KR20000076556A - 립스타틴의 정제 방법 - Google Patents

립스타틴의 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20000076556A
KR20000076556A KR1020000004323A KR20000004323A KR20000076556A KR 20000076556 A KR20000076556 A KR 20000076556A KR 1020000004323 A KR1020000004323 A KR 1020000004323A KR 20000004323 A KR20000004323 A KR 20000004323A KR 20000076556 A KR20000076556 A KR 20000076556A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lipstatin
extraction
heptane
solvent
acetic acid
Prior art date
Application number
KR1020000004323A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100336237B1 (ko
Inventor
도스발트슈테판
쿠퍼에른스트
슈타인바우어게르하르트
슈타인벤더에리히
Original Assignee
프리돌린 클라우스너, 롤란드 비. 보레르
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프리돌린 클라우스너, 롤란드 비. 보레르, 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 프리돌린 클라우스너, 롤란드 비. 보레르
Publication of KR20000076556A publication Critical patent/KR20000076556A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100336237B1 publication Critical patent/KR100336237B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B63/00—Purification; Separation; Stabilisation; Use of additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D305/02—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D305/10—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms not condensed with other rings having one or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D305/12—Beta-lactones

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Epoxy Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

본 발명은 립스타틴의 정제 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 예외적인 고수율 및 고순도로 조 립스타틴으로부터 립스타틴을 단리하기 위한 수단으로서, 복류 추출 형태인 액체-액체 추출을 항류 추출 형태인 재추출과 결합하는 방법에 관한 것이다.

