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Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 Die vorliegende Erfindung
bezieht sich auf die Gewinnung von Vitamin B12.
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Es ist bekannt, daß das Vitamin B1, bisher nur aus den Kulturflüssigkeiten,
die bei der Fermentation gewisser Microorganismen, z. B. des Streptomyces griseus,
erhalten werden, gewonnen wurde.
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Es wurde nun gefunden, daß das Vitamin B12 in erheblichen Mengen auch
im Mycel von Streptom3,ces griseus und anderen Vitamin-B12-erzeugenden Organismen
enthalten ist und aus diesen. in einfacher und wirtschaftlicher Weise gewonnen werden
kann.
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Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Gewinnung
von Vitamin B12 durch Fermentation von Vitamin-B12-bildenden Organismen, z. B. Streptomyces
griseus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Gärung zum Abschluß gebracht wird,
ehe eine wesentliche Autolyse der Zellen stattgefunden hat, worauf das Mycel von
der Kulturflüssigkeit abgetrennt, mit heißem Wasser ausgelaugt und der wäßrige Extrakt
gegebenenfalls in an sich bekannter Weise, z. B. durch Anwendung von Absorbentien,
weitergereinigt wird.
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Für die Fermentierung, die in üblicher Weise durchgeführt wird, kann
irgendein bekanntes, für die Kultur der betreffenden Organismen geeignetes Nährmedium
verwendet werden. Der Gärprozeß wird so lange unterhalten, bis in der Kultur ein
Höchstgehalt an Vitamin B12 erreicht ist und Verluste durch eine Autolyse der Zellstruktur
des
Mycels in einem wesentlichen Ausmaß noch nicht eingetreten sind.
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Die Gärzeit hängt von den besonderen Umständen und Bedingungen der
Gärung ab und wird z. B. durch die Art des Organismus, seine Familie und den benutzten
Stamm, von der Zusammensetzung des Kulturmediums, dem pg, der Temperatur, vom Druck
und dem Ausmaß der Belüftung u. dgl. beeinfluß t.
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Die günstigsten Bedingungen lassen sich leicht durch eine Versuchsgärung
feststellen, wenn man in gewissen Zeitabständen Proben der zieht, die möglichst
gleichmäßig vermischt sein sollen. Das Mycel wird abgetrennt und das Vitamin B12
daraus extrahiert. Eine Prüfung zeigt, ob bereits eine Autolyse stattgefunden hat.
Die Bestimmung des Vitamin-B12 Gehaltes gibt dann einen Anhalt dafür, welches die
günstigste Gärzeit für das betreffende Verfahren ist. .
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Das Mycel wird nun, sobald die günstigsten Bedingungen festliegen,
von der Kulturbrühe z. B. durch Zentrifugieren, Filtrieren od. dgl. abgetrennt und
mit heißem Wasser ausgezogen. Dies kann beispi-elsweise so durchgeführt werden,
daß man das Mycel mit heißem oder kaltem Wasser aufschlämmt, dann unmittelbar oder
mittelbar mit Dampf auf eine Temperatur von etwa ioo° erhitzt und diese Temperatur
ungefähr io Minuten aufrechterhält. Das Mycel wird dann von der wäßrigen Phase abgeschieden
und diese zur Gewinnung des Vitamins B12 weiterverarbeitet oder gegebenenfalls konzentriert.
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Der so erhaltene Mycelextrakt wird dann in bekannter Weise zur Gewinnung
von Vitamin B12 oder anderer wertvoller Produkte aufgearbeitet.
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Die Lösung wird z. B. mit einem mit Wasser praktisch nicht mischbaren
organischen Lösungsmittel ausgezogen, dieser Auszug einer geeigneten Absorptionssäule
zugeleitet und das wirksame Material mit einem wasserhaltigen organischen Lösungsmittel
von der Säule eluiert. Die aktive Substanz kann dann aus dieser Lösung z. B. durch
Einengen im Vakuum gewonnen werden. Als organische Lösungsmittel für die Extraktion
des Vitamins B12 aus seinen wäßrigen Lösungen sind z. B. n-Butylalkohol, Isobutylalkohol
oder Amylalkoh.ol geeignet.
