CN108251476A - 从酶制剂废水中提取维生素b12的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，属于微生物发酵技术领域，能够将酶制剂废水作为VB12源来提取VB12，降低了VB12的生产成本，实现了酶制剂废水的综合利用。本发明所述方法包括：获取好食脉孢菌发酵工艺的发酵液、将所得发酵液进行酶制剂的絮凝、酶制剂的压滤、酶制剂的提取、维生素B12的提取分离。该方法VB12的收率高，用于从酶制剂废水中提取VB12。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，具体为从好食脉孢菌发酵产酶后酶制剂废水中提取维生素B12的方法。
背景技术
维生素B12(VB12)又叫钴胺素，是唯一的一种需要肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的维生素，具有广泛的生理作用，可参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。目前，对VB12产生菌的研究多集中于放线菌、丙酸菌、诺卡式菌、棒状菌、芽孢杆菌、乙酸杆菌以及丁酸杆菌等。但目前的发酵方法由于发酵周期长、菌体量和产物积累量不一致等原因，导致VB12的生物发酵法生产成本过高。
因此，改进发酵和提取工艺，降低生产成本，促进市场所消费，提高产量是今后的重点之一。
发明内容
本发明旨在提供一种提取维生素B12的方法，具体为从酶制剂废水中提取维生素B12，解决了发酵法生产维生素B12成本过高的问题，实现了酶制剂废水的综合利用。
本发明提供一种从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，其中所述方法包括以下步骤：
1)获取好食脉孢菌发酵工艺的发酵液；
2)酶制剂絮凝工艺：
将发酵液压入絮凝罐后，加入絮凝剂组合物，混合均匀，然后补加一定量的水，使预处理后的溶液总体积为发酵液体积的1～2倍，其中所述絮凝剂组合物的成分及重量比为苯甲酸钠0.1～0.12％、硅藻土2.5～3.0％、珍珠岩3.0～4.5％；
3)酶制剂压滤工艺：
用PH 1.5～1.8的稀H2SO4溶液调节PH在2.8～3.2，搅拌反应1.5～2小时后，进入板框压滤机过滤；
4)酶制剂的提取：经膜截留分子量为10000的超滤膜过滤处理，被超滤膜截留的浓缩液为酶制剂，透过超滤膜的废水用于维生素B12的提取分离；
5)维生素B12的提取分离
第一吸附：将步骤4)酶制剂的提取中透过超滤膜的废水用弱酸性阳离子树脂50柱吸附，然后用15％氨水解析，得到第一解析液；
解析液板框过滤：第一解析液调节pH值后，加黄血盐升温进行转化，再次调节PH值；然后过板框进行过滤，取滤液，记为第三滤液；
浓缩：第三滤液经升膜蒸发器浓缩，浓缩液降温3～5℃；
第二吸附：浓缩液用纯化水稀释至12000-15000ug/ml经阴离子树脂脱色除杂后，用1:1冰醋酸调节pH值；
第三吸附：经大孔树脂吸附，然后用45％丙酮解析。
本发明提供一种从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，从发酵液提取酶制剂后的酶制剂废水中提取维生素B12，具有明显的经济效益和社会价值。相比通过发酵直接生产VB12降低了生产成本。实现了酶制剂废水的综合利用，解决了本领域的一个难点。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，其中，所述方法可以包括以下步骤：
1)获取好食脉孢菌发酵工艺的发酵液；
2)酶制剂絮凝工艺：
将发酵液压入絮凝罐后，加入絮凝剂组合物，混合均匀，然后补加一定量的水，使预处理后的溶液总体积为发酵液体积的1～2倍，其中所述絮凝剂组合物的成分及重量比为苯甲酸钠0.1～0.12％、硅藻土2.5～3.0％、珍珠岩3.0～4.5％；
3)酶制剂压滤工艺：
用PH 1.5～1.8的稀H2SO4溶液调节PH在2.8～3.2，搅拌反应1.5～2小时后，进入板框压滤机过滤；
4)酶制剂的提取：经膜截留分子量为10000的超滤膜过滤处理，被超滤膜截留的浓缩液为酶制剂，透过超滤膜的废水用于维生素B12的提取分离；
5)维生素B12的提取分离
第一吸附：将步骤4)酶制剂的提取中透过超滤膜的废水用弱酸性阳离子树脂50柱吸附，然后用15％氨水解析，得到第一解析液；
解析液板框过滤：第一解析液调节pH值后，加黄血盐升温进行转化，再次调节PH值；然后过板框进行过滤，取滤液，记为第三滤液；