Description

립스타틴의 정제 방법{PURIFICATION OF LIPSTATIN}
본 발명은 립스타틴의 정제 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 예외적인 고수율 및 고순도로 조 립스타틴으로부터 립스타틴을 단리하는 방법으로서, 복류 추출 형태의 액체-액체 추출을 항류 추출 형태의 재추출과 결합시키는 방법에 관한 것이다.
립스타틴은 비만과 관련된 질병의 예방 및 치료에 유용한 테트라하이드로립스타틴(THL, Orlistat)의 제조를 위한 핵심적인 중간체로서 상당히 중요하다.
립스타틴, 그의 제조를 위한 발효 방법, 미생물로부터 그것을 단리하는 방법 및 그것의 테트라하이드로립스타틴으로의 수소화 방법이 공지되어 있고, 예컨대 미국 특허 제 4,598,089 호에 기술되어 있다.
립스타틴은 하기 화학식 1과 같다.
또한, 조 립스타틴의 제조 방법이 유럽 특허 출원 제 96106598 호에 기술되어 있다. 이 방법은 지방 및 오일이 실질적으로 없고, 적절한 탄소 및 질소 공급원 및 무기염을 함유하는 수성 매질속에서 립스타틴을 생성하는, 방선균과 같은 미생물, 예컨대 스트렙토마이세스 톡시트리시니를 초기 성장상이 실질적으로 완료되고 충분한 세포 질량이 생성될 때까지 호기성 배양시키는 것을 포함한다. 그런 다음, 리놀렌산을 산화방지제, 임의적으로 카프릴산 및 N-포밀-L-로이신 또는 바람직하게는 L-로이신과 함께 배양액에 첨가한다. 발효가 완결된 후, 발효액을 추출한다. 생성된 조 립스타틴은 예컨대 미국 특허 제 4,598,089 호에 기술된 크로마토그래피법에 의하여 농축하고 정제할 수 있다.
조 립스타틴의 정제에 있어서 종래 기술의 특징은 다단계 크로마토그래피 프로토콜 또는 순수한 립스타틴을 얻기 위한 다단계 크로마토그래피와 결합한 립스타틴을 농축하기 위한 액체-액체 추출이다. 이런 방법은 전형적으로 실험실 규모로 발효 대사물질을 단리하는데 사용된다. 그러나, 이런 방법은 일반적으로 경제적인 대규모 공정에 적용시키기에는 부적합하다.
증류에 의해 조 립스타틴을 정제하려는 시도는 실패하였다. 립스타틴은 60℃에서 몇 시간 동안은 안정하지만, 그것의 증기압(7x10-10mbar)이 낮기 때문에 이 온도에서의 진공 증류(2mbar 이하)는 불가능하다. 더 높은 온도에서 립스타틴은 이산화탄소의 제거에 의하여 분해된다.
또한, 조 립스타틴은 -20℃ 미만의 온도에서 립스타틴의 결정화에 의하여 정제될 수 있다. 그러나, 저온 결정화는 값비싼 기술 장비를 요구하고, 결정화의 수율이 조 립스타틴의 품질에 크게 좌우된다. 특히, 조 립스타틴의 품질이 낮을 때, 결정화를 통한 립스타틴의 수율은 낮다.
본 발명은 심지어 품질이 낮은 조 립스타틴으로부터도 고수율 및 고순도로 립스타틴을 정제하는 신규하고 간단하며 저렴한 방법을 제공한다.
도 1은 복류 추출의 수행 상태를 나타내는 도면이다.
도 2는 항류 추출의 수행 상태를 나타내는 도면이다.
도 3은 복류 추출과 항류 추출이 결합되어 수행되는 본 발명의 바람직한 태양을 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 1의 복류 추출의 수행 상태를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 1의 항류 추출의 수행 상태를 나타내는 도면이다.
조 립스타틴으로부터 립스타틴을 정제하기 위한 본 발명의 방법은,
a) 지방족 또는 방향족 탄화수소로부터 선택된 비극성 용매로부터 카르복실산, 알코올, O-일치환된 모노에틸렌글리콜 또는 올리고에틸렌글리콜, 디올 또는 쌍극성 비양성자성 용매로부터 선택된 극성 용매로의 립스타틴의 액체-액체 추출 단계, 및
b) 극성 용매상의 물에 의한 희석 또는 상 비율의 변화 및 립스타틴의 새로운 비극성 용매로의 재추출 단계를 포함한다.
하기 정의는 본원 발명을 기술하기 위하여 사용된 다양한 용어의 의미와 범위를 제시하고 정의하기 위하여 설명된다.
'복류 추출'이라는 용어는 2-용매의 항류 추출을 의미한다. 이 추출은 도 1에 나타낸 바와 같이 수행된다.
상호 용해도가 낮은 두 용매를 추출 단위의 상부와 하부에 도입한다. 분리할 혼합물(공급물)은 세척 용매와 함께가 아니라면 어느 곳에 도입되어도 좋은데, 추출 단위의 중간에서 도입되는 것이 바람직하다. 도 1에서 추출은 추출 용매 및 추출물이 각각 더 높은 밀도의 용매(무거운 상)를 함유하고, 세척 용매 및 추출잔류물이 각각 더 낮은 밀도의 용매(가벼운 상)를 함유하는 그러한 형태로 이루어진다.
'항류 추출' 이라는 용어는 추출할 물질(공급물)이 사용된 용매의 하나와 함께 첨가된다는 의미이다. 그런 경우에 정제될 화합물로부터 불순물의 분리는 복류 추출의 경우 만큼 높지는 않은데, 이는 세척 과정이 생략되기 때문이다.
항류 추출은 도 2에 나타난 바와 같이 이루어진다.
하나의 용매(공급물과 함께) 및 상호 용해도가 낮은 다른 용매를 추출 단위의 상부 및 하부에 도입한다. 하나의 출구에서 목표 물질이 농축된 추출 용매가 칼럼을 떠난다(추출). 다른 출구에서, 공급물을 도입하기 위해 사용된, 목표 물질이 감소된 용매(추출 잔류물)가 칼럼을 떠난다. 상기 도면에서, 공급물과 잔류물이 각각 더 높은 밀도의 용매(무거운 상)를 함유하고 추출에 사용된 용매 및 추출물이 각각 더 낮은 밀도의 용매(가벼운 상)를 함유하는 그러한 형태로 추출이 도시되어 있다.
'조 립스타틴'이라는 용어는 세포 질량의 분리, 추출 및 농축후 발효 공정으로부터 생성되는, 립스타틴 및 불순물을 포함하는 조 생성물을 의미한다.