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Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird
die Masse des bei der Gärung erhaltenen Streptomyces griseus zerkleinert .und mit
heißem Wasser ausgezogen. Der heiße wäßrige Auszug wird bis auf ein Zehntel seines
ursprünglichen Volumens unter verringertem Druck eingeengt und das erhaltene wäßrige
Konzentrat mit einem proteolytischen Enzym, wie z. B. Papain, Trypsin, Pankreati.n
od. dgl., verdaut. Nach der Filtration wird die anfallende Lösung mit feuchtem n-Butylalkohol,
vorzugsweise in einem Gegenstromextraktionsapparat, extrahiert und der Butylalkoholauszug
nach dem Einengen unter verringertem Druck auf eine Aluminiumoxydsäule gegeben,
das Chromatogramm mit wäßrigem Äthylalkohol entwickelt und der wirksame, von der
Säule eloxierte Anteilunter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der so
gewonnene feste Rückstand wird dann aus wasserhaltigem Aceton umkristallisiert.
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Die Lösung des Vitamins Bit im organischen Lösungsmittel kann mehrere
Male ehromatographiert werden, um .eine möglichst weitgehende Reinigung zu erzielen.
In ähnlicher Weise kann man das durch Kristallisation erhaltene Material abermals
aus wäßrigem Aceton oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel umkristallisieren.
Eine Reinigung der das Vitamin B12 enthaltenden Lösungen kann auch dadurch erreicht
werden, daß man sie mit Anionen- und/oder Kationenaustauscher behandelt. Diese Säulen
absorbieren das Vitamin B12 aus den Lösungen nicht, sondern entfernen lediglich
die sauren oder basischen Verunreinigungen.
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Die das wirksame Material enthaltenden wäßrigen Lösungen, die erfindungsgemäß
behandelt werden, werden auf einen pa-Wert von etwa 6 bis 9 eingestellt.
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In den folgenden Beispielen sind die angeführten Wirksamkeiten des
Vitamins B12 durch die Wachstumsbeeinflussung des Lactobacillus lactis Dorn-er unter
Versuchsbedingungen, gemäß Journal of Biological Chemistry, Bd. 169, S. 455, 456,
bestimmt worden. Die angegebenen Prozentgehalte sind, wenn nicht anders angegeben,
Gewichtsprozent. Beispiel i Ein wäßriges Medium, das 0,7% Fischmehl, 0,3% getrocknetes
Hefeautolysat, i0/0 Glukose, 0,5 % Natriumchlorid, 0,o25 % Magnesiumsulfat, o,ooi%
Ferrosulfat, o,oo2% Kobaltnitrat und Wasser auf ioo% enthielt, wurde sterilisiert
und mit einer i.o%igen wachsenden Reinkultur von Streptomyces griseus geimpft. Die
Gärung wurde bei 27,7° unter aeroben Bedingungen submers und unter lebhaftem Rühren
durchgeführt, wobei die Belüftung in der Minute ein Raummaß steriler Luft auf je
ein Raummaß Kulturmedium betrug. Die Gärung wurde nach 44 Stunden abgebrochen. Die
Gesamtbrühe belief sich auf annähernd i8oo 1 und enthielt o,28 Millimikrogramm Vitamin
B12 im Kubikzentimeter. Zu den i8oo 1 wurden 29,3 kg Filterhilfe zugesetzt und dies
in einer hölzernen Filterpresse, die mit 22,5 kg Filterhilfe ausgekleidet war, filtriert.
Der Filterkuchen wurde trocken geblasen, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1350
1 angeri'thrt. 2 Stunden mit Direktdampf auf ioo° erhitzt und bei dieser Temperatur
io Minuten gehalten. Das Gemisch wurde abermals durch eine hölzerne Filterpresse
filtriert, wobei man i0621 eines an Vitamin B12 angereicherten Filtrates erhält.
Das Filtrat wurde dann in einem Dünnschichtverdampfer auf i Volumen von 112,51 eingeengt.
Dieses Konzentrat enthielt i80 Millimikrogramm Vitamin B12 im Kubikzentimeter.
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Beispiel e 31501 einer Brühe, die gemäß Beispiel i hergestellt wurde
und die 9,5 Millimikrogramm Vitamin
B12 im Kubikzentimeter enthielt,
wurden mit 47,3 kg Filterhilfe versetzt und, entsprechend Beispiel i, filtriert.
Der Filterkuchen wurde trocken geblasen und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von
1350 1 angerührt. Die erhaltene Mischung wurde mit Direktdampf auf ioo° erwärmt
und abermals filtriert. Es wurden 7o2,1 Filtrat erhalten und diese in einem Dünnschichtverdampfer
auf 67,51 eingeengt. Dieses Konzentrat enthielt 1,2 Mikrogramm Vitamin B12 im Kubikzentimeter.
