CN103408638B - 一种万古霉素结晶的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种万古霉素结晶的制备工艺，将万古霉素发酵液微滤后通过阳离子交换树脂吸附、洗脱，在得到的万古霉素高浓度洗脱液中加入尿素，搅拌溶解后，过滤除去悬浮颗粒，静置结晶，过滤后得到万古霉素晶体粗品。该工艺操作简单，获得晶体为灰白色，粒径大（显微镜检测平均粒径约32～47μm），易于过滤；结晶过程收率＞85%，溶解晶体溶液中万古霉素液相纯度＞85%且溶液颜色浅；产生的尿素可作为微生物氮源，避免对环境的污染。

Description

一种万古霉素结晶的制备工艺

技术领域

本发明属于抗生素分离纯化技术领域，具体涉及一种万古霉素结晶的制备工艺。

背景技术

万古霉素是由Micormick等于1956年从一株东方拟无枝酸菌的发酵液中分离得到的一种糖肽类抗生素，由美国礼莱公司开发，1958年获FDA批准上市。20世纪80年代，随着β-内酰胺类抗生素的大量使用，由甲氧西林耐药金葡球菌（MRSA）所引起的感染逐渐流行。万古霉素是目前临床上用于治疗由MRSA引起的严重感染疾病的重要药物，愈来愈引起人们的重视。万古霉素化学结构如下式所示:

公开号为4440753的美国专利公开了使用异丙醇、乙醇或丙酮等溶剂沉淀万古霉素，但该方法使用溶剂量大，导致沉淀颜色过深，溶剂对环境污染大；公开号为5235037的美国专利与公开号为101260134A的中国专利分别采用向万古霉素溶液添加碱金属盐和铵盐的盐析方法沉淀万古霉素，虽然取得较好的沉淀结果，产物纯度也有所增加，但是沉淀色素偏深、沉淀粒径过细、沉淀难以过滤。

发明内容

本发明针对以上这些问题，提供了一种万古霉素结晶的制备工艺，该工艺操作简单，获得晶体为灰白色，粒径大（显微镜检测平均粒径约32～47μm），易于过滤；结晶过程收率＞85%，溶解晶体溶液中万古霉素液相纯度＞85%且溶液颜色浅；产生的尿素可作为微生物氮源，避免对环境的污染。

一种万古霉素结晶的制备工艺，包括如下步骤：

（1）将万古霉素发酵液进行微滤，滤液通过阳离子交换树脂吸附、洗脱，得到含有万古霉素的高浓度洗脱液；

（2）在所述的高浓度洗脱液中加入尿素，搅拌使尿素溶解后，过滤除去悬浮颗粒；

（3）静置结晶，过滤后得到万古霉素晶体粗品。

通常来说，万古霉素通过东方拟无枝酸菌菌种采用深层、补料发酵法得到，发酵液中万古霉素浓度为10～17g/L。

步骤（1）中，阳离子交换树脂可以采用强酸性阳离子离子交换树脂；洗脱剂可以采用pH10～11的氢氧化钠、氢氧化钾或氨水溶液；洗脱速度一般控制在1～2倍柱床体积/小时范围内，洗脱液体积在0.5～1倍柱体积范围内。通过该方法制备的高浓度洗脱液中，万古霉素的浓度为20g/L～50g/L。

步骤（2）中加入尿素的目的是高浓的尿素能破坏万古霉素与水形成氢键的能力，从而降低万古霉素在水中的溶解度，增加结晶的收率。尿素浓度过低，结晶收率偏低；尿素浓度过高，结晶收率增加不明显，造成尿素原料的浪费。一般情况下，加入尿素使高浓度洗脱液中尿素的浓度是80～120g/L。

步骤（3）中，在将滤液结晶之前调节pH，调节pH的目的是减小万古霉素在水中溶解度，最好是调节至pH7.9～9.0。由于万古霉素的等电点为pI8.0，在此pH7.9～9.0条件下，万古霉素在水中溶解度大大降低，易于形成过饱和溶液，有利结晶过程。调节pH可以采用常规的碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水等，以碱溶液的形式，例如将氢氧化钠配置成1～4mol/L的溶液。

步骤（3）中，采用常规的结晶工艺即可，结晶温度在室温范围内，结晶时间控制在10～24h。结晶过滤可以采用常规的滤纸、滤布等过滤介质。

与现有技术相比，本发明有以下有益效果：

1.该万古霉素结晶的制备工艺操作简单，获得晶体为灰白色，粒径大（显微镜检测平均粒径约32～47μm），易于过滤；

2.结晶过程收率＞85%，溶解晶体溶液中万古霉素液相纯度＞85%且溶液颜色浅；

3.产生的尿素可作为微生物氮源，避免对环境的污染。

具体实施方式

实施例1

选用东方拟无枝酸菌为生产菌种，以葡萄糖、棉籽蛋白粉和无机盐等为发酵原料，进行发酵通气搅拌和中间补料的发酵法生产万古霉素；32～36℃发酵培养180～200h后，发酵结束，放罐，发酵液万古霉素浓度为15.13g/L。

