CN102391339A - 一种从好氧发酵液中提取腺苷钴胺的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从好氧发酵液中提取腺苷钴胺的方法,它包括如下步骤:a、好氧维生素B12发酵液在避光条件下水解过滤,得到滤液;b、滤液经弱酸性阳离子交换树脂吸附、解吸得到一解液;c、一解液加入絮凝剂,过滤,得到纯化液;d、纯化液大孔树脂吸附、展层和解吸得到二解液;e、二解液经强碱性阴离子交换树脂脱色,得到三解液;f、三解液经层析树脂吸附、展层,得到四解液;g、四解液再经大孔树脂浓缩,得到结晶原液;h、在搅拌状态下,向结晶原液中加入丙酮进行结晶、抽滤,干燥即得腺苷钴胺成品。本发明所得产品的有关物质低于1.0%,含量达到98.0%以上,产品得率达到50%以上,维生素B12的总得率高于80%,具有方法简便易行,提取得率高,产品纯度高,生产成本低的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取腺苷钴胺方法,特别涉及一种从粘着剑菌、脱氮假单胞菌及巨大芽孢杆菌进行维生素B12好氧发酵所得发酵液中提取腺苷钴胺的方法。
背景技术
腺苷钴胺是维生素B12的一种,又称辅酶B12,它是以钴离子为中心,与四个吡咯环、苯并咪唑及5-脱氧核糖腺苷组成的复杂络合物,分子式:C72H100CoN18O17P ,分子量:1579.57,其化学结构式如下:
腺苷钴胺为深红色晶体或结晶性粉末,无臭无味,在空气中易吸潮,见光易分解。腺苷钴胺属于维生素类药物,主要用于治疗恶性贫血和其它巨幼细胞型贫血,也可用于治疗各种营养不良性和失血性贫血,以及神经炎、神经痛及神经性障碍等疾病,还可治疗放射线及化疗引起的白细胞减少症,急慢性口腔溃疡和氰化物的解毒等症状,具有良好的临床使用效果。
目前生产腺苷钴胺的方法有两种,一种是从生产维生素B12的发酵液中提取制得,该种发酵液是厌氧发酵法产生的,菌种为谢氏丙酸杆菌。另一种是由氰钴胺经酶合成法转化为腺苷钴胺,该方法法已由西班牙intequim公司申报了专利,专利号为: 200510119016.5,名称为“酶催化生产腺苷辅酶维生素B12的方法”,但在市场上尚未见到该方法生产的产品。
目前生产氰钴胺的方法有两种,一种是前面所说的厌氧发酵法,另一种是好氧发酵法。而从好氧发酵液中提取腺苷钴胺的技术尚处于空白阶段。这是因为好氧发酵液中的腺苷钴胺既存在于胞内,也存在于胞外,其滤液的成分比较复杂,提取困难,故从好氧发酵液中提取腺苷钴胺未能形成生产工艺。厌氧发酵液中的腺苷钴胺仅存于胞内,其滤液的成分相对简单,故形成了成熟的腺苷钴胺提取工艺。但是由于厌氧法的发酵水平较低,与好氧法相比发酵中的产物浓度低5~6倍。因此,厌氧法生产维生素B12的工艺即将被淘汰,故研究好氧法生产腺苷钴胺的工艺势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从好氧发酵液中提取腺苷钴胺的方法, 该方法应具有简便易行、提取率高、产品纯度高、生产成本低等特点。
本发明所述技术问题是由以下技术方案解决的:
一种从好氧发酵液中提取腺苷钴胺的方法,它按如下步骤进行:
a、取维生素B12发酵液在避光条件下水解过滤,得到滤液;
b、滤液调节pH,经弱酸性阳离子交换树脂吸附、解吸得到一解液;
c、一解液用稀盐酸或稀醋酸调其pH为5.0~6.5,加入絮凝剂,用质量浓度为30%的氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.5,过滤,得到纯化液;
d、纯化液用稀盐酸或稀醋酸调节pH为3.0~5.0,经苯乙烯-二乙烯基苯类大孔树脂吸附、展层和解吸,去除部分其它类型的维生素B12,并经浓缩得到二解液;
e、二解液穿过强碱性阴离子交换树脂,脱色和去除部分杂质,得到三解液;
f、三解液经层析吸附树脂吸附、展层,去除杂质,得到四解液;
g、四解液再经大孔吸附树脂吸附和浓缩,得到结晶原液;
h、在搅拌状态下,向结晶原液中加入丙酮进行结晶,抽滤,干燥即得腺苷钴胺成品。