Beispiel 3 Ein wäßriges Medium, das 0,7% Fischmehl, 0,3'/0 getrocknete autolytisierte
Hefe, i °/o Glukose, o,5 °/o Natriumchlorid, o,ooi °/o Ferrosulfat, 0,o25 °/o Magnesiumsulfat,
o,oo2°/o Kobaltnitrat enthielt und mit Wasser auf ioo°/o aufgefüllt worden war,
wurde sterilisiert und mit einer io°/oigen Reinkultur von Streptomyces griseus geimpft.
Die Gärung wurde bei 27,7° submers unter aeroben Bedingungen und lebhaftem Rühren
durchgeführt, wobei die Belüftung ein Raumteil steriler Luft auf je ein Raumteil
Kulturbrühe in der Minute betrug. Dem Gärbottich wurden nach 42 Stunden 2430 1 Gesamtbrühe
entnommen, die im Kubikzentimeter 35 Millimikrogramm Vitamin B12 enthielt. Nach
Zusatz von 36 kg Filterhilfe wurde filtriert, der trocken geblasene Filterkuchen
nach Zusatz von 1350 1 Wasser auf ioo° erhitzt und für 30 Minuten auf dieser
Temperatur gehalten. Durch Filtrieren wurden 99o 1 Filtrat erhalten, das in einem
Dünnschichtverdampfer auf 1i2,51 konzentriert wurde. Dieses Konzentrat enthielt
1,2 Mikrogramm Vitamin B12 im Kubikzentimeter.
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Weitere 360o 1 der Gesamtbrühe der gleichen Fermentierung wurden nach
67 Stunden Gärdauer dem Gärbottich entnommen. Diese Gesamtbrühe, die 25 Minimikrogramm
Vitamin im Kubikzentimeter enthielt, wurde nach Zusatz von 6o kg Filterhilfe filtriert.
Der feuchte Filterkuchen wurde mittels Dampf auf ioo° erhitzt und die Temperatur
io Minuten auf ioo° gehalten. Der feuchte, aufgeschlämmte Filterkuchen wurde dann
auf einer Korbzentrifuge geklärt und in Anteile von 67,5 1 aufgeteilt. Es wurden
2o2,51 eines wäßrigen Vitamin-Bi.-Konzentrates erhalten, das 6 Mikrogramm Vitamin
im Kubikzentimeter enthielt.
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Eine Probe des ausgelaugten Filterkuchens wurde mit direktem Wasserdampf
auf ioo° erhitzt. Die Flüssigkeit über dem abgesetzten Schlamm enthielt 0,2 Mikrogramm
Vitamin B12 im Kubikzentimeter.
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Aus obigen Beispielen geht hervor, daß die nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren gewonnene Menge an Vitamin B12 anscheinend erheblich über die Gesamtmenge
hinausgeht, welche in der ursprünglichen Gesamtkulturbrühe enthalten war.
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Der Streptomyces griseus, der in den Beispielen zur Anwendung gelangte,
kann auch durch andere Vitamin-B12 erzeugende Streptomycesarten ersetzt werden.
Die Resultate sind im wesentlichen ähnlich. Im übrigen wird in analoger Weise verfahren.
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Bei den in den obigen Beispielen benutzten Filterhilfen handelt es
sich um feinverteilte Diatomeenerden.
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Die wäßrigen Konzentrate des Vitamins B12, die nach den genannten
Beispielen erhalten werden, können auf die angegebene Weise oder nach einer anderen
an sich bekannten Methode zur Isolierung des Vitamins weiterverarbeitet werden.
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Das auf diese Weise erhaltene Vitamin B12 kann unter anderem auch
als Zusatzfuttermittel für Tiere Verwendung finden.
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Für diesen Fall braucht man das Vitamin B12 nicht zu isolieren. Die
wäßrige Lösung, wie sie nach den obigen Beispielen erhalten wird, kann dann direkt
mit den Hauptfuttermitteln auf übliche Weise gemischt werden, vorausgesetzt, daß
die Konzentration geeignet und frei von giftigen oder schädlichen Substanzen ist.
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Dies trifft auch bei einer oralen Verabreichung für die Humantherapie
zu. Man muß sich also lediglich vergewissern, daß das Vitamin B12 frei von giftigen
oder schädlichen Verunreinigungen ist. Die wäßrigen Lösungen des Vitamins B12, wie
sie nach den Beispielen hergestellt worden sind, werden dann so weit eingeengt,
bis die gewünschte Konzentration erreicht ist. Man kann die Lösungen aber auch trocknen
und zu Tabletten verarbeiten.
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Bei einer subkutanen Verabreichung muß man natürlich ebenfalls Vorsorge
treffen, daß das Vitamin im wesentlichen rein ist und die Lösungen steril sind.