CN1302864A - 高含量的海藻糖酵母菌及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种高含量的海藻糖酵母菌及其生产方法,它是酵母菌株经单倍体分离、辐射空间条件的诱变处理后,选择相对高含量海藻糖的单倍体,经原生质体融合获得二倍体,从中筛选出一株高含量菌株,在确定摇瓶发酵条件的基础上,建立小罐发酵中合理的碳源流加及发酵后期提高温度的工艺,经大罐生产获得高生物量和高海藻糖含量酵母菌,分类命名:酿酒酵母Saccharomycescerevisiac,微生物株:DZTA8,保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No0535,保藏日期2001年2月7日。
Description
本发明涉及微生物菌种的生产技术，特别是一株高含量海藻糖酵母菌株的培育和通过合理的碳源流加及发酵后期提高温度，获得高生物量和高含量海藻糖酵母菌株的工艺方法。
众所周知，海藻糖(trehalose)是由两个葡萄糖分子经α,α-1→1键接的非还原性双糖，由于其分子构象存在双折轴向对称结构，因而海藻糖具有极强的稳定性和低呈色性。许多生物体在遭受不良环境，如干燥、高温、冷冻、高渗透压等胁迫时，通过体内调节合成海藻糖来抵御外界逆境的伤害。而使海藻糖身价倍增的主要原因是外源性的海藻糖对生物体和生物大分子同样有良好的非特异性保护作用。作为生物活性物质的稳定剂和保护剂，海藻糖在食品、保健品、化妆品、医药、分子生物学和农业等领域有着广阔的应用前景。然而海藻糖昂贵的价格限制了它的广泛应用。
到20世纪90年代后期，各国科学家开始研究和开发海藻糖的生产技术。由于海藻糖无法用化学法合成，生物法生产海藻糖大体有以下几种：
1、提取法：从天然植物或藻类中直接提取，其主要缺陷在于：由于该法受含量低、资源有限的限制已不再使用；
2．酶促转化法：是以葡萄糖、蔗糖或麦芽糖为介质，通过磷酸化酶反应转化成海藻糖；以淀粉为底物通过几种酶协同作用转化成海藻糖，其主要缺陷在于：酶促转化法获得的海藻糖含有其它杂糖，产品纯度达不到食用或医用要求；
3．发酵法：通过微生物发酵分离制备海藻糖，利用的微生物包括细菌(节杆菌、球菌、棒杆菌)、酵母、真菌等。其主要缺陷在于：从细菌培养液中分离海藻糖因含量太低及提取困难，无法工业化生产。相对来说，酵母是微生物发酵法生产海藻糖比较理想的材料，但普通面包酵母的海藻糖含量较低，一般仅为8-10％，目前销售的海藻糖商品大多使用发酵法培养面包酵母制备。其主要缺陷在于：由于细胞内可供提取的海藻糖含量较低，使所得产品制造成本过高，价格昂贵，不适合广泛地推广应用。
本发明的目的在于提供一种高含量的海藻糖酵母菌及其生产方法，针对发酵法生产海藻糖所用酵母菌种海藻糖含量低、缺乏有效的合成和累积海藻糖的发酵工艺的缺陷，通过选育高含量海藻糖的酵母菌株和适合产生高生物量和高海藻糖累积量的发酵工艺，克服现有技术的弊端，达到生产高生物量和高含量的海藻糖酵母细胞，从这些细胞中分离制备海藻糖及降低海藻糖酵母菌的生产成本的目的。
本发明的目的是这样实现的：一种高含量的海藻糖酵母菌，其特征在于：它是酵母菌株经单倍体分离、辐射空间条件的诱变处理后，选择相对高含量海藻糖的单倍体，经原生质体融合获得二倍体，从中筛选出一株高含量菌株，在确定摇瓶发酵条件的基础上，建立小罐发酵中合理的碳源流加及发酵后期提高温度的工艺，经大罐生产获得高生物量和高海藻糖含量酵母菌，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiac，微生物株：DZTA8，保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No 0535，保藏日期2001年2月7日。
