<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung von Cyanoc obalamin-Monocarbons äur e-Is om er en
Es ist bekannt, dass bei Cobalaminfermentationen, welche mit Propionibakterien durchgeführt werden, nicht nur das Vitamin B.., sondern auch verwandte Cobalamin-Verbindungen entstehen. Diese sogenannten Faktoren können gleiche oder verschiedene Eigenschaften aufweisen wie das Vitamin B12 ; es
EMI1.1
die aber biologisch nicht gleichwertig sind.
Es wurde nun gefunden, dass die biologisch mit dem Vitamin B12 antagonistisch wirkende Cyano- cobalamin-monocarbonsäure erfolgreich als Heilmittel gegen Polycythaemie verwendet werden kann. Es wurde ferner gefunden, dass dieses aktive Isomer einfach und rentabel hergestellt werden kann, wenn man den Propionibacterium-Stamm PBS 77 auf einem Panthothensäure und Biotin enthaltenden Eiweisshydrolysat züchtet und die in der Flüssigkeitskultur entstandene Cyanocobalamin-monocarbonsäure von dem ebenfalls entstandenen Vitamin B. trennt und isoliert.
Die Bekämpfung der Polycythaemie bedeutete bis heute ein ungelöstes Problem der Medizin. Mit dem erfindungsgemäss isolierten aktiven Faktor konnte bei täglicher intramuskulärer Verabreichung einer 1 - 3 mg Dosis nach einmonatiger Behandlung eine 30- bis 400/aige Abnahme der roten Blutkörperchen- zahl erzielt werden bzw. wurde die normale Blutkörperchenzahl wieder hergestellt.
Der für das Verfahren verwendete Propionibakterium-Stamm PBS 77 besitzt folgende Eigenschaften : gutes Wachstum auf flüssigem Nährboden, welcher Cornsteep-liquor oder Hefeextrakt und Glukose enthält, bei Züchtung unter mikroaeroben Bedingungen, besonders wenn dem Nährboden CaCO zugesetzt wurde. Der Stamm entspricht auf Grund der Bakterienbestimmung nach Bergey's Manual und nach Krassilnikoff etwa einen P. shermanii.
Morphologisch ist es kennzeichnend, dass die Kultur, die zum grössten Teil aus einzeln stehenden Kokken und aus unregelmässigen, jedoch sehr kurzen und dünnen Stäbchen besteht, schon in ihrem jungen Zustand in bedeutendem Masse, in höherem Alter jedoch beinahe ausschliesslich Kokken und eine kleinere Anzahl von grossen, geschwollenen Involutionsformen enthält. Charakteristische biochemische Eigenschaften : Der Stamm entwickelt sich auf Milchsäure enthaltendem Nährboden gut ; die flüssige Kultur zeigt nach Alkalisierung mit NaOH einen flockigen Niederschlag ; bei Gärung in Gegenwart von 5, 6-Dimethyl-benzimidazol enthält das Gärmedium Vitamin B. und die aktive Cyanocobalamin-mono- carbonsäure, welche mit dem Vitamin B, antagonistisch wirkt.
Der Propionibakterium-Stamm PBS 77 wurde folgendermassen gezüchtet : Aus Sahne wurde auf 1, 5% Hefeextrakt, 0, 5% Pepton und l% Glukose enthaltendem Bouillon ein Impfgut hergestellt, welches 48 h lang bei 250C im Thermostat gezüchtet wurde. Hierauf wurde auf 2% Cornsteep-liquor (Trockenmaterialgehalt 50%), 2% Glukose und 1, 81o Agar in Petri-Schalen weitergezüchtet. Die Platten wurden 8 Tage
<Desc/Clms Page number 2>
lang bei 250C im Vakuumexsikkator unter Stickstoff gehalten. Aus den voll entwickelten Kulturen wur- den die morphologisch für Propionibakterien gehaltenen auf ihre Verwendbarkeit zur Fermentation von
Vitamin Bl1 auf einem flüssigen Nährmedium in Gegenwart von Co++ und 5, 6-Dimethyl-benzimidazol geprüft.
Eine der aktiven Kulturen wurde auf einem flüssigen Gärmedium aus 2% Cornsteep-liquor (500/0), i 2% Glukose und l% CaCOs vermehrt, und dann zur Gewinnung von isolierten Kulturen wieder auf einem festen Nährboden weitergezüchtet, dessen Zusammensetzung mit dem oben bereits beschriebenen festen
Nährboden übereinstimmte.
