DE2757377A1 - Verfahren zum stabilisieren, konzentrieren und reinigen von insulin - Google Patents

Description

Regents of the University of Minnesota Minneapolis, Minnesota, V.St.A.

"Verfahren zum Stabilisieren, Konzentrieren und Reinigen von Insulin".

beanspruchte _{2?< De}zember 1976, V.St.A., Nr. 754,112

Priorität:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren, Konzentrieren und Reinigen von Insulin im technischen Maßstab. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Ionenaustauschharzen, um Insulin aus sauren Alkoholextrakten von Bauchspeicheldrüsengewebe entweder aus frischen oder aus gefrorenen Bauchspeicheldrüsen zu gewinnen. Die bevorzugte Verwendung einer Korbzentrifuge gestattet die Verarbeitung großer Mengen Substanz. Das Gewinnungs- und Reinigungsverfahren ist sehr einfach und läßt sich in sehr kurzer Zeit durchführen. Dabei werden höhere Ausbeuten als nach bekannten Verfahren erhalten. Die Produkte werden in einem reinen unveränderten stabilen Zustand gewonnen. Außerdem können pankreatische Enzyme, die gewöhnlich verworfen werden, gewonnen

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werden.

In der gewöhnlichen Praxis werden die Bauchspeicheldrüsen von Tieren, in erster Linie von Rindern und Schweinen, sofort beim Schlachten der Tiere beim Bereiten von Fleisch für den menschlichen Verzehr entfernt. Die Drüsen werden für den Versand zu Verarbeitungslaboratorien gefroren und gelagert, bis das Insulin und die Enzyme aus dem Gewebe entfernt werden können. Nach dem Auftauen wird das pankreätische Gewebe mazeriert und homogenisiert. Dann werden Insulin und Enzyme mit angesäuertem wässrigen Alkohol extrahiert, worauf der Extrakt eingeengt wird, wobei das Insulin ausfällt, das in kristalliner Form gewonnen wird. Der Insulinextrakt enthält proteolytische Enzyme, wie Trypsin und Chymotrypsin. Diese Enzyme sind für Insulin schädlich und müssen sofort vom Insulin abgetrennt werden.

Das übliche Verfahren zum Abscheiden der unerwünschten verunreinigenden Enzyme besteht darin, den alkoholischen Extrakt 30 Minuten lang auf 60⁰C zu erwärmen. Infolge der zur Inaktivierung dieser Enzyme mittels Erwärmen erforderlichen Zeit wird jedoch in unerwünschter Weise ein Teil des Insulins hydrolysiert. Dies äußert sich in der Bildung von Insulin-Nebenprodukten, wie Desamido-Insulln und Arginin-Insulin, die die Bildung von Antikörpern gegenüber Insulin bei Diabetikern, die über einen langen Zeitraum Insulin-Injektionen verabfolgt bekommen, hervorrufen.

Das Übliche Verfahren zum Konzentrieren von Insulin aus dem sauren alkoholischen Extrakt besteht darin, den Extrakt einzu-

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dampfen, um den Alkoholgehalt herabzusetzen und die Lösung einzuengen und festes Natriumchlorid zuzusetzen, um das Insulin in Form eines Salzkuchens auszufällen. Das Abdampfen des Alkohols und die Bildung des Salzkuchens verursachen weitere Insulinverluste. Nach der Bildung des Salzkuchens nach dem üblichen Verfahren wird das Insulin weiter konzentriert und über mehrere Kristallisationsstufen gereinigt, wie eine Kristallisation beim Isoelektrischen Punkt oder mittels Zinkacetat.

Es ist aus der US-PS 3 069 323 bekannt, eine wässrige alkoholische Lösung von rohem Insulin mit einem Aminocellulose-Anionenaustauscher bei pH-Werten von etwa 5,5 bis etwa 8,0 in Berührung zu bringen, um wenigstens einen Teil des Insulins an den Anionenaustauscher zu adsorbieren. Anschließend wird der Austauscher vom Gemisch getrennt und das Insulin aus dem Austauscher entweder mittels eines sauren oder mittels eines basischen Eluierungsmittels eluiert. Danach wird das Insulin mittels bekannter Verfahrensschritte kristallisiert. Es findet sich jedoch in dieser Patentschrift kein Hinweis auf ein Entfernen der proteolytischen Enzyme oder die Abwesenheit von Abbauprodukten in dem erhaltenen kristallinen Insulin.