一种高含量的海藻糖酵母菌的生产方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(一)高含量海藻糖酵母菌菌株的选育：
(1)．单倍体培养：将实验室保存的酵母菌株培养在YPD斜面上，在25-30℃的条件下，培养后转接到预生孢培养基，在25-30℃的条件下，培养2-3天；再转接至Kleyn生孢培养基，在25-30℃的条件下，培养5-7天后生成孢子；在显微镜下观察到大部分细胞形成内有四个孢子的子囊时，用0.2M的磷酸缓冲液洗下子囊，转移到灭菌离心管进行离心，悬于同样缓冲液，加入β-巯基乙醇1-3％以扩大细胞通透性，再加入1-3％浓度的蜗牛酶破子囊壁，待反应液至粘稠状，镜检子囊孢子的释放，离心反应液，用缓冲液洗1-3次，适当稀释后涂YPD平皿，在25-30℃的条件下培养，将单菌落挑出，与已知交配型的单倍体交配，以确定分离的单倍体是a或α交配型，保存于冰箱中备用；
(2)．卫星搭载：在卫星发射前，将上述分离获得的a和α单倍体搭载菌种装入小生物舱；舱内温度为17-26℃，平均电离辐射剂量为0.177GY/d，时间为15天；
(3)．交配融合形成二倍体：样品菌种返回实验室，开始地面测试，搭载菌株和地面对照菌株，经培养后，测定细胞内海藻糖累积量的变化，带有不同交配型的单倍体通过交配融合形成二倍体细胞，为了利于融合子的筛选，通过化学诱变使单倍体带上营养缺陷选择标记；
(4)．诱变处理：用甲基磺酸已酯对a和α单倍体菌株进行诱变，处理后的菌液经适当稀释后涂布在YPD平皿，将YPD平皿上长出菌落分别挑到YPD和YNB基础培养基以检出营养缺陷型，选择了a交配型中海藻糖含量较高的His-缺陷株和α交配型中带有Met-、Thr-双重缺陷株进行原生质体融合；融合株在不加任何氨基酸的YNB平皿上进行选择，从200多株二倍体中筛选出10-20株，再经三次培养细胞测定海藻糖产量后，确定1株高含量的海藻糖菌种，用于摇瓶和小罐优化发酵工艺试验；
(二)摇瓶发酵培养：培养基组成成分：经处理的糖蜜折合成葡萄糖含量为2-10％；酵母抽提物1.5-5.0％；玉米浆3.0-5.0％；(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4及微量元素0-10％；
(1)、培养温度：常温度培养到一定时间1-20小时后，再提高温度至33-45℃；
(2)、培养时间：海藻糖的累积在酵母生长的后期阶段，在16-36小时的培养时间收获细胞，能获得较高的海藻糖；
(三)小罐发酵培养：
(1)．菌种斜面培养：菌种接种在YPD斜面上，置于25-30℃温箱培养12-48小时；
(2)．大试管培养：将上述YPD斜面上的菌种接入装有5-10ml无菌麦芽汁液体大试管，置于20-40℃摇床振荡培养12-48小时；
(3)．三角瓶一级扩大培养：上述试管培养物转接于装有50-200ml的1/2倍体积麦芽汁和1/2倍体积处理后废糖蜜，折合葡萄糖含量为2-10％培养液的三角瓶中，置20-40℃摇床振荡培养12-48小时；
(4)．三角瓶二级扩大培养：将上述培养物按5-20％的接种量接入用处理后的废糖蜜，折合葡萄糖含量为2％-10％、酵母抽提物0.5-5.0％和包括玉米浆、(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、生物素和微量元素在内的各0.1-5％至少三种营养组分配成的液体培养基中，在20-40℃的条件下，振荡培养12-48小时；
(5)．三角瓶三级扩大培养：将上述培养物按5-20％的接种量接入用处理后的废蜜糖，折合葡萄糖含量为2％-10％、(NH4)2SO4或(NH4)2HPO40.5-10％、生物素和微量元素0-2％配成的液体培养基中，在20-40℃的条件下，培养12-48小时；
