CN105861344A - 一种同步培养提高酵母生物量和胞内海藻糖含量的方法 - Google Patents

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李欣
王志
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Abstract

本发明公开了一种同步培养提高酵母生物量和胞内海藻糖含量的方法，属于微生物发酵领域。该方法通过边流加培养边变温培养的同步培养方式，在提高酵母细胞生物量的同时，大幅提高酵母细胞胞内海藻糖的积累量，显著提高酵母海藻糖产率，该方法流加培养和变温培养一步完成，工艺简单、操作方便、生产周期短、生产成本低。

Description

一种同步培养提高酵母生物量和胞内海藻糖含量的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种同步培养提高酵母生物量和胞内海藻糖含量的方法。
背景技术
海藻糖是一种非还原性的二糖，广泛存在于各种生物体内，尤其是那些抗脱水作用的生物体，如一些微生物、耐干旱植物甚至低温休眠的脊椎动物等。由于海藻糖能够保护细胞中的生物大分子免受干燥、高温、冷冻和高渗透压等恶劣环境的破坏，而且海藻糖的这种保护作用不具有特异性，因而具有“生命之糖” 之称。海藻糖在医药、食品、化妆品、农业等领域有广泛的应用。
海藻糖生产方法有：（1）酶合成法，即利用酶制剂所具有的转糖基作用，在离体条件下作用于底物，合成海藻糖。酶合成法虽具有特异性好、转化率高的特点，但所用酶制剂需要精制，生产成本高；（2）基因工程法，利用基因工程技术将海藻糖合成酶基因导入植物或微生物中，从而利用基因工程微生物或转基因植物生产海藻糖，但转化率低，副产物多，产品分离困难；（3）微生物发酵法，即利用酵母发酵生产海藻糖，由于酵母菌易繁殖，胞内海藻糖含量较高，提取简单，而且海藻糖提取后的酵母菌还可以做成酵母膏等附加产品，早期商品化的海藻糖都是从酵母中提取得来，当前，美国、捷克等国家主要是利用酵母生产海藻糖。酵母发酵法也是国内海藻糖生产的重要方法。
安宁（硕士论文，论文题目“酵母菌生产海藻糖的研究”，2012年）在优化条件下，采用补糖工艺和NaCl胁迫方式经过72 h发酵培养，酵母胞内海藻糖含量达到了22.9%，但是最终酵母生物量只有23.3 g/L，海藻糖产率仅0.075 g/L·h。专利申请号为201010146889.6，专利名称为“一种提高酵母细胞海藻糖含量的方法”公开了一种提高酵母细胞海藻糖含量的方法：第一步，通过流加葡萄糖和营养盐溶液进行流加培养，同时进行变温培养，提高酵母生物量；第二步，离心收集酵母乳，在营养缺乏条件下控温培养酵母乳，提高酵母胞内海藻糖含量（16%以上）。该方法将提高酵母生物量与提高酵母胞内海藻糖含量分两步培养完成，并增加了离心收集酵母乳步骤，操作较复杂；同时总发酵时间（22-23 h）也较长，因此海藻糖产率仍不高。
发明内容
本发明的主要目的在于克服上述不足，通过边流加培养边变温培养的同步培养方式，在提高酵母细胞生物量的同时，大幅提高酵母胞内海藻糖含量，显著提高酵母海藻糖产率。
一种同步培养提高酵母生物量和胞内海藻糖含量的方法：即：通过碳源、氮源、磷源流加培养，提高酵母细胞生物量；当酵母细胞达到一定生物量后，在流加培养的同时，提高培养温度进行变温培养，达到一步培养提高酵母细胞生物量、胞内海藻糖积累量和海藻糖产率的目的。
一种同步培养提高酵母生物量和胞内海藻糖含量的方法，通过边流加碳源、氮源、磷源培养边变温培养的同步培养方式，其特征在于：流加碳源、氮源、磷源。流加碳源选自甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖、蔗糖中的一种或其组合；流加氮源选自硫酸铵、氨水、碳酸氢铵中的一种或其组合；流加磷源选自磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾中的一种或其组合。所述的变温培养为：在培养温度28-30℃下培养8-10 h，当酵母细胞生物量达到一定量后，提高培养温度到32-40℃继续培养3-8 h。
优选地，如上所述的一种同步培养提高酵母生物量和胞内海藻糖含量的方法，其特征在于：控制碳源、氮源、磷源流加速度，使酵母细胞比生长速率保持在0.04-0.08 h-1。