본 발명은 고순도 및 실용적인 양의 수율로 조 립스타틴으로부터 립스타틴을 단리하는 수단으로서 2개의 액체-액체 추출을 결합시키는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 조 립스타틴으로부터 립스타틴을 정제하는 방법은 지방족 또는 방향족 탄화수소로부터 선택된 비극성 용매로부터 카르복실산, 알코올, O-일치환된 모노에틸렌글리콜 또는 올리고에틸렌글리콜, 디올 또는 쌍극성 비양성자성 용매로부터 선택된 극성 용매로의 립스타틴의 액체-액체 추출, 및 이어서 물에 의한 극성 용매상의 희석 또는 상 비율의 변화 및 립스타틴의 새로운 비극성 용매로의 재추출을 포함한다
액체-액체 추출은 하기의 용매계에서 수행된다: 비극성 용매는 지방족 또는 방향족 탄화수소로부터 선택된다. 바람직한 지방족 탄화수소는 C5-C8지방족 탄화수소이고; 좀더 바람직하게는 헥산 또는 헵탄과 같은 C6-C7지방족 탄화수소이다. 방향족 탄화수소는 1 내지 3개의 메틸기로 임의적으로 치환된 벤젠으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 방향족 탄화수소는 벤젠 및 톨루엔이다.
극성 용매는 카르복실산(예컨대, 포름산 또는 아세트산이나 프로피온산과 같은 C1-C3알킬카르복실산),또는 C1-C3알코올(예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올), 또는 O-일치환된 모노에틸렌글리콜 또는 올리고에틸렌글리콜(예컨대, 에틸렌글리콜 모노메틸에테르) 또는 C2-C3디올(예컨대, 에탄디올 또는 1,3-프로판디올) 또는 퍼푸릴알코올 또는 테투라하이드로퍼푸릴알코올로부터 선택된다. 쌍극성 양성자성 용매는 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈, 디메틸설폭사이드, 아세토니트릴, 술포란, 니트로메탄등과 같은 용매를 포함한다. 바람직한 극성 용매는 수용성 유기 카르복실산, 알코올 또는 O-일치환된 모노에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜(예컨대, 아세트산, 메탄올 또는 에틸렌글리콜 모노메틸에테르)이고, 특히 바람직한 것은 아세트산이다.
극성 용매는 직접 또는 물과의 혼합물로서 사용될 수 있다.
제 1차 추출 단계에서는 조 립스타틴의 비극성 불순물이, 제 2차 추출 단계는 극성 불순물이 제거된다. 립스타틴의 극성 용매로의 추출로 비극성 불순물이 제거되고, 립스타틴의 비극성 용매로의 추출로 극성 불순물이 제거된다.
바람직한 실시 태양에서, 동일한 용매가 양 단계의 추출에 사용된다. 제 1차 추출후에 립스타틴의 분배를 변화시키기 위해 물에 의한 극성 용매의 희석 또는 상 비율의 전환을 포함하는 제 2 단계가 이어진다.
좀더 바람직한 실시 태양에서, 제 1차 추출은 립스타틴이 극성 용매중으로 추출되는 방식으로 수행되고 이어서 비극성 용매 바람직하게는 제 1차 추출 단계에서 사용된 것과 동일한 비극성 용매에 의해 극성 용매로부터 립스타틴이 재추출되는 방식으로 수행된다.
바람직한 실시 태양에서, 제 1 단계의 액체-액체 추출은 극성 용매가 약 1 내지 20%의 물, 좀더 바람직하게는 약 5%의 물을 함유하는 것을 특징으로 한다.
좀더 바람직한 실시 태양에서, 비극성 용매는 지방족 탄화수소이다. 특히 바람직한 것은 헵탄이다.
본 발명의 가장 바람직한 실시 태양에서는, 제 1단계의 액체-액체 추출은 복류 추출로서 수행되고 립스타틴은 극성 용매중으로 추출된다. 공급물은 사용된 용매중 하나에 의해 희석될 수 있는 조 립스타틴이다. 립스타틴은 극성(무거운) 상으로 추출되고; 지방산 또는 글리세라이드와 같은 비극성 불순물은 비극성(가벼운) 상에 남는다. 립스타틴 및 불순물의 분배 계수는 농도에 의존하기 때문에, 두 용매의 상 비율, 추출 시스템의 이론적인 단계의 수 및 용매에 대한 공급물의 비율은 로, 티씨, 베어드, 엠에이치아이, 하페쯔, 엠, 한슨, 씨(Lo, TC, Bairds, MHI, Hafez, M, Hanson, C(1983)):용매 추출 핸드북 윌리, 뉴욕(Handbook of solvent extraction. Wiley, New York)에 의한 적당한 방식 으로 조절되어야 한다. 분배 계수의 농도에의 의존성은 추출계에 사용된 극성 용매의 종류에 따라서 크게 달라진다. 수성 아세트산은 고농도를 얻기 위하여 매우 양호한 결과를 가져오고, 따라서 높은 생산성 및 사용되는 용매의 최소화를 가져온다.
추출은 믹서 고정자 시스템(mixer settler system)과 같은 연속식 추출 기구 또는 펄스화 체 플레이트 추출기(pulsed sieve plate extractor) 또는 교반된 칼럼과 같은 추출 칼럼을 사용하여 수행 될 수 있다.
바람직한 실시 태양에서, 재추출(정제의 제 2 단계)에 앞서 물을 가해 극성 용매를 대략 70 내지 90%, 바람직하게는 약 80%까지 희석시킨다.
본 발명의 가장 바람직한 실시 태양에서는, 제 2 정제 단계의 재추출은 항류 추출로서 수행되고 립스타틴은 비극성 용매에서 추출된다. 이 경우에 제 1차 추출의 추출물이 직접 사용될 수 있다. 농축된 립스타틴 공급물이 요구되는 복류 추출과 반대로, 연속 공정으로 항류 추출로서 제 2차 추출을 수행하는 경우에는 제 1차 추출후에 립스타틴의 농축화가 요구되지 않는다. 립스타틴은 비극성(가벼운) 상으로 추출되고 극성 불순물은 극성(무거운) 상에 남는다.
발효 공정 동안 립스타틴의 몇몇 아미노산 유사체가 형성된다. 립스타틴 자체는 측쇄로서 N-포밀(S)로이신을 함유하는 반면, 부산물은 다른 N-포밀아미노산을 함유한다. 이러한 부산물 중 하나는 메티오닌 유사 립스타틴이다. 조 립스타틴은 립스타틴에 비해 3% 이하로 이러한 부산물을 함유한다. 립스타틴의 정제에 있어서 이 불순물을 제거하는 것이 매우 중요하다. 그렇지 않으면 이어지는 수소화가 이러한 황 함유 화합물에 의해 방해를 받는다. 조 립스타틴내의 메티오닌 유사 립스타틴이 추출에 앞서 산화된다면 본 발명에 따른 조 립스타틴의 정제가 좀더 개선된다. 메티오닌 유사 립스타틴은 상응하는 술폭사이드 또는 술폰으로 산화시킨 후가 아니라면 립스타틴의 결정화 또는 추출 정제에 의해 그것을 직접 제거하는 것은 불가능하다. 이러한 산화는 예컨대 아세트산내의 과아세트산을 사용하는 방법과 같은 종래의 방법에 의해서 수행된다. 메티오닌 유사 립스타틴은 하기 화학식 2와 같이 설폭사이드 또는 술폰으로 산화될 수 있다:
