CN102321137A - 一种腺苷钴胺的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种腺苷钴胺的制备方法，其步骤包括：①过滤发酵液得菌丝体和一次滤液；②菌丝体悬浮，破壁，过滤，得悬浮滤液；③悬浮滤液经阳离子交换树脂进行交换，并用弱碱置换得到阳柱解析液；④过滤，得二次滤液；⑤二次滤液经大孔树脂柱吸附、展层、解析得到大孔解析液；⑥大孔解析液经蒸发去除丙酮得到浓缩液；⑦浓缩液经阴离子交换树脂交换，得到脱色液；⑧经大孔树脂吸附，解析得到结晶原液；⑨向结晶原液中加入丙酮，经动态结晶、静态结晶，得到成品腺苷钴胺。本发明采用全树脂提取和精制，操作简便，稳定性高，对环境友好，可极大的提高腺苷钴胺的收率和质量，同时降低生产成本。

Description

一种腺苷钴胺的制备方法

技术领域

本发明涉及化工制药领域，具体的说，是一种制备腺苷钴胺的方法。

背景技术

腺苷钴胺是维生素B₁₂的系列产品之一，化学名为：5，6-二甲基苯并咪唑-5’-脱氧腺嘌呤核苷基钴胺，是一个八面体形钴胺络合物，分子式：C₇₂H₁₀₀CoN₁₈O₁₇P，分子量为：1579.60。腺苷钴胺为暗红色结晶和非结晶性粉末，吸湿性强，见光易分解。腺苷钴胺是维生素B₁₂系列产品的重要品种，属原料药，具有重要的医用价值。

目前腺苷钴胺的制备方法主要包括下述几种。

一种为化学法，即先将微生物发酵生成的腺苷钴胺转化为氰钴胺，加入酶经合成法转化为腺苷钴胺，此法有西班牙interquim公司申报了专利号为200510119016.5的专利，但目前市场上还没有该法生产的腺苷钴胺。

我国腺苷钴胺的生产一直采用发酵液提取法，发酵液分为耗氧发酵液和厌氧发酵液。之前，有华药康欣有限公司和河北华容制药有限公司生产，采用的菌种为厌氧的薛氏丙酸菌，提取工艺采取大孔树脂和二步酸性氧化铝和一步中性氧化铝制备工艺，该工艺发酵单位低，氧化铝的分离提取能力低，损失量大，处理量小，因此产量低，收率低，劳动强度大，且环境污染严重，生产成本高，限制了腺苷钴胺的生产和应用。该工艺腺苷钴胺的收率为30％左右，维生素B₁₂的总收率为65％左右。

另有河北华荣制药有限公司申报的专利号为CN101948494 A的发明专利，名称为一种腺苷钴胺提取方法，该方法为：采用耗氧发酵液或厌氧发酵液提取腺苷钴胺，其对于耗氧发酵液的提取方法为：先水解发酵液，后经大孔树脂提取和氧化铝精制制备腺苷钴胺，该工艺的缺陷在于：由于先水解，胞内含量及纯度高的腺苷钴胺进入成分复杂的胞外液中，再对复杂的水解滤液进行提取，增加了提取的难度，因此提取收率低，表现为：腺苷钴胺收率低，为50％以上；维生素B₁₂的总收率低，仅为80％以上。另外，提取工艺中仍然采用氧化铝精制工艺，提取能力低，损失量大，收率低，劳动强度大，且环境污染严重，生产成本高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种腺苷钴胺的制备方法，采用全树脂提取和精制，操作简便，稳定性高，对环境友好，可极大的提高腺苷钴胺的收率和质量，同时降低生产成本。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种腺苷钴胺的制备方法，其步骤包括：

