HU227367B1 - Method for producing 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dion - Google Patents
Method for producing 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dion Download PDFInfo
- Publication number
- HU227367B1 HU227367B1 HU0700584A HUP0700584A HU227367B1 HU 227367 B1 HU227367 B1 HU 227367B1 HU 0700584 A HU0700584 A HU 0700584A HU P0700584 A HUP0700584 A HU P0700584A HU 227367 B1 HU227367 B1 HU 227367B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dione
- hydroxymethyl
- androstene
- culture
- androstadiene
- Prior art date
Links
- DAXJNUBSBFUTRP-RTQNCGMRSA-N (8r,9s,10r,13s,14s)-6-(hydroxymethyl)-10,13-dimethyl-7,8,9,11,12,14,15,16-octahydro-6h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(CO)C2=C1 DAXJNUBSBFUTRP-RTQNCGMRSA-N 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- FHJPVZDWFMYGSB-RTQNCGMRSA-N (8r,9s,10r,13s,14s)-6-(hydroxymethyl)-10,13-dimethyl-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(CO)C2=C1 FHJPVZDWFMYGSB-RTQNCGMRSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N Hydrocortisone Natural products O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 19
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 11
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 claims description 7
- 229960005471 androstenedione Drugs 0.000 claims description 7
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 241000203720 Pimelobacter simplex Species 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- QSKCXFVAMAAMKA-UPPCKRDASA-N (8s,9r,10s,13s,14s)-13-ethyl-10,11-dihydroxy-2,6,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical group O=C1CC[C@]2(O)[C@H]3C(O)C[C@](CC)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 QSKCXFVAMAAMKA-UPPCKRDASA-N 0.000 claims description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 5
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N vitamin K3 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000017 cortisol group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000000985 2-methyl-1,4-naphthoquinonyl group Chemical group CC=1C(C2=CC=CC=C2C(C1*)=O)=O 0.000 claims description 2
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 claims description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N Aromasine Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(=C)C2=C1 BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 229960000255 exemestane Drugs 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- KQRGETZTRARSMA-DAELLWKTSA-N (8r,9s,10r,13s,14s)-10,13-dimethyl-6-methylidene-1,2,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthrene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(=C)C2=C1 KQRGETZTRARSMA-DAELLWKTSA-N 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 4
- UAEPNZWRGJTJPN-UHFFFAOYSA-N methylcyclohexane Chemical compound CC1CCCCC1 UAEPNZWRGJTJPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- LUJVUUWNAPIQQI-UHFFFAOYSA-N (+)-androsta-1,4-diene-3,17-dione Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 LUJVUUWNAPIQQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZNVUJQVZSTENZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(C#N)=C(C#N)C1=O HZNVUJQVZSTENZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N androsta-1,4-diene-3,17-dione Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 LUJVUUWNAPIQQI-QAGGRKNESA-N 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N beta-Sitostanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 LGJMUZUPVCAVPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N beta-sitosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2(C)C3CC=C4CC(O)CCC4C3CCC12C)C(C)C NJKOMDUNNDKEAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N formestane Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1O OSVMTWJCGUFAOD-KZQROQTASA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- WIXFIQKTHUVFDI-UHFFFAOYSA-N menadione sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)(S(O)(=O)=O)CC(=O)C2=C1 WIXFIQKTHUVFDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GYNNXHKOJHMOHS-UHFFFAOYSA-N methyl-cycloheptane Natural products CC1CCCCCC1 GYNNXHKOJHMOHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N sitosterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CC[C@@H](CC)C(C)C)[C@@]1(C)CC2 KZJWDPNRJALLNS-VJSFXXLFSA-N 0.000 description 2
- 229950005143 sitosterol Drugs 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N (-)-beta-Sitosterol Natural products O[C@@H]1CC=2[C@@](C)([C@@H]3[C@H]([C@H]4[C@@](C)([C@H]([C@H](CC[C@@H](C(C)C)CC)C)CC4)CC3)CC=2)CC1 KZJWDPNRJALLNS-VPUBHVLGSA-N 0.000 description 1
- CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-ethyl-5alpha-cholest-22-en-3beta-ol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(CC)C(C)C)C1(C)CC2 CSVWWLUMXNHWSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- ORVCATCRRUXRCE-UHFFFAOYSA-N 2-iodooxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1OI ORVCATCRRUXRCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 24xi-n-propylcholesterol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(CCC)C(C)C)C1(C)CC2 KLEXDBGYSOIREE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 6-hydroxymethyl-4-androstene Chemical compound 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N Citrostadienol Natural products CC=C(CC[C@@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC[C@H]4[C@H](C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3CC[C@]12C)C(C)C LPZCCMIISIBREI-MTFRKTCUSA-N 0.000 description 1
- ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N Dehydro-beta-sitosterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)CCC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 ARVGMISWLZPBCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 229940076810 beta sitosterol Drugs 0.000 description 1
- MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N beta-Sistosterol Natural products CCC(CCC(C)C1CCC2C3CC=C4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(C)C MJVXAPPOFPTTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- XGZRAKBCYZIBKP-UHFFFAOYSA-L disodium;dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Na+].[Na+] XGZRAKBCYZIBKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002084 enol ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N finasteride Chemical compound N([C@@H]1CC2)C(=O)C=C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)NC(C)(C)C)[C@@]2(C)CC1 DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N 0.000 description 1
- 229960004039 finasteride Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- XDPFHGWVCTXHDX-UHFFFAOYSA-M menadione sodium sulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC=C2C(=O)C(C)(S([O-])(=O)=O)CC(=O)C2=C1 XDPFHGWVCTXHDX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N meoh methanol Chemical compound OC.OC COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007040 multi-step synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000015500 sitosterol Nutrition 0.000 description 1
- NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N sitosterol Natural products CC=C(/CCC(C)C1CC2C3=CCC4C(C)C(O)CCC4(C)C3CCC2(C)C1)C(C)C NLQLSVXGSXCXFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- PEGXTFPYSNIZKK-UHFFFAOYSA-L zinc;2-aminoacetic acid;sulfate Chemical compound [Zn+2].NCC(O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O PEGXTFPYSNIZKK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
- C07J1/0003—Androstane derivatives
- C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Description
A találmány tárgya új, biokonverziós eljárás 6-hidroximetil-1,4-androsztadién-3,17-dion (rövidített nevén: 6-hidroxi-metil-ADD) előállítására. A találmány közelebbről 6-hidroxi-metil-4-androsztén-3,17-dion (rövidített nevén: 6-hidroxi-metil-AD) mikrobiológiai A1-dehidrogénezésére vonatkozik. A kapott vegyület az emlőrák kezelésére szolgáló, aromatázgátló hatású 6-metilén-1,4-androsztadién-3,17-dion (rövidített nevén: 6-metilén-ADD, exemesztán) szintézisének közbenső terméke.This invention relates to a novel bioconversion process for the preparation of 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dione (abbreviated as 6-hydroxymethyl-ADD). More particularly, the present invention relates to the microbiological A 1 -dehydrogenation of 6-hydroxymethyl-4-androstene-3,17-dione (abbreviated as: 6-hydroxymethyl-AD). The resulting compound is an intermediate in the synthesis of 6-methylene-1,4-androstadiene-3,17-dione (abbreviated as 6-methylene-ADD, exemestane) for the treatment of breast cancer.