Des weiteren ist aus der südafrikanischen Patentschrift Nr. 69/5280 bekannt geworden, in lm-Essigsäure gelöstes kristallines Insulin mittels Durchleiten durch ein Molekularsieb oder durch Säulen mit einem vernetzten, ein dreidimensionales Netzwerk bildenden Dextran mit definierter Porengröße zu fraktionieren. Auf diese Weise ist es möglich, aus dem als Aus-

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gangsmaterial verwendeten Insulin Proteine pankreatischen Ursprungs mit einem Molekulargewicht über etwa 6000 zu entfernen. Jedoch ist es dann erforderlich, auch die insulinähnlichen Substanzen mit praktisch dem gleichen Molekulargewicht wie Insulin, die sich in ihrer Zusammensetzung geringfügig unterscheiden, beispielsweise Desamido-Insulin und Arginin-Insulin, zu entfernen. Dies erfolgt vorzugsweise mittels Säulenchromatographie an einem Ionenaustauscher. Es ist ferner bekannt, das kristalline Insulin unmittelbar mittels Säulenchromatographie zu reinigen, indem man das unreine kristalline Insulin einer Säulenchromatographie an einem Anionenaustauscher unterwirft. Abgesehen von der Notwendigkeit, kristallines Insulin in üblicher Weise herzustellen, verläuft die vorgeschlagene Reinigung mittels Säulenchromatographie langsam, ist also nicht für eine wirtschaftliche Erzeugung geeignet und liefert nur niedrige Ausbeuten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es nun, ein vereinfachtes Verfahren zur Gewinnung von Insulin zur Verfügung zu stellen, das in technischem Maßstab und rasch durchführbar ist und Insulin in hoher Reinheit liefert. Die Erfindung löst diese Aufgabe.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Verfahren zum Stabilisieren, Konzentrieren und Reinigen von Insulin, das durch die folgenden Stufen gekennzeichnet ist:

(a) Herstellen eines alkoholischen Extrakts mit niedrigem sauren pH-Wert von zerkleinertem homogenisiertem Bauchspeicheldrüsengewebe,

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(b) ein erstes Stabilisieren, Konzentrieren und Reinigen des Insulins durch Inberührungbringen des alkoholischen Extrakts mit niedrigem sauren pH-Wert mit einem sauren Kationenaustauscher, Adsorbieren des Insulins an den Kationenaustauscher, Waschen mit einer wässrigen Lösung mit niedrigem pH-Wert und Abtrennen des Alkohols und der pankreatischen Enzyme vom Kationenaustauscher,

(c) Eluieren des stabilisierten, konzentrierten und gereinigten adsorbierten Insulins aus dem Kationenaustauscher mittels einer gepufferten alkoholischen Lösung von hohem pH-Wert,

(d) ein zweites Konzentrieren und Reinigen des in dem Eluierungsmittel aus dem Kationenaustauscher erhaltenen Insulins durch Inberührungbringen dieser alkoholischen Insulin-Lösung mit hohem pH-Wert mit einem basischen Anionenaustauscher, Adsorbieren des Insulins an den Austauscher und Abtrennen des alkoholischen Eluierungsmittels,

(e) Waschen des an den Anionenaustauscher adsorbierten Insulins mittels einer wässrigen Pufferlösung von hohem pH-Wert und Entfernen des restlichen Alkohols und

(f) Eluieren des weiter stabilisierten, konzentrierten und gereinigten adsorbierten Insulins aus dem Anionenaustauscher mittels einer verdünnten Säure von niedrigem Molekularge-

wicht.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man entweder von frisch exzidierten oder gefrorenen Bauchspeicheldrüsen ausgehen. Dann wird zuerst in an sich bekannter Weise ein saurer alkoholischer