(6)．小罐发酵培养：
1)．发酵培养基组份：处理后的废糖蜜、铵盐、磷盐及钙、镁盐和微量元素，各组分含量在0-10％；
2)碳源及营养物质的合理流加：依据发酵过程中酵母的瞬时比生长率及其变化建立先按指数上升流加，再按指数下降流加的流加，使流加碳源及营养物质最大限度地转化为菌体；
3)通过在发酵过程中提高温度至30-45℃，获得更高的海藻糖产量；
4)通过延长发酵时间提高海藻糖累积：在常规发酵时间的基础上再延长1-15小时，使细胞内海藻糖含量提高；
(四)大罐生产：
按照上述建立的小罐发酵参数和工艺条件，进行2-10个批次的工厂大罐发酵，将流加的糖蜜折合成葡萄糖计算，平均每克葡萄糖转化产生0.3-0.5克菌体，每100克干重细胞平均含20-40克海藻糖，生产的高含量的海藻糖酵母菌，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiac，微生物株：DZTA8，保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No 0535。
该卫星搭载改为辐射培养，将上述分离获得的a和α单倍体菌种放入辐射箱内，提供与卫星搭载大体相同的条件，高能粒子密度136个/cm2，温度为17-26℃，平均电离辐射剂量为0.177GY/天，时间为15-30天，保藏日期2001年2月7日。
本发明的主要优点是：
1、由于本发明为发酵法生产海藻糖酵母菌提供了优良菌株，采用该菌株结合合理的碳源流加和先经常规温度培养、后期提高温度的发酵工艺，获得高生物量；
2、同时，高海藻糖含量的酵母细胞在多批次大罐生产中，将流加的糖蜜折合成葡萄糖计算，平均每克葡萄糖转化产生0.3-0.6克菌体，每100克干重细胞平均含20-40克海藻糖，其海藻糖含量是普通酵母的2.4-3.0倍；
3、与常用方法使用同样的原料和发酵设备，可增加海藻糖产量1.4-2.0倍，也就是降低成本1.4-2.0倍。
下面结合较佳实施例和附图进一步说明。
图1是本发明的生产工艺流程示意图。
实施例1
参阅图1，本发明的高含量的海藻糖酵母菌，其特征在于：它是酵母菌株经单倍体分离、辐射(空间)条件的诱变处理后，选择相对高含量海藻糖的单倍体，经原生质体融合获得二倍体，从中筛选出一株高含量菌株，在确定摇瓶发酵条件的基础上，建立小罐发酵中合理的碳源流加及发酵后期提高温度的工艺，经大罐生产获得高生物量和高海藻糖含量酵母菌，分类命名：酿酒酵母Saccharomycescerevisiac，微生物株：DZTA8，保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No 0535，保藏日期2001年2月7日。
其生产工艺包括如下步骤：
(一)高含量的海藻糖酵母菌菌株的选育：
1、菌株选育：
将实验室保存的酵母菌株培养在YPD(蛋白胨2％，酵母粉11％，葡萄糖2％，琼脂1.5％)斜面上，在25-30℃的条件下，培养后转接到预生孢培养基(蛋白胨0.8％，酵母粉0.3％，葡萄糖1％，琼脂1.5％)，在25-30℃的条件下，培养2-3天，再转接至Kleyn生孢培养基(KH2PO40.012％,K2HPO40.02％,NaAc 0.5％，葡萄糖0.062％,NaCl 0.062％，生物素0.2mg/100ml，微量元素1ml/100ml。(其中微量元素组分：MgSO4·7H2O 0.3-0.5％,CuSO4·5H2O 0.001-0.003％,MnSO4·4H2O0.1-0.3％,FeSO4·4H2O 0.1-0.3％)，在25-30℃的条件下，培养5-7天后生成孢子。在显微镜下观察到大部分细胞形成内有四个孢子的子囊时，用0.2M的磷酸缓冲液洗下子囊，转移到灭菌离心管进行离心，悬于同样缓冲液，加入β-巯基乙醇1-3％以扩大细胞通透性，再加入1-3％浓度的蜗牛酶破子囊壁，待反应液至粘稠状，镜检子囊孢子的释放，离心反应液，用缓冲液洗1-3次，适当稀释后涂YPD平皿，在25-30℃的条件下培养，将单菌落挑出，与已知交配型的单倍体交配，以确定分离的单倍体是a或α交配型，存放于冰箱中备用。