만약 술폭사이드가 요구되면 산화제는 메티오닌 유사 립스타틴의 양과 동몰량으로 또는 1.5 당량까지 사용되고, 만약 술폰이 요구되면 2배량이 사용된다. 더 많은 과량은 립스타틴의 산화 분해를 방지하기 위하여 피해야 한다. 산화는 0 내지 50℃에서, 바람직하게는 실온에서 수행되고; 수 분내에 반응이 완결된다. 산화에 사용된 용매는 중요하지 않고, 바람직하게는 추출 정제 공정 동안 사용된 용매 중 하나는 산화 공정에서도 사용된다. 메티오닌 유사 립스타틴은 조 립스타틴 단계에서 또는 제 1차 추출 정제 단계 후에 산화될 수 있다. 바람직하게는 산화는 고농도의 헵탄 용액내에서 조 립스타틴으로 수행되고, 생성된 혼합물은 제 1차 추출 정제 단계에서의 공급물로서 사용된다. 산화된 메티오닌 유사 립스타틴은 극성 불순물이고 제 2차 추출 동안 제거되는데, 극성 상으로 남게 된다.
만일 수성 아세트산/헵탄계가 추출 정제에 사용된다면, 립스타틴과 산화된 메티오닌 유사 립스타틴간의 분배 계수 차이로 인하여 물의 추가 후 제 1차 추출로부터 바로 얻은 추출물을 사용하여 항류 추출로서 제 2차 추출 단계가 수행되는 것이 충분하다. 그러므로 가장 바람직한 실시 태양에서는, 조 립스타틴으로부터 립스타틴의 정제는 약 95% 아세트산/헵탄에서 조 립스타틴의 복류 추출에 의해 수행되고, 이어서 립스타틴 용액을 물에 의해 약 80% 아세트산으로 희석하고 헵탄으로 용액을 항류 추출한다. 그런 다음 정제된 립스타틴은 농축 또는 결정화에 의해서 헵탄으로부터 단리될 수 있다. 이런 바람직한 방법은 도 3에 제시된다.
상기에서 지적한 바와 같이, 상기의 방법 중 임의의 하나에 의해서 제조된 립스타틴은 수소화에 의해서 테트라하이드로립스타틴(orlistat)으로 전환될 수 있다. 립스타틴의 수소화는 적절한 촉매의 존재하에서 예컨대, 미국 특허 제 4,598,089호에 기술된 바와 같이 그것 자체로 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 촉매의 예는 팔라듐/탄소, 플라티늄 산화물, 팔라듐 등이다. 수소화에 사용되는 용매는 중요하지 않다. 가장 바람직한 용매는 최종 추출 단계에 사용되는 것이다. 그런 경우 립스타틴을 함유하는 추출물은 수소화를 위하여 직접 또는 농축화후에 사용된다. 다른 적절한 용매는 예를들어 메탄올 및 에탄올과 같은 저급(lower) 알코올, 제 3차-부틸-메틸에테르 또는 테트라하이드로퓨란과 같은 에테르, 아세트산 또는 디클로로메탄과 같은 할로겐화된 용매이다. 수소화는 바람직하게는 낮은 수소압 및 실온에서 수행된다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 추출 방법과 그에 후속하는 립스타틴의 테트라하이드로립스타틴으로의 수소화를 포함한다. 바람직하게는, 반응은 25℃ 및 낮은 수소압(예컨대, 0.5 내지 5 bar)에서 귀금속 함유 수소화 촉매에 의해서 수행된다.
테트라하이드로립스타틴은 결정화에 의해서 정제되고 단리될 수 있다. 바람직하게는 헥산 또는 헵탄과 같은 비극성 용매가 수소화 및 결정화에 사용된다.
요약하면, 본 발명은 상기에서 정의된 바와 같이,
a) 메티오닌 유사 립스타틴의 산화,
b) 약 95% 아세트산/헵탄에 의한 조 립스타틴의 복류 추출,
c) 물에 의한 약 80% 아세트산으로의 립스타틴 용액의 희석; 및
d) 헵탄에 의한 용액의 항류 추출을 포함하는 방법에 관한 것이다.
이 공정 후에는 립스타틴의 테트라하이드로립스타틴으로의 수소화, 임의적으로 테트라하이드로립스타틴의 결정화가 뒤따를 수 있다.
본 발명은 또한
a) 메티오닌 유사 립스타틴의 산화,
b) 약 95% 아세트산/헵탄에 의한 조 립스타틴의 복류 추출,
c) 물에 의한 약 80% 아세트산으로의 립스타틴 용액의 희석; 및
d) 헵탄에 의한 용액의 항류 추출, 및
e) 립스타틴의 테트라하이드로립스타틴으로의 수소화를 포함하는 테트라하이드로립스타틴의 제조 방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 립스타틴 및 테트라하이드로립스타틴의 제조를 위한 상기 방법의 용도에 관한 것이다.
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 태양을 예시하지만 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1:
생물자원의 분리 후의 발효 및 추출로 얻은 조 립스타틴을 농축한다. 사용된 재료는 58%(w/w)의 립스타틴(HPLC-분석) 및 0.9%(w/w)의 메티오닌 유사 립스타틴(1H-NMR-분석)을 함유하였다.
a. 메티오닌 유사 립스타틴의 산화: 55.7g의 조 립스타틴을 77ml의 헵탄으로 희석하였다. 아세트산 중의 37% 과아세트산 용액 212㎕를 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다.
b. 헵탄/95% 수성 아세트산에 의한 복류 추출: 7 분리 단계를 갖는 추출기의 시뮬레이션을 위해 7개의 분별 깔때기를 사용하였다.