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Extrakt von kleingeschnittenem, homogenisiertem Bauchspeicheldrüsengewebe hergestellt. Der Extrakt wird gegebenenfalls neutralisiert, und der flüssige, das Insulin enthaltende Extrakt wird mittels Filtrieren, Dekantieren, Zentrifugieren oder dergleichen, abgetrennt. Die ausgefallenen Feststoffe werden verworfen. Dann macht das Insulin eine erste Konzentrations- und Reinigungsstufe durch, indem der flüssige Extrakt mit einem sauren Kationenaustauscher, vorzugsweise in einer Korbzentrifuge oder gegebenenfalls in einer Chromatographiesäule oder in einem absatzweise verlaufenden Verfahren in Berührung gebracht wird, um das Insulin an den Kationenaustauscher zu adsorbieren und die verunreinigenden proteolytischen Enzyme und andere Verunreinigungen abzutrennen. Das derart konzentrierte Insulin wird aus dem Kationenaustauscher mittels einer alkoholischen Pufferlösung mit hohem pH-Wert eluiert. Dann wird das Insulin einer weiteren Konzentrations- und Reinigungsstufe unterworfen, indem es mit einem basischen Anionenaustauscher in Berührung gebracht wird, um das Insulin an dem Austauscher zu adsorbieren und den größten Teil des Alkohols abzutrennen. Das adsorbierte Insulin wird dann mit einer wässrigen Pufferlösung mit hohem pH-Wert gewaschen, um den restlichen Alkohol zu entfernen. Das konzentrierte gereinigte Insulin wird dann aus dem Anionenaustauscher mit verdünnter Säure mit einem niedrigen Molekulargewicht eluiert und kann anschließend kristallisiert oder mittels Gelfiltrationschromatographie weiter gereinigt werden.

Die erste Adsorption kann ohne weiteres in den Schlachthöfen durchgeführt werden, wo die Bauchspeicheldrüsen exzidiert werden.

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Dadurch braucht man nicht mehr wie bei der üblichen Praxis die Bauchspeicheldrüsen einzufrieren und wieder aufzutauen, was die Hauptursache für einen Insulinverlust darstellt. Das adsorbierte Insulin kann unmittelbar an pharmazeutische Laboratorien zum Eluieren von Insulin aus dem Kationanaustauscher versandt werden, wobei sich dann die Konzentrierungs- und Reinigungsstufen und weiter das im Kreislaufführen und wieder Einsetzen des Kationenaustauschers anschließen.

Die von dem adsorbierten Insulin abgetrennten Enzyme können gesondert gewonnen werden.

Die Erfindung wird durch das beigefügte Fließdiagramm näher veranschaulicht, das das Entfernen des Alkohols, das Stabilisieren, das Konzentrieren und das Reinigen des Insulins aus Bauchspeicheldrüsen zeigt.

Die Hauptquelle für Insulin stammt aus Rinder- oder Schweine-Bauchspeicheldrüsen, die beim Schlachten der Tiere zur Zubereitung von Fleisch für den menschlichen Verzehr herausgeschnitten werden. Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren in gleicher Weise für die Behandlung von Insulin geeignet ist, das aus gefrorenen Bauchspeicheldrüsen extrahiert worden ist, bevorzugt man jedoch, um einen Verlust an Insulin infolge Gefrieren und Auftauen zu vermeiden, das Insulin aus frisch exzidierten Bauchspeicheldrüsen zu extrahieren. Die Bauchspeicheldrüsen werden, gleichgültig ob es sich um frische oder gefrorene und wieder aufgetaute Bauchspeicheldrüsen handelt, in einer sauren

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alkoholischen Lösung, die etwa 65 % Äthanol und 35 % Wasser enthält und einen pH-Wert von etwa 2,8 aufweist, zerkleinert oder in anderer Weise mazeriert und homogenisiert. Das Gemisch wird gegebenenfalls mittels Zugabe von etwa 20prozentiger Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von etwa 8,2 eingestellt, um die Feststoffe, einschließlich der Enzyme, auszufällen, die durch Abfiltrieren, Dekantieren, Zentrifugieren oder dergleichen entfernt werden. Das Filtrat, d.h. der flüssige saure alkoholische Extrakt, enthält Insulin in einer Menge

'den/

von etwa 20 bis 80 mg je Liter zusammen mit/proteolytischen Enzymen. Trypsin, Chymotrypsin und dergleichen. Da diese Enzyme das Insulin angreifen, müssen sie sofort abgetrennt werden. Anstatt das übliche Abtrennungsverfahren anzuwenden, das in einem Erhitzen besteht, wobei eine nachteilige teilweise Hydrolyse des Insulins und die Erzeugung unerwünschter Insulin-Nebenprodukte, wie Desamido-Insulin, Arginin-Insulin und dergleichen, stattfindet ,werden diese Verunreinigungen durch ein Ionenaustauschverfahren, vorzugsweise in einer Korbzentrifuge, entfernt. Obwohl die vorliegende Erfindung insbesondere im Hinblick auf die Anwendung einer Korbzentrifuge für den Ionenaustausch beschrieben wird, kann man das Verfahren selbstverständlich auch unter Anwendung einer Säulenchromatographie oder eines absatzweise arbeitenden Ionenaustauschverfahrens durchführen.