①向腺苷钴胺发酵液中加入絮凝剂和助滤剂，过滤，得菌丝体和一次滤液；

②菌丝体加水悬浮，并加入沉降剂，调PH为4.5～6.0，加热使细胞壁破壁，过滤，得悬浮滤液；

③悬浮滤液经阳离子交换树脂进行交换，并用弱碱置换得到阳柱解析液；

④在阳柱解析液中加入沉降剂，调PH为4.5～6.0，过滤，得二次滤液；

⑤二次滤液经大孔树脂柱吸附、展层、解析得到大孔解析液；

⑥大孔解析液经蒸发去除丙酮得到浓缩液；

⑦浓缩液经阴离子交换树脂交换，得到脱色液；

⑧先将脱色液PH调为4.5～6.0，再经大孔树脂吸附，解析得到结晶原液；

⑨向结晶原液中加入丙酮，经动态结晶、静态结晶，得到成品腺苷钴胺。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤①中所述腺苷钴胺发酵液是以脱氮假单孢菌为生产菌制备的。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤①中所述絮凝剂为二价锌离子，其用量为3～7kg/立方米发酵液，所述助滤剂为二价钙离子，其用量为2～5kg/立方米发酵液。

作为本发明的一种优选技术方案，所述絮凝剂为氯化锌或硫酸锌；所述助滤剂为氯化钙。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤②中悬浮操作时水与菌丝体的重量比为(4～6)∶1；沉降剂的用量为菌丝体滤泥重量的0.2～0.4％；细胞壁破壁操作时的加热温度为80～92℃，加热持续时间为20～40分钟。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤③中采用阳离子交换树脂交换腺苷钴胺，其置换剂为5～8％氨水溶液，得到的阳柱解析液用7％的盐酸调PH为4.5～6.0。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤④中沉降剂的用量为6～10Kg/立方米阳柱解析液；沉降剂为聚合氯化铝和氯化镁的等质量配比混合物。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤⑥中蒸发操作进行至浓缩液的密度≥0.990g/ml。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤⑧中用20％的醋酸将脱色液PH调为4.5～6.0，经大孔树脂吸附，再用0.930～0.990g/ml的丙酮水溶液解析得到含腺苷钴胺的结晶原液，其中，丙酮水的用量为大孔树脂体积的2～3倍。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤⑨中，在搅拌下向结晶原液中加入0.79～0.81g/ml的丙酮，使得最终溶液的密度为0.820～0.840g/ml，搅拌1～2h，静置3～6h后，过滤、洗涤、过筛、干燥，得腺苷钴胺成品。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明采用脱氮假单孢菌为产生菌，首先将菌丝体和胞外液分离，并且从菌丝体内提取生产腺苷钴胺，胞外液可用于生产维生素B₁₂，在一次过滤时引入了絮凝剂和助滤剂，在悬浮和二次过滤时引入了沉降剂，增加了阳离子交换树脂提取、阴离子交换树脂精制、层析树脂精制，采用动、静态相结合的结晶工艺，整个工艺流程操作简便，稳定性高，对环境友好，极大的提高腺苷钴胺的收率和质量，同时降低生产成本；其具体有益效果列举如下

①采用发酵单位高的脱氮假单孢菌，其发酵单位是薛氏丙酸菌的5～8倍，使得产品产量大幅提高；

②在一次过滤时，加入絮凝剂和助滤剂，使得发酵液中的蛋白絮凝，便于后步提取及提高收率；

③从菌丝体内提取腺苷钴胺，菌丝体内的成分简单，杂质少，便于提取精制，同时将腺苷钴胺与其大部分同系物和发酵残留物的分离放在提取的最前端——一次过滤，不仅降低了后续的提取难度，而且避免了其同系物在后续工序分离引起的本身损失和腺苷钴胺的损失，因此，腺苷钴胺的提取收率≥90％，总收率≥55％，维生素B₁₂总收率≥92％，收率的提高，使得生产成本大幅下降；

④在利用杂质含量低的菌丝体生产腺苷钴胺基础上，又采用阳、阴离子交换树脂及大孔树脂柱协同作用，去除了料液中极性不同、分子量不同、构型不同的各种杂质，因此，产品纯度高、杂质低；

