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Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Biosynthese eines mikrobiellen Insektizides enthaltend Sporen und kristallines Endotoxin, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Mikroorganismus Bacillus thuringlensis oder einen verwandten Bazillus derart in einem Nährmedium unter Sporenbildung züchtet, dass die durch die Belüftung Im Laufe der submersen Kultivierung vor Beendigung der Sporenbildung hervorgerufene frühe Zell-Lyse verhindert wird.
Es ist bekannt, dass die frühe Lyse von Zellen im Laufe der Züchtung zu niederen Ausbeuten und herabgesetzter Wirksamkeit des Bioinsektizides sowie zu einer Erhöhung seiner Toxizität führt.
Die Erfindung liefert eine verbesserte Methode zur Erzeugung von Sporen und kristallinem Endotoxin in dem Verfahren, bei welchem frühe Lyse von Bakterienzellen üblicherweise auftritt als Resultat enzymatischer Vorgänge, welche durch die Belüftung induziert werden.
Die Verzögerung der Sporenbildung während des vegetativen Wachstums von Bakterien wird der Wirkung von einem oder mehreren Inhibitoren von eiweissartiger Natur zugeschrieben. Die proteolytische Zersetzung von vorgeschlagenen Inhibitoren führt zu einem Beginn der Sporenbildung. Abgesehen davon wurden verschiedene Theorien betreffend der Funktion der Protease vorgelegt, welche eine der frühen Erscheinungen
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J. Vol. 109, Seiten 793 bis 801,1968).
Gemäss Schaeffer wurde vermutet, dass im Laufe des Wachstums von Bakterien in einem rasch metabolisiertenNährsubstrat und in Gegenwart einer verwendbarenStickstoffquelle Stoffwechselprodukte entstehen, welche die Synthese extracellularer Proteasen und eines für die Sporen- bildung spezifischen Enzyms unterdrücken würden. möglicherweise ähnlich wie im Krebs-Zyklus (P. Schaeffer, Bacteriol. Rev., Vol. 33, Seiten 48 bis 71,1969). Die Resultate einer derartigen Unterdrückung ist die Anhäufung von Essigsäure und Brenztraubensäure, wodurch ein Abfall des pH-Wertes und frühe Lyse von Bakterienzellen im allgemeinen hervorgerufen werden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist es nun gelungen bei der Sporulierung die frühe Lyse von Bakterienzellen zu verhindern, indem man die Biosynthese unter anaeroben Bedingungen während 4 bis 6 h durchführt und den pH-Wert im Laufe der Biosynthese im Bereich von 6, 3 bis 7 hält.
Es wurde unter anderem mit Hilfe der Erfindung möglich, die Proteinkristall-parasporalen Körper ss- Endotoxin) zu gewinnen und vom wasserlöslichen Exotoxin (ss-Exotoxin) zu reinigen, welches infolge seiner Toxizität für Säugetiere entfernt werden muss. Die beste Methode zur Entfernung des Exotoxins gemäss der Erfindung bedient sich semipermeabler Membranen.
Es ist bekannt, dass die Bacillus thuringiensis-Gruppe von Mikroorganismen gekennzeichnet ist durch die Bildung von proteinhaltigen parasporalen Endotoxin-Kristallen. Die insektenpathogene Natur von Bacillus thuringiensis auf eine grosse Reihe von lepidoptären Larven durch Ingestion ist in erster Linie auf die Wirkung von Endotoxin zurückzuführen. Gewisse Stämme von Bacillus thuringiensis bilden neben intracellularem Endotoxin ein extracellulares, wasserlösliches, wärmestabiles Exotoxin. Unter der Bezeichnung Exotoxin wird hier ein aktiver Stoff von lebenden Zellen verstanden, welcher in das Medium ausgeschieden wird, im Gegensatz zu Endotoxin, welches erst nach der vollständigen Auflösung der Zellen freigesetzt wird.
Für ein besseres Verständnis der Erfindung werden die Charakteristiken der oben erwähnten Toxine eingehender beschrieben.
Das kristalline Endotoxin
Ein proteinhaltiger kristalliner Einschluss wurde aus der sporulierten Kultur von Bacillus thuringiensis durch Hannay und Fitz-James isoliert (C. L. Hannay und P. Fitz-James, Can. J. Microbiol., Vol. l, Selten 694 bis 710,1955). Die elektronenmikroskopischen Studien zeigten, dass während der Sporenbildung von Bakterien von Bacillus thuringiensis ein asporaler kristalliner Körper zusammen mit den Sporen entwickelt wurde. Es wurde ferner gefolgert, dass eine neue Beziehung zwischen der Bildung der Sporen und der EndotoxinKristalle vorhanden ist. Kiirzliche Untersuchungen zeigten, dass das kristalline Endotoxin aus einer hochmolekularen Proteinkomponente und einem Siliciumskelett besteht. Die Sporen und die Endotoxin-Kristalle können aus dem Kulturmedium im Sediment einer Hochleistungszentrifuge gewonnen werden.
Die Abtrennung des kristallinenEndotoxins von den Sporen wurde auf verschiedene Weise durchgeführt, z. B. durchfraktlonierte Sedimentation, stufenweise Sedimentation und Abtrennung In einem zweiphasigen System.