Es sind zahlreiche Arten von Ionenaustauschern zur Anwendung in einer Korbzentrifuge zum Entfernen biologischer Substanzen geeignet.Derartige Austauschsubstanzen schließen Cellulose, vernetzte Dextrane, Agarose, Polymerisate von Hydroxy-methacry-

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laten, Acrylsäuremethylester, Styrol-Divinylbenzol und andere Ionenaustauscher ein. Diese Ionenaustauscher werden in Chromatographiesäulen und anderen absatzweise arbeitenden Verfahren eingesetzt, um biologische Verbindungen oder Substanzen zu entfernen. Bei Anwendung von Ionenaustauscher in einer Korbzentrifuge wird jedoch die zum Gewinnen von labilen biologischen Substanzen erforderliche Zeit wesentlich herabgesetzt. Es werden in kürzeren Zeiten größere Volumen an Substanz gewonnen. Ein Regenerieren des Ionenaustauschers wird in der Korbzentrifuge vereinfacht und beschleunigt. Es können Korbzentrifugen mit Korbgrößen von 122 cm bis zu 30,5 cm und Bettkapazitäten von 450 bis zu 5 Litern verwendet werden. Ein Bearbeiten von biologischen Substanzen in einer Korbzentrifuge hat den Vorteil der

/kombiniert/

Einfachheit eines absatzweisen Ionenaustauscnes/mit der Trennwirkung eines Säulenaustausches und kann in einer viel kürzeren Zeit durchgeführt werden. Es wird ein Höchstmaß an Ausbeute und Leistung durch Kombination eines höchst spezifischen Ionenaustauschmediums mit der eahr raschen Gewinnung in einer Korbzentrifuge erhalten.

Der rohe saure alkoholische Insulinextrakt wird durch Zugabe von etwa 8,5 m-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von etwa 2/8 angesäuert. Bei einem Verfahren in technischem Maßstab liegt ein typischer Ansatz bei etwa 45 000 bis 45OOOO Liter. Der Extrakt wird vorzugsweise unmittelbar nach der Herstellung mit einem speziellen Kationenaustauscher in einer mit Löchern versehenen Schale der Korbzentrifuge in Berührung gebracht. Die proteolytisehen Enzyme werden sofort vom Insulin abgetrennt.

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Das Insulin wird an den Kationenaustauscher adsorbiert, und die Enzyme werden in der Zentrifuge zusammen mit dem die anderen Verunreinigungen enthaltenden Alkohol abgeschleudert. Das Insulin wird dadurch von dem typischen Anfangswert von etwa 40 mg/1 auf einen Gehalt zwischen etwa 16 000 und 40 000 mg/1 konzentriert, und 90 bis 95 % der verunreinigenden Substanzen werden vom adsorbierten Insulin entfernt. Jeweils 1000 Liter saurer alkoholischer Extrakt erfordern etwa 1 Liter angequollenen Kationenaustauscher oder 400 g trockenen Kationenaustauscher.

Der bevorzugte Ionenaustauscher für die erste Konzentrierungsund Reinigungsstufe ist ein stark saurer Kationenaustauscher 4n Form eines dreidimensionalen Polysaccharid-Netzwerkes aus vernetzten Dextranketten, deren

Glucoseeinheiten über Xtherbrücken funktioneHe Sulfopropylgruppen CH₃H₆SO₃- eingeführt worden sind. Derartige Kationenaustauscher sind unter dem Warenzeichen "SP Sephadex C-25" im Handel. Die Korbzentrifuge mit einer mit Löchern versehenen Schale einer annähernden Endkapazität von 450 Litern wird durch Auskleiden der mit Löchern versehenen Schale mit einem 5 oder 10 Mikron-Filter aus Polyamid oder einem Polyäthylen hoher Dichte vom Ziegler-Typ hergestellt. 150 kg des vorgenannten Kationenaustauschers werden über Nacht mit 0,Jm- Essigsäure in 65prozentigern Äthanol ins Gleichgewicht gebracht.

Der derart behandelte Kationenaustauscher wird in die Korbzentrifuge eingegossen. Dann wird die Zentrifuge in Gang gesetzt.