浓缩：第三滤液经升膜蒸发器浓缩，浓缩液降温3～5℃；
第二吸附：浓缩液用纯化水稀释至12000-15000ug/ml经阴离子树脂脱色除杂后，用1:1冰醋酸调节pH值；
第三吸附：经大孔树脂吸附，然后用45％丙酮解析。
VB12早期是利用丙酸杆菌厌氧发酵产生的，该菌种主要问题是发酵时产生大量的有机酸，会明显降低VB12产量。
现在对VB12产生菌的研究多集中于放线菌、丙酸菌、诺卡式菌、棒状菌、芽孢杆菌、乙酸杆菌以及丁酸杆菌等。但目前的发酵方法由于发酵周期长、菌体量和产物积累量不一致等原因，导致VB12的生物发酵法生产成本过高。
改进发酵和提取工艺，降低生产成本，促进市场所消费，提高产量是今后的重点之一。
好食脉胞菌以葡萄糖、糖蜜、玉米浆、无机盐等原料作为发酵基础培养基，经发酵罐内实罐灭菌后，冷却至工艺培养温度，接入已培养好的生产菌种子菌液，通入经净化处理后的无菌压缩空气，在搅拌情况下，进行发酵培养，可得到高含量的复合酶和VB12。复合酶制中的各种酶分子量都在50000左右，而VB12的分子量只有1500左右，酶制剂在浓缩时采用膜过滤的方法，通常用10000孔径的膜进行浓缩，所以在提取酶时不会在酶液里，而是全在废水里，因此只要从废水中直接提取，酶和提取互相不会干拢。
此外，所有微生物在进行发酵时都会产生多种产品，如：单一菌种发酵可以得到含各种酶的复合酶制剂，醇发酵时得到各种醇，有机酸发酵时得到各种有机酸，但是要把发酵产物分别提取有一定难度，还有的没有经济价值，因此发酵液综合利用是本领域的一个难点。
本发明实施例提供一种从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，从发酵液提取酶制剂后的酶制剂废水中提取维生素B12，具有明显的经济效益和社会价值。相比通过发酵直接生产VB12降低了生产成本。
本发明实施例中，酶制剂废水指的是从发酵液原液中将酶提取出来后所产生的废水。也就是说，本发明实施例提供的提取方法，得到发酵液后，先从发酵液中将酶提取出来，然后从所得废水中提取VB12，实现了酶制剂废水的综合利用，解决了本领域的一个难点。
在第一吸附中，将酶制剂的提取中透过超滤膜的废水用弱酸性阳离子树脂吸附，然后用15％氨水作为解析液进行解析。
在解析液板框过滤工艺中，解析液调节PH值后，加氨水含量3-4倍的黄血盐升温进行转化，再次调节PH值。然后过板框进行过滤，取滤液，该滤液交至下道工序。滤渣经过二次调渣过滤后，顶板框后收集二次滤液，该滤液一同交至下道工序。
在浓缩工艺中，解析液板框过滤工艺后的滤液经大孔树脂吸附解析后，经升膜蒸发器浓缩，浓缩液降温3-5℃。
第二吸附中，浓缩工艺所得浓缩液用纯化水稀释至12000-15000ug/ml经阴离子树脂脱色除杂后，用1:1冰醋酸调节pH值。
第三吸附中，脱色除杂后的溶液经大孔树脂吸附，再用45％丙酮解析。
第三吸附处理后所得解析液可进行烘干处理，得到VB固体产品。
下文对本发明实施例中适用的好食脉孢菌发酵工艺进行进一步的阐述。
其中，所述好食脉孢菌发酵工艺为好食脉孢菌产酶的发酵工艺，该好食脉孢菌的保藏编号为CICC12001。
复合酶制中的各种酶分子量都在50000左右，而的分子量只有1500左右，在提取酶时VB12一般不会在酶液里，而是全在废水里，因此只要从废水中直接提取，酶和提取互相不会干拢。
本发明实施例所述提取维生素B12的方法，适用于酶制剂废水，该酶制剂废水指的是发酵液提取分离酶后的废水。也就是说，本发明实施例所述提取维生素B12的方法，先将
具体的，所述好食脉孢菌发酵工艺可以包括以下步骤：
1)所述好食脉孢菌的保藏编号为CICC12001；
2)一级种子培养
将菌种转移到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃，风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，其中，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min。
进一步地，在发酵过程中添加营养液A或营养液B，营养液A的成分及组成为槐糖40～50g/L、甜菜碱15～28g/L、玉米浆1.1～2.0g/L；营养液B的成分及组成为纤维二糖10～15g/L、反玉米素0.1～0.5g/L、甜菜碱12～21g/L、玉米浆1.5～2.5g/L、栀子苷0.12～0.36g/L、碳酸氢钠0.01～0.03g/L、氧化镁0.01～0.03g/L。
本发明实施例的好食脉孢菌发酵工艺可以同时生产复合酶和VB12。
