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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von Elastase aus einer Elastase enthaltenden Lösung, die durch eine Aktivierungsbehandlung des Schweinepankreas erhalten wurde.
Elastase ist in der Form ihres Vorproduktes in der Bauchspeicheldrüse von Säugetieren vorhanden. Um Elastase beispielsweise aus Schweinepankreas zu gewinnen, wird das Elastase-Vorprodukt gewöhnlich aktiviert, um es in Elastase überzuführen, welche sodann extrahiert wird. Die Aktivierung erfolgt entweder durch Erhitzen des zerkleinerten frischen Pankreas zwecks Erzielung der Autolyse oder durch eine Behandlung durch Zusatz von Säugetierzwölffingerdarm oder eines Extraktes des Zwölffingerdarmes, von Trypsin oder einer Trypsin enthaltenden Substanz, wie Pankreatin, von Äthanol, Aceton oder Isopropylalkohol.
Die auf diese Weise aktivierte Elastase wird aus der Lösung nach der Aktivierungsbehandlung gewöhnlich durch Zusatz einer wässerigen Lösung beispielsweise eines Acetatpuffers, Filtration des Gemisches zwecks Gewinnung einer klaren Lösung und Aussalzen der Lösung mit Ammoniumsulfat extrahiert. Bei der herkömmlichen Verfahrensweise ist es also notwendig, für die Fällung der Elastase auszusalzen und vorher den Extrakt zu filtrieren, um eine möglichst klare Lösung zu erhalten, so dass der Aussalzvorgang ermöglicht wird.
Beispielsweise wird gemäss einer bekannten Verfahrensweise die Elastaselösung mit einer Acetatpufferlösung nach der Aktivierung behandelt, worauf eine grosse Menge eines Filterhilfsmittels zugesetzt und die Lösung zwecks Gewinnung einer möglichst klaren Lösung filtriert wird, wonach Ammoniumsulfat bis zu einer 45%igen Sättigung hinzugefügt und das Gemisch ausgesalzen wird. Die Arbeitsweise zur Gewinnung der klaren Lösung ist an sich äusserst schwierig, da das Pankreas eine grosse Menge an Fett enthält.
Eine solche Vorgangsweise eignet sich demnach nicht für die Massenproduktion. Ein weiterer äusserst ernster Nachteil ist der, dass die Gewinnung von Elastase durch Aussalzen in sehr niedrigen Ausbeuten von weniger als etwa 60 bis 70%, bezogen auf die aktivierte Elastase erfolgt. Die grosse Menge des Restmaterials wird bei dem bekannten Verfahren als nicht extrahierbares Material verworfen. Das bekannte Gewinnungsverfahren konnte daher nicht als ein industriell befriedigender Prozess betrachtet werden.
In Anbetracht dieser Umstände wurden seitens der Patentinhaberin intensive Forschungsarbeiten durchgeführt, mit dem Ziel, ein Verfahren zur Gewinnung von Elastase mittels einer einfachen chemischen Arbeitsweise ohne der Erfordernis einer schwierigen Klärung oder komplizierten Aussalzung zu entwickeln.
Denmach betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Elastase durch Fällung der Elastase aus einer Elastase enthaltenden Lösung, die durch eine Aktivierungsbehandlung von Schweinepankreas erhalten wurde, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der Lösung ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel in einer Menge, dass die Konzentration des Lösungsmittels im Bereich von 30 bis 80 Vol./Vol.-%, bezogen auf die das Lösungsmittel enthaltende Lösung, liegt, zugesetzt wird.
Die Erfindung wird in der Folge näher beschrieben.
Der Ausdruck "Schweinepankreas" umfasst nicht nur das Pankreas des Schweines an sich, sondern auch den Rückstand, erhalten nach der Extraktion von Insulin aus dem Schweinepankreas, den Rückstand, erhalten nach der Extraktion von Kallikrein aus dem Schweinepankreas und Materialien, die sich vom Schweinepankreas ableiten, wie z. B. entfettetes Pankreas. Aus diesen Ausgangsmaterialien kann eine Elastase enthaltende Lösung durch die Aktivierungsbehandlung erhalten werden.