Az exemesztán előállítására többféle megoldási módot ismerünk az irodalomból, ezek túlnyomó többsége tisztán kémiai szintézis. így, Wojciechowska és munkatársai [Polish Journal of Applied Chemistry, 47(3—4), 63-74/2004/] 1,4-androsztadién-3,17-dionból (ADD) kiindulva közbenső termékeken át szintetikus módszerrel 6-hidroxi-metil-ADD-t állítottak elő, amiből vízvesztéssel kaptak 6-metilén-ADD-t.Various methods for preparing exemestane are known in the literature, the vast majority of which are purely chemical syntheses. Thus, starting from 1,4-androstadiene-3,17-dione (ADD), Wojciechowska et al., Polish Journal of Applied Chemistry, 47 (3-4), 63-74 / 2004, synthesized 6-hydroxy- methyl-ADD was obtained from which 6-methylene-ADD was lost by water loss.
Longo és Lombardi (lásd: EP 326 340 számú európai szabadalmi leírás) 4-androsztén-3,17-dionból (AD) kiindulva enoléteren át jutottak 6-metilén-4androsztén-3,17-dionhoz, melyből brómozást követően hidrogén-bromid-kihasítással állítottak elő exemesztánt.Longo and Lombardi (EP 326 340), starting from 4-androstene-3,17-dione (AD), obtained 6-methylene-4-androstene-3,17-dione via enol ether, from which after hydrobromination the hydrogen bromide was removed. made exemestane.
Shao, Li és You [Zhongguo Yiyao Gongye Zazhi, 32(8), 345-346 /2001/] 2,3-diklór-5,6-diciano-1,4-benzokinont használtak 6-metilén-androszténdion dehidrogénezésére.Shao, Li and You (Zhongguo Yiyao Gongye Zazhi, 32 (8), 345-346 / 2001 /) used dehydrogenation of 6-methylene-androstenedione in 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone.
Kunnen és munkatársai (lásd: WO 2005/070951 számú PCT-nemzetközi szabadalmi bejelentés) 1,4androsztadién-3,17-dionból kiindulva többlépcsős szintézissel alakították ki az exemesztán 6-metiléncsoportját.Starting from 1,4-androstadiene-3,17-dione, Kunnen et al. (See WO 2005/070951) have synthesized the 6-methylene group of exemestane by multistep synthesis.
Zhu és Pan (CN 1 491 957 számú kínai szabadalmi leírás) 2-jód-oxi-benzoesavat használtak a A1-kettős kötés kialakítására 6-metilén-4-androsztén-3,17-dionban.Zhu and Pan (Chinese Patent No. 1,491,957) used 2-iodooxybenzoic acid to form an A 1 double bond in 6-methylene-4-androstene-3,17-dione.
Az egyetlen, biokonverziós lépést is tartalmazó eljárás során Krook és Hewitt (WO 2001/004342 számú PCT-nemzetközi szabadalmi bejelentés) 6-metilén-4androsztén-3,17-dionból közvetlenül állítottak elő exemesztánt enzimatikus dehidrogénezéssel. A kiindulási anyagot rossz vízoldhatósága miatt vízzel nem elegyedő szerves oldószerben (toluol) oldották fel, a dehidrogenáz enzimaktivitással rendelkező Arthrobacter simplex baktériumsejteket pedig vizes szuszpenzióban juttatták a rendszerbe. A dehidrogénezési reakció elektronakceptor és kataláz jelenlétében, levegő-nitrogén elegy bevezetése mellett kevertetve játszódott le, befejeztével a terméket a toluolos fázisból oktánnal kicsapva kristályosították.In a single process including a bioconversion step, Krook and Hewitt (PCT International Application WO 2001/004342) were prepared directly from 6-methylene-4-androstene-3,17-dione by enzymatic dehydrogenation of exemestane. Because of its poor water solubility, the starting material was dissolved in a water-immiscible organic solvent (toluene), and Arthrobacter simplex bacterial cells with dehydrogenase activity were introduced into the system in an aqueous suspension. The dehydrogenation reaction was carried out in the presence of an electron acceptor and catalase under stirring with an air / nitrogen mixture, and the product was crystallized from the toluene phase by precipitation with octane.
Összefoglalva, a fenti eljárások közös hátránya, hogy nagy mennyiségben használnak fokozottan tűzveszélyes és/vagy erősen toxikus reagenseket, oldószereket. Ezenkívül a hozamok sem érik el a gazdaságos ipari gyártás követelményeit.In summary, a common disadvantage of the above procedures is the high use of highly flammable and / or highly toxic reagents and solvents. In addition, the yields do not meet the requirements of economical industrial production.
Amint az a fentiekből is kitűnik, 6-hidroxi-metil-1,4androsztadiéndion közvetlen biokonverziós előállítására vonatkozó közlés nem található a szakirodalomban.As stated above, there is no disclosure in the literature of direct bioconversion of 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene dione.