本发明具有以下的有益效果：通过边流加培养边变温培养的同步培养方式，在提高酵母细胞生物量（大于60 g/L，折干计）的同时，显著提高酵母细胞胞内海藻糖的积累量（16%以上，折干计），大幅提高酵母胞内海藻糖产率（大于0.6 g/L·h，折干计）。该方法流加培养和变温培养一步完成，工艺简单、操作方便、生产周期短、生产成本低，为酵母发酵法生长海藻糖工艺改进奠定了基础。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1：
（1）种子培养：从活化好的斜面培养基上挑取五环鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii，CCTCC NO：M 2013310）接入装有400 ml液体培养基（含糖量30%糖蜜100份，酵母浸膏0.5份，磷酸二氢钾1.0份，氯化钾0.05份，硫酸铵0.5份，硫酸镁0.06份）的培养瓶中，30℃，180 r/min，摇床培养24-30 h，得到液体种子培养液约400 ml。
（2）发酵培养：采用10 L发酵罐（SGJ-10L/C 生物反应器，上海联环生物工程设备有限公司），将4 L发酵培养基（含糖量30%糖蜜100份，酵母浸膏0.5份，磷酸二氢钾1.0份，氯化钾0.05份，硫酸铵0.5份，硫酸镁0.06份）一次性加入到发酵罐中，灭菌处理后，接种（酵母种子液的接种量应控制发酵罐中初始菌体浓度为40-50 g/L），碳源（糖蜜）、氮源（氨水）、磷源（磷酸二氢钾）采用流加方式，具体流加方法为：1.5 L糖蜜（含糖量30%）、0.4 L氨水（10%，v/v）、0.3 L磷酸二氢钾（8%，w/v）从发酵开始到发酵12 h左右流加完毕，控制流加速度，使酵母细胞比生长速率保持在0.04-0.08 h-1。此外，通风量控制在0.4-0.8 vvm，转速控制在250-550 r/min，pH 控制在5.0左右，发酵液中乙醇含量控制在0.5%以下。发酵过程中温度控制方法为：30℃培养8 h后，提高发酵温度到35℃，在35℃培养8 h后发酵结束，总共发酵时间16 h。
发酵结束时，酵母细胞生物量（大于60 g/L，折干计），胞内海藻糖积累量（17%以上，折干计），海藻糖产率（大于0.64 g/L•h，折干计）。
实施例2：
（1）种子培养：同实施例1。
（2）发酵培养：采用10 L发酵罐（SGJ-10L/C 生物反应器，上海联环生物工程设备有限公司），将4 L发酵培养基（含糖量30%糖蜜100份，酵母浸膏0.5份，磷酸二氢钾1.0份，氯化钾0.05份，硫酸铵0.5份，硫酸镁0.06份）一次性加入到发酵罐中，灭菌处理后，接种（酵母种子液的接种量应控制发酵罐中初始菌体浓度为40-50 g/L），碳源（糖蜜）、氮源（氨水）、磷源（磷酸二氢钾）采用流加方式，具体流加方法为：1.5 L糖蜜（含糖量30%）、0.4 L氨水（10%，v/v）、0.3 L磷酸二氢钾（8%，w/v）从发酵开始到发酵12 h左右流加完毕，控制流加速度，使酵母细胞比生长速率保持在0.04-0.08 h-1。此外，通风量控制在0.4-0.8 vvm，转速控制在250-550 r/min，pH 控制在5左右，发酵液中乙醇含量控制在0.5%以下。发酵过程中温度控制方法为：30℃培养10 h后，提高发酵温度到35℃，在35℃培养6 h后发酵结束，总共发酵时间16 h。
发酵结束时，酵母细胞生物量（大于65 g/L，折干计），胞内海藻糖积累量（16%以上，折干计），海藻糖产率（大于0.65 g/L•h，折干计）。

Claims (2)

1.一种同步培养提高酵母生物量和胞内海藻糖含量的方法，其特征在于：通过边流加碳源、氮源、磷源培养边变温培养的同步培养方式，所述的流加碳源优选甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖、蔗糖中的一种或其组合；流加氮源优选硫酸铵、氨水、碳酸氢铵中的一种或其组合；流加磷源优选磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾中的一种或其组合；
所述的变温培养为：28-30℃下培养8-10h后，32-40℃培养3-8h。
2.如权利要求1所述的一种同步培养提高酵母生物量和胞内海藻糖含量的方法，其特征在于：控制碳源、氮源、磷源流加速度，使酵母细胞比生长速率保持在0.04-0.08h-1。
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