本发明实施例提供的好食脉孢菌发酵工艺，采用好食脉孢菌同时生产复合酶和VB12，不仅酶产物中纤维素酶、木聚糖酶、中温淀粉酶、蛋白酶各酶的酶活均较高，且相互之间的配比适宜，构成的复合酶可用于饲料复合酶制剂，提高饲料利用率。同时还可得到较高含量的VB12，发酵液在将复合酶提取分离后既可直接作为VB12原料源用作饲料添加剂、也可用于进一步提取分离VB12，降低了发酵生产VB12的成本。
在一级种子培养之前，还可以包括斜面培养，以活化菌种。
斜面培养的培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂17g、加水至体积为1000mL、pH自然；121℃灭菌30min。
斜面培养的过程可以为：将菌种移接在斜面培养基上，置于恒温培养箱中28℃下培养3天。
具体地，斜面培养基的配制过程中，马铃薯需要去皮后切皮，而后加水煮沸，取4层纱布进行过滤。
斜面培养的过程中，培养3天后，斜面培养基上回生长出大量的孢子，此时视为培养成熟，可取出置于4℃冰箱中保存待用。
随后依次经过一级种子培养和二级种子培养，然后在发酵培养基中进行发酵生产。其中，一级种子培养的时间要大于二级种子培养的时间。具体的，一级种子培养的时间可以是二级种子培养的时间的约3～4倍左右。
进一步地，可以在一级种子培养罐中培养20～24h，然后在二级种子培养罐中培养6～8h。进一步优选地，可以在一级种子培养罐中培养22h，在二级种子培养罐中培养7h。
本发明实施例提供了从酶制剂废水中提取VB12的方法，采用好食脉孢菌发酵生产复合酶和VB12，可同时得到高酶活的复合酶以及高含量的VB12，发酵液在分离酶制剂之后产生的酶制剂废水中含有高含量的VB12，可用于提取VB12且在该提取过程中无需添加氰化钾等带有剧毒毒性的氰化物，避免氰化物的残留可能导致的安全隐患问题。
在本发明一实施例中，在接种过程中，将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为106～109个/mL的孢子悬液，接种到灭菌的发酵培养基中，例如可以制成107个/mL的孢子悬液、108个/mL的孢子悬液、或者109个/mL的孢子悬液。
接种量一般是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。接种量过大或者过小，均会影响发酵。本发明实施例的方法中，可以以20％～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中，进行后续的发酵生产；进一步可以以28％～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中，进行后续的发酵生产。
在本发明一实施例的方法中，可以在发酵过程中添加营养液。适用的营养液可以为营养液A，其成分及组成为槐糖40～50g/L、甜菜碱15～28g/L、玉米浆1.1～2.0g/L；或者可以为营养液B，其成分或组成为纤维二糖10～15g/L、反玉米素0.1～0.5g/L、甜菜碱12～21g/L、玉米浆1.5～2.5g/L、栀子苷0.12～0.36g/L、碳酸氢钠0.01～0.03g/L、氧化镁0.01～0.03g/L。
营养液A或营养液B可以在发酵过程中添加到发酵罐中。例如可以在发酵过程的0～18小时内添加稿发酵罐中，例如可以在第1小时、第3小时、第6小时、或者第18小时添加到发酵罐内。
在发酵过程中添加营养液A的情况下，以发酵培养基的起始总重量计，营养液A的添加量为发酵培养基的起始总重量的40％～62％。
进一步的，营养液A可以分批多次添加到发酵罐中。例如可以分为4批依次在发酵过程的第3小时、第18小时、第60小时、第96小时添加到发酵罐中。
在本发明一优选实施例中，营养液A的添加分为四个阶段：第一阶段为发酵过程的第3小时，加入营养液A总量的20％；第二阶段为发酵过程的第18小时，加入营养液A总量的50％；第三阶段为发酵过程的第60小时，加入营养液A总量的20％；第四阶段为发酵过程的第96小时，加入营养液A总量的10％。
进一步地，营养液A成分及组成还可以包括反玉米素0.1g/L。也就是说，营养液A的成分及组成还可以为槐糖40～50g/L、甜菜碱15～28g/L、玉米浆1.1～2.0g/L、反玉米素0.1g/L。
在发酵过程中添加营养液B的情况下，营养液B的添加量为发酵培养基起始总重量的10～20％。
营养液B可以分批多次添加到发酵罐中。例如可以分为4批依次在发酵过程的第3小时、第18小时、第60小时、第96小时添加到发酵罐中。
