CN103420953B - 一种提纯奥利司他中间体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种减肥药奥利司他重要中间体利普司他汀的纯化方法。本发明提供了纯化方法，包括发酵液预处理、浸提、转相、浓缩。本发明所获得产品纯度高，所提供的工艺具有收率高、周期短、工艺简单易控制、而且设备溶媒投资少、生产成本低、非常适合于工业化大生产。

Description

一种提纯奥利司他中间体的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种减肥药奥利司他重要中间体利普司他汀的提纯方法。

技术背景

利普司他汀(Lipstatin)由毒三素链霉菌（Streptomyces tocytricini）通过生物发酵、溶媒提取精制而成，是一种新的胰脂肪酶抑制剂，能选择性地抑制胃肠道内的胰脂肪酶，减少脂肪的分解和吸收。其四氢衍生物已被瑞士罗氏公司成功开发为减肥药赛尼可（Xenical），又名奥利司他（Orlistat），是目前唯一通过非中枢神经系统作用治疗肥胖症的药物。

普利司他汀（lipstatin）作为减肥药奥利司他的重要中间体，其结构式为：

制备奥利司他（Orlistat）有全合成和半合成2种方式，目前临床上使用的奥利司他原料药大多由利普司他汀（lipstatin）还原来制备，反应式如下：

中国发明专利CN102936234A公开了一种制备脂肪酶抑制剂奥利司他的方法，利用混合溶剂超声波法初提链霉菌菌丝体中的利普司他汀，将利普司他汀粗体物氢化后，利用大孔树脂提取得到奥利司他纯品的方法，该工艺设备要求高、工艺复杂、成本高，不利于工业化大生产。

中国发明专利CN102304105A公开了一种制备高纯度奥利司他的方法，具体方案包括发酵液利普司他经过滤、有机溶剂浸提、有机水溶液萃取、硅胶柱层析、脱色、氢化、结晶和干燥工序，但是生产周期长，收率低，成本高。

中国发明专利CN101948450A公开了一种生产奥利司他的方法，依次将普利司他汀发酵液浸提、过滤菌体、调节PH值至3.0-4.5，上大孔吸附树脂吸附，经丙酮水溶液洗脱得洗脱液，用庚烷萃取洗脱液，浓缩萃取液后氢化合成奥利司他，但该工艺用到大孔吸附树脂柱层析提纯利普司他汀粗品时，仅能除去利普司他汀粗品中极性较大的杂质，与利普司他汀结构相似的无法去除，其实施例中经大孔吸附树脂柱层析提纯效果最好的是利普司他汀浓度为65%。该工艺整体上生产周期长，工艺复杂，生产成本高，收率低。

中国发明专利CN1266058A公开了一种纯化一制胰脂菌素的方法，首先将含蛋氨酸类似物的普利司他汀（lipstatin）粗品用过乙酸-乙酸溶液氧化处理，接着用强极性溶剂如95%乙酸/非极性溶剂如庚烷进行双流萃取，将普利司他汀转相到极性溶媒中，浓缩萃取液，然后加水到上述浓缩液中，最后采用庚烷逆流萃取，但是上述工艺需要对普利司他汀（lipstatin）粗品经过氧化处理，并且上述2次萃取均需用到连续萃取装置如搅拌器沉降器系统，优选7个分离级的萃取器（如小试应用7个分液漏斗），设备要求高，工艺路线复杂，而且用到的强极性溶媒腐蚀性强，操作繁琐且不安全，不利于工业化大生产。

链霉菌发酵液中杂质多、直接用发酵菌丝体普利司他汀（lipstatin）粗品氢化获得奥利司他样品，除了含有奥利司他外，还含有很多其他的杂质，很难纯化达到药用纯度的要求。

代码解释：

(Thin Layer ChromatograpHy)，简称TLC，薄层层析法；

t代表吨；

发明内容

本发明针对现有技术中提纯普利司他汀时收率低、工艺复杂、生产周期长、设备要求条件高、溶媒用量大，生产成本高、不易放大等缺点，提供了一种收率高、工艺容易控制、生产周期短、利用普通化工设备、溶媒用量较少，成本低、非常适合于工业化大生产的提纯利普司他汀的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种提纯利普司他汀的方法，包括以下步骤：