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Die Zentrifugengeschwindigkeit wird so weit erhöht, bis ein gleichmäßiges Bett gegen die Wandung der Zentrifuge geschleudert worden ist. Dies erfordert eine Zentrifugalkraft zwischen 500 und 1000 g. Dann bringt man den sauren alkoholischen Insulinextrakt, der zuvor zum Entfernen von Feststoffen filtriert worden ist, auf das Austauscherbett in der Korbzentrifuge mit einer Geschwindigkeit zwischen 100 und 500 g. Das Zentrifugat, also die aus der Zentrifuge austretende Flüssigkeit, wird für eine weitere Verarbeitung zur Gewinnung der pankreatischen Enzyme aufbewahrt.

Das Insulin ist selektiv an den Kationenaustauscher adsorbiert. Man kann etwa 45 000 Liter sauren alkoholischen Extrakt auf ein Bett von 450 Liter Kationenaustauscher aufbringen. Dies stellt eine annähernd tausendfache Konzentrierung dar. Das Kationenaustauscherbett mit dem adsorbierten Insulin wird mit 450 Litern 0,1 m-Essigsäure in 65prozentigem Äthanol gewaschen, um restliche Verunreinigungen, wie Enzyme, zu entfernen.

Anschließend wird das Insulin aus dem Kationenaustauscherbett in der Weise eluiert, daß man die Geschwindigkeit der Zentrifuge auf 100 g herabsetzt und dann eine Pufferlösung in 65prozentigem Äthanol von hohem pH-Wert, etwa 6,5 bis 9, zugibt. Beispielsweise stellt eine 0,1 m-Lösung von Chlorwasserstoffsäure £n 65prozentigem Äthanol, die mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Puffer (Tris-Puffer) vom pH 8,2 gepuffert ist, ein bevorzugtes Eluierungsmittel dar. Der Kationenaustauscher wird dann mit der gleichen Lösung gewaschen und wiederum mit 0,1 irr Essigsäure in

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65prozentigern Äthanol ins Gleichgewicht gebracht. Wenn das Insulin in Schlachthöfen adsorbiert worden ist, wird der Kationenaustauscher zusammen mit dem adsorbierten Insulin sofort zu Fabrikationsstätten, beispielsweise der pharmazeutischen Industrie, gesandt, wo das Insulin für eine weitere Bearbeitung eluiert und der Austauscher regeneriert und an die Schlachthöfe zur Wiederverwendung bei späteren sauren alkoholischen Extrakten zurückgesandt wird.

Das aus dem Kationenaustauscher eluierte und auf das 400- bis 10OOfache konzentrierte Insulin wird dann zur weiteren Konzentrierung und Reinigung auf einen Anionenaustauscher gegeben, der in einer Korbzentrifuge angeordnet 1st. Ein bevorzugte: Anionenaustauscher leitet sich von einem dreidimensionalen Polysaccharid-Netzwerk aus vernetzten Dextranketten ab, deren Glucoseeinheiten über Ätherbrücken mit funktionellen Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-araino-äthylgruppen, /"-CH₂H₄N⁺ (C₃H₅) ₂-CH₂CH (OH) CH₃J-Gruppen verbunden sind. Derartige Anionenaustauscher sind unter dem Warenzeichen "QAE Sephadex A-25" im Handel erhältlich. Dieser Anionenaustauscher wird über Nacht mit einer 0,1m-Lösung Trispuffer-hydrochlorid in 65prozentigem Äthanol vom pH 8,2 ins

Gleichgewicht gesetzt. Das Bettvolumen des Anionenaustauschers 'sollte ein Viertel oder 25% des aus dem Kationenaustauscherbett erhaltenen eluierten Volumens an saurem alkoholischem Extrakt betragen, d.h. etwa 100 bis 115 Liter bei einem Kationenaustauscherbettvolumen von etwa 450 Liter.

Während das Insulin an dem Anionenaustauscher adsorbiert ist,

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wird der Alkohol durch Waschen des Austauschers mit wässriger Pufferlösung von einem ungefähren pH 6,5 bis 9,0 entfernt. Eine bevorzugte Pufferlösung ist ein 0,1m Tris-Puffer in Form des Hvdrochlorids vom pH 8,2 ohne Äthanol. 100 bis 200 Liter Tris-Puffer sollten ausreichend sein. Insulin ist gewöhnlich bei hohen pH-Werten instabil. Wenn es jedoch gemäß vorliegender Erfindung an einen Anionenaustauscher adsorbiert ist, ist das Insulin bei hohen pH-Werten innerhalb des angegebenen Bereiches stabil.