2．卫星搭载：在卫星发射前，将上述分离获得的a和α单倍体搭载菌种装入小生物舱，一般，卫星飞行轨道倾角为63°，远点354km，近点175km，微重力水平5×10-5g，高能粒子密度136个/cm2(地面对照35.6±6个/cm2)。记录显示，在15天的飞行期间，舱内温度为17-26℃，平均电离辐射剂量为0.177GY/天。
3．交配融合形成二倍体：上述卫星搭载的辐射样品菌种返回实验室，开始地面测试，搭载菌株和地面对照菌株，经培养后，测定细胞内海藻糖累积量的变化，a和α单倍体地面对照菌株的海藻糖含量在8％左右，a和α单倍体搭载菌株分别是对照的1.26倍至1.72倍。带有不同交配型的单倍体通过交配融合形成二倍体细胞。为了利于融合子的筛选，通过化学诱变使单倍体带上营养缺陷选择标记。
4．诱变处理：
用甲基磺酸已酯对a和α单倍体菌株进行诱变，处理后的菌液经适当稀释后涂布在YPD平皿，将YPD平皿上长出菌落分别挑到YPD和YNB基础培养基(每升中含葡萄糖10-30g,(NH4)2SO42-8g,KH2PO40.5-0.9g,K2HPO4 0.1-0.2g,MgSO4·7H2O 0.2-0.8g,NaCl 0.05-0.2g,CaCl2·2H2O 0.05-0.2g，微量元素：H3BO4 400-600μg,CuSO4·5H2O20-60μg,KI50-200μg,FeCl2·6H2O 100-300μg,MnSO4·H2O 300-500μg,Na2MoO4·2H2O100-300μg,ZnSO4·7H2O 300-500μg，维生素：生长素1-3μg，泛酸钙300-500μg，肌醇1000-3000μg，烟酸300-500μg，对氨基苯甲酸100-300μg，硫胺素300-500μg，核黄素100-300μg，吡哆醇300-500μg)以检出营养缺陷型。选择a交配型中海藻糖含量较高的His-缺陷株和α交配型中带有Met-、Thr-双重缺陷株进行原生质体融合。融合株在不加任何氨基酸的YNB平皿上进行选择。从200多株二倍体中筛选出10-20株，再经三次培养细胞测定海藻糖产量后，确定1株用于研究摇瓶和小罐优化发酵工艺试验样品。
(二)摇瓶发酵培养：培养基组成成分：经处理的糖蜜折合成葡萄糖含量为2-10％；酵母抽提物1.5-5.0％；玉米浆3.0-5.0％；(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4及微量元素0-8％。
1、培养温度：常温度培养1-20小时，再提高温度至33-45℃。
2、培养时间：海藻糖的累积在酵母生长的后期阶段，在16-36小时的培养时间收获细胞，能获得较高的海藻糖。
(三)小罐发酵培养：
1．菌种斜面培养：菌种接种在YPD斜面上，置25-30℃温箱培养12-48小时。
2．大试管培养：将上述YPD斜面上的菌种接入装有5-10ml无菌麦芽汁液体大试管，置于20-40℃的摇床振荡培养12-48小时。
3．三角瓶一级扩大培养：上述试管培养物转接于装有50-200ml的1/2倍体积麦芽汁和1/2倍体积处理后废糖蜜，折合葡萄糖含量为2-10％培养液的三角瓶中，置于20-40℃的摇床振荡培养12-48小时进行扩大培养。