①发酵液预处理：向链霉菌发酵液中加入助滤剂和絮凝剂，调节pH值至酸性，过滤，得到含有利普司他汀的混合物；

②浸提：用中等极性的溶媒对含有利普司他汀的混合物进行微生物细胞破碎，得到含有利普司他汀的浸提液；

③转相：

第一次转相：向含有利普司他汀的浸提液中加入水和非极性溶媒，将利普司他汀转相至非极性溶媒相中；

第二次转相：向含有利普司他汀的非极性溶媒中加入中等极性的溶媒，搅拌，静置分层，收集轻相；

④浓缩。

优选步骤①中pH值调节至2-6，更优选pH值调节至2-4；

其中，步骤③第一次转相后还可以包括：

水洗去杂：向含有利普司他汀非极性溶媒中加入水，搅拌，静置分层，收集轻相；

其中，步骤③第二次转相后还可以包括：

反洗：向含有利普司他汀的中等极性溶媒中加入非极性溶媒，搅拌，静置分层；反洗数次，直到杂质消失为止，收集含有利普司他汀的中等极性溶媒相；

其中，步骤①中所述助滤剂为常用的助滤剂。考虑助滤效果和成本，优选珍珠岩、硅藻土、纤维素、氧化镁或活性炭中任一种；

其中，步骤①中所述絮凝剂为常用的絮凝剂。考虑絮凝效果和成本，优选聚丙烯酰胺、聚合氯化铝、聚合硅酸铝铁或三氯化铁中任一种。

其中，按重量计，步骤①中所述助滤剂占发酵液重量的3.0-5.0%，所述絮凝剂占发酵液重量的0.01-0.1%。

其中，步骤②或③的中等极性的溶媒为乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮或乙腈中任一种。

在步骤②中所述中等极性的溶媒对含有利普司他汀混合物均可进行破壁浸提，因考虑到溶媒毒性，优选乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮等中的任一种；考虑到成本问题，更优选为乙醇。

在步骤③中，考虑到转相效果，中等极性溶媒优选乙腈。

其中，步骤③的所述非极性溶媒为庚烷、石油醚或正己烷中任一种。这些非极性溶媒对利普司他汀中较多的杂质溶解度均较大，通过二次或多次转相完成除去杂质的目的，考虑到溶媒毒性、成本、操作安全等因素，优选庚烷作为萃取剂；

其中，在步骤③中所述的水可以为饮用水、去离子水和纯净水，考虑到成本和实验效果，优选饮用水。

其中，步骤②中所述中等极性的溶媒和浸提液体积重量比（升/吨）为4-6：1。

其中，步骤③第一次转相中所述非极性溶媒和浸提液的体积比为0.4-0.6：1；所述水和浸提液的体积比为0.4-0.6：1。

其中，步骤③第二次转相中所用中等极性的溶媒和非极性溶媒体积比为0.4～0.6：1；

如果包括水洗去杂，则其中加入的水与非极性溶媒相体积比为0.2～0.5：1。

如果包括反洗，则其中所用中等极性的溶媒与非极性溶媒体积比为4～6：1。

经研究发现，中等极性溶媒的溶解选择性较强，利普司他汀很容易溶解到中等极性的溶媒中，而利普司他汀浸提液中所含的杂质却不溶于中等极性的溶媒中，而非极性溶媒如庚烷、石油醚、正己烷对利普司他汀浸提液中较多的杂质溶解度较大，不能单次除去杂质，只有通过不同极性的溶媒二次或多次转相，利用利普司他汀浸提液中杂质在不同溶媒体系中的溶解度的不同，达到除去杂质的目的，从而得到较高纯度的利普司他汀。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

本发明人经过大量的实验，证实无需经大孔树脂吸附和硅胶柱洗脱，就能有效去除杂质，收率高达80%，HPLC检测利普司他汀纯度为75%。经验证，利普司他汀纯度在70%就可以顺利地进行后续的氢化反应并经常规工艺处理后获得符合药用的奥利司他。与现有技术中，采用大孔树脂吸附或硅胶柱洗脱制备利普司他汀相比，本发明的中间体收率高，且其纯度也足以满足后序进一步合成的需要，且提高了最终产品奥利司他收率，从而降低生产成本。