Der neue Stamm PBS 77 wurde beim ungarischen Institut für Gesundheitswesen unter der Nr. 601013 hinterlegt.
Bei der Züchtung dieses Stammes - die auf Nährböden durchgeführt werden kann, welche das Wachs- tum der Propionibakterien ermöglichen-, werden neben 2-3 y/ml Vitamin B, 0, 4-0, 6 y/ml der mit dem Vitamin B12 antagonistisch wirkenden Cobalamin-monocarbonsäure erhalten. Als Nährboden kann ein beliebiges Eiweisshydrolysat tierischer oder pflanzlicher Herkunft verwendet werden, welches mit Pantothensäure und Biotin ergänzt wurde (z. B. Cornsteep-liquor, Hefeextrakt usw.).
Die Gärung wird unter mikroaeroben Bedingungen zweckmässig in Gegenwart von 5, 6-Dimethyl- - benzimidazol bei 25 - 300C durchgeführt.
Bei der Aufarbeitung der Flüssigkeitskultur nach beendeter Gärung kann die erhaltene Cobalamin- - monocarbonsäure erfindungsgemäss einfacherweise und quantitativ vom Vitamin B12 getrennt und isoliert werden. Die Trennung kann verschieden erweise durchgeführt werden. Bei einer Ausführungsform des Ver- fahrens wird das ausgegorene Nährmedium oder das aus diesem erhaltene Konzentrat bei einem PH- Wert über 7 zweckmässig bei 7, 5-8, 5 mit einem wasserunlöslichen Lösungsmittel extrahiert, wobei zunächst das Vitamin B12 entfernt wird. Hierauf wird die wässerige Lösung angesäuert und anschliessend bei einem
PH- Wert von zweckmässig 2 bis 4, 5 mit einem wasserunlöslichen Lösungsmittel extrahiert.
Aus dieser
Lösung kann die Cobalamin-monocarbonsäure gewonnen werden, z. B. indem man sie in einem wasser- löslichen wässerigen Lösungsmittel löst und kristallisiert.
Als Lösungsmittel für die Extraktion aus dem Gärmedium können zweckmässig Phenol, Kresol, ha- logenierte Phenolderivate oder apolare Lösungsmittel, z. B. aliphatische Kohlenwasserstoffe oder deren
Halogenderivat bzw. deren Mischungen verwendet werden.
Für die Extraktion der Monocarbonsäure sind ebenfalls die oben erwähnten Lösungsmittel bzw. Ge- mische geeignet.
Bei einer weiteren Ausführungsweise des erfindungsgemässen Verfahrens wird die Cyanocobalamin- - monocarbonsäure von dem Vitamin B12 durch Anionenaustauscher getrennt. Zu diesem Zweck können mittelstark oder stark basische Anionenaustauscher nach alkalischer Behandlung, also mit OH-Ionen be- laden, verwendet werden. Das Gärmedium bzw. die Lösung des Konzentrats wird schwach sauer oder neutral auf den Anionenaustauscher aufgetragen, worauf eine saure oder alkalische Lösung oder eine
Salz-Lösung zur Eluierung verwendet wird. Es ist vorteilhaft, wenn zur Eluierung eine Lösung verwendet wird, die auch ein wasserlösliches polares organisches Lösungsmittel, z. B. Aceton, Äthanol oder Me- thanol, enthält.
Das Eluieren erfolgt vorteilhaft bei einem pH-Wert von 2 bis 9.
EMI2.1
Elektrodialyse von der Cobalamin-monocarbonsäure getrennt. Dieses Verfahren ist angebracht, wenn be- reits gereinigte Lösungen der Trennung unterworfen werden. Die Trennung kann in neutralem Milieu oder in schwach alkalischem Medium in Gegenwart eines Puffers durchgeführt werden.
Die Cobalamin-monocarbonsäure kann aus ihrer Lösung in wasserunlöslichem Lösungsmittel erfindungsgemäss z. B. folgendermassen isoliert werden : Die Lösung wird mit einem Gemisch von Wasser und einem polaren Lösungsmittel, z. B. Aceton, Methyläthylketon, Diäthyläther, Dioxan, Äthylacetat oder Butanol versetzt, wodurch die Cynaocobalamin-monocarbonsäure in die wässerige Phase verdrängt wird.