4．三角瓶二级扩大培养：将上述培养物按5-20％的接种量接入用处理后的废糖蜜，折合葡萄糖含量为2％-10％、酵母抽提物0.5-5.0％和包括玉米浆、(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、生物素和微量元素在内的各0.1-5.0％至少三种营养组分配成的液体培养基中，在20-40℃的条件下，振荡培养12-48小时。
5．三角瓶三级扩大培养：将上述培养物按5-20％的接种量接入用处理后的废蜜糖，折合葡萄糖含量为2％-10％、(NH4)2SO4或(NH4)2HPO4 0.5-10％、生物量和微量元素0-2％配成的液体培养基中，在20-40℃的条件下，培养12-48小时。
6．小罐发酵培养：
(1)发酵培养基组份：处理后的废糖蜜、铵盐、磷盐及钙、镁盐和微量元素，各组分含量在0-10％。
(2)碳源及营养物质的合理流加：依据发酵过程中酵母的瞬时比生长率及其变化，建立了一条先按指数上升流加，再按指数下降流加的流加曲线，使流加的碳源最大限度地转化为菌体。
(3)通过发酵后期提高温度增加海藻糖累积：海藻糖是在经逆境，如干旱、高温、高渗透压等诱导合成的代谢物，在发酵过程中适当地提高温度至30-45℃，获得更高的海藻糖产量。
(4)通过延长发酵时间提高海藻糖累积：在常规发酵时间的基础上再延长1-15小时，使细胞内海藻糖累积量大大提高。
(四)大罐生产：
按照上述建立的小罐发酵参数和工艺条件，进行2-10个批次的工厂大罐发酵试验。将流加的糖蜜折合成葡萄糖计算，平均每克葡萄糖转化产生0.3-0.5克菌体，每100克干重细胞平均含20-40克海藻糖，其海藻糖的含量是普通酵母的2.4-4.0倍。使用同样的原料和发酵设备，可增加海藻糖产量1.4-3.0倍，也就是降低成本1.4-3.0倍。本发明的高含量的海藻糖酵母菌，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiac，微生物株：DZTA8，保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No 0535，保藏日期2001年2月7日。
实施例2
本实施例中，其卫星搭载改为辐射培养，将上述分离获得的a和α单倍体菌种放入辐射箱内，提供与卫星搭载大体相同的条件，高能粒子密度136个/Gm2，温度为17-26℃，平均电离辐射剂量为0.177GY/天，时间为15-30天。其他条件同实施例1，同样获得高含量的海藻糖酵母菌株，海藻糖含量达到≥20％。
综上所述，本发明具有如下的特点：
1、利用航天条件辐射诱变结合常规育种的手段，制得高含量的海藻糖酵母菌株，海藻糖含量达到≥20％。
2．根据菌种特点，建立了适合获得高生物量酵母菌体的碳源指数流加量。
3．用废糖蜜代替葡萄糖作为发酵培养基的碳源，既利用了制糖工业的废弃料，又降低了生产成本。
4．根据海藻糖的产生原理，通过将发酵温度提高到30-45℃，建立了发酵温度与细胞内海藻糖累积和增加产量之间关系，提高了产量。
5．根据海藻糖的累积原理，通过在常规发酵时间基础上延长1-15小时，建立了延长发酵时间与提高细胞内海藻糖累积之间关系。
6．根据不同条件增加了一些微量元素的供应和流加，包括玉米浆、酵母抽提物、生物素、尿素、氨、钙和镁等，提高了海藻糖的产量。
Claims (9)
1、一种高含量的海藻糖酵母菌，其特征在于：它是酵母菌株经单倍体分离、辐射空间条件的诱变处理后，选择相对高含量海藻糖的单倍体，经原生质体融合获得二倍体，从中筛选出一株高含量菌株，在确定摇瓶发酵条件的基础上，建立小罐发酵中合理的碳源流加及发酵后期提高温度的工艺，经大罐生产获得高生物量和高海藻糖含量酵母菌，分类命名：酿酒酵母Saccharomycescerevisiac，微生物株：DZTA8，保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No 0535，保藏日期2001年2月7日。