Aus dem Anionenaustauscher wird das Insulin mittels 1,0m-Essigsäure vom pH 3,2 bis 3,6 eluiert. Es werden etwa 100 bis 130 Liter benötigt. Die Konzentration des nach der zweiten Konzentrierungsstufe erhaltenen Insulins liegt zwischen 16000 und 64000 mg/1 , wobei 95 bis 99% der Verunreinigungen entfernt sind. Das erhaltene, stabile, konzentrierte und gereinigte Insulin kann dann aus der Essigsäure kristallisiert werden. Es kann auch mittels Gelfiltrationschromatographie auf einen Reinheitsgrad von etwa 99,0 bis 99,9 % weiter gereinigt werden. Der Anionenaustauscher wird wieder ins Gleichgewicht gebracht und ist dann für die nächste Charge aus dem Kationenaustauscher bereit.

Die Ionenaustauscher können in der Korbzentrifuge regeneriert werden, indem man große Volumina regenerierender Pufferlösungen in kurzen Zeiträumen durch die Ionenaustauscherbetten leitet, wodurch man auch sogenannte "low flow"-Ionenaustauscner im industriellen Maßstab anwendbar machen kann.

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Das Verfahren vorliegender Erfindung weist eine Anzahl von Vorteilen gegenüber den üblichen Insulingewinnungsverfahren auf. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entfallen die nachstehenden Stufen:

(1) Wärm einäctL vie rung der pro teoly ti sehen Enzyme,

(2) Abdampfen des Alkohols,

(3) Ausfällen eines Salzkuchens,

(4) Kristallisieren beim isoelektrischen Punkt und

(5) die Zinkacetat-Kristallisation.

Durch Weglassen dieser üblichen Verfahrensmaßnahmen und durch Ersetzen dieser Maßnahmen durch Ionenaustauschverfahren in einer Korbzentrifuge wird eine weit höhere Ausbeute an Insulin erhalten. Durch Weglassen von Verfahrensschritten, bei denen Insulin denaturiert wird, beträgt die Ausbeute 85 bis 95 % im Vergleich zu 40 bis 60 %. Die pankreatischen Enzyme werden nicht nur zu einem früheren Zeitpunkt, d.h. in einer früheren Stufe, ohne das Insulin zu hydrolysieren und unerwünschte Insulin-Nebenprodukte zu bilden, entfernt, sondern man kann diese Enzyme auch gewinnen. Da diese Enzyme während der Kationenaustauscheradsorption entfernt werden, ist das Insulin stabil und keiner Hydrolyse unterworfen. Dies ermöglicht die Durchführung der ersten Kationenaustauscheradsorption in Schlachthöfen, das Weglassen eines Frierens und Auftauens der Bauchspeicheldrüsen, was mit einem Verlust mit Insulin verbunden ist , und das anschließende Verarbeiten an Orten, wo pharmazeutische Insulin-Präparate hergestellt werden. Der Kationenaustauscher kann von dem pharmazeutischen Werk regeneriert und den Pankreas-Lieferbetrieben für eine weitere Insu-

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lingewinnung zugeführt werden.

Selbstverständlich sind zahlreiche Modifikationen und Variationen des Verfahrens vorliegender Erfindung möglich. Das gegebene Beispiel stellt lediglich eine bevorzugte Ausführungsform dar.

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Beiblatt

saurer alkoholischer Insulin-Extrakt vom pH 2,8 (65prozentiges Äthanol)

L 707 C

gegebenenfalls Neutralisation auf pH 8,2 mittels 20prozentiger NaOH

FiItrat

Rückstand verworfen

Ansäuern auf pH 3,2 mittels 8,5n-Schwefelsäure

saures alkoholisches Filtrat (Volumen 380 000 Liter)

Kationenaustauscher

pH 3,6 lm-Essigsäure in 65prozentigem Äthanol

(Volumen 3200 Liter)

O,lm-tris-HCl-Pufferlösung vom pil. 6,2 (65prozentiges Äthanol)

alkoholisches Insulin-Konzentrat (Volumen 4000 Liter) Enzym-Gewinnung (380320 Liter, pH 3,2 65prozentiges Äthanol)

Anionenaustauscher

pH 8,2 , ο,Ιΐα-Tris-HCl-Pufferlösung (65prozentiges Äthanol)