在本发明一优选实施例中，营养液B的添加分为四个阶段：第一阶段为发酵过程的第3小时，加入营养液B总量的25％；第二阶段为发酵过程的第18小时，加入营养液B总量的35％；第三阶段为发酵过程的第60小时，加入营养液B总量的20％；第四阶段为发酵过程的第96小时，加入营养液B总量的20％。
微生物在进行发酵时都会产生多种产品，通过单一菌种发酵获取多产物，普遍都存在的问题是“此消彼长”，提高了一种产物的产量的同时会降低其他产物的产量，难以实现多产物的产量均衡分配，均有提高。在这过程中通过单一菌种发酵获取多产物时，一般是通过膜分离等手段，将其他产物在发酵过程中及时隔离出去。而本发明实施例提供的采用好食脉孢菌通过发酵同时生产复合酶和VB12的方法，可同时得到高含量的复合酶以及VB12。
营养液的添加对复合酶和VB12的产量具有很大影响，能够改变细胞膜的渗析性，促进细胞内外物质交换能力，从而提高发酵速率；可能还促进了菌种生长和发酵进程，进而提高了发酵产率。
在不同的发酵阶段菌体浓度是不同的，生长、代谢及生产状态也是不同的，因此掌握不同阶段中合适的添加方式和添加量比较重要。添加时机不当可能不仅没有提高产酶和VB12的效果，反而会抑制菌体生长，不利于产酶和VB12。因此，营养液的添加时机对产酶及VB12具有很大影响。本发明实施例所述方法中，发酵过程的第3小时、第18小时、第60小时、第96小时是比较重要的切入点。
下文以具体实施例进一步详细阐述本发明实施例所述的从酶制剂废水中提取维生素B12的方法。
其中，所用菌种均为好食脉孢菌CICC12001。
实施例1
1)斜面培养
从保菌管中刮一环菌种，移接在斜面培养基上，恒温培养箱中28℃下培养3天，斜面上生长出大量的孢子即为培养成熟，取出放于4℃冰箱保存备用；
斜面培养基的配置：马铃薯去皮200g切片加水1000ml,煮沸20min,用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g,琼脂17g，补充体积至1000ml,PH自然，置于电炉上缓慢煮沸至琼脂溶化，分装试管，121℃灭菌30min。
2)一级种子培养
将菌种接种到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
转移到二级种子罐中，在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃,风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，然后以20～30％的接种量接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
在发酵过程中添加营养液A，营养液A的成分及组成为槐糖45g/L、甜菜碱15g/L、玉米浆1.5g/L；
营养液A的添加量为发酵培养基起始总重量的62％；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；121-123℃温度下灭菌处理25min。
6)酶制剂絮凝工艺：
将发酵液压入絮凝罐后，加入絮凝剂组合物，混合均匀，然后补加一定量的水，使预处理后的溶液总体积为发酵液体积的1～2倍，其中所述絮凝剂组合物的成分及重量比为苯甲酸钠0.1～0.12％、硅藻土2.5～3.0％、珍珠岩3.0～4.5％；
7)酶制剂压滤工艺：
用PH 1.5～1.8的稀H2SO4溶液调节PH在2.8～3.2，搅拌反应1.5～2小时后，进入板框压滤机过滤；
8)酶制剂的提取：经膜截留分子量为10000的超滤膜过滤处理，被超滤膜截留的浓缩液为酶制剂，透过超滤膜的废水用于维生素B12的提取分离；
9)维生素B12的提取分离
第一吸附：将步骤8)酶制剂的提取中透过超滤膜的废水用弱酸性阳离子树脂50柱吸附，然后用15％氨水解析。
10)解析液板框过滤：解析液加辅料调节PH值后，加含量的3-4倍黄血盐升温进行转化，再次调节PH值。然后过板框进行过滤，滤液交至下道工序。
11)浓缩：步骤10)所得滤液经1180柱大孔树脂吸附解析后，经升膜蒸发器浓缩，浓缩液降温3-5℃。
12)第二吸附：浓缩液用纯化水稀释至12000-15000ug/ml经900柱阴离子树脂脱色除杂后，用1:1冰醋酸调节pH值。
13)步骤12)所得脱色除杂后溶液经1600柱大孔树脂吸附、用低浓度丙酮展层、再用45％丙酮解析。
14)烘干处理
步骤13)所得解析液用纯化水稀释调节比重后，用丙酮结晶，抽滤得到湿晶体。湿晶体经晾干过筛后，用双锥干燥机进行干燥。