在提纯过程中，可利用TLC，在很短的时间内就能判断除杂效果，其方法简单有效，其展开剂为乙酸乙酯和正己烷，其体积比为1:2-5，优选1:3。

另外本发明提供的提纯利普司他汀的方法工艺简单易控制、而且整套提纯设备均为普通化工设备，无需高压抽真空设备，设备要求较低，设备所需资金少。

因提纯工艺中无需经大孔树脂吸附和硅胶柱洗脱，步骤③中所用溶媒量较过柱所用溶媒量小，而且免除过柱后大量溶媒回收的繁琐工序。因溶媒用量少，所用溶媒毒性小，从而减少环境污染。

因提纯工艺中无需经大孔树脂吸附和硅胶柱洗脱，具有收率高、周期短，生产成本低、非常适合于工业化大生产。

具体实施例

下面通过一些实施例对本发明作一些说明。应理解这些实施例仅用于例证的目的，并不限制本发明的范围，同时，本领域技术人员对本发明作出的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。

实施例中含有利普司他汀的发酵液是采用利普司他汀产生菌链霉菌按现有发酵方法而制备得到。

实施例1

1）发酵液预处理：取5t新鲜培养的利普司他汀发酵液，加入助滤剂氧化镁150kg、絮凝剂三氯化铁2.8kg，用盐酸调pH至4.0，板框过滤,得到1t含有利普司他汀的混合物。

2）浸提：将含有利普司他汀混合物加入到6000L异丙醇溶液中进行微生物细胞破碎，搅拌1小时，板框过滤，得到含有利普司他汀的浸提液。

3）转相：

第一次转相：向浸提液中加入3600L饮用水，3600L石油醚，搅拌10min后静置1小时分层，取上层石油醚相；

第二次转相：向石油醚相中加入2160L异丙醇，搅拌5min以后静置1小时分层，异丙醇相使用TLC进行点板判断去除杂质效果，杂质斑消失，收集含有利普司他汀的异丙醇相。

4）浓缩：将含有利普司他汀的异丙醇相在水浴温度为65℃条件下浓缩获得其浓缩物。经HPLC检测，含量78%，收率达70%。

实施例2

1）发酵液预处理：取5t新鲜培养的利普司他汀发酵液，加入助滤剂珍珠岩200kg、絮凝剂聚丙烯酰胺500ml，用盐酸调pH至3.5，板框过滤，得到1t含有利普司他汀的混合物。

2）浸提：将含有利普司他汀混合物加入到4000L乙醇溶液中进行微生物细胞破碎，搅拌1小时，板框过滤，得到含有利普司他汀混合物浸提液。

3）转相：

第一次转相：向浸提液中加入2000L饮用水，2000L庚烷，搅拌10min后静置1小时分层，取上层庚烷相；

第二次转相：向庚烷相中加入1000L乙腈，搅拌5min以后静置1小时分层，乙腈相使用TLC进行点板判断去除杂质效果，杂质斑消失，收集含有利普司他汀的乙腈相；

4）浓缩：将含有利普司他汀的乙腈相在水浴温度为45℃条件下浓缩获得其浓缩物。经HPLC检测，含量81%，收率达到74%。

实施例3

1）发酵液预处理：取5t新鲜培养的利普司他汀发酵液，加入助滤剂纤维素200kg、絮凝剂聚合硅酸铝铁0.5kg，用盐酸调pH至6.0，板框过滤，得到1t含有利普司他汀的混合物。

2）浸提：将含有利普司他汀的混合物加入到4000L异丙醇溶液中进行微生物细胞破碎，搅拌1小时，板框过滤，得到含有利普司他汀混合物浸提液。

3）转相：

第一次转相：向浸提液中加入2400L饮用水，2000L正己烷，搅拌10min后静置1小时分层，取上层正己烷相；

水洗去杂：向正己烷相中加入600L饮用水，搅拌5min以后静置1小时分层，取上层正己烷相；

第二次转相：向正己烷相中加入1000L乙醇，搅拌5min以后静置1小时分层，得到含有利普司他汀的乙醇相；

4）浓缩：将含有利普司他汀的乙醇相在水浴温度为60℃条件下浓缩获得其浓缩物。经HPLC检测，含量76%，收率达75%。

实施例4

1）发酵液预处理：取5t新鲜培养的利普司他汀发酵液，加入助滤剂硅藻土250kg、絮凝剂聚合氯化铝5kg，用草酸调pH至2.0，板框过滤，得到1t含有利普司他汀混合物。