I

\,Om-Essigsäure

Insulin-Konzentrat (Volumen 1000 Liter) Proteine verworfen (4320 Liter , pH 8,2 65prozentiges Äthanol)

Claims (17)

Patentansprüche

1. Ve

Verfahren zum Stabilisieren, Konzentrieren und Reinigen von Insulin, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:

(a) Herstellen eines alkoholischen Extrakts mit niedrigem sauren pH-Wert von zerkleinertem homogenisiertem Bauchspeicheldrüsengewebe ,

(b) ein erstes Stabilisieren, Konzentrieren und Reinigen des Insulins durch Inberührungbringen des alkoholischen Extrakts mit niedrigem sauren pH-Wert mit einem sauren Kationenaustauscher, Adsorbieren des Insulins an den Kationenaustauscher, Waschen mit einer wässrigen Lösung mit niedrigem pH-Wert und Abtrennen des Alkohols und der pankreatisehen Enzyme vom Kationenaustauscher,

(c) Eluieren des stabilisierten, konzentrierten und gereinigten adsorbierten Insulins aus dem Kationenaustauscher mittels einer gepufferten alkoholischen Lösung von hohem pH-Wert,

(d) ein zweites Konzentrieren und Reinigen des in dem Eluierungsmittel aus dem Kationenaustauscher enthaltenen Insulins durch Inberührungbringen dieser alkoholischen Insulinlösung mit hohem pH-Wert mit einem basischen Anlonenaustauscher, Adsorbieren des Insulins an dem Austauscher und Abtrennen des alkoholischen Eluierungsmittels,

(e) Waschen des an den Anionenaustauscher adsorbierten Insulins mittels einer wässrigen Pufferlösung von hohem pH-Wert und Entfernen des restlichen Alkohols und

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(f) Eluieren des weiter stabilisierten, konzentrierten und gereinigten adsorbierten Insulins aus dem Anionenaustauscher mittels einer verdünnten Säure von niedrigem Molekulargewicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennezichnet, daß man zur Herstellung des sauren alkoholischen Extrakts des Bauchspeicheldrüsengewebes ein Gemisch von etwa 65 % Äthanol und etwa 35 % Wasser bei einem pH-Wert von etwa 2,8 verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,

/einen/ /verwendet, dessen/

daß man 7 Kationenaustauscher/Glukoseeinheiten in vernetzten Dextranketten über Ätherbrücken mit funktioneilen Sulfopropylgruppen verbunden sind.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das konzentrierte und gereinigte Insulin aus dem sauren Kationenaustauscher mit einem Gemisch von etwa 65 % Äthanol und etwa 35 % Wasser bei pH-Werten zwischen etwa 6,5 und 9 eluiert.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4,

/einen/ /verwendet,dessen/ dadurch gekennzeichnet, daß man / Anionenaustauscher/Glukoseeinheiten in vernetzten Dextranketten über Ätherbrücken mit funktioneilen Diäthyl-(2-hydroxy-propyl)-amino-äthyl-Gruppen verbunden sind.

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6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Anionenaustauscher mit
einer wässrigen Pufferlösung von einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 9 wäscht.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Insulin aus dem Anionenaustauscher mit etwa lm-Essigsäure eluiert.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bauchspeicheldrüsengewebe Gewebe von frisch exzidierten Bauchspeicheldrüsen verwendet.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Ionenaustausch in einer Korbzentrifuge durchführt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die
folgenden Stufen:

(a) Herstellen eines Extrakts von zerkleinertem homogenisiertem Bauchspeicheldrüsengewebe mit einem Gemisch von etwa 65 % Äthanol und 35 % Wasser bei einem pH-Wert von etwa 2,8 ,

(b) ein erstes Stabilisieren, Konzentrieren und Reinigen des Insulins durch Inberührungbringen des alkoholischen Extrakts mit niedrigem saurem pH-Wert mit einem sauren
Kationenaustauscher in Form einps dreidimensionalen PoIygaccharid-^etzwerks aus vernetzten Dextranketten,

- Vir-

deren Glucoseeinheiten über Ätherbrücken mit funktionellen SuIfopropy1-Gruppen verbunden sind, in einer Korbzentrifuge, Adsorbieren des Insulins an den Kationenaustauscher, Waschen mit einer wässrigen Lösung mit niedrigem pH-Wert und Abschleudern des abgetrennten Alkohols und der pankreatischen Enzyme,