Aus der so erhaltenen wässerigen Lösung kann die Monocarbonsäure durch Adsorption auf Tierkohle und darauffolgendem Eluieren mit wässerigem Alkohol gereinigt werden. Die wässerige Phase kann auch einer
EMI2.2
Methode auf Papier Nr. 214 (Machery-Nagel) ein relativer Rf-Wert von 0, 3 bis 0, 6 ermittelt. Das Pro- dukt wandert papierelektrophoretisch in einem Phosphatpuffer, dessen pH-Wert 6, 8 beträgt, anodisch.
Die Monocarbonsäure kann durch Amidierung in das Vitamin B., umgesetzt werden. Das Produkt erweist sich papierchromatographisch (mit Wasser : sekundärem Butanol : Eisessig) als einheitlich. Im Agarplat-
<Desc/Clms Page number 3>
tentest erweist sich das Produkt bei Verwendung von E. coli 113-3 als Antagonist von Vitamin Ba'Die antagonistische Wirkung hat kompetetiven Charakter und ist nur dann vollkommen, wenn das Verhältnis der Cyanocobalamin-monocarbonsäure zum Vitamin B12 40 : 1 oder noch höher ist. Pharmakologisch wurde keine toxische Wirkung der Monocarbonsäure beobachtet.
Das Vitamin B12 kann aus der von der Cobalamin-monocarbonsäure befreiten Lösung durch an sich bekannte Methoden (z. B. Adsorption auf Kohle) nach erfolgter Reinigung isoliert werden.
Die Aufarbeitungsmethode gemäss der Erfindung - also das Trennen der reinen Monocarbonsäure vom Vitamin B., und die anschliessende Isolierung - kann stets erfolgreich verwendet werden, wenn die aktive Cobalamin-monocarbonsäure in wässeriger Lösung neben dem Vitamin B12 vorliegt und davon getrennt und isoliert hergestellt werden soll. In Beispiel 5 ist angegeben, wie die ausgegorene Flüssigkeitskultur eines P. freudenreichii Stammes, welcher prozentmässig wenig an aktiver Monocarbonsäure produziert, mit dem erfindungsgemässen Verfahren aufgearbeitet werden kann.
Weitere Einzelheiten des Verfahrens sind in den Beispielen zu finden :
EMI3.1
steep-liquor, 2% Glukose, 2% CaCO, 5 #/ml Co(NO3)2, 1 #/ml 5,6-Dimethyl-benzimidazol. Das Me- dium wird mit 10% eines auf demselben Gärmedium fermentierten PBS 77 Impfgutes eingeimpft, 6 Tage lang bei 28 - 290C unter täglich zweimaligem Umrühren gehalten. Nach 6 Tagen enthält der Gäransatz insgesamt 150 mg Vitamin .1. Nach erfolgter Gärung werden die Bakterien durch Zentrifugieren ent- fernt. Die Bakteriensuspension wird mit 500 ml 0, 1% NaOH enthaltendem 70%igem wässerigem Äthanol
1 h lang gekocht und filtriert. Das Auskochen mit Äthanol wird noch zweimal mit je 200 ml Äthanol wiederholt.
Die vereinigten Extrakte von roter Farbe werden unter vermindertem Druck vom Äthanol be- freit. Die konzentrierte wässerige Lösung wird mit 5 g aktiver Kohle versetzt, nach einstündigem Stehen abgenutscht und mit Wasser gewaschen, worauf bei 60 - 700C mit einem 67% eigen wässerigen Äthanol eluiert wird. Das Eluat wird unter vermindertem Druck von Äthanol befreit. Die wässerige Lösung wird mit einer 10% igen Ammoniak-Lösung alkalisiert, bis der PH- Wert 8 beträgt, und anschliessend mit einem
Gemisch von Phenol und Tetrachlorkohlenstoff (1 : 3) extrahiert, bis die Phenollösung kaum mehr rosa- farben ist. Hierauf wird die wässerige Lösung mit Salzsäure bis auf einen PHS Wert von 3,5 angesäuert.