将万古霉素发酵液经陶瓷膜微滤后，经聚苯乙烯为基质的磺酸型强酸性阳离子交换树脂吸附，用pH10氢氧化钠溶液洗脱，洗脱速度为1倍柱床体积/小时，洗脱液体积在0.5倍柱体积，获得11L高浓万古霉素洗脱液（其中万古霉素浓度为47.71g/L，产物合计524.88g，万古霉素液相纯度83.4%），洗脱液颜色为黑色。用浓磷酸将高浓洗脱液调pH至3.2，往洗脱液中加入880g尿素（洗脱液中尿素浓度为80g/L）；搅拌溶解后，用过滤器过滤；所得澄清滤液用3mol/LNaOH溶液迅速调pH8.1，后静置结晶，每隔2h将晶体重悬搅拌一次。结晶12h后，用布式漏斗抽滤收获晶体，所得晶体颜色为灰白色，显微镜检查平均粒径为43μm。将获得的晶体用盐酸水溶液溶解，共获得4.3L盐酸万古霉素溶液（其中万古霉素浓度为107.54g/L，万古霉素产物合计462.42g，色谱纯度86.29%），溶液颜色淡黄色（大部分色素残留在母液中），结晶收率88.1%。

结晶过程收率(%)公式如下,其它实施例均按此公式计算收率。

式中：盐酸万古霉素溶液为晶体用盐酸溶液溶解液。

实施例2

按实例1发酵法生产万古霉素。将万古霉素发酵液经陶瓷膜微滤后，经聚苯乙烯为基质的磺酸型强酸性阳离子交换树脂吸附，用pH11氢氧化钠溶液洗脱，洗脱速度为1倍柱床体积/小时，洗脱液体积在0.5倍柱体积，获得2200L高浓万古霉素洗脱液（其中万古霉素浓度为25.37g/L，产物合计55.8kg，液相纯度83.4%），洗脱液颜色为黑色。往洗脱液储罐中加入264kg尿素（洗脱液中尿素浓度为120g/L）；搅拌溶解后，用管道过滤器过滤；所得澄清滤液用3mol/LNaOH溶液迅速调pH8.9，后静置结晶，每隔2h将晶体重悬搅拌一次。结晶24h后，用板框压滤器压滤收获晶体，晶体颜色为灰白色，显微镜检查平均粒径为39μm，母液颜色为黑色。将获得的晶体用盐酸水溶液溶解，共获得607L盐酸万古霉素溶液（其中万古霉素浓度为80.54g/L，万古霉素产物合计48.9kg，色谱纯度88.37%），溶液颜色淡黄色，结晶收率87.6%。

实施例3

考察尿素添加量对万古霉素结晶收率的影响。取按实例1方法制备的高浓万古霉素洗脱液（其中万古霉素浓度为35.13g/L，液相纯度86.4%），洗脱液颜色为黑色。取上述洗脱液5份，每份1L，分别加入尿素至浓度至0、40、80、120、140g/L；搅拌溶解后，用滤纸过滤；澄清滤液用3mol/LNaOH溶液迅速调pH8.5，后静置结晶，每隔2h将晶体重悬搅拌一次。结晶24h后，分别用滤纸过滤收获晶体。将获得的晶体用盐酸水溶液溶解，高效液相色谱分析晶体溶液纯度。尿素添加量对万古霉素结晶收率的影响如表1。

表1尿素浓度对万古霉素结晶的影响

组号	尿素添加量（g/L）	母液效价（g/L）	结晶收率(%)	晶体外观	晶体纯度（%）
						1	0	30.20	13.3	棕黄色	87.8
2	40	14.70	57.8	淡黄色	89.3
						3	80	5.08	85.4	灰白色	89.8
4	120	4.28	87.7	灰白色	90.5
						5	140	4.80	86.2	灰白色	89.7

从表1结果看出，尿素添加量对万古霉素结晶的收率和产品质量（外观和纯度）影响较大，在尿素添加量为80～120g/L的情况下，制备的万古霉素晶体质量较佳，且结晶收率高。

Claims (3)

1.一种万古霉素结晶的制备工艺，包括以下步骤：

（1）将万古霉素发酵液进行微滤，滤液通过阳离子交换树脂吸附、洗脱，得到含有万古霉素的高浓度洗脱液，所述高浓度洗脱液中万古霉素的浓度为20～50g/L；步骤（1）中所述万古霉素发酵液中万古霉素浓度为10～17g/L，所用的洗脱液选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水溶液中的一种，洗脱速度为1～2倍柱床体积/小时，步骤（1）所用的阳离子交换树脂为磺酸型强酸性离子交换树脂；

（2）用浓磷酸将高浓洗脱液调pH至3.2，往洗脱液中加入尿素；搅拌溶解后，用过滤器过滤除去悬浮颗粒；

（3）步骤（2）所得滤液调pH7.9～9.0，静置结晶，过滤后得到万古霉素晶体粗品；步骤（3）通过氢氧化钠溶液调节pH；在静置结晶时每隔2h将晶体重悬搅拌一次；结晶12h后，用布式漏斗抽滤收获晶体，所得晶体颜色为灰白色。

2.根据权利要求1所述的万古霉素结晶的制备工艺，其特征在于：步骤（2）中加入尿素使洗脱液中尿素的浓度是70～120g/L。

3.根据权利要求1所述的万古霉素结晶的制备工艺，其特征在于：所述的步骤（1）中的洗脱液为氢氧化钠水溶液，浓度是1～4mol/L。