A jelen találmány célja tehát egy olyan, gazdaságos és környezetkímélő biokonverziós megoldás kidolgozása, amely ipari léptékű megvalósításra alkalmas.It is therefore an object of the present invention to provide an economical and environmentally friendly bioconversion solution suitable for industrial scale implementation.
Az exemesztán előállításához vezető, 4-androsztén-3,17-dionból kiinduló reakcióutak áttekintése során, a különböző intermedierek mikrobiológiai A1-dehidrogénezhetőségét megvizsgálva arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy Arthrobacter simplex sejtek alkalmazásával a 6-hidroxi-metil-4-androsztén-3,17dion kiváló hatásfokkal és számottevő melléktermékképződés nélkül átalakítható 6-hidroxi-metil-1,4-androsztadién-3,17-dionná, és így olyan, előnyösen kivitelezhető eljáráshoz jutunk, melynek révén elkerülhetők a 4-androsztén-3,17-dion átalakításánál fellépő termékgátlásból vagya 6-metilén-4-androsztén-3,17-dion rossz vízoldhatóságából származó hátrányok éppúgy, mint a környezetre veszélyes reagensek és oldószerek használata.Reviewing the pathways leading to the production of exemestane from 4-androstene-3,17-dione, examining the microbiological A 1 -dehydrogenation of the various intermediates, it was surprisingly discovered that 6-hydroxymethyl-4-androstene was used in Arthrobacter simplex cells. The 3,17dione can be converted to 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dione with excellent efficiency and without significant by-product formation, thereby providing a preferred process that avoids 4-androstene-3,17-dione disadvantages resulting from product inhibition or poor water solubility of 6-methylene-4-androstene-3,17-dione, as well as the use of environmentally hazardous reagents and solvents.
Fentiek alapján a találmány tárgya eljárás 6-hidroximetil-1,4-androsztadién-3,17-dion előállítására, olyan módon, hogy 6-hidroxi-metil-4-androsztén-3,17-diont biokatalizátor jelenlétében dehidrogénezünk.Accordingly, the present invention relates to a process for the preparation of 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dione by dehydrogenating 6-hydroxymethyl-4-androstene-3,17-dione in the presence of a biocatalyst.
A szubsztrátumul szolgáló 6-hidroxi-metil-4androsztén-3,17-diont 4-androsztén-3,17-dionból kiindulva, ismert módon [J. Am. Chem. Soc. 78, 430-436 (1956) és Helv. Chim. Acta 56(7), Nr. 247., 2396-2404 (1973)] állítjuk elő.The 6-hydroxymethyl-4-androstene-3,17-dione for the substrate is obtained starting from 4-androstene-3,17-dione by known methods [J. Chem. Soc. 78, 430-436 (1956) and Helv. Chim. Acta 56 (7), No. 247, 2396-2404 (1973).
A találmány szerinti eljárás egy előnyös változatában a dehidrogénezés kivitelezésére szteroid-A1-dehidrogenáz enzim termelésére képes baktériumsejteket, előnyösen Arthrobacter simplex (ATCC 6946) mikroorganizmust aerob körülmények között, önmagában ismert módon elszaporítunk, az enzim bioszintézisét a baktériumtenyészethez adott induktorral elindítjuk, az így kapott biokatalizátort a kiindulási anyagként használt 6-hidroxi-metil-4-androsztén-3,17-dionnal kölcsönhatásba hozzuk, kívánt esetben az elegyhez stabilizátort és elektronakceptort adunk, majd a biokonverzió befejezése után a terméket önmagában ismert módon kinyerjük.In a preferred embodiment of the invention, bacterial cells capable of producing steroid A 1 -dehydrogenase enzymes, preferably Arthrobacter simplex (ATCC 6946), are cultured under aerobic conditions in a manner known per se to increase bacterial synthesis of the enzyme. contacting the biocatalyst with the starting material, 6-hydroxymethyl-4-androstene-3,17-dione, optionally adding a stabilizer and an electron acceptor, and then, after completion of the bioconversion, recovering the product in a manner known per se.
A találmány szerinti eljárásban induktorként hidrokortizont vagy 4-androsztén-3,17-diont, stabilizátorként 13-etil-10,11 -dihidroxi-4-gonén-3,17-diont vagy a 17-es pozícióban 8-10 szénatomos alkiloldalláncot tartalmazó szterint, elektronakceptorként pedig 2-metil-1,4-naftokinont vagy annak biszulfitszármazékát alkalmazzuk.In the process of the invention, the inducer is hydrocortisone or 4-androstene-3,17-dione, the stabilizer is 13-ethyl-10,11-dihydroxy-4-gonene-3,17-dione or a sterol having a C8-C10 alkyl side chain at position 17. and the electron acceptor is 2-methyl-1,4-naphthoquinone or a bisulfite derivative thereof.
A találmány szerinti eljárás megvalósításához a szakember számára önmagában ismert biokatalizátorelőállítási módok közül (ép sejtek, sejtmentes enzimextraktumok, ill. azok immobilizált készítményei) Arthrobacter simplex ép sejt tenyészetét használhatjuk, amelyet folyékony táptalajon inkubálunk, amely szénforrást, előnyösen glükózt, 1-35 g/l koncentrációban, élesztőkivonatot 1-10 g/l koncentrációban és szervetlen sókat tartalmaz. A tenyészetet 25-38 °C-on, előnyösen 35 °C-on inkubáljuk 20-72 óráig, ekkor a tenyészethez adjuk a bakteriális-A1-dehidrogenáz (STDH) enzim termelődését indukáló vegyülete(ke)t tartalmazó oldatot.From the biocatalyst preparation methods known to those skilled in the art (intact cells, cell-free enzyme extracts, or their immobilized preparations), the cultures of Arthrobacter simplex, which are incubated on a liquid medium containing a carbon source, preferably glucose, of 1-35 g / l may be used. Yeast extract at a concentration of 1-10 g / l and inorganic salts. The culture is incubated at 25-38 ° C, preferably 35 ° C, for 20-72 hours, at which time the solution (s) containing bacterial A 1 -dehydrogenase (STDH) inducer is added to the culture.