上述提取腺苷钴胺的方法,所述步骤a中,维生素B12发酵液为好氧发酵液;该好氧发酵液是经粘着剑菌、脱氮假单孢菌及巨大芽孢杆菌好氧发酵而得。
上述提取腺苷钴胺的方法,所述步骤b中,滤液用稀盐酸、稀硝酸或冰醋酸调节pH为2.5~4.0。
上述提取腺苷钴胺的方法,所述步骤b中,一柱弱酸性阳离子交换树脂为聚丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂。
上述腺苷钴胺的提取方法,所述步骤b解吸所使用的解吸剂为剂稀氨水,其中氨和水的质量比为3~10:100。
上述提取腺苷钴胺的方法,所述步骤c中,絮凝剂为二价锌盐或三价铝盐,如氯化锌、硫酸锌、聚合氯化铝、硫酸铝等,所述维生素B12和絮凝剂用量的重量比为1: 10~20。
上述提取腺苷钴胺的方法,所述步骤d中,浓缩得到的二解液,其维生素B12浓度控制在500~20000ug/ml。
上述提取腺苷钴胺的方法,所述步骤e中,强碱性阴离子交换树脂为大孔型聚苯乙烯系阴离子交换树脂。
上述提取腺苷钴胺的方法,所述步骤f和g中,所使用的层析吸附树脂和大孔吸附树脂均为苯乙烯-二乙烯基苯类大孔树脂。
上述腺苷钴胺的提取方法,所述步骤d、f中,展层所使用的展层剂为丙酮与水,其体积比为5~15:100;或者使用乙醇与水为展层剂,其体积比为5~20:100。
上述腺苷钴胺的提取方法,所述步骤d、f、g中,解吸所使用的解吸剂为丙酮与水,其体积比为30~60:100;或者使用乙醇与水为解吸剂,其体积比为50~80:100。
本发明主要是由粘着剑菌、脱氮假单孢菌及巨大芽孢杆菌等好氧条件下的发酵液,经过絮凝剂的纯化、大孔树脂的浓缩及层析树脂的精制等提取手段,得到的腺苷钴胺产品质量完全符合药典质量要求。本发明具有以下优点:
1、该发明填补了从维生素B12好氧发酵液中提取腺苷钴胺的国际空白。
2、好氧发酵液的成分复杂,蛋白、色素及杂质种类明显多于厌氧发酵液,通过大量的实验,对絮凝剂、大孔树脂及层析树脂进行筛选,本发明建立了好氧发酵液提取腺苷钴胺的最佳工艺。
3、本发明制备的腺苷钴胺产品质量与厌氧工艺制备的产品质量基本一致,能够达到2010版中腺苷钴胺项下规定的要求。产品的有关物质不大于1.0%,含量不小于98.0%。
4、本发明具有简便易行、提取率高、产品纯度高、生产成本低等特点,适宜大批量的生产。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步详述。
实施例1:
取含有10g维生素B12的好氧发酵液在避光条件下水解过滤,得到滤液;然后将滤液用稀盐酸调节pH为3.0,经聚丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂吸附,用质量比为6%的稀氨水为解吸剂解吸得到一解液;一解液用稀盐酸调pH为6.5,加入絮凝剂二价锌盐,维生素B12:絮凝剂用量的重量比=1: 12,用质量浓度为30%的氢氧化钠溶液调pH至7.0,过滤后,再用水悬浮滤饼再次过滤,重复几次该操作,合并所有滤液得到纯化液;纯化液用稀盐酸调节pH为4.8后吸附于苯乙烯-二乙烯苯类大孔树脂,用水洗涤后使用低比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为5:100溶液进行展层,得到含有1.7g的其他类型维生素B12的展层液,等色带完全展断后,用高比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为45:100溶液进行解吸,得到含有6.8g腺苷钴胺的二解液;将二解液浓缩至腺苷钴胺浓度为5000ug/ml,快速穿过大孔型聚苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂,脱色并去除部分杂质,得到三解液;三解液吸附于苯乙烯-二乙烯基苯类层析树脂,用水洗涤后使用低比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为7:100溶液进行展层,等色带基本展断后,用高比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为10:100溶液继续展层收料,所收料液为四解液;四解液经苯乙烯-二乙烯基苯类大孔树脂柱吸附、水洗和解吸,解吸剂丙酮与水的体积比为45:100,得到含有腺苷钴胺6.5g结晶原液;在搅拌状态下向结晶原液中加入丙酮使腺苷钴胺结晶出来,经抽滤、干燥得到6.5g的腺苷钴胺产品。该产品的各种杂质为0.67%,腺苷钴胺含量为98.3%,产品得率为65.0%,维生素B12的总得率为82.0%。