⑤采用了全树脂提取、精制工艺，替代了氧化铝工艺，生产工艺稳定，操作简单，提取周期缩短，提高了批处理能力；

⑥本发明采用动态结晶和静态结晶相结合的方式，既避免静态结晶时间长的弊端，又解决了全部动态结晶时由于晶体较小、比表面大、吸附杂质多、影响产品纯度的弊端，总计结晶时间为4～8小时，比传统的3～5天缩短了很多。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

实施例1

用脱氮假单孢菌纯种对含有麦芽糖、玉米浆、氯化钴组分的培养基进行发酵，发酵单位为182μg/ml，取10m³发酵液，含维生素B121820g，加入絮凝剂硫酸锌50kg和助滤剂氯化钙40kg对发酵液进行固液分离，得到1565kg滤饼(同时得到含维生素B₁₂的一次滤液，用于生产氰钴胺)，加水7000kg悬浮，并加入沉降剂(包含聚合氯化铝和氯化镁各2Kg)，调PH为5.09，加热至87℃保温30分钟使细胞壁破壁，经过滤后得到悬浮滤液，滤饼加5000kg水悬浮后再次过滤，所得滤液合并至悬浮滤液，悬浮滤液含维生素B12 1180g，将此悬浮滤液以500L/h的流量交换于树脂体积为400L的Amberlite^(TM)Cobalamin阳离子交换树脂中，用6％的氨水溶液250L解析后得到阳柱解析液，在阳柱解析液中加入沉降剂(包含聚合氯化铝和氯化镁各1.2Kg)，调PH为5.13，过滤，得到二次滤液，所得滤饼悬浮二次(每次加水300L)，将滤液转入二次滤液，再将此二次滤液以20L/h的流量吸附在树脂体积为50L的Amberlite^(TM)1180大孔树脂柱中，水洗后以20L/h的流量用密度为0.990g/ml的展层剂150L进行展层，得到含维生素B₁₂的展层液，用于生产氰钴胺，以20L/h的流量用密度为0.950g/ml的解析剂120L解析得到大孔解析液，其含腺苷钴胺1080g；真空蒸发大孔解析液至无丙酮味(密度为0.995g/ml)，得到浓缩液，以50L/h的流量将浓缩液通过树脂装量为50L的Amberlite^(TM)IRA900阴离子交换树脂，杂质及色素被交换在树脂上，用120L水将树脂柱中的腺苷钴胺顶出，得到脱色液，用20％醋酸调解料液PH为5.46，以50L/h的流量将脱色液吸附于树脂装量为40L的Amberlite^(TM)1600N大孔树脂柱中，再用0.940g/ml的丙酮水溶液100L解析得到含腺苷钴胺的结晶原液，在搅拌下，向结晶原液中加入密度为0.805g/ml的丙酮至溶液的密度为0.830g/ml，搅拌1h，静置3h后，过滤、洗涤、过筛、干燥得到1065g腺苷钴胺产品，该产品按2010版药典检测方法检测，含量为98.62％，有关物质为0.94％，腺苷钴胺提取收率为91.5％，腺苷钴胺收率为58.5％，维生素B₁₂总收率为94.1％。