Az indukciót önmagában ismert módon váltjuk ki; hidrokortizont 10-100 mg/l koncentrációnak megfelelően, metanolos oldatban adjuk a tenyészethez. Amennyiben a hidrokortizon enzimatikus bomlása miattInduction is induced in a manner known per se; hydrocortisone is added at a concentration of 10-100 mg / L in methanolic solution. If due to enzymatic decomposition of hydrocortisone
HU 227 367 Β1 idővel az indukciós hatás csökken, ismételt hidrokortizonadagolással tartható fenn a konverzióhoz szükséges aktivitás.The induction effect decreases over time, with repeated administration of hydrocortisone to maintain the activity required for conversion.
Felismerésünk szerint az inaktiválódás csökkentésére előnyösebb megoldás, ha a hidrokortizon mellett lassan lebomló, önmagában nem indukáló hatású szteroidot, például β-szitoszterint, vagy az Olasz K. és munkatársai (US 6 762 302 számú USA-beli szabadalmi leírás) által a finaszterid biokonverziós előállítása során már sikerrel alkalmazott 13-etil-10,11-dihidroxi4-gonén-3,17-diont is adagolunk az indukció megkezdésekor, 10-100 mg/l koncentrációban.It has been found to be more desirable to reduce inactivation by the bioconversion of finasteride, which is a slowly degradable, non-inducing steroid such as β-sitosterol or hydrocortisone, or by K.K., et al., U.S. Patent No. 6,762,302. 13-ethyl-10,11-dihydroxy-4-gonene-3,17-dione, which had already been used successfully, was added at the start of the induction at a concentration of 10-100 mg / l.
A tenyésztést változatlan fermentációs paraméterek mellett folytatva az indukció során 45-53 óra alatt a tenyészet 4000-9000 E/dm3 STDH-aktivitást és 18-25 közötti OD-értékeketérel. Ezt az indukált tenyészetet közvetlenül vagy 2-8 °C-on több hétig tárolva is használhatjuk biokonverzióra.Continuing the culture with unchanged fermentation parameters during induction over 45-53 hours, the culture produces 4000-9000 U / dm 3 of STDH activity and an OD of 18-25. This induced culture can be used for bioconversion either directly or at 2-8 ° C for several weeks.
A találmány szerinti eljárásban célszerű úgy eljárni, hogy a megfelelően indukált tenyészetet sterilezett vízzel eredeti térfogatának 3-15-szeresére hígítjuk, majd hozzáadjuk az átalakítandó 6-hidroxi-metil-4androsztén-3,17-dion (1-10 g/dm3) és az elektronkarrierként alkalmazott 2-metil-1,4-naftokinon (10-100 mg/dm3) vízzel elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen metanollal készített oldatát.In the process of the present invention, it is convenient to dilute the properly induced culture with sterilized water 3 to 15 times its original volume and then add the 6-hydroxymethyl-4-androstene-3,17-dione (1-10 g / dm 3 ) to be converted. and a solution of 2-methyl-1,4-naphthoquinone (10-100 mg / dm 3 ) as an electron carrier in a water-miscible organic solvent, preferably methanol.
A biokonverziós elegyet aerob körülmények között 32 °C-on inkubáljuk. Óránként vett minták vékonyréteg-kromatográfiás vagy HPLC-s vizsgálatával követjük a konverziót, az átalakulás befejeződése (3-12 óra) után vízzel nem elegyedő szerves oldószeres extrakcióval kinyerjük a keletkezett 6-hidroxi-metil-1,4-androsztadién-3,17-diont.The bioconversion mixture was incubated under aerobic conditions at 32 ° C. Hourly samples were monitored by TLC or HPLC, and after completion of conversion (3-12 hours), the resulting 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17- was obtained by extraction with a water immiscible organic solvent. dione.
A következő példákkal a találmány szerinti eljárást mutatjuk be, anélkül, hogy annak tárgykörét bármilyen értelemben korlátoznánk:The following examples illustrate the process of the invention without limiting the scope thereof in any way:
1. példa a) lépés:Example 1 Step a):
STDH enzimet tartalmazó Arthrobacter simplextenyészet előállításaPreparation of Arthrobacter simple culture containing STDH enzyme
Arthrobacter simplex (ATCC 6946) baktérium tenyészetét a következő összetételű ferde agaron tartjuk fenn:Culture of Arthrobacter simplex (ATCC 6946) was maintained on slanted agar with the following composition:
A leoltott tenyészetet 32 °C-on 4 napig inkubáljuk, majd +4-10 °C-on további 30 napig tároljuk tenyészet indítása céljából. Vegetatív tenyészet készítéséhez szilárd táptalajos tenyészetről leoltunk 500 cm3 térfogatú lombikban sterilezett 100 cm3, következő összetételű táptalajt:The inoculated culture is incubated at 32 ° C for 4 days and then stored at + 4-10 ° C for an additional 30 days to start the culture. To prepare a vegetative culture, inoculate 100 cm 3 sterilized in a 500 cm 3 flask from a solid culture medium with the following composition:
A tenyészetet 24 órán keresztül rázatjuk 32 °C-on, 200 perc-1 löketszámú rázóasztalon.The culture was shaken for 24 hours at 32 ° C on a shaking table for 200 minutes -1 .
A kapott inokulumtenyészet 2-2 cm3-ével 2 db 500 cm3-es rázólombikban elkészített 100-100 dm3 tápközeget oltunk, melyek összetétele:2 to 2 cm 3 of the resulting inoculum culture were inoculated with 100 to 100 dm 3 of medium in two 500 cm 3 shake flasks containing:
A tenyészeteket 24 órán keresztül rázatjuk 32-37 °C-on, előnyösen 32 °C-on, 200 perc-1 löketszámú rázóasztalon. Az így készített oltótenyészetek 200 cm3-vel oltunk 9 dm3 térfogatú laboratóriumi üvegfermentorban sterilezett 5 dm3 főfázistáptalajt, melynek összetétele:The cultures are shaken for 24 hours at 32-37 ° C, preferably 32 ° C, on a shaking table for 200 minutes -1 . The thus prepared inoculum cultures were inoculated with 200 cm 3 of a 5 dm 3 main phase medium sterilized in a 9 dm 3 laboratory glass fermenter with the following composition:
A tápközeget 121 °C-on 40 percig sterilezzük, oltás előtt a pH értékét NaOH-oldattal 6,3-6,4 közé állítjuk.The medium was sterilized at 121 ° C for 40 minutes and the pH adjusted to 6.3-6.4 with NaOH prior to inoculation.