a)에 기술된 산화 공정으로부터 생성된 혼합물을 6부분으로 나누고 각 부분을 4번째 분별 깔때기(sf-4)로 공급하였다. sf-4 공급으로 시작하여, 50ml의 헵탄 및 100ml의 95% 수성 아세트산을 첨가하였는데, 이는 헵탄/수성 아세트산의 상 비율 1/2에 해당한다. 혼합물을 흔들어서 상을 분리하였다. 위쪽 상을 다음 분별 깔때기로 이동시키고 아래쪽 상을 이전 분별 깔때기로 이동시켰다. 초기에 새로운 용매가 사용되고, 이것이 이전 및 다음의 분별 깔때기로부터 얻은 상으로 단계적으로 대치되었다. 모든 분별 깔때기를 이런 방식으로 채우면, 헵탄을 첫 번째 분별 깔때기에, 수성 아세트산을 일곱 번째 분별 깔때기에만 첨가하였다. 립스타틴을 함유하는 추출물을 수집하였다. 추출 잔류물에 있는 립스타틴을 박층 크로마토그래피에 의해서 관측하여 함량을 리터당 1g 미만으로 유지하고, 미리 계산한 상 비율 및 농도를 조절하였다.
모든 조 립스타틴을 공급하였을 때, 모든 립스타틴이 계로부터 세척되어 나올 때까지 양 미적재 용매를 첨가하였다. 도 4는 이런 추출을 제시한다:
감압하에 용매를 증류 제거함으로써 추출물을 약 600ml의 부피로 농축하였다. 칼 피셔 방법에 의해 측정된 물 함량은 3.5%였다.
c. 항류 추출: 7 분리 단계를 갖는 추출기의 시뮬레이션을 위하여 다시 7개의 분별 깔때기를 사용하였다.
b)로부터 생성된 추출물(600ml)을 6부분으로 분할하고(각 100ml) 각 부분을 30ml의 물과 함께 일곱 번째 분별 깔때기에 첨가하였다. 130ml의 헵탄을 첫 번째 분별 깔때기에 첨가하였다. 위쪽 상을 다음 분별 깔때기로 아래쪽 상을 이전의 분별 깔때기로 이동시킴으로써 b) 단락에 유사한 연속 공정의 시뮬레이션으로서 추출을 수행하였다. 추출 잔류물에 있는 립스타틴을 박층 크로마토그래피에 의해 관측하여 리터 당 1g 미만의 함량을 유지하고 미리 계산된 상 비율 및 농도를 조절하였다. 제 1차 추출 단계로부터 얻은 모든 추출 용액을 공급하였을 때, 모든 립스타틴이 세척되어 나올 때까지 양 용매를 첨가하였다. 도 5는 이 추출을 예시한다:
헵탄내의 정제된 립스타틴(추출물)을 수집하고 감압하에서 250ml 부피로 농축시켰다. 이 용액은 순도 90%(w/w)의 정제된 립스타틴 35.3g을 함유하였다(HPLC). 이것은 조 생성물중의 립스타틴에 대해 정제된 생성물 중의 립스타틴의 함량으로 계산하여 98% 수율에 해당한다.
d. 수소화: 정제된 립스타틴 용액 250ml를 5 bar의 압력하 25℃의 스테인레스 스틸 오토클레이브내에서 숯 상의 5% 팔라듐 3.5g으로 총 6시간 동안 수소화하였다. 촉매를 여과 분리하고 여과액을 증발시켰다. 잔류물을 700ml 헵탄에 용해시키고 테트라하이드로립스타틴을 0℃에서 결정화하였다. 생성물을 여과시키고, 냉 헵탄으로 세척하고 25℃에서 진공 건조시킨다. 96%(w/w) 순도(HPLC)의 테트라하이드로립스타틴 28g을 수득한다. 이것은 정제된 생성물내의 립스타틴에 대해 85% 수율에 해당한다. 헥산으로부터 재결정화된 후의 테트라하이드로립스타틴의 순도는 97%(W/W,HPLC에 의해)였다.
실시예 2:
실시예 1에서 사용된 것과 동일한 용매에 의한 연속식 추출을 위해 7 단계 믹서 고정자 시스템을 사용하였다.
사용된 농축 조 립스타틴은 65%(w/w)의 순도이고, 0.14%(w/w)의 메티오닌 유사 립스타틴을 함유한다.
a. 헵탄/95% 수성 아세트산에 의한 복류 추출: 100kg의 조 립스타틴을 100kg의 헵탄으로 희석하였고 이 용액을 공급물로서 사용하였다. 믹서 고정자를 1/2의 상 비율(v/v)로 헵탄 및 95%의 수성 아세트산으로 채웠다. 추출 정제를 위하여 시간당 37.5 리터의 헵탄, 시간당 75 리터의 95% 수성 아세트산 및 시간당 15 리터의 조 립스타틴 용액을 첨가하였다. 헵탄을 첫 번째 믹서에, 립스타틴 용액을 네 번째 믹서에, 수성 아세트산을 일곱 번째 믹서에 도입하였다. 립스타틴 함유 추출물 및 비극성 불순물 함유 추출 잔류물을 수집하였다. 추출 잔류물내의 립스타틴의 함량을 박층 크로마토그래피에 의해서 관측하여 리터당 1g 미만으로 유지하였다. 모든 조 립스타틴의 공급 후에, 모든 립스타틴이 세척되어 나올 때까지 양 용매의 공급을 계속하였다. 추출물(아래쪽 상)의 샘플을 농축하여 71%(w/w) 순도의 립스타틴을 얻었다. 전체적으로, 추출물 1500kg을 수득하였고, 물 함량은 4.6%였다(칼 피셔 방법).
b. 메티오닌 유사 립스타틴의 산화: 이전의 추출로부터의 추출 용액에 아세트산 중의 37% 과아세트산 용액 60ml를 첨가하였고, 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다.
c. 항류 추출: 280 리터의 물을 첨가하여 물의 함량이 20%가 되도록 조절하였다. 물을 첨가한 후 립스타틴의 오일 상의 분리로 인하여 상기 용액은 600 리터 헵탄에 의해 추출되었다. 이 추출물을 분리하고 이후에 연속 추출의 헵탄에 첨가하였다.
계속하여 수성 아세트산 중의 립스타틴 잔존 용액의 연속식 추출을 위하여 제 1차 추출에서와 동일한 믹서 고정자를 사용하였다. 시간당 50 리터의 헵탄을 첫 번째 믹서에, 시간당 50 리터의 수성 아세트산 중의 립스타틴 용액을 일곱 번째 믹서에 공급함으로써 연속식 추출을 행하였다. 헵탄 추출물을 이전에 얻은 추출물에 첨가하였고, 감압하에서 용매를 증류 제거함으로써 이 용액을 대략 1000 리터의 부피로 농축하였다. 샘플을 86%(w/w) 순도의 립스타틴이 되도록 건조될 때까지 농축하였다.
d. 수소화: 수득된 용액을 동일한 크기의 3개의 배치에서 수소화하였다. 유리로 된 눈금있는 교반된 수소화 용기에서 수소화를 수행하였다. 1회의 배치에 숯 상의 5% 팔라듐 2kg을 사용하였다. 1시간 후에 수소화가 완료되었고; 수소 압이 5 bar에 달하였다. 촉매를 여과 분리하고 여과액을 용매의 증류 제거에 의하여 농축하였다. 생성물의 건조된 샘플은 90%(w/w) 테트라하이드로립스타틴(립스타틴이 다양한 위치를 갖는 이성질체인 "전환 가능한" 부산물 또는 수소화 후에 테트라하이드로립스타틴으로 변환되는 단 하나의 C=C 이중결합을 함유하기 때문에, 그 품질이 정제된 립스타틴보다 더 높다)을 함유하였다. 600kg의 헵탄을 첨가하여 0℃에서 테트라하이드로립스타틴을 결정화하였다. 생성물을 여과 분리하고, 냉 헵탄으로 세척하고 감압하에서 건조하였다.