实施例2:
取含有10g维生素B12的好氧发酵液在避光条件下水解过滤,得到滤液;然后将滤液用稀盐酸调节pH为2.9,经聚丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂吸附,用质量比为6%的稀氨水为解吸剂解吸得到一解液;一解液用稀盐酸调pH为5.0,加入絮凝剂二价锌盐,维生素B12:絮凝剂用量的重量比=1: 20,用质量浓度为30%的氢氧化钠溶液调pH至7.5,过滤后,再用水悬浮滤饼再次过滤,重复几次该操作,合并所有滤液得到纯化液;纯化液用稀盐酸调节pH为4.0后吸附于苯乙烯-二乙烯苯类大孔树脂,用水洗涤后使用低比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为10:100溶液进行展层,得到含有1.9g的其他类型维生素B12的展层液,等色带完全展断后,用高比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为50:100溶液进行解吸,得到含有6.5g腺苷钴胺的二解液;将二解液浓缩至腺苷钴胺浓度为10000ug/ml,快速穿过大孔型聚苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂,脱色并去除部分杂质,得到三解液;三解液吸附于苯乙烯-二乙烯基苯类层析树脂,用水洗涤后使用低比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为7:100溶液进行展层,等色带基本展断后,用高比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为12:100溶液继续展层收料所收料液为四解液;四解液经苯乙烯-二乙烯基苯类大孔树脂柱吸附、水洗和解吸,解吸剂丙酮与水的体积比为50:100,得到含有腺苷钴胺6.2g结晶原液;在搅拌状态下向结晶原液中加入丙酮使腺苷钴胺结晶出来,经抽滤、干燥得到6.2g的腺苷钴胺产品。该产品的各种杂质为0.77%,腺苷钴胺含量为98.5%,产品得率为62.0%,维生素B12的总得率为81.0%。
实施例3:
取含有10g维生素B12的好氧发酵液在避光条件下水解过滤,得到滤液;然后将滤液用稀盐酸调节pH为3.5,经聚丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂吸附,用质量比为6%的稀氨水为解吸剂解吸得到一解液;一解液用稀盐酸调pH为6.0,加入絮凝剂二价锌盐,维生素B12:絮凝剂用量的重量比=1: 15,用质量浓度为30%的氢氧化钠溶液调pH至6.5,过滤后,再用水悬浮滤饼再次过滤,重复几次该操作,合并所有滤液得到纯化液;纯化液用稀盐酸调节pH为3.2后吸附于苯乙烯-二乙烯苯类大孔树脂,用水洗涤后使用低比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为8:100溶液进行展层,得到含有2.0g的其他类型维生素B12的展层液,等色带完全展断后,用高比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为55:100溶液进行解吸,得到含有6.6g腺苷钴胺的二解液;将二解液浓缩至腺苷钴胺浓度为12000ug/ml,快速穿过大孔型聚苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂,脱色并去除部分杂质,得到三解液;三解液吸附于苯乙烯-二乙烯基苯类层析树脂,用水洗涤后使用低比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为6:100溶液进行展层,等色带基本展断后,用高比例的丙酮水,可选择丙酮与水的体积比例为10:100溶液继续展层收料,所收料液为四解液;四解液经苯乙烯-二乙烯基苯类大孔树脂柱吸附、水洗和解吸,解吸剂丙酮与水的体积比为55:100,得到含有腺苷钴胺6.3g结晶原液;在搅拌状态下向结晶原液中加入丙酮使腺苷钴胺结晶出来,经抽滤、干燥得到6.3g的腺苷钴胺产品。该产品的各种杂质为0.81%,腺苷钴胺含量为98.7%,产品得率为63.0%,维生素B12的总得率为83.0%。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明保护范围的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述基础上做出的其它不同形式的变化或变动,仍应处于本发明的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种从好氧发酵液中提取腺苷钴胺的方法,其特征在于,它包括如下步骤:
a、取好氧维生素B12发酵液在避光条件下水解过滤,得到滤液;
b、滤液调节pH,经弱酸性阳离子交换树脂吸附、解吸得到一解液;
c、一解液用稀盐酸或稀醋酸调其pH为5.0-6.5,加入絮凝剂,用质量浓度为30%的氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.5,过滤,得到纯化液;
d、纯化液用稀盐酸或稀醋酸调节pH为3.0~5.0,经苯乙烯-二乙烯基苯类大孔树脂吸附、展层和解吸,去除部分其它类型的维生素B12,并经浓缩得到二解液;
e、二解液穿过强碱性阴离子交换树脂,脱色和去除部分杂质,得到三解液;
f、三解液经苯乙烯-二乙烯基苯类层析树脂吸附、展层,去除杂质,得到四解液;
g、四解液再经苯乙烯-二乙烯基苯类大孔树脂吸附和浓缩,得到结晶原液;
h、在搅拌状态下,向结晶原液中加入丙酮进行结晶,抽滤,干燥即得腺苷钴胺成品。
2.根据权利要求1所述提取腺苷钴胺的方法,其特征在于,所述维生素B12发酵液为好氧发酵液;所述好氧发酵液是经粘着剑菌、脱氮假单孢菌及巨大芽孢杆菌好氧发酵而得。
3.根据权利要求2所述提取腺苷钴胺的方法,其特征在于,所述滤液用稀盐酸、稀硝酸或冰醋酸调节pH为2.5~4.0。
4.根据权利要求3所述提取腺苷钴胺的方法,其特征在于,所述一柱弱酸性阳离子交换树脂为聚丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂。
5.根据权利要求4所述提取腺苷钴胺的方法,其特征在于,所述一柱解吸所使用的解吸剂稀氨水,其中,氨和水的质量比为3~10:100。
6.根据权利要求5所述提取腺苷钴胺的方法,其特征在于,所述絮凝剂为二价锌盐或三价铝盐,所述维生素B12和絮凝剂用量的重量比为1: 10~20。
7.根据权利要求6所述提取腺苷钴胺的方法,其特征在于,所述浓缩得到的二解液,其维生素B12浓度控制在500~20000ug/ml。
8.根据权利要求7所述提取腺苷钴胺的方法,其特征在于,所述强碱性阴离子交换树脂为大孔型聚苯乙烯系季胺基阴离子交换树脂。
9.根据权利要求8所述提取腺苷钴胺的方法,其特征在于,所述展层使用的展层剂为丙酮与水,其体积比为5~15:100;或者使用乙醇与水为展层剂,其体积比为5~20:100;
解吸所用解吸剂为丙酮水溶液或乙醇溶液,其中丙酮水溶液中丙酮与水的体积比为30~60:100;乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为50~80:100。
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120328 |