2、如权利要求1所述的高含量的海藻糖酵母菌，其特征在于：海藻糖含量达到≥20％。
3、如权利要求1所述的高含量的海藻糖酵母菌，其特征在于：海藻糖含量为20-40％。
4、一种高含量的海藻糖酵母菌的生产方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(一)高含量海藻糖酵母菌菌株的选育：
(1)．单倍体培养：将实验室保存的酵母菌株培养在YPD斜面上，在25-30℃的条件下，培养后转接到预生孢培养基，在25-30℃的条件下，培养2-3天；再转接至Kleyn生孢培养基，在25-30℃的条件下，培养5-7天后生成孢子；在显微镜下观察到大部分细胞形成内有四个孢子的子囊时，用0.2M的磷酸缓冲液洗下子囊，转移到灭菌离心管进行离心，悬于同样缓冲液，加入β-巯基乙醇1-3％以扩大细胞通透性，再加入1-3％浓度的蜗牛酶破子囊壁，待反应液至粘稠状，镜检子囊孢子的释放，离心反应液，用缓冲液洗1-3次，适当稀释后涂YPD平皿，在25-30℃的条件下培养，将单菌落挑出，与已知交配型的单倍体交配，以确定分离的单倍体是a或α交配型，保存于冰箱中备用；
(2)．卫星搭载：在卫星发射前，将上述分离获得的a和α单倍体搭载菌种装入小生物舱；舱内温度为17-26℃，平均电离辐射剂量为0.177GY/d，时间为15天；
(3)．交配融合形成二倍体：样品菌种返回实验室，开始地面测试，搭载菌株和地面对照菌株，经培养后，测定细胞内海藻糖累积量的变化，带有不同交配型的单倍体通过交配融合形成二倍体细胞，为了利于融合子的筛选，通过化学诱变使单倍体带上营养缺陷选择标记；
(4)．诱变处理：用甲基磺酸已酯对a和α单倍体菌株进行诱变，处理后的菌液经适当稀释后涂布在YPD平皿，将YPD平皿上长出菌落分别挑到YPD和YNB基础培养基以检出营养缺陷型，选择了a交配型中海藻糖含量较高的His-缺陷株和α交配型中带有Met-、Thr-双重缺陷株进行原生质体融合；融合株在不加任何氨基酸的YNB平皿上进行选择，从200多株二倍体中筛选出10-20株，再经三次培养细胞测定海藻糖产量后，确定1株高含量的海藻糖菌种，用于摇瓶和小罐优化发酵工艺试验；
(二)摇瓶发酵培养：培养基组成成分：经处理的糖蜜折合成葡萄糖含量为2-10％；酵母抽提物1.5-5.0％；玉米浆3.0-5.0％；(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4及微量元素0-10％；
(1)、培养温度：常温度培养到一定时间1-20小时后，再提高温度至33-45℃；
(2)、培养时间：海藻糖的累积在酵母生长的后期阶段，在16-36小时的培养时间收获细胞，能获得较高的海藻糖；
(三)小罐发酵培养：
(1)．菌种斜面培养：菌种接种在YPD斜面上，置于25-30℃温箱培养1 2-48小时；
(2)．大试管培养：将上述YPD斜面上的菌种接入装有5-10ml无菌麦芽汁液体大试管，置于20-40℃摇床振荡培养12-48小时；
(3)．三角瓶一级扩大培养：上述试管培养物转接于装有50-200ml的1/2倍体积麦芽汁和1/2倍体积处理后废糖蜜，折合葡萄糖含量为2-10％培养液的三角瓶中，置20-40℃摇床振荡培养12-48小时；
(4)．三角瓶二级扩大培养：将上述培养物按5-20％的接种量接入用处理后的废糖蜜，折合葡萄糖含量为2％-10％、酵母抽提物0.5-5.0％和包括玉米浆、(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、生物素和微量元素在内的各0.1-5％至少三种营养组分配成的液体培养基中，在20-40℃的条件下，振荡培养12-48小时；