(c) Eluieren des stabilisierten, konzentrierten und gereinigten adsorbierten Insulins aus dem Kationenaustauscher mittels eines Gemisches von etwa 65 % Äthanol und 35 % Wasser bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 9,

(d) ein zweites Konzentrieren und Reinigen des in dem Eluierungsmittel aus dem Kationenaustauscher enthaltenen Insulins durch Inberührungbringen dieser alkoholischen Insulinlösung mit hohem pH-Wert mit einem basischen Anionenaustauscher in-Form eines dreidimensionalen Polysaccharid-Netzwerks ai'Q vprnot-zten Dextranketten, deren Glucose-

elhheit'en über Ätherbrücken mit funktioneilen Diäthyl-(2-hydroxy-propyl)-amino-äthy1-Gruppen verbunden sind, in einer Korbzentrifuge, Adsorbieren des Insulins an den Austauscher und Abschleudern des Alkohols,

(e) Waschen des an den Anionenaustauscher adsorbierten Insulins mit einer wässrigen Pufferlösung vom pH-Wert von etwa 6,5 bis 9 und Entfernen des restlichen Alkohols und

(f) Eluieren des stabilisierten, konzentrierten und gereinigten Insulins aus dem Anionenaustauscher mittels einer verdünnten Säure von niedrigem Molekulargewicht.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Bauchspeicheldrüsengewebe von frisch exzidierten Bauchspeicheldrüsen verwendet.

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12. Verfahren zum Stabilisieren und Konzentrieren von Insulin aus frisch exzidlerten Bauchspeicheldrüsen zum Versand und zum Lagern für eine anschließende Reinigung und weitere Konzentrierung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:

(a) Herstellen eines alkoholischen Extrakts mit niedrigem sauren pH-Wert von zerkleinertem homogenisiertem, frisch exzidierten Bauchspeicheldrüsengewebe,

(b) Konzentrieren des Insulins durch Inberührungbringen des Extrakts mit einem sauren Kationenaustauscher, Adsorbieren des Insulins an den Kationenaustauscher und Abtrennen des Alkohols und der pankreatisehen Enzyme und

(c) Entfernen des Kationenaustauschers mit dem adsorbierten stabilisierten, konzentrierten und teilweise gereinigten Insulins und Verpacken zum Versand und zur Lagerung.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt von frisch exzidiertem Bauchspeicheldrüsengewebe mittels eines Gemisches von etwa 65 % Xthanol und 35 % Wasser bei einem pH-Wert von etwa 2,8 herstellt.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 12 oder 13, dadurch gekenn-

/elnen/ /verwendet,dessen/

zeichnet, daß man 7 Kationenaustauschei/Glukoseeinheiten i_n vernetzten Dextranketten über Ätherbrücken mit funktioneilen SuIfopropylgruppen verbunden sind ·

15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus der ersten Insulinkon-

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zentrierungsstufe abgetrennten pankreatischen Enzyme isoliert.

16. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man den Ionenaustausch in einer Korbzentrifuge durchführt.

17. Verfahren zum Stabilisieren, Konzentrieren und teilweisen Reinigen von Insulin aus frisch exzidierten Bauchspeicheldrüsen für eine weitere Reinigung undKonzentrierung nach den Ansprüchen 1 bis 16, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:

(a) Herstellen eines alkoholischen Extraktes mit niedrigem sauren pH-Wert von zerkleinertem homogenisertem, frisch exzidiertem Bauchs\>eicheldrüsengewebe, wobei der Extrakt Insulin und andere Bestandteile enthält, die das Insulin zersetzen können,

(b) Herstellen eines kompakten Bettes eines sauren Kationenaustauschers, der Insulin zu adsorbieren und die das Insulin zerstörenden Bestandteile nicht zu adsorbieren vermag,

(c) Stabilisieren und Konzentrieren des Insulins durch Leiten des Extrakts durch das kompakte Bett des Kationenaustauschers zur Abtrennung des rohen Insulins aus dem Extrakt und Adsorbieren an den Austauscher,

(d) Waschen des Bettes mit einer wässrigen Lösung von niedrigem pH-Wert zum Entfernen des Alkohols und der das Insulin zerstörenden Bestandteile und

(e) Eluieren des erhaltenen stabilisierten, konzentrierten und

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teilweise gereinigten adsorbierten Insulins aus dem Kationenaustauscher mittels einer wässrigen Lösung von hohem pH-Wert für eine weitere Reinigung.

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