Die Extraktion mit Phenol-Tetrachlorkohlenstoff wird weiter fortgesetzt, bis das Lösungsmittel eine schwache Rosafärbung aufweist. Hierauf wird die saure Phenol-Tetrachlorkohlenstoff-Lösung mit einer gleichen Menge von 50% gem wässerigem Aceton versetzt, so dass die Cyanocobalamin-monocarbonsäure in die wässerige Phase verdrängt wird. Das Extrahieren mit Aceton wird fortgesetzt, bis die Lösungsmittelphase keine rote Farbe mehr aufweist. Aus der wässerigen Lösung werden die organischen Lösungsmittelspuren durch Vakuumdestillation entfernt. Nach Zusetzen von 0,3 g Tierkohle wird abgenutscht. Die Kohle wird mit Wasser durchgewaschen und bei 600C mit 67% gem wässerigem Äthanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bis auf etwa 0, 5 - 1 ml eingeengt.
Nach eintägigem Stehen bei 50C werden dicke nadelförmige Kristalle erhalten, welche abgenutscht, mit einer geringen Menge eiskalten Wassers durchgewaschen und im Luftstrom getrocknet werden.
Es werden 9, 6 mg Cyanocobalamin-monocarbonsäure erhalten, welche elektrophoretisch und papierchromatographisch ermittelt einheitlich ist.
Bei der Extraktion der alkalischen wässerigen Phase werden Phenol-Tetrachlorkohlenstoff-Fraktionen erhalten, welche das Vitamin B12 enthalten. Aus der Phenollösung wird das Vitamin B12 durch Umschütteln mit 50% gem wässerigem Äthanol in die wässerige Phase verdrängt. Nach einmaliger Adsorption auf Tierkohle wird das Produkt kristallisiert. Man erhält 70 mg kristallines Vitamin B.
Beispiel 2 : 1000 l des im Beispiel 1 beschriebenen Nährbodens werden in einem 1 m-Fermentor aus säurefestem Metall bei 1200C 1 h lang sterilisiert. Hierauf wird mit einem Impfgut aus einem 10% PBS 77 Propionibakterium shermanii Stamm eingeimpft. Das Impfgut wurde durch Eindampfen von vorerst 10 l und hierauf 100 l Gärmedium mit einer 400 ml Stammzüchtung nach je 6 Tagen hergestellt. Die 1000 1-Fermentation wird 6 Tage lang bei 28 - 300C steril bebrütet und jede 2 h behutsam umgerührt.
Nach Beendigung der Gärung besitzt die Lösung bei Verwendung von E. coli eine Vitamin B.-Aktivität von 2, 8 g. Das Gärmedium wird 1 h lang gekocht, abgekühlt und bis auf einen pH-Wert von 2, 5 angesäuert, worauf 2% Bleicherde zugesetzt werden. Nach einstündigem Umrühren wird vom Absorbens zentrifugiert, und anschliessend mit 70% igem wässerigem Äthanol, welches mit Ammoniak auf einen pH- Wert von 8, 5 bis 9, 0 eingestellt wurde, eluiert. Das Eluieren wird dreimal wiederholt, während die Bleicherde abgenutscht wird. Die vereinigten Äthanollösungen werden neutral unter vermindertem Druck auf ein Zehntel eingeengt. 1,, ! oo NaCN und 20% (NHJSOj werden hinzugefügt, worauf in drei Portionen mit insgesamt 20% Benzylalkohol extrahiert wird.
Die Benzylalkohollösung wird mit einem gleichen Volumen
<Desc/Clms Page number 4>
eines Benzin-Benzol-Gemisches (2 : 1) sowie mit einem halben Volumen Wasser versetzt, so dass das Vitamin B12 und die Cyanocobalamin-monocarbonsäure in die wässerige Phase gebracht wird. Die wässerige Extraktion wird noch zweimal wiederholt. Hierauf wird die wässerige Lösung mit 150 g Tierkohle versetzt und abgenutscht. Die Tierkohle wird auf der Nutsche mit 0,5% NaCN enthaltendem Wasser gewaschen und dann mit 67%igem wässerigem Äthanol eluiert. Das Äthanol wird durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt. Das so erhaltene wässerige Konzentrat enthält das Vitamin B12 und die Cyanocobalamin- - monocarbonsäure.
Durch Zusetzen von 35ar NaHCO wird die rote wässerige Lösung bis auf einen pH-Wert von 8 alkalisiert und hierauf mit einem Gemisch von Phenol : Chloroform (1 : 4) so lange extrahiert, bis die PhenolPhase kaum mehr rosafarben ist. Der vereinigte Phenolextrakt enthält das Vitamin B , welches wie im Beispiel 1 beschrieben isoliert wird. Es werden 1, 3 g kristallines Vitamin 812 erhalten.
