DE2620317C2 - Verfahren zur Herstellung eines biologischen Insektizids - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines biologischen InsektizidsInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines biologischen Insektizids mit einem Gehalt an Sporen
und kristallinem Endotoxin, bei dem man Bacillusthuringiensis-Stämme
in einem Nährmedium unter Belüftung züchtet und den pH-Wert hierbei zwischen 6,3 und 7 hält, das erhaltene Produkt abtrennt, trocknet
und gegebenenfalls mahlt.
Es ist allgemein bekannt, daß die frühe Lyse von Zellen im Laufe der Züchtung zu niederen Ausbeuten und
herabgesetzter Wirksamkeit des Bioinsektizides sowie zu einer Erhöhung seiner Toxizität führt.
Aus der DE-AS 12 42 935 ist ferner ein Verfahren zur Herstellung biologischer Insektizide bekannt, bei dem
man Bacillus-thuringiensis-Stämme in einem flüssigen Nährmedium züchtet, dessen pH-Wert zwischen 5,5
und 8,5 liegt.
Die Verzögerung der Sporenbildung während des vegetativen Wachstums von Bakterien wird der Wirkung
von einem oder mehreren Inhibitoren von eiweißartiger Natur zugeschrieben. Die proteolytische Zersetzung
von vorgeschlagenen Inhibitoren führt zu einem Beginn der Sporenbildung. Abgesehen davon wurden
verschiedene Theorien betreffend der Funktion der Protease vorgelegt, welche eine der frühen Erscheinungen
ist, die mit dem Einsetzen der Sporenbildung verbunden ist (J. Mandelstam und W. M. Waites, Biochem. J.
Vol. 109, Seiten 793 bis 801, 1968). Gemäß Schaeffer wurde vorgeschlagen, daß im Laufe des Wachstums von
Bakterien in einem rasch metabolisierten Nährsubstrat und in Gegenwart einer verwendbaren Stickstoffquelle
Stoffwechselprodukte entstehen, welche die Synthese extracellular Proteasen und eines für die Sporenbildung
spezifischen Enzyms unterdrücken würden, möglicherweise ähnlich wie im Krebs-Zyklus (P. Schaeffer,
Bacteriol. Rev., Vol. 33, Seiten 48 bis 71, 1969). Das Resultat einer derartiger. Unterdrückung ist die Anhäufung
von Essigsäure und Brenztraubensäure, wodurch ein Abfall des pH-Wertes und frühe Lyse von Bakterienzellen
im allgemeinen hervorgerufen werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren
zur Herstellung eines biologischen Insektizides mit einem Gehalt an Sporen und kristallinem Endotoxin
anzugeben, bei dem die vor Beendigung der Sporenbildung hervorgerufene frühe Zell-Lyse verhindert wird.
Gelöst wird die gestellte Aufgabe mit einem Verfahren,
wie es in den Ansprüchen gekennzeichnet ist.
Durch die Erfindung wird erreicht, die Proteinkristallparasporalen
Körper (σ-Endotoxin) zu gewinnen und vom wasserlöslichen Körper (ß-Exotoxin) zu reinigen,
welches infoige seiner Toxizität für Säugetiere entfernt werden muß. In vorteilhafter Weise werden zur Entfernung
des Exotoxins semipermeable Membranen verwendet.
Es ist bekannt, daß die Bacillus-thuringiensis-Stämme
durch die Bildung von proteinhaltigen para-
M) sporalen Endotoxin-Kristallen gekennzeichnet sind.
Die insektenpathogene Natur von Bacillus thuringiensis auf eine große Reihe von lepidoptären Larven durch
Ingestion ist in erster Linie auf die Wirkung von Endotoxin zurückzuführen. Bestimmte Bacillus-thuringiensis-Stämme
bilden neben intracellularem Endotoxin ein extracellulares, wasserlösliches, wärmestabiles Exotoxin.
Unter der Bezeichnung Exotoxin wird hier ein aktiver Stoff von lebenden Zellen verstanden, welcher in
das Medium ausgeschieden wird, im Gegensatz zu Endotoxin, welches erst nach der vollständigen Auflösung
der Zellen freigesetzt wird. Zum besseren Verständnis der Erfindung sollen die Charakteristika der
erwähnten Toxine näher beschrieben werden.
