請求項１の工程ｂ）記載の再抽出が、
    向流抽出であり、そしてリプスタチンが、非極性溶媒に
    抽出される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 粗リプスタチンのメチオニン類似副産
    物が、抽出の前に酸化される、請求項１〜１１のいずれ
    か１項記載の方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか一項記載の
    方法によりリプスタチンを精製し、更に精製したリプス
    タチンをテトラヒドロリプスタチンへ水素化する工程を
    含む、テトラヒドロリプスタチンの製造方法。
14. 【請求項１４】 水素化反応が、２５℃で低水素圧で貴
    金属含有水素化触媒により行われる、請求項１３記載の
    方法。
15. 【請求項１５】 ａ）メチオニン類似リプスタチンの酸
    化工程； ｂ）９５％酢酸／ヘプタン中での粗リプスタチンの複流
    抽出工程； ｃ）水による８０％酢酸までのリプスタチン溶液の希釈
    工程；及び ｄ）ヘプタンによる該溶液の向流抽出工程、 を含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によりリプス
    タチンを精製し、更に精製したリプスタチンをテトラヒ
    ドロリプスタチンへ水素化する工程を含む、テトラヒド
    ロリプスタチンの製造方法。
17. 【請求項１７】 更に、テトラヒドロリプスタチンの結
    晶化工程を含む、請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 粗リプスタチンからのリプスタチンの
    精製方法であって、 ａ）メチオニン類似リプスタチンの酸化工程； ｂ）９５％酢酸／ヘプタン中での粗リプスタチンの複流
    抽出工程； ｃ）水による８０％酢酸までのリプスタチン溶液の希釈
    工程；及び ｄ）ヘプタンによる該溶液の向流抽出工程、 を含む方法。
19. 【請求項１９】 テトラヒドロリプスタチンの製造方法
    であって、 ａ）メチオニン類似リプスタチンの酸化工程； ｂ）９５％酢酸／ヘプタン中での粗リプスタチンの複流
    抽出工程； ｃ）水による８０％酢酸までのリプスタチン溶液の希釈
    工程；及び ｄ）ヘプタンによる該溶液の向流抽出工程、続いて ｅ）テトラヒドロリプスタチンへのリプスタチンの水素
    化工程； ｆ）テトラヒドロリプスタチンの結晶化工程、を含む方
    法。
20. 【請求項２０】 請求項１〜１９のいずれか１項記載の
    方法を用いて、リプスタチン又はテトラヒドロリプスタ
    チンを製造する方法。