Bei der Aktivierungsbehandlung wird vorzugsweise das Pankreas mittels einer Fleischmaschine oder durch Gefrierpulverisierung so fein wie möglich zerkleinert. Es ist jedoch auch möglich, das Pankreas direkt ohne Zerkleinerung zu aktivieren. Bekannte Aktivierungsbehandlungen sind die autolytische Behandlung, die enzymatische Behandlung und die Behandlung mit organischen Lösungsmitteln. Insbesondere sind der Zusatz von Zwölffingerdarm von Säugetieren oder eines Zwölffingerdarmextraktes, von Trypsin, Pankreatin, Äthanol, Aceton oder Isopropylalkohol sowie die Autolyse durch Erhitzen bekannt. Im erfindungsgemässen Verfahren können diese bekannten Aktivierungsbehandlungen direkt angewendet werden.
In vorteilhafter Weise kann die Behandlung beispielsweise nach der in der Beschreibung der offengelegten JP-PS Nr. 61287/77 beschriebenen Methode durchgeführt werden, gemäss welcher
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der Zwölffingerdarm von Schweinen zum frischen Schweinpankreas hinzugefügt und das Gemisch bei einem PH von 7 bis 7, 5 stehengelassen wird. Im Falle der Aktivierung durch Zusatz eines organischen Lösungsmittels wird vorzugsweise dasselbe Lösungsmittel wie das, das in der nachfolgenden Fällung verwendet wird, eingesetzt.
Gemäss einer weiteren Methode wird eine entsprechende Menge an Wasser oder einer verdünnten Salzlösung zum zerkleinerten Ausgangsmaterial direkt oder nach der Aktivierungsbehandlung hinzugefügt, um eine Suspension zu erhalten, welche sodann gewünschtenfalls mit einem Filterhilfsmittel versetzt wird, um grobe Fasersubstanzen vorher zu entfernen. Durch diese Behandlung wird die nachfolgende Fällung der Elastase erleichtert. Das Wasser oder die verdünnte Salzlösung können in einer solchen Menge zugesetzt werden, dass nur grobe Faserstoffe entfernt werden.
Diese Menge liegt dabei bei 0, 5 bis 2 Vol.-Teilen pro Vol.-Teil Ausgangsmaterial oder behandeltes Material. Das Filterhilfsmittel wird verwendet, um das Zusammenballen der Faserstoffe zu beschleunigen. Zu diesem Zweck ist Diatomeenerde (Kieselgur) am meisten geeignet, für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens jedoch ist dieser Verfahrensschritt nicht unbedingt erforderlich, so dass die Erfindung durch diesen Verfahrensschritt nicht eingeschränkt wird.
Unmittelbar nach der Aktivierungsbehandlung kann zum Zwecke der Entfettung ein geeignetes organisches Lösungsmittel zugesetzt werden, jedoch ist auch dieser Arbeitsgang für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens nicht unbedingt erforderlich und daher auch nicht einschränkend.
Die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzten wasserlöslichen organischen Lösungsmittel sind die, welche mit Wasser in jedem gewünschten Verhältnis unter Bildung einer durchsichtigen Lösung mischbar sind. Konkrete Beispiele solcher Lösungsmittel sind Aceton, Äthanol, Isopropylalkohol usw. Ein besonders bevorzugtes Lösungsmittel ist Aceton.
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zu entnehmen ist. Erfindungsgemäss wird das wasserlösliche organische Lösungsmittel der aktivierten, Elastase enthaltenden Lösung zugesetzt, um Elastase zu fällen. Wenn die Konzentration des wasserlöslichen organischen Lösungsmittels weniger als 30 Vol./Vol.-%, bezogen auf die das Lösungsmittel enthaltenden Lösung enthält, so erfolgt keine Fällung der Elastase. Die für die Fällung erforderliche Menge beträgt daher wenigstens 30 Vol./Vol.-%.
Ist hingegen die Konzentration höher als 80 Vol./Vol.-%, so werden die in der Lösung enthaltenen Proteine und Peptide ebenfalls zusammen mit der Elastase gefällt und beeinträchtigen dadurch stark die Reinheit der Elastase. Aus diesen Gründen soll die Konzentration des wasserlöslichen organischen Lösungsmittels im Bereich von 30 bis 80 Vol./Vol.-%, vorzugsweise von 50 bis 70 Vol./Vol.-5, liegen.