,r Das kristalline Endotoxin
Ein proteinhaltiger kristalliner Einschluß wurde aus dersporuüerten Kultur von Bacillus thuringiensis durch
llannay and Fitz-James isoliert (C. L. Hannay und P. Fit»James, Can. J. Microbiol., Vol. 1, Seiten 694 bis
jo 710, 1955). Elektronenmikroskopische Studien zeigten,
daß während der Sporenbildung von Bacillus-thuringiensis-Stämmen ein asporaler kristalliner Körper
zusammen mit den Sporen entwickelt wurde. Es wurde gefolgert, daß eine Beziehung zwischen der Bildung der
ir) Sporen und der Endotoxin-Kristalle vorhanden ist.
Kürzliche Untersuchungen zeigten, daß kristallines Endotoxin aus einer hochmolekularen Proteinkomponente
und einem Siliciumskelett besteht. Die Sporen und die Endotoxin-Kristalle können aus dem Kultui medium
im Sediment einer Hochleistungszentrifuge gewonnen werden. Die Abtrennung des kristallinen
F.ndotoxins von den Sporen wurde auf verschiedene Weise durchgeführt, z. B. durch fraktionierte Sedimentation,
stufenweise Sedimentation und Abtrennung in
4-1 einem zweiphasigen System.
Das Exotoxin
Zusätzlich zu kristallinem Endotoxin scheiden gewisse Bacillus-thuringiensis-Stämme während der
Vi vegetativen Wachstumsphase eine toxische Fraktion in
das Medium aus, welche chemisch mit den Adeninnucleotiden verwandt ist. Zwischen der Erzeugung von
kristallinem Endotoxin und Exotoxin besteht kein Zusammenhang. Untersuchungen ergaben, daß Exoto-
> xin nur von gewissen Genotypen von besonderen Varietäten von Bacillus-thuringiensis gebildet werden kann.
Ein Verfahren zur Gewinnung von Exotoxin wurde von De Barjac entwickelt. Nach diesem Verfahren wird
Bacillus thuringiensis in einem Medium gezüchtet, wel-
bo ches zusätzlich zu 0,75% Pepton und 1% Glucose Mineralsalze
enthält, und zwar während 70 Stunden bei 30° C Die Herstellung eines biologischen Insektizids
nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erfolgt vorzugsweise in folgenden Stufen:
A) Kultivierung
Die Kulturen werden ausgehend von den Sporen einer Stammkultur von Bacillus-thuringiensis erhalten.
Das Nährmedium zur Herstellung des vegetativer Inoculums in Schüttelflaschen enthält folgende
Bestandteile:
Gew.-%
Bacto-trypton (»Difco«)
Glucose
MgSO4 · 7H2O
ZnSO4 TH2O
Fe2(SO4)3
MnSO4 5H2O
0,8 2,5 0,2 0,2 0,2 0,1
Das Medium für Schrägagarkulturen war dasselbe wie
oben mit einem Zusatz von 2% Agar.
Vorteilhafte Ergebnisse werden dann erhalten, wenn Jie Züchtung in einem der folgenden Medien I oder II
erfolgte:
Medium I
Gew.-%
Melasse (50% Feststoff)
(NH4J2SO4
Maisquellwasser
CaCO3
pH-Wert nach der Sterilisation: 6,8
1,4 0,3 0,1 0,1 0,1
Medium II (mit Stärke anstelle von Melasse)
Gew.-%
Stärke
Na2HPO4
Maisquellwasser
CaCO3
pH-Wert nach dem Sterilisieren: 6,8
1,3 1,0 0,4 0,2 6,8
Das Nährmedium für das vegetative Inoculum (300 ml) war in sterilisierbaren Raschen mit flachem Boden
und einem Fassungsvermögen von 1 Litir enthalten. Das Nährmedium in den Flaschen wurde 45 Minuten
lang bei 121° C sterilisiert. Die Glucose wurde getrennt nach der Tyndalisationsmethode sterilisiert und aseptisch
zum sterilisierten Medium zugesetzt. Das Nährmedium für die Kultivierung in Fermentatoren wurde
jortionsweise im Fermentator während 45 Minuten bei 121° C sterilisiert. Die Kultivierung erfolgte in Fermentatcren
aus rostfreiem Stahl. Die Kultur wurde mit 150 Umdrehungen pro Minute bewegt. Die Belüftung
betrug 0,5 Liter pro Minute und die Inkubationstemperatur 28 bis 30° C. Die Anwendung eines »anaeroben
Schocks« erfolgte durch Unterbrechung der Belüftung während 3 bis 6 Stunden in der zwölften Stunde der submersen
Kultivierung. Die Zeit für den Unterbruch der Belüftung wurde mit Hilfe eines Sauerstoffanalysators
bestimmt. Die Kultivierung kann ohne frühe Zell-Lyse
und ohne Anwendung des beschriebenen >'unaeroben Schocks« durchgeführt werden, wenn im Laufe der Kultivierung
der pH-Wert derart reguliert wird, daß er nicht unter 6.3 fällt. Die Sporenbildung unter Freisetzung von
Endotoxin-Kristallen ist in 35 bis 40 Stunden Kultivierung beendet.