Die alkalische wässerige Lösung, welche die Cyanocobalamin-monocarbonsäure enthält, wird auf den PH -Wert von, 2, 5 angesäuert, worauf mit einem Gemisch von Phenol-Chloroform (1 : 4) so lange extrahiert wird, bis die Phenol-Phase kaum mehr rosafarben zurückbleibt. Die wässerige Phase bleibt gelbbraun. Die vereinigten Phenolextrakte werden mit 5obigem wässerigem Aceton umgeschüttelt, worauf die Cyanocobalamin-monocarbonsäure in die wässerige Phase übergeht. 2 g Tierkohle werden zugesetzt, die nach halbstündigem Stehen abgenutscht, mit destilliertem Wasser gründlich durchgewaschen und dann mit 67'obigem wässerigem Äthanol eluiert wird. Die Äthanollösung der Cyanocobalamin-monocarbonsäure wird unter vermindertem Druck von Äthanol befreit und eingeengt.
Aus der so erhaltenen wässerigen Lösung scheiden sich nach Abkühlen Kristalle ab. Nach 24stündigem Aufbewahren bei 50C wird eine dicke Kristallschicht erhalten. Die Kristalle werden kalt auf einer G4-Glasnutsche abgenutscht, mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen und getrocknet. 92 mg kristalline Cyanocobalamin-monocarbonsäure werden erhalten. Das Produkt erweist sich papierelektrophoretisch und papierchromatographisch als einheitlich.
Beisp iel 3 : In einem 20 inLFermenter wird der Propionibakterium shermanii Stamm PBS 77, wie im Beispiel 2 beschrieben, fermentiert. Nach beendigter Gärung enthält der Gäransatz 31, 2 g Vitamin B12.
Die Bakterien werden durch Zentrifugieren entfernt, worauf das Vitamin B12 und die Cyanocobalamin-monocarbonsäure, wie im Beispiel 1 beschrieben, gemeinsam aus den Bakterien gewonnen werden. Nach der Adsorption auf Tierkohle wird ein gereinigter Extrakt erhalten, der das Vitamin B12 und die Cyanocobalamin-monocarbonsäure enthält. Das Trennen des Vitamins B12 von der Cyanocobalamin-monocarbonsäure wird wie folgt durchgeführt :
EMI4.1
Harzsäule so lange mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser keine rosa Färbung mehr aufweist. Der Durchlauf und die Eluate enthalten die ganze Menge des Vitamins B12'während die Monocarbonsäure auf der Säule verbleibt.
Hierauf wird mit 0, 01 n HCl, welche 50% Aceton enthält, eluiert (800 ml). Die so erhaltene Cobalamin-monocarbonsäure-Lösung wird neutral unter vermindertem Druck
EMI4.2
sorption gereinigt. Nach Abtreiben des Äthanols wird so lange Aceton zugesetzt, bis die Lösung trüb wird, worauf über Nacht bei 50C aufbewahrt wird. Die ausgeschiedenen Kristallnadeln werden filtriert, mit 8 Obigem wässerigem Aceton gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Es werden 1, 5 g Cyanocobalamin-monocarbonsäure erhalten.
Beispiel 4 : Ein 100 1 Gäransatz wird wie im Beispiel 1 beschrieben fermentiert. Die ausgegorene Kultur weist eine Vitamin B-Aktivität von 257 mg auf. Die Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben durch Zentrifugieren, Extraktion mit Äthanol und Adsorption. Nach der Adsorption auf Tierkohle wird eine wässerige Lösung erhalten, die 151 mg Vitamin B12 und 26, 1 mg Cyanocobalamin-monocarbonsäure enthält.
EMI4.3
worauf bei 220 V Spannung 3 h lang elektrodialysiert wird. Die Cyanocobalamin-monocarbonsäure wandert anodisch. Die auf diese Weise getrennten Verbindungen werden separat durch Adsorption gereinigt, worauf das Vitamin B12 aus wässerigem Aceton und die Cyanocobalamin-monocarbonsäure aus heissem Wasser kristallisiert wird.
Es werden 132 mg Vitamin B12 und 23, 1 mg Cyanocobalamin-monocarbonsäure erhalten.