Die Methode der Fällung ist keinen besonderen Beschränkungen unterworfen. Beispielsweise wird das wasserlösliche organische Lösungsmittel bis zur Einstellung der Konzentration auf einen gegebenen Wert zugesetzt, worauf das Gemisch beispielsweise 1 h lang gerührt wird, um eine die Elastase enthaltende Fällung zu bilden, welche abfiltriert wird. Alternativ kann die Fällung neuerlich in Wasser gelöst und ein Filterhilfsmittel, wie Diatomeenerde zur Lösung hinzugefügt werden, wonach das Gemisch filtriert wird, um eine Elastase enthaltende Lösung zu erhalten, welche neuerlich mit einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel versetzt wird, wobei die Konzentration des wasserlöslichen organischen Lösungsmittels auf einen Bereich von 30 bis 80 Vol./Vol.-%, bezogen auf die resultierende Lösung, eingestellt wird, um das gewünschte Produkt zu fällen.
Das erfindungsgemässe Verfahren umfasst daher auch die wiederholte Fällungsbehandlung der Elastase enthaltenden Lösung.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Elastasefällung wird mehrmals mit dem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel gewaschen und vakuumgetrocknet, um die Elastase als Trockenprodukt abzutrennen.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Rohelastase kann im Zuge geeigneter Reinigungsmethoden weiter gereinigt werden. Für die Fällung kann beispielsweise eine Methode angewendet werden, die in der japanische Patentveröffentlichung Nr. 21557/75 beschrieben ist, gemäss welcher das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Trockenprodukt in einer wässerigen Lösung vom PH 5 bis 10 gelöst und die Lösung länger als 1 h bei 5 bis 50 C stehen-
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gelassen wird, wonach sie ausgesalzen und die resultierende Fällung entsprechend gereinigt und gefriergetrocknet wird. Diese Reinigungsstufe wird durchgeführt, wenn hochreine Elastase gefordert wird, sie ist jedoch unnötig, wenn die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Rohelastase den Anforderungen entspricht.
Durch die Reinigungsstufe wird somit das erfindungsgemässe Verfahren nicht eingeschränkt.
Die Erfindung wird durch die folgenden Vergleichbeispiele und Versuchsbeispiele näher erläutert.
Vergleichsbeispiel 1 :
Proben
1. Probe gemäss der Erfindung :
Ein nach dem folgenden Beispiel 1 erhaltenes Trockenprodukt wurde als Probe verwendet.
2. Die Kontrollprobe wurde nach folgendem herkömmlichen Verfahren erhalten :
1 kg Schweinepankreas wurde zerkleinert und mit 200 ml Wasser und 7 g Pankreatin versetzt. Sodann wurden 5 ml einer 40%igen wässerigen Natriumhydroxydlösung hinzugefügt und das Gemisch heftig gerührt. Es wurde zur Durchführung der Aktivierung 2 h lang bei 170C stehengelassen. Hierauf wurden 3 1 einer 0, 1 mAcetatpufferlösung (PH 4, 8) zugesetzt und wurde das Gemisch 4 h lang gerührt und sodann über Nacht stehengelassen. Die Flüssigkeit wurde mit 300 g Celite versetzt und gerührt und sodann filtriert. Der Filtrationsrückstand wurde zum Zwecke der Extraktion mit 2 1 des Acetatpuffers (PH 4, 8) versetzt. Nach der Filtration wurden die Filtrate vereinigt (4, 5 1). Es wurde Ammoniumsulfat bis zu einer 45%igen Sättigung zugesetzt.
Nach dem Aussalzen wurde das resultierende Präzipitat abfiltriert und vakuumgetrocknet. Das resultierende Trockenprodukt wurde als Kontrollprobe verwendet.
Methode und Ergebnisse :
Die Elastaseaktivitäten der Probe gemäss der Erfindung und der Kontrollprobe wurden unter Verwendung von Succinyltrialanin-p-nitroanilid als Substrat ermittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
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<tb>
<tb> Probe <SEP> Trockengewicht <SEP> Elastase-Erhaltene
<tb> (g) <SEP> Aktivität <SEP> Gesamteinheiten
<tb> (Einheit/mg)
<tb> Erfindungsgemässe
<tb> Probe <SEP> 105 <SEP> 1, <SEP> 11 <SEP> 116,500
<tb> Kontrolle <SEP> 88 <SEP> 1,00 <SEP> 88,000
<tb>
Die Tabelle 1 zeigt, dass im Vergleich zum herkömmlichen Verfahren mit dem einfachen und leicht durchführbaren chemischen Verfahren gemäss der Erfindung eine höhere Ausbeute erzielt werden kann.