A tenyésztést 35 °C-on, 300 perc-1 keverőfordulattal, 60 dm3/óra áramlási sebességű levegőztetéssel végezzük. A glükózfelhasználást pH-csökkenés kíséri, mely a növekedési sebesség csökkenését okozhatná. Ennek elkerülésére a tenyészet pH-értékét 200 g/dm3 NaOH-oldat adagolásával 6,3-6,5 alá nem engedjük csökkenni. A tenyésztés időtartama 24-26 órás, melyet további kb. 48-96 órás indukció követ.The cultivation was carried out at 35 ° C for 300 min -1 with aeration at a flow rate of 60 dm 3 / h. Glucose utilization is accompanied by a decrease in pH which could cause a decrease in growth rate. To avoid this, the pH of the culture is not lowered to 6.3-6.5 by adding 200 g / dm 3 of NaOH. The cultivation period is 24-26 hours, which is followed by approx. 48-96 hours induction followed.
A STDH enzim képződésének indukciójához előkészítünk 0,5 g glicint és 0,75 g cink-szulfátot előzőleg 40 cm3 vízben oldva és 121 °C-on 30 percig sterilezve.To induce the formation of STDH enzyme, 0.5 g of glycine and 0.75 g of zinc sulfate were prepared by dissolving previously in 40 cm 3 of water and sterilizing at 121 ° C for 30 minutes.
HU 227 367 Β1HU 227 367 Β1
Feloldunk 0,5 g hidrokortizont 50 cm3 metanolban, mely 0,35 g vízmentes kalcium-kloridot tartalmaz. Ezt az oldatot összeöntjük a glicin-cink-szulfát-oldattal, hozzáadagoljuk a tenyészethez. 0,5 g növényi eredetű szitoszterint megnedvesítünk 0,5 cm3 1%-os Tween-80 oldattal, 40 ml vízzel, felforraljuk a habzás megszűnéséig, sterilezzük 121 °C-on 30 percig, majd lehűlésig rázóasztalon rázatjuk. A kapott szuszpenziót is hozzáadjuk a tenyészethez és folytatjuk a tenyésztést változatlan fermentációs paraméterek mellett. Az indukció során 48-96 óra alatt a tenyészetek 5000-7000 E/dm3 STDH-aktivitást, 20-25 OD-értékkel jellemezhető sejtsűrűséget érnek el.Dissolve 0.5 g of hydrocortisone in 50 cm 3 of methanol containing 0.35 g of anhydrous calcium chloride. This solution was combined with the glycine-zinc sulfate solution and added to the culture. 0.5 g of plant-derived sitosterol was moistened with 0.5 cm 3 of 1% Tween-80 solution, 40 ml of water, boiled until the foaming ceased, sterilized at 121 ° C for 30 minutes and then shaken to cool. The resulting suspension is also added to the culture and the culture is continued with the same fermentation parameters. During the induction period, cultures achieve a STDH activity of 5000-7000 U / dm 3 and a cell density of 20-25 OD values within 48-96 hours.
b) lépésStep b)
6-Hidroxi-metil-1,4-androsztadién-3,17-dion (röviden: 6-hidroxi-metil-ADD) előállítása 6-hidroximetil-4-androsztén-3,17-dionból (röviden: 6-hidroximetil-AD-ból)Preparation of 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dione (briefly 6-hydroxymethyl-ADD) from 6-hydroxymethyl-4-androstene-3,17-dione (briefly 6-hydroxymethyl-AD) -from)
A dehidrogénezést az így előállított biokatalizátor vizes közegben előkészített szuszpenziójával végezzük. Előkészítjük a biokonverziós közeget pH=7 foszfátpuffer sterilezésével: 16,15 g KH2PO4-ot és 35,65 g Na2HPO4.2H2O-ot 4,8 dm3 csapvízben 121 °C-on 30 percig sterilezünk 9 dm3 térfogatú üvegfermentorban, melyet pH- és oldottoxigén-érzékelő elektródokkal szereltünk fel. A hőmérsékletet 32 °C-on szabályozzuk, majd 330 cm3 indukált tenyészetet aszeptikusán beadagolunk a foszfátpufferbe. Ezt követően az előzőleg 202 cm3 metanol és 22 cm3 víz forrásig melegített elegyében feloldott 14,5 g 6-hidroxi-metil-4-androsztén3,17-diont a biokonverziós rendszerhez adjuk, végül 10 cm3 steril vízben feloldott 0,5 g 2-metil-1,4-naftokinon-nátrium-biszulfit (röviden: menadion-biszulfit) elektronakceptorral kiegészítjük a rendszert.The dehydrogenation is carried out with a suspension of the biocatalyst thus prepared in an aqueous medium. Prepare the bioconversion medium by sterilizing pH 7 phosphate buffer: 16.15 g KH 2 PO 4 and 35.65 g Na 2 HPO 4. 2H 2 O in 4.8 dm 3 tap water at 121 ° C for 30 min. dm 3 in a glass fermenter equipped with pH and dissolved oxygen sensing electrodes. The temperature is controlled at 32 ° C and 330 cm 3 of the induced culture is aseptically added to the phosphate buffer. Subsequently dissolved in the previously-heated 202 cm 3 of methanol and 22 cm3 of water to boiling in a mixture of 14.5 g of 6-hydroxymethyl-4-3,17-dione is added to the bioconversion and then 10 cm 3 of sterile water dissolved 0.5 g of 2-methyl-1,4-naphthoquinone sodium bisulfite (Menadione bisulfite in short) is added to the system.