Beispiel 5 : In einem 1 m3-, mit einem Rührer versehenen säurefesten Stahlfermenter werden
<Desc/Clms Page number 5>
1000 l des folgenden Nährbodens sterilisiert : Gepresste Hefe (entspricht 2% Trockenmaterial) wird 10 h lang bei 450C autolysiert. Die ungelösten Teile werden aus dem Autolysat zentrifugiert und die auf der
Oberfläche schwimmende reine Lösung wird weiter verarbeitet. Der Nährboden enthält ausserdem 2% Glu- kose, 1'CaCO, 5 y/ml Co (NO) undly/ml5, 6-Dimethyl-benzimidazol. Der Nährboden wird mit
10% Propionibakterium freudenreichii, welches auf gleichem Nährboden gezüchtet wurde, eingeimpft.
Nach sechstägiger Gärung bei 28-300C und zweistündigem Umrühren weist das Gärmedium eine Vit- amin B.-Aktivität von 2,57 g auf (E. coli). Die Bakterien werden durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen. Die Bakteriensuspension wird mit 30 l 500/oigem wässerigem
Aceton von 0, 05% NaCN-Inhalt l h lang gekocht und abgenutscht. Das Auskochen mit wässerigem Ace- ton wird noch zweimal mit je 15 1 wiederholt. Die vereinigten roten Lösungen werden im Vakuum vom
Aceton befreit, worauf die wässerige Lösung mit 140 g Tierkohle versetzt und nach 1/2 h abgenutscht wird. Die Kohle wird mit etwas Wasser durchgewaschen und mit wässerigem Äthanol von 60 - 700C eluiert.
Das Eluat wird im Vakuum vom Äthanol befreit, worauf die wässerige Lösung mit 101eigen Am- moniak bis auf einen pH-Wert von 8 alkalisiert und mit einem Phenol : Chloroform-Gemisch (l : 5) extra- hiert wird, bis die Phenolphase kaum mehr rosafarben ist. Hierauf wird der wässerige Teil mit Salzsäure auf PH = 3 angesäuert und die Phenol : Chloroform-Extraktion wird fortgesetzt, bis das Lösungsmittel kaum mehr rosafarben ist. Die saure Phenol : Chloroform-Lösung wird mit dem vierfachen Volumen Äther und einem halben Volumen Wasser versetzt, so dass die Cyanocobalamin-monocarbonsäure in die wässerige
Phase übergeht. Hierauf wird die Extraktion mit Wasser fortgesetzt, bis die Lösungsmittelphase keine rote
Farbe mehr aufweist.
Die organischen Lösungsmittelspuren werden aus der wässerigen Lösung durch Va- kuumdestillation entfernt. 0,5 g Tierkohle werden zugesetzt, nach 1/2 h wird abgenutscht, mit Wasser gewaschen und bei 60 - 700C mit 700/oigem wässerigem Äthanol eluiert. Das Eluat wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, worauf so viel heisses Wasser zugesetzt wird, dass der Rückstand in Lösung geht.
Nach zweistündigem Aufbewahren bei 50C werden die ausgeschiedenen Kristalle abgenutscht, mit etwas eiskaltem Wasser gewaschen und durch Durchsaugen von Luft getrocknet. Es werden 2,2 mg Cyanocobal- amin-monocarbonsäure erhalten.
Die bei der Extraktion der alkalischen wässerigen Lösung erhaltenen Phenol : Chloroform-Extrakte enthalten das Vitamin beaus dieser Lösung wird das Vitamin B12 durch Zusetzen des vierfachen Volumens Äther und eines halben Volumens Wasser in die wässerige Lösung gebracht. Nach einmaliger Adsorption auf Tierkohle wird kristallisiert. Es werden 810 mg kristallines Vitamin Bl2erhalten.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung des als Antagonist des Vitamins B12 wirkenden Cyanocobalamin-monocarbonsäure-Isomeren, dadurch gekennzeichnet, dass durch Fermentation des Stammes PBS 77 von Propionibakterium shermanii, hinterlegt beim Ungarischen Institut für Hygiene unter der Nr. 601013, eine Gärbrühe hergestellt, die Bakterien aus der Gärbrühe abgeschieden und extrahiert oder ein nach Aufschliessen der Bakterien in der Gärbrúhe durch Zugabe von Adsorptionsmitteln gewonnenes Adsorbat extrahiert wird, anschliessend die im Extrakt enthaltenen Verbindungen Vitamin. B12 und Cyanocobalamin- - monocarbonsäure durch Lösungsmittelextraktion, Ionenaustausch oder Elektrodialyse voneinander getrennt werden und die Cyanocobalamin-monocarbonsäure isoliert wird.