实施例2

用脱氮假单孢菌纯种对含有麦芽糖、玉米浆、氯化钴组分的培养基进行发酵，发酵单位为207μg/ml，取10m³发酵液，含维生素B122070g，加入絮凝剂硫酸锌50kg和助滤剂氯化钙40kg后对发酵液进行固液分离，得到滤饼1570kg(同时得到含维生素B₁₂的一次滤液，用于生产氰钴胺)，加水7000kg悬浮，并加入沉降剂(包含聚合氯化铝和氯化镁各2Kg)，调PH为5.45，加热至85℃保温30分钟使细胞壁破壁，经过滤后得到悬浮滤液，滤饼加5000kg水悬浮后再次过滤，将滤液合并至悬浮滤液，悬浮滤液含维生素B12 1331g，将此悬浮滤液以500L/h的流量交换于树脂体积为400L的Amberlite^(TM)Cobalamin阳树脂中，用6％的氨水溶液260L解析后得到阳柱解析液，在阳柱解析液中加入沉降剂(包含聚合氯化铝和氯化镁各1.2Kg)，调PH为5.39，过滤，得到二次滤液，所得滤饼悬浮二次(每次加水300L)，将滤液转入二次滤液，将此二次滤液以20L/h的流量吸附在树脂体积为50L的Amberlite^(TM)1180大孔树脂柱中，经水洗后以20L/h的流量用密度为0.985g/ml的展层剂150L进行展层，得到含维生素B₁₂的展层液，用于生产氰钴胺，以20L/h的流量用密度为0.955g/ml的解析剂110L解析得到的大孔解析液，其含腺苷钴胺1305g，真空蒸发大孔解析液至无丙酮味(密度为0.995g/ml)得到浓缩液，以50L/h的流量将浓缩液通过树脂装量为50L的Amberlite^(TM)IRA900阴离子交换树脂，杂质及色素被交换在树脂上，用130L水将树脂柱中的腺苷钴胺顶出，得到脱色液，用20％的醋酸调节料液PH为5.59，以50L/h的流量将脱色液吸附于树脂装量为40L的Amberlite^(TM)1600N的大孔树脂柱，再用0.950g/ml的丙酮水溶液90L解析得到含腺苷钴胺的结晶原液，在搅拌下，向结晶原液中加入密度为0.810g/ml的丙酮至溶液的密度为0.835g/ml，搅拌1h，静置3h后，过滤、洗涤、过筛、干燥得到1290g腺苷钴胺产品，该产品按2010版药典检测方法检测，含量为98.91％，有关物质为0.85％，腺苷钴胺提取收率为92.8％，腺苷钴胺收率为62.3％，维生素B₁₂总收率为93.4％。

实施例3

用脱氮假单孢菌纯种对含有麦芽糖、玉米浆、氯化钴组分的培养基进行发酵，发酵单位为215μg/ml，取10m³发酵液，含维生素B122150g，加入絮凝剂硫酸锌50kg和氯化钙40kg后对发酵液进行固液分离，得到含维生素B₁₂的一次滤液，用于生产氰钴胺，得到滤饼1590kg，加水7000kg悬浮，并加入沉降剂(包含聚合氯化铝和氯化镁各2Kg)，调PH为5.36，加热至85℃保温30分钟使细胞壁破壁，经过滤后得到悬浮滤液，将滤饼加5000kg水悬浮后再次过滤，将滤液合并至悬浮滤液，悬浮滤液含维生素B12 1310g，将此悬浮滤液以500L/h的流量交换于树脂体积为400L的Amberlite^(TM)Cobalamin阳树脂中，用7％的氨水溶液260L解析后得到阳柱解析液，在阳柱解析液中加入沉降剂(包含聚合氯化铝和氯化镁各1.2Kg)，调PH为5.51，过滤，得到二次滤液，滤饼悬浮二次(每次加水300L)，将滤液转入二次滤液，再将此二次滤液以20L/h的流量吸附在树脂体积为50L的Amberlite^(TM)1180大孔树脂柱中，经水洗后以20L/h的流量用密度为0.990g/ml的展层剂150L进行展层，得到含维生素B₁₂的展层液，用于生产氰钴胺，以20L/h的流量用密度为0.960g/ml的解析剂130L解析得到的大孔解析液，其含腺苷钴胺1290g，真空蒸发大孔解析液至无丙酮味，得到浓缩液，以50L/h的流量将浓缩液通过树脂装量为50L的Amberlite^(TM)IRA900阴离子交换树脂，杂质及色素被交换在树脂上，用130L水将树脂柱中的腺苷钴胺顶出，得到脱色液，用20％的醋酸调节料液PH为5.32，以50L/h的流量将脱色液吸附于树脂装量为40L的Amberlite^(TM)1600N的大孔树脂柱，再用0.935g/ml的丙酮水溶液100L解析得到含腺苷钴胺的结晶原液，在搅拌下，向结晶原液中加入密度为0.805g/ml的丙酮至溶液的密度为0.830g/ml，搅拌1h，静置3h后，过滤、洗涤、过筛、干燥得到干燥得到1280g腺苷钴胺产品，该产品按2010版药典检测方法检测，含量为98.75％，有关物质为0.86％，腺苷钴胺提取收率为92.9％，腺苷钴胺收率为59.5％，维生素B12总收率为94.6％。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (10)