A fermentáció során a hőmérsékletet 32 °C-on, a keverést 300/min fordulatszámon tartjuk, az oxigénellátást 60 dm3/óra levegőátáramoltatással biztosítjuk. Esetleges habzás esetén SB-2020 habgátlót juttathatunk a rendszerbe.During the fermentation, the temperature is maintained at 32 ° C, the stirring is maintained at 300 rpm and the oxygen supply is provided by an air flow of 60 dm 3 / h. In the event of foaming, the SB-2020 foam suppressant can be introduced into the system.
A biokonverzió előrehaladását VRK- vagy HPLCanalízissel vizsgáljuk, regisztráljuk a mintákban mérhető STDH-aktivitást és a sejtkoncentrációra jellemző optikai denzitás (OD) értékeket.The progress of bioconversion is monitored by TLC or HPLC, and the STDH activity in the samples and the optical density (OD) values of the cell concentration are recorded.
Amikor a bevitt 6-hidroxi-metil-AD 90%-a már átalakult, a biokonverziót leállítjuk. A fermentléhez 5 g/dm3 szűrési segédanyagot (Perfiit) adunk, majd vákuum segítségével leszűrjük. A kiszűrt biomassza és szűrési segédanyag égetésre kerül, a szűrletet 2 dm3 etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist félretesszük, a vizes fázist újra extraháljuk 1 dm3 etil-acetáttal. Az etil-acetátos fázisokat összegyűjtjük, 0,8 dm3 NaOH-oldattal (50 g/dm3) mossuk, majd hozzáadunk 0,2 dm3 csapvizet, és Rotavapor készülékben, vákuumban 65-70 °Cos vízfürdőn ledesztilláljuk az etil-acetátot. Rosszul kristályosodó anyagot kapunk, melyet tovább tisztítunk úgy, hogy 0,2 dm3 metanollal melegen oldatba visszük a kivált anyagot. Beoldás után hozzáadunk 0,15 dm3 csapvizet és 4 cm3 NaOH-oldatot (50 g/dm3). Ezt követően az oldószert ledesztillálva homogén nyers kristályos anyag válik ki, melyet 3 órás kevertetés után szűrünk, a kristályokat 10 cm3 vízzel fedve mossuk, majd vákuum szárítószekrényben 80 °C-on súlyállandóságig szárítjuk. Az így kapott nyers kristály tömege 10 g, 6-hidroxi-metil-ADD-tartalma 92%.Once 90% of the 6-hydroxymethyl-AD has been converted, bioconversion is stopped. To the fermentation broth was added 5 g / dm 3 of filter aid (Perfit) and filtered under vacuum. The filtered biomass and filtration aid are incinerated and the filtrate is extracted with 2 dm 3 of ethyl acetate. The organic phase is discarded and the aqueous phase is re-extracted with 1 dm 3 of ethyl acetate. The ethyl acetate phases were collected, washed with 0.8 dm 3 of NaOH (50 g / dm 3 ), then 0.2 dm 3 of tap water was added and the ethyl acetate was distilled in a Rotavapor apparatus under vacuum at 65-70 ° C. A poorly crystallizing material is obtained, which is further purified by dissolving the precipitated material in 0.2 dm 3 of methanol. After reconstitution, 0.15 dm 3 of tap water and 4 cm 3 of NaOH solution (50 g / dm 3 ) are added. The solvent was removed by evaporation to give a homogeneous crude crystalline material, which, after stirring for 3 hours, was washed with 10 cm 3 of water and dried in a vacuum oven at 80 ° C to constant weight. The crude crystal thus obtained had a weight of 10 g and a 92% 6-hydroxymethyl ADD content.
További tisztításához a 10 g nyers kristályt 20 cm3 diklór-metánban feloldjuk, majd állandó keverés közben hozzácsepegtetünk 100 cm3 metil-ciklohexánt, mely kicsapja a terméket. A rendszert 1 órán át kevertetjük. A kivált kristályokat üvegszűrőn szűrjük, 10 cm3 metil-ciklohexánnal fedve mossuk, majd vákuum szárítószekrényben 80 °C-on súlyállandóságig szárítjuk. Az így kapott kristály tömege 9,5 g, 6-hidroxi-metilADD-tartalma 93% (mely 60,9% kihozatalnak felel meg.)For further purification, 10 g of crude crystal are dissolved in 20 cm 3 of dichloromethane and 100 cm 3 of methyl cyclohexane are added dropwise with constant stirring, which precipitates the product. The system was stirred for 1 hour. The precipitated crystals were filtered through a glass filter, washed with 10 cm 3 of methylcyclohexane and then dried in a vacuum oven at 80 ° C to constant weight. The crystal thus obtained had a weight of 9.5 g and a 6-hydroxymethylADD content of 93% (corresponding to a yield of 60.9%).