B) Abtrennung und Reinigung
Nach vollständiger Auflösung der Bakterien unier Freisetzung von Sporen und Endotoxin-Kristallen
erfolgt die Trennung der Sporen und des kristallinen Endotoxins vom Exotoxin. Wasserlösliches Exotoxin
wird vorzugsweise mittels Dialyse en/fernt. Bei diesem
• Verfahren wird ein Gemisch von Sporen und kristallinem
Endotoxin, welches für Säugetiere nicht toxisch ist, erhalten. Die Gegenwart oder Abwesenheit von
wasserlöslichem Exotoxin wurde mittels eines biologischen Tests bestimmt. Ein Nährmedium für den biolo-
■. gischen Test wurde durch Erhitzen eines Gemisches aus 10 g pulverisiertem Agar, 500 ml frischer Milch und 7 g
Hefe hergestellt. Eine 10-ml-Probe wurde sodann in
eine Petri-Schale von 9 cm Durchmesser übertragen, in welcher bereits 250 μΐ der Testlösung vorlagen. Sobald
ι sich die Gele verfestigt hatten, wurden 20 Eier von
Musca domestica zugesetzt. Die Platten wurden während 48 Stunden in einem Inkubator bei 30° C gehalten.
Die Entwicklung von Larven und die Disturbanz des Agargels wurden beobachtet (R. P. M. Bond, C. B. C.
Boyce and S. J. French, Biochem. J. Vol. 114, Seiten 477
bis 488, 1969). Das erhaltene Produkt, welches vom wasserlöslichen Exotoxin befreit ist, kann auf die für
die Herstellung von Insektiziden übliche Weise weiterverarbeitet und verwendet werden.
C) Trocknung
Die Trocknung kann nach einer der folgenden Methoden erfolgen:
a) Durch Vermischen des erhaltenen Gemisches von Sporen und Endotoxin-Kristallen mit bentonitischen
Tonen und Einführen in einen belüfteten Trockner mit Platten in Form von dünnen Filmen
bei einer Temperatur von etwa 40 bis 45° C.
b) Das erhaltene Gemisch wird in Wasser suspendiert und in einem rotierenden oder pneumatischen
Trockner getrocknet.
c) Durch Versprühen des erhaltenen Gemisches im Rahmen eines Sprühtrocknungsverfahrens.
D) Zerkleinern und Sieben
Erfolgt das Trocknen in einem Sprühtrockner, muß das erhaltene Produkt nicht mehr zerkleinert werden.
Beim Trocknen in belüfteten Trocknern auf Platten wird das Produkt in einer Vorrichtung zum Typ Alpina zerkleinert
und durch ein Sieb gesiebt, dessen Feinheit mindestens derjenigen eines Siebes No. 180 entspricht.
E) Bestimmung der Wirksamkeit
Die Bestimmung wurde nach folgenden Methoden durchgeführt: Durch Zählen von vorhandenen lebenden
Sporen nach der Plaitenmethode und durch Ausführung von Bioversuchen an Testinsekten.
Die erhaltenen Produkte werden nach üblichen Methoden standardisiert.
Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der vorliegenden Erfindung näher veranschaulichen.
Ausgehend von einer Kultur vom Bacillus-thuringiensis.