1.一种腺苷钴胺的制备方法，其特征步骤包括：

①向腺苷钴胺发酵液中加入絮凝剂和助滤剂，过滤，得菌丝体和一次滤液；

②菌丝体加水悬浮，并加入沉降剂，调PH为4.5～6.0，加热使细胞壁破壁，过滤，得悬浮滤液；

③悬浮滤液经阳离子交换树脂进行交换，并用弱碱置换得到阳柱解析液；

④在阳柱解析液中加入沉降剂，调PH为4.5～6.0，过滤，得二次滤液；

⑤二次滤液经大孔树脂柱吸附、展层、解析得到大孔解析液；

⑥大孔解析液经蒸发去除丙酮得到浓缩液；

⑦浓缩液经阴离子交换树脂交换，得到脱色液；

⑧先将脱色液PH调为4.5～6.0，再经大孔树脂吸附，解析得到结晶原液；

⑨向结晶原液中加入丙酮，经动态结晶、静态结晶，得到成品腺苷钴胺。

2.根据权利要求1所述的腺苷钴胺的制备方法，其特征在于：步骤①中所述腺苷钴胺发酵液是以脱氮假单孢菌为生产菌制备的。

3.根据权利要求1所述的腺苷钴胺的制备方法，其特征在于：步骤①中所述絮凝剂为二价锌离子，其用量为3～7kg/立方米发酵液，所述助滤剂为二价钙离子，其用量为2～5kg/立方米发酵液。

4.根据权利要求3所述的腺苷钴胺的制备方法，其特征在于：所述絮凝剂为氯化锌或硫酸锌；所述助滤剂为氯化钙。

5.根据权利要求1所述的腺苷钴胺的制备方法，其特征在于：步骤②中悬浮操作时水与菌丝体的重量比为(4～6)∶1；沉降剂的用量为菌丝体滤泥重量的0.2～0.4％；细胞壁破壁操作时的加热温度为80～92℃，加热持续时间为20～40分钟。

6.根据权利要求1所述的腺苷钴胺的制备方法，其特征在于：步骤③中采用阳离子交换树脂交换腺苷钴胺，其置换剂为5～8％氨水溶液，得到的阳柱解析液用7％的盐酸调PH为4.5～6.0。

7.根据权利要求1所述的腺苷钴胺的制备方法，其特征在于：步骤④中沉降剂的用量为6～10Kg/立方米阳柱解析液；沉降剂为聚合氯化铝和氯化镁的等质量配比混合物。

8.根据权利要求1所述的腺苷钴胺的制备方法，其特征在于：步骤⑥中蒸发操作进行至浓缩液的密度≥0.990g/ml。

9.根据权利要求1所述的腺苷钴胺的制备方法，其特征在于：步骤⑧中用20％的醋酸将脱色液PH调为4.5～6.0，经大孔树脂吸附，再用0.930～0.990g/ml的丙酮水溶液解析得到含腺苷钴胺的结晶原液，其中，丙酮水的用量为大孔树脂体积的2～3倍。

10.根据权利要求1所述的腺苷钴胺的制备方法，其特征在于：步骤⑨中，在搅拌下向结晶原液中加入0.79～0.81g/ml的丙酮，使得最终溶液的密度为0.820～0.840g/ml，搅拌1～2h，静置3～6h后，过滤、洗涤、过筛、干燥，得腺苷钴胺成品。