Szerkezetazonosítását NMR-analízissel végeztük, mellyel a következő jellemző kémiai eltolódási értékeket kaptuk:Structure identification was performed by NMR analysis to obtain the following characteristic chemical shift values:
1H-NMR {Varian NMRS-500, DMSO-d6(TMS), δ(ρριτι)}: 7,17d (C-1); 6,08 dd (C-2); 6,02 d (C-4); 2,7 m (C-6); 1,16 m & 2,01 m (C-7); 1,92 m (C-8); 1,06 m (C-9); 1,59 m & 1,83 m (C-11); 1,20 m & 1,69 m (C-12); 1,28 m (C-14); 1,54 m & 1,88 m (C-15); 2,01 m & 2,42 m (C-16); 0,89 s (C-18); 1,20 s (C-19); 3,57 m & 3,70 m (-CH2(6)); 4,76 t (-OH) 13C-NMR {Varian NMRS-500, DMSO-d6(TMS), Ő(ppm)}: 156,8 (C-1); 125,9 (C-2); 184,8 (C-3); 126,3 (C-4); 168,2 (C-5); 48,1 (C-6); 31,9 (C-7); 30,4 (C-8); 50,6 (C-9); 43,0 (C-10); 21,0 (C-11); 30,9 (C-12); 46,9 (C-13); 49,7 (C-14); 21,4 (C-15); 35,1 (C-16); 219,1 (C-17); 13,5 (C-18); 19,5 (C-19); 62,8 (-CH2(6)) 1 H-NMR {Varian NMRS-500, DMSO-d 6 (TMS), δ (ρριτι)}: 7.17d (C-1); 6.08 dd (C-2); 6.02 d (C-4); 2.7 m (C-6); 1.16 m & 2.01 m (C-7); 1.92 m (C-8); 1.06 m (C-9); 1.59m & 1.83m (C-11); 1.20m & 1.69m (C-12); 1.28 m (C-14); 1.54m & 1.88m (C-15); 2.01 m & 2.42 m (C-16); 0.89 s (C-18); 1.20 s (C-19); 3.57 m & 3.70 m (-CH 2 (6)); 4.76 t (-OH) 13 C-NMR {Varian NMRS-500, DMSO-d 6 (TMS), δ (ppm)}: 156.8 (C-1); 125.9 (C-2); 184.8 (C-3); 126.3 (C-4); 168.2 (C-5); 48.1 (C-6); 31.9 (C-7); 30.4 (C-8); 50.6 (C-9); 43.0 (C-10); 21.0 (C-11); 30.9 (C-12); 46.9 (C-13); 49.7 (C-14); 21.4 (C-15); 35.1 (C-16); 219.1 (C-17); 13.5 (C-18); 19.5 (C-19); 62.8 (-CH 2 (6))
2. példaExample 2
Az 1. példa szerint járunk el a STDH enzim kialakításánál, de a főfázistenyésztésnél az alábbi változtatást alkalmazzuk:Example 1 proceeds with STDH formation, but with the following change in the main phase culture:
HU 227 367 Β1HU 227 367 Β1
Táblázat (folytatás)Table (continued)
Az indukciónál az 1. példában leírtak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a A1-dehidrogenáz enzim képződését stabilizáljuk önmagában nem indukáló hatású anyag egyidejű adagolásával. Az STDH enzim induktoraként legkedvezőbbnek tartott hidrokortizont a nagy sejtsűrűségű tenyészet metabolizálhatja, ami a már keletkezett STDH fokozatos inaktiválódásához vezethet. Az inaktiválódás elkerülése érdekében a hidrokortizon mellett 13-etil-10,11-dihidroxi-4-gonén-3,17diont (röviden: 10,11-dihidroxi-levodiont) is adagolunk az indukció megkezdésekor.Induction of the procedure described in Example 1, except that the formation of the one dehydrogenase enzyme is stabilized in itself the simultaneous administration of the substance no inducer. Hydrocortisone, which is considered to be the most favorable inducer of the STDH enzyme, may be metabolized by high cell density cultures, which may lead to the gradual inactivation of already produced STDH. In addition to hydrocortisone, 13-ethyl-10,11-dihydroxy-4-gonene-3,17-dione (10,11-dihydroxy-levodione) is added at the initiation of induction to avoid inactivation.
A A1-dehidrogenáz enzim képződését 100 mg/dm3 hidrokortizon hozzáadásával indukáljuk, egyúttal 75 mg/dm3, metanolban oldott 13-etil-10,11-dihidroxi4-gonén-3,17-diont adagolunk enzimstabilizátorként. 48-72 óra indukció után a tenyészetet 14-szeres térfogatú pH=7 foszfátpufferrel felhígítjuk és így használjuk a biokonverzióhoz, melyet az azt követő kinyeréssel együtt az 1. példában ismertetett módon végzünk. Ilyen módon eljárva 9,8 g nyerskristályt kapunk, melynek 6-hidroxi-metil-ADD-tartalma 92,2% (62,3% kihozatalnak felel meg.)Formation of AA 1- dehydrogenase is induced by the addition of 100 mg / dm 3 of hydrocortisone and addition of 75 mg / dm 3 of 13-ethyl-10,11-dihydroxy-4-gonene-3,17-dione in methanol as the enzyme stabilizer. After 48-72 hours of induction, the culture was diluted with 14 volumes of pH 7 phosphate buffer and used for bioconversion, followed by recovery as described in Example 1. This gives 9.8 g of a crude crystal having a content of 6-hydroxymethyl ADD of 92.2% (corresponding to a yield of 62.3%).
3. példaExample 3
Mindenben a 2. példa szerint járunk el, de a főfázisú tenyésztést és enzimindukciót 80 dm3 térfogatú tápközegben végezzük. A fermentáció során a hőmérsékletet 35 °C értéken szabályozzuk, a keverést 200 perc-1 fordulatszámon tartjuk. A levegőztetést 960 dm3/óra áramlási sebességgel végezzük. Az esetleges habzást Struktol SB2020 habgátló adagolásával szorítjuk vissza. Az enzimindukció megkezdése után 48-72 óra múlva a tenyészet felhasználható biokonverzióra.All were carried out as in Example 2, but the main-phase cultivation and enzyme induction were performed in 80 dm 3 medium. During fermentation the temperature was controlled at 35 ° C, stirring was maintained at 200 min -1 rpm. Aeration is carried out at a flow rate of 960 dm 3 / h. Any foaming is suppressed by addition of Struktol SB2020 foam inhibitor. 48-72 hours after the start of enzyme induction, the culture can be used for bioconversion.