结果：以200M3发酵液计，VB12的收率为84％，固体产量为7.78kg。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)获取好食脉孢菌发酵工艺的发酵液；
2)酶制剂絮凝工艺：
将发酵液压入絮凝罐后，加入絮凝剂组合物，混合均匀，然后补加一定量的水，使预处理后的溶液总体积为发酵液体积的1～2倍，其中所述絮凝剂组合物的成分及重量比为苯甲酸钠0.1～0.12％、硅藻土2.5～3.0％、珍珠岩3.0～4.5％；
3)酶制剂压滤工艺：
用PH 1.5～1.8的稀H2SO4溶液调节PH在2.8～3.2，搅拌反应1.5～2小时后，进入板框压滤机过滤；
4)酶制剂的提取：经膜截留分子量为10000的超滤膜过滤处理，被超滤膜截留的浓缩液为酶制剂，透过超滤膜的废水用于维生素B12的提取分离；
5)维生素B12的提取分离
第一吸附：将步骤4)酶制剂的提取中透过超滤膜的废水用弱酸性阳离子树脂50柱吸附，然后用15％氨水进行解析，得到第一解析液；
解析液板框过滤：第一解析液调节pH值后，加黄血盐升温进行转化，再次调节PH值；然后过板框进行过滤，取滤液，记为第三滤液；
浓缩：第三滤液经升膜蒸发器浓缩，浓缩液降温3～5℃；
第二吸附：浓缩液用纯化水稀释至12000-15000ug/ml经阴离子树脂脱色除杂后，用1:1冰醋酸调节pH值；
第三吸附：经大孔树脂吸附，然后用45％丙酮解析。
2.根据权利要求1所述的一种从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，其特征在于，所述好食脉孢菌发酵工艺包括以下步骤：
1)所述好食脉孢菌的保藏编号为CICC12001；
2)一级种子培养
将菌种转移到一级种子罐中，在一级种子罐中培养20～24h，其中，温度28～30℃，风量1:0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
一级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
3)二级种子培养
在二级种子罐中培养6～8h，其中温度28～30℃，风量1：0.6～1：0.8，罐压0.03～0.05Mpa；
二级种子培养基为：甜菜糖100g/L、玉米蛋白粉25g/L、玉米浆25g/L、KCl 2g/L、硫酸铵10g/L、硫酸镁2g/L、磷酸氢二钾12g/L、氯化钙1g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min；
4)接种
将二级种子培养后的菌种用无菌水制成含量为107个/mL的孢子悬液，接种到灭菌的发酵培养基中；
5)发酵生产
在温度28～30℃、罐压0.02～0.05Mpa、风量1：0.6～1：0.8、溶氧≧30％、pH4.8～5.0的条件下发酵180～210小时，其中，在发酵过程中通过添加氨水调控pH；
发酵培养基的组成为：甜菜糖50g/L、玉米蛋白粉25g/L、KCl 1g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾6g/L、玉米浆25g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁0.17g/L、氯化钴0.015g/L、硫酸锰0.02g/L；121-123℃温度下灭菌处理25min。
3.根据权利要求1所述的一种从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，其特征在于，在发酵过程中添加营养液A或营养液B，营养液A的成分及组成为槐糖40～50g/L、甜菜碱15～28g/L、玉米浆1.1～2.0g/L；营养液B的成分及组成为纤维二糖10～15g/L、反玉米素0.1～0.5g/L、甜菜碱12～21g/L、玉米浆1.5～2.5g/L、栀子苷0.12～0.36g/L、碳酸氢钠0.01～0.03g/L、氧化镁0.01～0.03g/L。
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种从酶制剂废水中提取维生素B12的方法，其特征在于，在一级种子培养之前还包括斜面培养，所述斜面培养包括：将菌种移接在斜面培养基上，置于恒温培养箱中28℃下培养3天；
斜面培养基的组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂17g/L、pH自然；121℃灭菌30min。
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