2）浸提：将含有利普司他汀混合物加入到6000L丙酮溶液中进行微生物细胞破碎，搅拌1小时，板框过滤，得到含有利普司他汀混合物浸提液。

3）转相：

第一次转相：向浸提液中加入2400L饮用水，2400L石油醚，搅拌10min后静置1小时分层，取上层石油醚相；

第二次转相：向石油醚相中加入960L丙酮，搅拌5min以后静置1小时分层，得到含有利普司他汀的丙酮相；

反洗：向丙酮相中加入240L石油醚，搅拌5min以后静置1小时分层；丙酮相使用TLC进行点板判断去除杂质效果，若杂质斑存在，再次加240L石油醚反洗，直到杂质斑消失，共用石油醚洗涤4次，收集含有利普司他汀的丙酮相；

4）浓缩：将含有利普司他汀的丙酮相在水浴温度为30℃条件下浓缩获得其浓缩物。经HPLC检测，含量78%，收率达76%。

实施例5

1）发酵液预处理：取5t新鲜培养的利普司他汀发酵液，加入助滤剂珍珠岩200kg、絮凝剂聚丙烯酰胺500ml，用盐酸调pH至3.5，板框过滤，得到1t含有利普司他汀的混合物。

2）浸提：将含有利普司他汀混合物加入到4000L乙醇溶液中进行微生物细胞破碎，搅拌1小时，板框过滤，得到含有利普司他汀混合物浸提液。

3）转相：

第一次转相：向浸提液中加入2000L饮用水，2000L庚烷，搅拌10min后静置1小时分层，取上层庚烷相；

水洗去杂：向庚烷相中加入700L饮用水，搅拌5min以后静置1小时分层，取上层庚烷相；

第二次转相：向庚烷相中加入1000L乙腈，搅拌5min以后静置1小时分层，得到含有利普司他汀的乙腈相；

反洗：向乙腈相中加入200L庚烷，搅拌5min以后静置1小时分层；乙腈相使用TLC进行点板判断去除杂质效果，若杂质斑存在，再次加200L庚烷反洗，直到杂质斑消失，共用庚烷洗涤2次，收集含有利普司他汀的乙腈相；

4）浓缩：将含有利普司他汀的乙腈相在水浴温度为45℃条件下浓缩获得其浓缩物。HPLC法检测，含量75%，收率达到80%。

实施例6

1）发酵液预处理：取5t新鲜培养的利普司他汀发酵液，加入助滤剂氧化镁150kg、絮凝剂三氯化铁2.8kg，用盐酸调pH至4.0，板框过滤,得到1t含有利普司他汀的混合物。

2）浸提：将含有利普司他汀混合物加入到6000L丁酮溶液中进行微生物细胞破碎，搅拌1小时，板框过滤，得到含有利普司他汀混合物浸提液。

3）转相：

第一次转相：向浸提液中加入3600L饮用水，3600L庚烷，搅拌10min后静置1小时分层，取上层庚烷相；

水洗去杂：向庚烷相中加入1800L饮用水，搅拌5min以后静置1小时分层，取上层庚烷相；

第二次转相：向庚烷相中加入2160L异丙醇，搅拌5min以后静置1小时分层，得到含有利普司他汀的异丙醇相；

反洗：向异丙醇相中加入360L庚烷，搅拌5min以后静置1小时分层；异丙醇相使用TLC进行点板判断去除杂质效果，若杂质斑存在，再次加360L庚烷反洗，直到杂质斑消失，共用庚烷洗涤2次，收集含有利普司他汀的异丙醇相；

4）浓缩：将含有利普司他汀的异丙醇相在水浴温度为65℃条件下浓缩获得其浓缩物。经HPLC检测，含量71%，收率达75%。

实施例7

1）发酵液预处理：取5t新鲜培养的利普司他汀的发酵液，加入助滤剂活性炭200kg、絮凝剂聚丙烯酰胺500ml，用盐酸调pH到3.0，板框过滤，得到1t含有利普司他汀的混合物。