1회의 배치에서 97%(w/w) 순도의 테트라하이드로립스타틴 17kg을 얻었다. 이것은 조 립스타틴 중의 립스타틴에 대해 테트라하이드로립스타틴 76% 수율에 해당한다.
실시예 3
생물자원의 분리 후의 발효 및 추출로부터 얻은 조 립스타틴을 농축한다. 재료는 62%(w/w)의 립스타틴 및 0.1%(w/w)의 메티오닌 유사 립스타틴을 함유하였다.
a. 메티오닌 유사 립스타틴의 산화: 53g의 조 립스타틴을 75ml의 헵탄으로 희석하였다. 아세트산 중의 37% 과아세트산 용액 24㎕를 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분간 교반하였다.
b. 헵탄/10% 수성 메탄올에 의한 복류 추출: 연속식 추출을 시뮬레이션하기 위한 동일한 7개의 분별 깔때기 시스템을 실시예 1에서 기술된 바와 같이 사용하였다. a)에 기술된 산화 공정으로부터 생성된 혼합물을 6 부분으로 나누었고 각 부분을 4번째 분별 깔때기(sf-4)에 공급하였다. 첫 번째 분별 깔때기에 100ml의 헵탄을, 일곱 번째 분별 깔때기에 10%의 수성 메탄올 10ml를 공급하였고, 이것은 10/1의 헵탄/수성 메탄올의 상 비율에 해당한다. 추출물(위쪽 상, 헵탄 중의 립스타틴)을 수집하였다. 모든 조 립스타틴을 공급하였을 때, 모든 립스타틴이 세척되어 나올 때까지 새로운 양 용매를 더 추가하였다. 감압하에서 용매를 증류 제거함으로써 추출물을 110ml의 부피로 농축하였다.
c. 헵탄/10% 수성 메탄올에 의한 추가의 복류 추출: 상기 추출로부터 수득한 용액을 6부분으로 나누었다. 전에 사용한 7개의 분별 깔때기와 동일한 시스템으로 동일한 종류의 추출을 행하였으나, 다른 상 비율을 가졌다. 공급물의 각 부분을 4번째 분별 깔때기에 첨가하였다. 헵탄 100ml를 1번째 분별 깔때기에, 10% 수성 메탄올 100ml를 7번째 분별 깔때기에 첨가하였는데, 이것은 1/1의 헵탄/수성 메탄올의 상 비율에 해당한다. 추출물(아래쪽 상, 수성 메탄올 중의 립스타틴)을 수집하였다. 모든 조 립스타틴을 공급하였을 때, 모든 립스타틴이 세척되어 나올 때까지 양 새로운 용매를 더 첨가하였다. 감압하에서 용매를 증류 제거함으로써 추출물을 250ml의 부피로 농축하였다.
d. 립스타틴의 헵탄으로의 배치 추출: c)로부터 수득한 추출 용액에 물을 첨가하여 물의 함량을 50%로 조절한다. 이 혼합물을 각각 600ml의 헵탄으로 두번 추출하였다. 용매를 증류 제거함으로써 추출물을 농축하였다. 86%(w/w) 순도의 립스타틴 34g을 수득하였다. 이것은 조 생성물 중의 립스타틴에 대해 정제된 생성물 중의 립스타틴의 함량으로 계산한 89% 수율에 해당한다.
e. 수소화: 수소화 및 결정화를 실시예 1에서와 유사하게 수행하였다. 정제된 생산물 중의 립스타틴에 대해 90%의 수율로 97%(w/w) 순도의 테트라하이드로립스타틴을 수득하였다.
실시예 4:
실시예 3에 기술된 것과 동일한 7 단계 추출 장치를 사용하여 실시예 3에서와 동일한 배치로부터 조 립스타틴을 정제하였다. 10% 수성 에틸렌글리콜모노메틸에테르 및 헵탄을 대체 용매로 사용하였다. 불변으로 유지되는 농도 및 상 비율을 실시예 3과 비교하였다. 정제 후의 립스타틴 샘플의 분석 결과 80%(w/w)이었다. 이전 실시 예에서 기술한 대로 테트라하이드로립스타틴의 수소화 및 결정화를 수행하였다. 96%(w/w)의 순도의 테트라하이드로립스타틴을 수득하였다.
실시예 5:
55%(w/w) 립스타틴 및 0.6%(w/w) 메티오닌 유사 립스타틴의 분석치를 갖는 조 립스타틴을 교반된 쿠에니(Kuehni) 칼럼에서 정제하였다.
a. 헵탄/95% 수성 아세트산에 의한 복류 추출: 추출을 위하여, 칼럼의 내경 6cm, 칼럼의 높이 180cm, 실시 단계의 수 50, 고정자 플레이트가 없는 단면적 10%인 쿠에니 칼럼 E60을 사용하였다. 칼럼을 130rpm으로 교반하였다. 새로운 95% 수성 아세트산을 분산 상으로서 칼럼 상부 주입구에 4.0l/h로 공급하였다. 새로운 헵탄을 연속 상으로서 칼럼 저부 주입구에 1.75l/h로 공급하였다. 헵탄 중의 40%(w/w)의 조 립스타틴 용액을 27번째 실시 단계에서(하부로부터 계산함)칼럼에 0.775kg/h로 공급하였다. 평형점에서 칼럼 저부 배출구에서의 추출 상 중의 립스타틴의 수율은 99% 이상이었고, 립스타틴의 순도는 70%(w/w)였다. 메티오닌 유사 립스타틴의 함량은 0.6%(w/w)였다.
b. 과아세트산에 의한 산화: 95% 수성 아세트산 추출물 중의 메티오닌 유사 립스타틴을 동몰량의 37% 과아세트산의 첨가에 의하여 산화시켰다.
c. 헵탄/75% 수성 아세트산에 의한 항류 추출: 추출을 위하여 a)단락에 기술된 것과 동일한 치수를 갖는 쿠에니 칼럼을 사용하였다. 칼럼을 205rpm으로 교반하였다. 95% 수성 아세트산 중의 립스타틴 추출물(a)단락에 따라서 제조된 68%(w/w) 순도의 립스타틴을 갖는 여러가지 추출 배치의 풀(pool))을 분산 상으로서 칼럼 상부 주입구에 8.6l/h로 공급하였다. 새로운 탈이온화된 물을 칼럼의 47번째 실시 단계(저부에서부터 계산됨)에 2.1l/h로 공급하였다. 새로운 헵탄을 연속 상으로서 칼럼 저부 주입구에 6.0l/h로 공급하였다. 평형점에서 칼럼 상부 배출구에서의 추출 상 중의 립스타틴의 수율은 97%였고 립스타틴의 순도는 88%(w/w)였다. 이것은 조 생성물 중의 립스타틴에 대해 정제된 생성물에서의 립스타틴의 함량을 기준으로 계산하여 96 내지 97%의 수율에 해당한다.
본 발명의 방법에 따르면, 대규모 공정에서도 종래의 방법에 비해 현저히 높은 수율 및 순도로 조 립스타틴으로부터 립스타틴을 경제적으로 단리할 수 있다.