(5)．三角瓶三级扩大培养：将上述培养物按5-20％的接种量接入用处理后的废蜜糖，折合葡萄糖含量为2％-10％、(NH4)2SO4或(NH4)2HPO40.5-10％、生物素和微量元素0-2％配成的液体培养基中，在20-40℃的条件下，培养12-48小时；
(6)．小罐发酵培养：
1)．发酵培养基组份：处理后的废糖蜜、铵盐、磷盐及钙、镁盐和微量元素，各组分含量在0-10％；
2)碳源及营养物质的合理流加：依据发酵过程中酵母的瞬时比生长率及其变化建立先按指数上升流加，再按指数下降流加的流加，使流加碳源及营养物质最大限度地转化为菌体；
3)通过在发酵过程中提高温度至30-45℃，获得更高的海藻糖产量；
4)通过延长发酵时间提高海藻糖累积：在常规发酵时间的基础上再延长1-15小时，使细胞内海藻糖含量提高；
(四)大罐生产：
按照上述建立的小罐发酵参数和工艺条件，进行2-10个批次的工厂大罐发酵，将流加的废糖蜜折合成葡萄糖计算，平均每克葡萄糖转化产生0.3-0.5克菌体，每100克干重细胞平均含20-40克海藻糖，生产出高含量的海藻糖酵母菌，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiac，微生物株：DZTA8，保藏号为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No 0535，保藏日期2001年2月7日。
5、如权利要求4所述的高含量的海藻糖酵母菌的生产方法，其特征在于：该卫星搭载改为辐射培养，将上述分离获得的a和α单倍体菌种放入辐射箱内，提供与卫星搭载大体相同的条件，高能粒子密度136个/cm2，温度为17-26℃，平均电离辐射剂量为0.177GY/天，时间为15-30天。
6、如权利要求4所述的高含量的海藻糖酵母菌的生产方法，其特征在于：该酵母菌株培养YPD斜面为蛋白胨2％，酵母粉1％，葡萄糖2％，琼脂1.5％。
7、如权利要求4所述的高含量的海藻糖酵母菌的生产方法，其特征在于：该预生孢培养基为蛋白胨0.8％，酵母粉0.3％，葡萄糖1％，琼脂1.5％。
8、如权利要求4所述的高含量的海藻糖酵母菌的生产方法，其特征在于：该Kleyn生孢培养基为KH2PO4 0.012％,K2HPO4 0.02％,NaAc 0.5％，葡萄糖0.062％,NaCl 0.062％，生物素0.2mg/100ml，微量元素1ml/100ml；其中微量元素组分：MgSO4·7H2O 0.3-0.5％,CuSO4·5H2O 0.001-0.003％,MnSO4·4H2O 0.1-0.3％,FeSO4·4H2O 0.1-0.3％。
9、如权利要求4所述的高含量的海藻糖酵母菌的生产方法，其特征在于：该YNB基础培养基为每升中含葡萄糖10-30g,(NH4)2SO4 2-8g,KH2PO4 0.5-0.9g,K2HPO4 0.1-0.2g,MgSO4·7H2O 0.2-0.8g,NaCl 0.05-0.2g,CaCl2·2H2O0.05-0.2g；微量元素：H3BO4 400-600μg,CuSO4·5H2O 20-60μg,KI50-200μg,FeCl2·6H2O 100-300μg,MnSO4·H2O 300-500μg,Na2MoO4·2H2O100-300μg,ZnSO4·7H2O 300-500μg；维生素：生长素1-3μg，泛酸钙300-500μg,肌醇1000-3000μg，烟酸300-500μg，对氨基苯甲酸100-300μg，硫胺素300-500μg，核黄素100-300μg，吡哆醇300-500μg。
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