Vergleichsbeispiel 2 :
Proben :
1. Probe gemäss der Erfindung : Filtrat, erhalten durch die Rohfiltration im Versuchsbei- spiel 1.
2. Kontrollprobe erhalten nach den folgenden herkömmlichen Verfahren :
Ein Gesamtfiltrat, erhalten durch Vereinigung der Filtrate, die bei der Herstellung der Kontrollprobe im Vergleichsbeispiel 1 gewonnen wurden.
Verfahren und Ergebnisse :
Die Elastaseaktivitäten wurden in derselben Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 ermittelt.
Die Ergebnisse sind der Tabelle 2 zu entnehmen.
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Tabelle 2
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<tb>
<tb> Probe <SEP> Filtratmenge <SEP> Elastase-Erhaltene
<tb> (1) <SEP> Aktivität <SEP> Gesamteinheiten
<tb> (Einheit/mg)
<tb> Erfindungsgemässe
<tb> Probe <SEP> 1,8 <SEP> 67,2 <SEP> 120,960
<tb> Kontrolle <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 20, <SEP> 8 <SEP> 93, <SEP> 600 <SEP>
<tb>
Die Tabelle 2 zeigt, dass die nach dem erfindungsgemässen Verfahren bereits in der Extraktionsstufe erzielten Ausbeuten höher waren als die Ausbeuten nach dem herkömmlichen Verfahren.
Versuchsbeispiel 1 : 2, 4 I Wasser und 17 g Pankreatin wurden zu 2, 4 kg zerkleinertem Schweinepankreas hinzugefügt. Hierauf wurden 12 ml einer 40%igen wässerigen Natriumhydroxydlösung zugesetzt und das
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dass die Acetonkonzentration auf 0,20, 30,40, 50,60, 70 bzw. 80 Vol./Vol.-% eingestellt wurde. Nach 1 h langem Stehenlassen bei 250C wurde die resultierende Fällung abfiltriert. Die jeweiligen Fällungen wurden in wässerigen Acetonlösungen mit derselben Konzentration wie die in der Fällungsstufe suspendiert. Die resultierenden Fällungen wurden neuerlich abfiltriert. Die Elastaseaktivitäten der Fällungen wurden unter Verwendung von Succinyltrialanin-p-nitroanilid als Substrat ermittelt.
Die Ausbeuten an Elastase in den jeweiligen Fällungen wurden aus der so erhaltenen Elastaseaktivität und aus der Akivität der Elastase im Filtrat errechnet.
Ergebnisse :
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengefasst. Dieser Tabelle ist zu entnehmen, dass bei der Fällung von Elastase aus einer Elastase enthaltenden wässerigen Lösung, erhalten durch die Aktivierungsbehandlung von Schweinepankreas, die Elastasefällung bei einer Acetonkonzentration von 30 bis 40 Vol./Vol.-% beginnt und im wesentlichen bei einer Konzentration von 60 Vol./Vol.-% beendet ist.
Eine Acetonkonzentration von mehr als 80 Vol./Vol.-% ist nicht vorteilhaft, weil dadurch grössere Mengen an zugegenem Protein und Peptiden ebenfalls gefällt werden.
Tabelle 3
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<tb>
<tb> Aceton-Konzentration <SEP> Ausbeute <SEP> an <SEP> Elastomeren <SEP> im
<tb> Vol./Vol.-% <SEP> Präzipitat, <SEP> Gew.-%
<tb> 0 <SEP> 0
<tb> 20 <SEP> 2
<tb> 30 <SEP> 2
<tb> 40 <SEP> 35
<tb> 50 <SEP> 83
<tb> 60 <SEP> 99
<tb> 70 <SEP> 99
<tb> 80 <SEP> 100
<tb>
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1 : 200 ml Wasser und 7 g Pankreatin wurden zu 1 kg zerkleinertem Schweine-
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zugesetzt und das Gemisch 1 h lang gerührt. Die Acetonschicht wurde entfernt und die resultierende Fällung mit 1, 2 l Wasser versetzt, wonach das resultierende Gemisch 2 h lang gerührt wurde.
Hierauf wurden 10 g Diatomeenerde zugegeben und wurde das Gemisch einer Rohfiltration unterworfen, wobei 1, 8 l Filtrat erhalten wurden. Das Filtrat wurde mit Aceton bis zu einer Acetonkonzentration von 60 Vol./Vol.-% versetzt und die resultierende Fällung abfiltriert. Die Fällung wurde hierauf 3mal mit 1, 5 l Aceton gewaschen und sodann im Vakuum zu einem Trockenprodukt getrocknet.