Claims (19)

  1. a) 지방족 또는 방향족 탄화수소로부터 선택된 비극성 용매로부터 카르복실산, 알코올, O-일치환된 모노에틸렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜, 디올 또는 쌍극성 양성자성 용매로부터 선택된 극성 용매로의 립스타틴의 액체-액체 추출 단계, 및
    b) 물에 의해 극성 용매상을 희석하거나 상 비율을 변화시키고 립스타틴을 새로운 비극성 용매로 재추출하는 단계를 포함하는, 조 립스타틴으로부터 립스타틴을 정제하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    a) 단계의 극성 용매가 약 1 내지 약 20%의 물을 함유하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    a) 단계의 극성 용매가 약 5%의 물을 함유하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    비극성 용매가 지방족 탄화수소인 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    비극성 용매가 헵탄인 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    극성 용매가 수용성 유기 카르복실산, 알코올 또는 O-일치환된 모노에틸렌글리콜 또는 올리고에틸렌글리콜인 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    극성 용매가 아세트산, 메탄올 또는 에틸렌글리콜 모노메틸에테르인 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    제 1항에 정의된 a) 단계의 액체-액체 추출이 복류 추출이고 립스타틴이 극성 용매 중으로 추출되는 방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    재추출 이전에 극성 용매가 물의 첨가에 의하여 약 90 내지 약 70%로 희석되는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    극성 용매가 물의 첨가에 의하여 약 80%로 희석되는 방법.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    제 1항의 b) 단계에 정의된 재추출이 항류 추출이고 립스타틴이 비극성 용매 중으로 추출되는 방법.
  12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    조 립스타틴의 메티오닌 유사 부산물이 추출 이전에 산화되는 방법.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    립스타틴의 테트라하이드로립스타틴으로의 수소화를 후속적으로 수반하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    수소화 반응이 낮은 수소압 및 25℃에서 귀금속 함유 수소화 촉매에 의해 수행되는 방법.
  15. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    a) 메티오닌 유사 립스타틴의 산화,
    b) 약 95%의 아세트산/헵탄에 의한 조 립스타틴의 복류 추출,
    c) 물에 의한 80% 아세트산으로의 립스타틴의 희석; 및
    d) 헵탄에 의한 용액의 항류 추출을 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    립스타틴의 테트라하이드로립스타틴으로의 수소화를 후속적으로 수반하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    테트라하이드로립스타틴의 결정화를 후속적으로 수반하는 방법.
  18. a) 메티오닌 유사 립스타틴의 산화,
    b) 약 95% 아세트산/헵탄에 의한 조 립스타틴의 복류 추출;
    c) 물에 의한 약 80% 아세트산으로의 립스타틴 용액의 희석; 및
    d) 헵탄에 의한 용액의 항류 추출을 포함하는,
    조 립스타틴으로부터 립스타틴을 정제하는 방법.
  19. a) 메티오닌 유사 립스타틴의 산화,
    b) 약 95% 아세트산/헵탄에 의한 조 립스타틴의 복류 추출;
    c) 물에 의한 약 80% 아세트산으로의 립스타틴 용액의 희석; 및
    d) 헵탄에 의한 용액의 항류 추출,
    e) 립스타틴의 테트라하이드로립스타틴으로의 수소화,
    f) 테트라하이드로립스타틴의 결정화를 포함하는,
    테트라하이드로립스타틴의 제조 방법.
KR1020000004323A 1999-01-29 2000-01-28 립스타틴의 정제 방법 KR100336237B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99101893 1999-01-29
EP99101893.8 1999-01-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20000076556A true KR20000076556A (ko) 2000-12-26
KR100336237B1 KR100336237B1 (ko) 2002-05-09