var. Berliner erfolgt die Kultivierung in flüssigem belüfteten Medium unter Verwendung von
Medium I (siehe oben) nach der beschriebenen
Methode. Die Inkubationstemperatur im Laufe der submersen Kultivierung beträgt etwa 28° C. Die Kultur
wird mit 150 Umdrehungen pro Minute bewegt bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 Liter pro Liter
pro Minute. Während der zwölften bis vierzehnten Kultivierungsstunde wird die Belüftung für 3 bis 6 Stunden
unterbrochen. Der Zeitpunkt der Unterbrechung der Belüftung wird mit Hilfe eines Sauerstoffanalysators
bestimmt. Die Belüftung wird unterbrochen, sobald der Prozentsatz an Löslichkeit und an Verbrauch von Sauerstoff
abnimmt, und der pH-Wert auf etwa 5,8 ablallt. Nach 3 bis 6 Stunden wird die Belüftung in derselben
Geschwindigkeit von 0,5 Liter pro Liter pro Minute weitergeführt. Die Kultivierung ohne frühe Lyse kann ohne
Anacrobiosc durchgeführt werden, wenn der pH-Wert
des Mediums bei 6,3 bis 6,5 gehalten wird. Die submerse Kultivierung wird weitergeführt bis die Spüren
und das kristalline Endotoxin in das Medium abgegeben werden (durchschnittliche 35 bis 40 Stunden). Das
Kulturmedium wird sodann in den Behälter gegeben, in welchem die Reinigung vom wasserlöslichen Exotoxin
durchgeführt wird. Die Reinigung erfolgt mittels Dialyse. Hierzu kann eine Vorrichtung verwendet werden,
wie sie in der Zeichnung dargestellt ist. Das Kulturmedium wird aus dem Fermentator in den Behälter A eingefüllt,
welcher mit einem Rührer pund einer Dialysemembran «ausgerüstet ist. Die Membran kann kolloidal
sein oder von jedem anderen in der Praxis üblichen Typ. Die Dialyse erfolgt rascher, wenn deionisiertes
Wasser b in den Behälter B zugesetzt wird. Die Gegenwart oder Abwesenheit von wasserlöslichem Exotoxin
wird durch den oben beschriebenen Biotest bestimmt. Zu dem erhaltenen Gemisch aus Sporen und kristallinen
Endotoxinen wird ein pulverförmiges Füllmaterial zugesetzt und das Gemisch in einem Trockenofen auf
Platten getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in einem Zerkleinerungsapparat vom Typ Alpina gemahlen
und gesiebt, um ein Pulver zu erhalten.
Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 ausgeführt, jedoch für die submerse Kultivierung im Fermentator
das Nährmedium Il (siehe oben) verwendet.
Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt,jedoch nach dersubmersen Kultivierung
der Bakterien und nach Durchführung der Dialyse, d. h. nach der Reinigung vom Exotoxin, wird das erhaltene
Produkt in einem Zentrifugallrockner getrocknet und anschließend in einer Alpina-Vorrichtung vermählen.
Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt,jedoch wird das nach dersubmersen Kultur
der Bakterien und nach Durchführung der Dialyse erhaltene Produkt wieder in Wasser suspendiert, worauf
die erhaltene Suspension in einem Sprühtrockner versprüht wird. Die Temperatur des Trockners beträgt 90
bis 1000C. Am besten eignen sich zu diesem Zweck Sprühtrockner, welche Scheiben mit 10 000 bis 15 000
Umdrehungen pro Minute aufweisen. Das Produkt ist ein sehr feines Pulver, welches weder vermählen noch
gesiebt zu werden braucht. Das Exotoxin ist in diesem Endprodukt nicht vorhanden.
Die vorliegende Erfindung kann auch für andere Variationen derselben Bakterienart, z. B. Bacillus thuringiensis,
var. sotto. Bacillus thuringiensis var. subtoxicus angewandt werden. Alle diese Bakterien sind in
der Literatur eingehend beschrieben.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der höheren Wirksamkeit des erhaltenen Produktes und der
ausgezeichneten Reinheit des Produktes in bezug auf Exotoxin bei hohen Ausbeuten an Sporen und kristallinen
Endotoxinen.
Beispiel 5
(Vergleichsbeispiel)
(Vergleichsbeispiel)
Es wurden Vergleichsversuche durchgeführt, aus denen sich eindeutig ergibt, daß
a) durch Unterbrechung der Belüftung und Durchführung der Fermentierung unteranaeroben Bedingungen
oder
b) durch eine pH-Wertregulierung
in überraschender Weise eine frühe Zell-Lyse verhindert
wird.
Die durchgeführten Versuche finden ihren Niederschlag in den folgenden Tabellen 1 bis 4.