Ausbeute : 105 g.
Aktivität : 1, 11 Einheiten/mg
Beispiel 2 : 10 l Wasser und 70 g Pankreatin wurden zu 10 kg zerkleinertem Schweinepankreas hinzugefügt, wonach 50 ml 40%ige wässerige Natriumhydroxydlösung zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde gerührt und 2 h lang bei 35 C stehengelassen, um die Aktivierung herbeizuführen. Hierauf wurde Aceton bis zu einer Konzentration von 30 Vol./Vol.-% hinzugefügt und 100 g Diatomeenerde zum Gemisch hinzugegeben, welches einer Rohfiltration unterworfen wurde. Das Rohfiltrat wurde mit Aceton bis zu einer Konzentration von 60 Vol./Vol.-% versetzt und die resultierende Fällung abfiltriert. Die Fällung wurde 3mal mit 15 l Aceton gewaschen und vakuumgetrocknet, wobei 1, 2 kg eines Trockenproduktes erhalten wurden.
Aktivität : 0, 93 Einheiten/mg.
Das so erhaltene Trockenprodukt kann gewünschtenfalls in folgender Weise weiter gereinigt
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hinzugefügt. Das Gemisch wurde 1 h lang gerührt und sodann 20 h lang bei 20 C stehengelassen. Hierauf wurden 700 g Diatomeenerde zum Gemisch hinzugefügt und das Gemisch filtriert. Das Filtrat wurde mit Ammoniumsulfat bis zu einer 40%igen Sättigung versetzt, um das Produkt auszusalzen. Das ausgesalzte Produkt wurde abfiltriert und 370 g des so erhaltenen Produktes wurden in 3, 7 l 0, 1 m Carbonatpufferlösung (PH 7, 0) gelöst. Die Lösung wurde filtriert, wobei eine klare Lösung erhalten wurde, die 3 Tage lang gerührt wurde, um Elastasekristalle zu erhalten. Die Kristalle wurden entsalzt und sodann gefriergetrocknet, wobei 35 g eines Trockenproduktes erhalten wurden.
Elastin-hydrolytische Aktivität : 165 Einheiten/mg.
Beispiel 3 : 4 l einer 50 Vol./Vol.-% wässerigen Acetonlösung wurden zu 10 kg zerkleinertem Schweinepankreas hinzugefügt und das Gemisch 16 h lang bei 10 C stehengelassen, um die Aktivierung herbeizuführen. Sodann wurde Aceton bis zu einer Konzentration von 70 Vol./Vol.-% hinzugefügt und das Gemisch 1 h lang gerührt. Die Acetonschicht wurde entfernt, wobei 12 kg einer Fällung erhalten wurden, welche mit 13 l Wasser versetzt wurde. Das Gemisch wurde 2 h lang gerührt und sodann mit 100 g Diatomeenerde versetzt, worauf das Gemisch einer Rohfiltration unterworfen wurde. Aceton wurde zum Rohfiltrat bis zu einer Konzentration von 70 Vol./Vol.-% hinzugefügt und die resultierende Fällung abfiltriert.
Die Fällung wurde mit 15 l Aceton 3mal gewaschen und vakuumgetrocknet, wobei 1, 15 kg eines Trockenproduktes erhalten wurden.
Aktivität : 0, 97 Einheiten/mg.
Erforderlichenfalls können 1, 2 kg des erhaltenen Trockenproduktes in der in der Reinigungsstufe gemäss Beispiel 2 beschriebenen Weise gereinigt werden. Dabei werden 33 g gefriergetrocknete Elastasekristalle erhalten.
Elastinhydrolytische Aktivität : 175 Einheiten/mg.
Beispiel 4 : 4 l einer 50 Vol./Vol.-% wässerigen Äthanollösung wurden zu 10 kg zerkleinertem
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200 g Diatomeenerde hinzugefügt und das Gemisch einer Rohfiltration unterworfen. Das Rohfiltrat wurde mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 60 Vol./Vol.-% versetzt und die gebildete Fällung abfiltriert. Die Fällung wurde sodann in einer 60 Vol./Vol.-% wässerigen Äthanollösung suspendiert und die Suspension filtriert. Die abfiltrierte Fällung wurde 3mal mit 15 l Aceton ge-
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waschen und sodann vakuumgetrocknet, wobei 1 kg eines Trockenproduktes erhalten wurde.