Family

ID=8237471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020000004323A KR100336237B1 (ko) 1999-01-29 2000-01-28 립스타틴의 정제 방법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6156911A (ko)
EP (1) EP1028115B1 (ko)
JP (1) JP3445209B2 (ko)
KR (1) KR100336237B1 (ko)
CN (1) CN100363354C (ko)
AT (1) ATE228118T1 (ko)
CA (1) CA2296996C (ko)
DE (1) DE60000796T2 (ko)
DK (1) DK1028115T3 (ko)
ES (1) ES2185523T3 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003047531A2 (en) * 2001-12-04 2003-06-12 Biogal Gyogyszergyar Rt Preparation of orlistat and orlistat crystalline forms
WO2005007639A1 (en) * 2003-07-17 2005-01-27 Biocon Limited Preparation of tetrahydrolipstatin by hydrogenation of lipstatin, solvent extraction and purification
PT1673359E (pt) * 2003-09-12 2009-10-06 Ranbaxy Lab Ltd Processo para a preparação de formas cristalinas de orlistat
FR2861990B1 (fr) * 2003-11-10 2006-02-10 Nouveaux Produits Pharma Comprimes faiblement doses a reseau de polymeres
CN1763021B (zh) * 2005-09-29 2010-08-11 杭州华东医药集团生物工程研究所有限公司 一种提纯奥利司他的方法
EP1803714A1 (en) 2005-12-27 2007-07-04 KRKA, tovarna zdravil, d.d., Novo mesto Process for preparing crystalline forms of orlistat
US20080021092A1 (en) * 2006-01-06 2008-01-24 Deepak Murpani Stable pharmaceutical compositions of orlistat
EA201070378A1 (ru) * 2007-09-17 2010-08-30 Др. Редди`С Лабораторис Лтд. Фармацевтические составы орлистата
KR101455449B1 (ko) 2009-06-15 2014-10-27 다이킨 고교 가부시키가이샤 고순도 불소 함유 에테르의 제조 방법
CN101948450B (zh) * 2010-10-13 2013-04-24 鲁南制药集团股份有限公司 一种生产制备奥利司他的方法
CN102558103B (zh) * 2010-12-13 2015-01-14 山东新时代药业有限公司 一种分离和纯化奥利司他的方法
CN103030613B (zh) * 2011-09-29 2014-11-12 北大方正集团有限公司 一种利普司他汀的提纯方法
US20150099800A1 (en) * 2012-05-24 2015-04-09 Northeastern University Novel lipase inhibitors, reporter substrates and uses thereof
CN103420953B (zh) * 2013-07-19 2015-10-21 杭州华东医药集团新药研究院有限公司 一种提纯奥利司他中间体的方法
CN103992296B (zh) * 2014-06-06 2015-08-05 鲁南新时代生物技术有限公司 一种奥利司他的制备方法
CN103992297B (zh) * 2014-06-06 2016-04-13 鲁南制药集团股份有限公司 一种利普司他汀的制备方法
CN110031556B (zh) * 2018-11-27 2022-02-15 福建省微生物研究所 毒三素链霉菌发酵产物中lipstatin类代谢产物的快速鉴别方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1247547A (en) * 1983-06-22 1988-12-28 Paul Hadvary Leucine derivatives
MY116591A (en) * 1996-04-26 2004-02-28 Hoffmann La Roche Process for the production of lipstatin and tetrahydrolipstatin

Also Published As

Publication number Publication date
EP1028115A1 (en) 2000-08-16
ES2185523T3 (es) 2003-05-01
US6156911A (en) 2000-12-05
CN1266058A (zh) 2000-09-13
JP2001039962A (ja) 2001-02-13
JP3445209B2 (ja) 2003-09-08
CA2296996A1 (en) 2000-07-29
KR100336237B1 (ko) 2002-05-09
DK1028115T3 (da) 2003-03-17
DE60000796T2 (de) 2003-09-18
CA2296996C (en) 2005-11-15
DE60000796D1 (de) 2003-01-02
EP1028115B1 (en) 2002-11-20
ATE228118T1 (de) 2002-12-15
CN100363354C (zh) 2008-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100336237B1 (ko) 립스타틴의 정제 방법
US10442785B2 (en) Hydrogenation of catmint oil
KR20160105370A (ko) 메틸 메타크릴레이트의 제조 방법
EP0171009A2 (en) Purification of tocopherols by extraction
US6384268B1 (en) Treatment of formaldehyde-containing mixtures
SU1542412A3 (ru) Способ получени S- @ -циано-3-феноксибензилового спирта или его смеси с R-изомером
EP1824811B1 (en) Process for the purification of benzphetamine hydrochloride
US7153994B2 (en) Manufacture of trimethylhydroquinone diacylates
MXPA00001032A (en) Purification of lipstatin
US4365079A (en) Recovery of dimethyl sebacate from an isomeric mixture of C12 esters
TWI291952B (en) Purification of lipstatin
JP2002514680A (ja) 炭化水素成分または留分からの不純物の除去
Nishii et al. Enantiomeric resolution of a germacrene-D derivative by chiral high-performance liquid chromatography
EP0270023A1 (en) Improved method of preparing cineoles
CN115385818B (zh) 一种扑热息痛杂质及制备方法
US5053561A (en) Method of isolating trans-1,1,4,4-tetraalkyl-2-butene-1,4-diols
JPH0119370B2 (ko)
CN116120358A (zh) 一种奥利司他中间体的制备方法
CN112028780A (zh) 一种苯海拉明的纯化方法
SU1133254A1 (ru) Способ выделени бензо( @ )тиофена и нафталина из нафталиновой фракции
KR20000049980A (ko) 엘-무스콘의 광학활성 분리 정제 방법
CN117586117A (zh) 1,2,4,5-环己烷四甲酸的纯化方法
KR830001516B1 (ko) 메타크릴산 에스테르의 제조 방법
CN1876654A (zh) 一种蛋白酶抑制剂重要中间体的制备方法
CN108250181A (zh) 一种制备埃索美拉唑杂质d的方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120329

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130329

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160330

Year of fee payment: 15

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170330

Year of fee payment: 16

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180329

Year of fee payment: 17

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190123

Year of fee payment: 18