Verlauf der Kultivierung von Bacillus thuringiensis var. Berliner unter Einstellung des pH-Wertes auf 6,5
während der 12. bis 16. Stunde durch Zusatz einer 10%igen NaOH-Lösung in einem Standardmedium in
einem 300 bzw. 3000 Liter fassenden Fermentationsgefäß.
| Tabelle 1 | Kohlehydrate | löslicher Zucker | pH | Zellen/ml | Sporen/ml | _ |
| Zeit | g/L | g/L | mit pH-Wert-Regulierung | - | ||
| in Stunden | 19,68 | 0 | 6,9 | _ | 1,2 X 103 | |
| 0 | 14,60 | 3,7 | 6,7 | 7,9 x 106 | 1,0 x 1012 | |
| 6 | 14,00 | 4,0 | 6,5 | 1,2 X 1010 | ||
| 12 bis 16 | 4.00 | 0.0 | 7,8 | Zell-Lysis | ||
| 45 bis 50 | ||||||
Verlauf der Kultivierung von Bacillus thuringiensis var. Berliner ohne pH-Wert-Regulierung
Zeit
in Stunden
Kohlehydrate g/L
löslicher Zucker g/L
Zellen/ml Sporen/ml
mit pH-Wert-Regulierung
12 bis 16
45 bis 50
45 bis 50
19,60
16,00
16,00
7,00
4,5
5,0 0,9 0,5
Verlauf der Kultivierung von Bacillus thuringiensis var. Berliner mit anaerobem Schock (Unterbrechung der
Belüftung nach der 12. Stunde der Fermentation fürdie folgenden 4 Stunden)
in Stunden
pH
Zellen/ml Sporen/ml
mit anaerobem Schock
12 bis 16
45 bis 50
45 bis 50
7,0
6,5
6,3 bis 6,5
8,0
2 X 10"
3 x 107
2 X 10-1 8 x 10"
Aus den in den Tabellen 2 und 4 aufgeführten Daten ergibt sich eindeutig, daß eine frühe Zell-Lyse stattfindet,
wenn de: pH-Wert nicht gesteuert wird bzw. wenn die Belüftung nicht unterbrochen wird. Aus den Tabellen
ergibt sich des weiteren, daß eine frühe ZeIi-Lyse bei einem pH-Wert von 5,5 bis 5,8 auftritt (vgl.
6,9
6,6 5,5 bis 5,8
6,8
5,0 x 106
Zell-Lysis
Zell-Lysis
2 X 10»
Verlauf der Kultivierung von Bacillus thuringiensis var. Berliner ohne anaerobem Schock
20
Zeit pH
in Stunden
Zellen/ml Sporen/ml
ohne anaerobem Schock
12 bis 16
45 bis 50
45 bis 50
7,2
6,7
5,2 bis 5,7
7,3
8 x I08 Zell-Lysis
9 x 108
Tabelle 2), woraus sich eindeutig die Notwendigkeit und Bedeutung der Arbeitsweise in einem engen pH-Wertbereich
gemäß der Erfindung ergibt.
Wie sich aus Tabelle 3 ergibt, führt auch eine Unterbrechung der Belüftung vor der Sporolierung zu einer
Verhinderung einer frühen Zell-Lyse.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung eines biologischen Insektizids mit einem Gehalt an Sporen und kristallinem
Endotoxin, bei dem man Bacillus-thuringiensis-Stämme in einem Nährmedium unter Belüftung
züchtet und den pH-Wert hierbei zwischen 6,3 und 7 hält, das erhaltene Produkt abtrennt, trocknet und
gegebenenfalls mahlt, dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Verhinderung der frühen Zell-Lyse die Belüftung bei der zwölften bis vierzehnten
Züchtungsstunde während 3 bis 6 Stunden unterbricht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Spore.i und das kristalline
Endotoxin vom toxischen Exotoxin mittels Dialyse abtrennt.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2620317A DE2620317C2 (de) | 1976-05-07 | 1976-05-07 | Verfahren zur Herstellung eines biologischen Insektizids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2620317A DE2620317C2 (de) | 1976-05-07 | 1976-05-07 | Verfahren zur Herstellung eines biologischen Insektizids |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2620317A1 DE2620317A1 (de) | 1977-11-10 |
| DE2620317C2 true DE2620317C2 (de) | 1984-05-03 |
Family
ID=5977359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2620317A Expired DE2620317C2 (de) | 1976-05-07 | 1976-05-07 | Verfahren zur Herstellung eines biologischen Insektizids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE2620317C2 (de) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL249632A (de) * | 1959-03-20 |
-
1976
- 1976-05-07 DE DE2620317A patent/DE2620317C2/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2620317A1 (de) | 1977-11-10 |
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|---|---|---|---|
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Representative=s name: BARTELS, H. HELD, M., DIPL.-ING. DR.-ING., PAT.-AN |
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| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
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