2）浸提：将含有利普司他汀的混合物加入到5000L乙腈溶液中进行微生物细胞破碎，搅拌1小时，板框过滤，得到含有利普司他汀混合物浸提液；

3）转相：

第一次转相：向浸提液中加入2000L饮用水，3000L石油醚，搅拌10min后静置1小时分层，取上层石油醚相；

水洗去杂：向石油醚相中加入900L饮用水，搅拌5min以后静置1小时分层，取上层石油醚相；

第二次转相：向石油醚相中加入1500L丁酮，搅拌5min以后静置1小时分层，得到含有利普司他汀的丁酮相；

反洗：向丁酮相中加入300L石油醚，搅拌5min以后静置1小时分层；丁酮相使用TLC进行点板判断去除杂质效果，若杂质斑存在，再次加300L石油醚反洗，直到杂质斑消失，共用石油醚洗涤3次，收集含有利普司他汀的丁酮相；

4）浓缩：将含有利普司他汀的丁酮相在水浴温度为60℃条件下浓缩获得其浓缩物。经HPLC检测，含量70%，收率达78%。

对比实验1：助滤剂、絮凝剂，PH值对发酵液预处理效果比较

若链霉菌发酵液中未加入助滤剂、絮凝剂，PH值未控制至酸性，发酵液很难抽滤，过滤后期会严重堵塞板框。

发酵液预处理情况直接影响到利普司他汀提纯的难易程度及其纯度和收率，影响其预处理情况因素主要包括助滤剂、絮凝剂及其用量和PH值，具体如下：

在提纯利普司他汀工艺中，加入助滤剂、絮凝剂，调节PH，预处理发酵液时，如果发酵液絮凝效果不好，用板框过滤时，未絮凝的菌丝体或细胞碎片很容易堵塞滤布，使得过滤时间大大加长，得到的菌丝体含水量高，在后续浸提时很难完全浸提使有效成分进入到浸提液。使得提纯收率很低。所以选择合适的助滤剂、絮凝剂、pH对于工艺的可操作性及收率都很重要。

本工艺所选的絮凝剂、助滤剂及pH组合，发酵液絮凝效果非常好，板框过滤时滤速快，得到的菌丝体含水量低，在细胞破壁浸提过程中很完全，收率很高，而且操作简单，易于控制，适合于工业化大生产。具体见下表1：

表1：

对比实验2：发酵液预处理方法对利普司他汀纯度、收率的影响

若发酵液不经过助滤剂、絮凝剂和调节pH预处理，实验工艺如下：

5t发酵液经金属膜过滤后，得到1.2t含利普司他汀混合物。

后续按照本发明实施例5进行，具体如下：

1）浸提：将利普司他汀产生菌的菌丝体加入到4800L乙醇溶液中进行微生物细胞破碎，搅拌1小时，板框过滤，得到含有利普司他汀产生菌菌丝体的混合物浸提液；

2）转相：

第一次转相：向浸提液中加入2400L饮用水，2400L庚烷，搅拌10min后静置1小时分层，取上层庚烷相；

水洗去杂：向庚烷相中加入840L饮用水，搅拌5min以后静置1小时分层，取上层庚烷相；

第二次转相：向庚烷相中加入1200L乙腈，搅拌5min以后静置1小时分层，得到含有利普司他汀的乙腈相；

反洗：向乙腈相中加入240L庚烷，搅拌5min以后静置1小时分层；乙腈相使用TLC进行点板判断去除杂质效果，若杂质斑存在，再次加240L庚烷反洗，直到杂质斑消失，共用庚烷洗涤2次，收集含有利普司他汀的乙腈相；

3）浓缩：将含有利普司他汀的乙腈相在水浴温度为45℃条件下浓缩获得其浓缩物。HPLC法检测，含量50%，收率达到62%。

试验证明，采用金属膜过滤发酵液，最后获得的利普司他汀纯度、收率均不如本发明实施例5。可见絮凝剂、助滤剂及pH的选择，即发酵液的预处理，将直接影响到利普司他汀的收率和纯度。

对比实验3：提纯方法对利普司他汀纯度和收率的影响

在其他条件与本发明实施例5相同的前提下，参照中国发明专利CN102304105A中总收率最高的实施例1中萃取和硅胶柱层析步骤、把本发明实施例5中转相步骤替换为CN102304105A实施例1中萃取和硅胶柱层析步骤提纯利普司他汀，具体工艺如下：