Aktivität : 1, 12 Einheiten/mg.
Das resultierende Trockenprodukt kann erforderlichenfalls nach der folgenden Verfahrensweise weiter gereinigt werden : 10 l einer 0, 1 m Kaliumdihydrogenphosphatlösung wurden zu 1 kg des Trockenproduktes hinzugefügt. Das Gemisch wurde 2 h lang bei 35 C gerührt und sodann mit 500 g Diatomeenerde versetzt, wonach das Gemisch filtriert wurde. Das Filtrat wurde mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 45% versetzt und nach dem Aussalzen wurde das Produkt abfiltriert. 350 g des erhaltenen Produktes wurden in einer 0, 1 m Carbonatpufferlösung (PH 7, 0) gelöst. Die Lösung wurde filtriert, wobei eine klare Lösung erhalten wurde, die 3 Tage lang gerührt wurde, um Elastasekristalle zu erhalten.
Die Kristalle wurden abfiltriert, entsalzt und gefriergetrocknet, wobei 33 g eines Trockenproduktes erhalten wurden.
Elastin-hydrolytische Aktivität : 168 Einheiten/mg.
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Aktivierung herbeizuführen. Hierauf wurde Isopropylalkohol bis zu einer Konzentration von 80 Vol./Vol.-% zugesetzt. Nach 1 h langem Rühren wurde die Isopropylalkoholschicht entfernt, wobei 12 kg einer Fällung erhalten wurden. Die Fällung wurde mit 13 l Wasser versetzt und das Gemisch 2 h lang gerührt, worauf 100 g Diatomeenerde zugesetzt wurden und das Gemisch einer Rohfiltration unterworfen wurde. Das Filtrat wurde mit Isopropylalkohol bis zu einer Konzentration von 70 Vol./Vol.-% versetzt und die resultierende Fällung abfiltriert. Die Fällung wurde weiters 2mal mit 15 l Isopropylalkohol gewaschen und vakuumgetrocknet, um 1, 2 kg eines Trockenproduktes zu erhalten.
Aktivität : 1, 02 Einheiten/mg.
1, 2 kg des erhaltenen Trockenproduktes können gegebenenfalls weiter nach dem Reinigungsverfahren gemäss Beispiel 2 gereinigt werden, wobei man 34 g gefriergetrocknete Elastasekristalle erhält.
Elastin-hydrolytische Aktivität : 170 Einheiten/mg.
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rung herbeizuführen. Das aktivierte Pankreas wurde zerkleinert und mit 10 l Wasser und 200 g Diatomeenerde vermischt. Das Gemisch wurde einer Rohfiltration unterworfen und das Filtrat mit Aceton bis zu einer Konzentration von 80 Vol./Vol.-% versetzt. Die Acetonschicht wurde entfernt und die Fällung aufgenommen. Die Fällung wurde sodann in 20 l einer 70 Vol./Vol.-% wässerigen Acetonlösung suspendiert. Die Suspension wurde filtriert. Das Gewicht der Fällung (Gemisch) betrug 3, 5 kg.
Aktivität : 0, 34 Einheiten/mg.
Die resultierende Fällung kann gegebenenfalls nach der folgenden Arbeitsweise weiter gereinigt werden : 14 l einer 0, 1 m Phosphatpufferlösung (PH 7, 4) wurden zu 3, 5 kg der Fällung hinzugefügt. Nach Einstellen des PH auf 7, 0 mit 2 n wässeriger Natriumhydroxydlösung wurde das Gemisch 20 h lang bei 200C stehengelassen. Hierauf wurden 700 g Diatomeenerde hinzugefügt und das Gemisch filtriert. Ammoniumsulfat wurde zum Filtrat bis zu einer 40%igen Sättigung zugesetzt, um auszusalzen. 340 g eines abfiltrierten Produktes wurden in 0, 1 m Carbonatpufferlösung (PH 7, 0) gelöst und die Lösung filtriert. Die resultierende klare Lösung wurde 3 Tage lang gerührt, um Elastasekristalle zu erhalten.
Die Kristalle wurden durch Zentrifugieren aufgenommen, entsalzt und gefriergetrocknet, wobei 34 g eines Trockenproduktes erhalten wurden.
Elastin-hydrolytische Aktivität : 178 Einheiten/mg.
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