Az így előállított tenyészetből 5 dm3-hez 70 dm3 pH=7 0,06M sterilezett foszfátpuffert adunk. 217,5 gThe culture thus obtained 5 Rates are relative dm 3 to 70 dm 3, pH 7 phosphate buffer was sterilized 0.06. 217.5 g
6-hidroxi-metil-4-androsztén-3,17-diont feloldunk 3300 cm3 metanolban kb. 50 °C-os vízfürdőn és keverés mellett a felhígított tenyészethez öntjük. Ezután 7,5 g menadion-biszulfitot feloldunk 150 cm3 steril vízben, és a biokonverziós elegyhez öntjük. A biokonverziós elegyet 100 dm3-es fermentorban 32 °C-on, 0,1 v/v/min levegőáramoltatás mellett 200/min fordulatszámon kevertetjük. Óránként vett minták vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatával követjük a konverziót, az átalakulás befejeződésekor az 1. példa szerinti etilacetátos extrakcióval kinyerjük a keletkezett 6-hidroximetil-1,4-androsztadién-3,17-diont. Az így kapott termék tömege 152 g, 6-hidroxi-metil-ADD-tartalma 91,5% (megfelel 64% kihozatalnak).6-Hydroxymethyl-4-androstene-3,17-dione is dissolved in 3300 cm 3 of methanol for approx. Pour into diluted culture in a 50 ° C water bath and stirring. Then 7.5 g of menadione bisulfite is dissolved in 150 cm 3 of sterile water and added to the bioconversion mixture. The bioconversion mixture was agitated in a 100 dm 3 fermenter at 32 ° C with an air flow rate of 0.1 v / v / min at 200 rpm. The conversion is monitored by thin-layer chromatography on the hourly samples, and upon completion of the conversion, the resulting 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dione is recovered by the ethyl acetate extraction of Example 1. The product thus obtained had a weight of 152 g and a 6-hydroxymethyl ADD content of 91.5% (corresponding to 64% yield).
Claims (5)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0700584A HU227367B1 (en) | 2007-09-11 | 2007-09-11 | Method for producing 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dion |
| PCT/HU2008/000101 WO2009034398A1 (en) | 2007-09-11 | 2008-09-10 | Process for the synthesis of 6-hydroxymethyl-l,4- androstadien-3.17-dione |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU0700584A HU227367B1 (en) | 2007-09-11 | 2007-09-11 | Method for producing 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dion |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0700584D0 HU0700584D0 (en) | 2007-11-28 |
| HUP0700584A2 HUP0700584A2 (en) | 2009-06-29 |
| HU227367B1 true HU227367B1 (en) | 2011-04-28 |
Family
ID=89987738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0700584A HU227367B1 (en) | 2007-09-11 | 2007-09-11 | Method for producing 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dion |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| HU (1) | HU227367B1 (en) |
| WO (1) | WO2009034398A1 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107988092B (en) * | 2017-11-10 | 2020-12-29 | 天津科技大学 | Arthrobacter simplex mutant strain with stress tolerance and engineering bacterium |
| CN114317664A (en) * | 2021-12-28 | 2022-04-12 | 浙江仙琚制药股份有限公司 | Method for preparing 11a,15 a-dihydroxy androstenedione |
| CN115181705A (en) * | 2022-07-27 | 2022-10-14 | 河南利华制药有限公司 | Method for improving dehydrogenation conversion rate of mould material |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3322120A1 (en) * | 1982-07-30 | 1984-02-02 | The Upjohn Co., 49001 Kalamazoo, Mich. | METHOD FOR CONVERTING 1,2-SATURED 3-KETOSTEROIDS IN 1,2-DEHYDROSTEROIDS |
| AU5873300A (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-30 | Pharmacia & Upjohn Company | Process to prepare exemestane |
| HU227238B1 (en) * | 2006-09-15 | 2010-12-28 | Richter Gedeon Nyrt | Process for obtaining selectively monohydroxylated 3,17-diketo steroid compounds, purification and separation thereof |
-
2007
- 2007-09-11 HU HU0700584A patent/HU227367B1/en unknown
-
2008
- 2008-09-10 WO PCT/HU2008/000101 patent/WO2009034398A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009034398A1 (en) | 2009-03-19 |
| HUP0700584A2 (en) | 2009-06-29 |
| HU0700584D0 (en) | 2007-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7259005B2 (en) | Microorganism having ability to convert sterol into androst-4-ene-3, 17-dione/androsta-1,4-diene-3, 17-dione and preparation method and use thereof | |
| HU227367B1 (en) | Method for producing 6-hydroxymethyl-1,4-androstadiene-3,17-dion | |
| EP1534732B1 (en) | 5 androsten-3-ol steroid intermediates and processes for their preparation | |
| US8367394B2 (en) | Process for the synthesis of 9α-hydroxy-steroids | |
| US7241601B2 (en) | Process for the preparation of Fexofenadine | |
| EP0922770B1 (en) | A microbiological process for the transformation of 17beta-carboxy substituted 3-oxo-4-azasteroids and the use of such products as inhibitors of the enzyme 5alpha-reductase | |
| US20070066579A1 (en) | 5-androsten-3beta-ol steroid intermediates and processs for their preparation | |
| MXPA05014202A (en) | Microbial method for hydrolysis and oxidation of androst-5-ene and pregn-5-ene steroid esters. | |
| JPS6350000B2 (en) | ||
| US20060100185A1 (en) | 5-Androsten-3beta-ol steroid intermediates and processes for their preparation | |
| US5250712A (en) | 1β,15α-dihydroxy-1α-methyl-5α-androstane-3,17-dione, its production and use | |
| EP0983295A2 (en) | 4-aza-steroids substituted in one or more of positions 7, 11 and 15 or with an unsaturated 14(15)-double bond as inhibitors of testosterone-5-alpha-reductase | |
| EP1679317A2 (en) | 5-Androsten-3 -ol steroid intermediates and processes for fheir preparation | |
| CH493504A (en) | Steroid hydroxylation process | |
| CS200518B2 (en) | Process for preparing derivatives of androstanone | |
| JPS637795A (en) | Production of 7alpha-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione | |
| JPS59186998A (en) | 17-cyano-12,17-dihydroxyandrosta-1,4-diene-3-one | |
| JP2000262295A (en) | Production of optically active 3-substituted indole | |
| JPS59187000A (en) | Androsta-1,4,11 (12)-triene-3,17-dione | |
| JP2000279190A (en) | Production of optical active 3-substituted-(2- hydroxyalkyl)indole | |
| PL149597B1 (en) | Method of obtaining 6-alpha-fluoro-16-alpha,17-alpha-isopropylidenedioxy-11-betha,21-dihydroxy-4-pregnene-3,20-dione |