1）发酵液预处理和浸提步骤参照本发明实施例5进行；

2）萃取：向浸提液中加入2000L饮用水，2000L庚烷，搅拌10min后静置1小时分层，取上层庚烷相；

3）浓缩：庚烷相60℃减压浓缩，得到浓缩物。

4）层析：层析柱直径800mm,柱体积约为1200L，层析柱下半部分装填200-300目硅胶，上半部填装100-200目硅胶，装填完毕后用氮气维持压力0.3Mpa，维持时间为2小时；用乙酸乙酯平衡2倍柱体积，流速控制在0.3倍体积/小时，将步骤4）中的浓缩液上样硅胶柱，上样体积为柱体积的10%，用乙酸乙酯洗柱3倍柱体积，再用体积比为1:9的丙酮和乙酸乙酯混合溶剂作为流动相进行洗脱，共用8000L丙酮和乙酸乙酯的混合溶剂作为流动相进行洗脱，洗脱过程中压力控制为0.15Mpa，流速为0.2倍体积/小时，收集纯度大于80%利普司他汀洗脱液，持续时间22～25小时；将洗脱液减压浓缩至无有机溶剂，得到棕黄色油状利普司他汀。HPLC测定，利普司他汀纯度为85%，收率为50%。

对比实验4：提纯方法对溶媒用量、生产周期的影响

经对比本发明实施例5和对比实验3，对于不同的提纯方法，对溶媒用量和生产周期影响很大，具体见下表2：

表2：

试验名称	收率（%）	纯度（%）	生产周期（h）	溶媒用量(L)
					实施例5	80	75	14	7600
对比试验3	50	85	30	18600

从表2知：本发明提纯利普司他汀的工艺具有收率高、周期短、溶媒用量少、而且免除过柱后大量溶媒回收的繁琐工序，工艺简单易控制，并且能响应国家提倡的绿色环保、安全生产等号召，同时生产成本大幅度降低，非常适合于工业化大生产。

Claims (9)

1.一种提纯利普司他汀的方法，包括以下步骤：

①发酵液预处理：向链霉菌发酵液中加入助滤剂和絮凝剂，调节pH值至酸性，过滤，得到含有利普司他汀的混合物；所述的助滤剂加入量占发酵液重量的3.0-5.0％；所述的絮凝剂加入量占发酵液重量的0.01-0.1％；所述的pH值调节至2-6；

②浸提：用中等极性的溶媒对含有利普司他汀的混合物进行微生物细胞破碎，得到含有利普司他汀的浸提液；

③转相：

第一次转相：向含有利普司他汀的浸提液中加入水和非极性溶媒，将利普司他汀转相至非极性溶媒相中；

水洗去杂：向含有利普司他汀非极性溶媒中加入水，搅拌，静置分层，收集轻相；

第二次转相：向含有利普司他汀的非极性溶媒中加入中等极性的溶媒，搅拌，静置分层，收集轻相；

反洗：向含有利普司他汀的中等极性溶媒中加入非极性溶媒，搅拌，静置分层；反洗数次，直到杂质消失为止，收集含有利普司他汀的中等极性溶媒相；

④浓缩。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述调节pH值至2-4。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤①中所述助滤剂为珍珠岩、硅藻土、纤维素、氧化镁或活性炭中任一种；所述絮凝剂为聚丙烯酰胺、聚合氯化铝、聚合硅酸铝铁或三氯化铁中任一种。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述中等极性的溶媒为乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮或乙腈中任一种；所述非极性溶媒为庚烷、石油醚或正己烷中任一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤②中所述中等极性的溶媒和浸提液体积重量比(升/吨)为4-6：1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤③第一次转相中所述非极性溶媒和浸提液的体积比为0.4-0.6：1；所述水和浸提液的体积比为0.4-0.6：1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤③第二次转相中所用中等极性的溶媒和非极性溶媒体积比为0.4-0.6：1。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：水洗去杂步骤中所述加入水和非极性溶媒相体积比为0.2-0.5：1。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：反洗步骤中所用中等极性的溶媒和非极性溶媒体积比为4-6：1。