Das Exotoxin
Zusätzlich zum kristallinen Endotoxin scheiden gewisse Stämme von Bacillus thuringiensis während der vegetativen Wachstumsphase eine toxische Fraktion in das Medium aus, welche chemisch verwandt ist mit den Adeninnucleotiden. Es besteht kein Zusammenhang zwischen der Erzeugung von kristallinem Endotoxin und Exotoxin. Gemäss Untersuchungen kann Exotoxin nur von gewissen Genotypen von besonderen Varietäten von Bacillus thuringiensis gebildet werden. Die Methode für die Erzeugung von Exotoxin wurde von De Barjac entwickelt. Gemäss dieser Methode wird Bacillus thuringiensis in einem Medium gezüchtet, welches Mineralsalze zusätzlich zu Pepton 0, 75% und Glucose 1% enthält, und zwar während 70 h bei 300C.
Die Herstellung der mikrobiellen Insektizide gemäss der Erfindung erfolgt vorzugsweise mittels folgender Stufen :
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A) Kultivierung.
Die Kulturen werden erhalten ausgehend von den Sporen einer Stammkultur der Bakterien Bacillus thuringiensis.
Das Nährmedium zur Herstellung des vegetativenInoculums inSchüttelflaschen enthält folgende Bestandteile :
Bacto-Trypton ("Difco") (Aminosäurenmischung) 0, 8 Gew.-% als Stickstoffquelle)
Glucose 2, 5 Gew.-%
MgSO4. 7H2O 0, 2 Gew.-% Zens04. 7H20 0,2 Gew.-%
Fe2 (SO4)30,2Gew.-%
MnSo4. 5H2O0,1Gew.-%
Das Medium für Schrägagarkulturen war dasselbe wie oben mit einem Zusatz von 2% Agar.
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Melasse (50% Feststoff) 1, 4 Gew. -% Hefe 0, 3 Gew.-% (NH4)2SO40,1Gew.-%
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1 Gew. -%CACAOS 0,1 Gew.-%
Der PH-Wert nach der Sterilisation 6, 8.
Oder mit dem Medium, welches anstelle von Melasse Stärke enthält.
Medium II :
Stärke 1, 3 Gew. -%
Hefe 1, 0 Gew. -%
Na2HPO4 0,4 Gew.-%
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sierten Medium zugesetzt. Das Nährmedium für die Kultivierung in Fermentatoren wurde hergestellt und portionenweise im Fermentator während 45 min bei 121 C sterilisiert. Die Kultivierung wurde in Fermentatoren aus rostfreiem Stahl durchgeführt. Die Kultur wurde mit 150 Umdr/min bewegt,und die Belüftung betrug 0, 5 1 Luft/min je Liter und die Inkubationstemperatur 28 bis 30 C. Die Anwendung eines "anaeroben Schocks"wurde durchgeführt durch Unterbrechung der Belüftung während 3 bis 6 h in der zwölften Stunde der submersen Kultivierung. Die Zeit für die Unterbrechung der Belüftung wurde mit Hilfe des Sauerstoffanalysators bestimmt.
Die Kultivierung kann durchgeführt werden ohne frühe Lyse von Zellen und ohne Anwendung des beschriebenen"anaeroben Schocks", wenn im Laufe der Kultivierung der PH-Wert derart reguliert wird, dass er nicht unter 6, 3 fällt. Die Sporenbildung unter Freisetzung von Endotoxin-Kristallen ist in 35 bis 40 h Kultivierung beendet.
B) Abtrennung und Reinigung.
Nach vollständiger Auflösung der Bakterien unter Freisetzung von Sporen und Endotoxin-Kristallen wird
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die Trennung der Sporen und des kristallinen Endotoxins vom Exotoxin ausgeführt. Wasserlösliches Exotoxin wird vorzugsweise mittels Dialyse entfernt. Nach dieser Methode wird ein Gemisch von Sporen und kristallinem Endotoxin, welches für Säugetiere nicht toxisch ist, erhalten. Die Gegenwart oder Abwesenheit von
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wurde. Ein Nährmedium für den biologischen Test wurde hergestellt durch Erhitzen des Gemisches von 10 g pulversiertem Agar, 500 ml frischer Milch und 7 g Hefe. Eine 10 ml-Probe wurde sodann In eine PetriSchale von 9 cm Durchmesser übertragen, In welcher 250 l der Restlösung bereits eingefüllt worden war. Sobald sich die Gele verfestigt hatten, wurden 20 Eier von Musca domestic zugesetzt.
Die Platten wurden während 48 h in einem Inkubator bei 300C gehalten. Die Entwicklung von Larven und die Disturbanz des Agargels wurden beobachtet (R. P. M. Bond, C. B. C. Boyce und S. J. French, Blochem. J. Vol. 114, Seiten 477 bis 488,1969). Das erhaltene Produkt, welches vom wasserlöslichen Exotoxin befreit ist, kann auf die für die Herstellung von Insektiziden übliche Weise weiterverarbeitet und verwendet werden.
C) Trocknung.
Die Trocknung kann nach einer der folgenden Methoden erfolgen :
Durch Vermischen des erhaltenen Gemisches von Sporen und Endotoxin-Kristallen mit bentonitischen Tonen und Einführen in einen belüfteten Trockner mit Platten in Form von dünnen Filmen bei einer Temperatur von etwa 40 bis 450C.
Das erhaltene Gemisch wird In Wasser suspendiert und in rotierenden oder pneumatischen Trockner getrocknet.
Durch Versprühen des erhaltenen Gemisches in einer Sprühtrocknungsanlage.
D) Zerkleinern und Sieben.
Wenn das Trocknen in einem Sprühtrockner erfolgt, benötigt das erhaltene Produkt keine Zerkleinerung mehr. Beim Trocknen in belüfteten Trocknern auf Platten wird das Produkt in einer Vorrichtung zerkleinert und durch ein Sieb gesiebt, dessen Feinheit mindestens derjenigen eines Siebes No. 180 entspricht.
E) Bestimmung der Wirksamkeit.
Die Bestimmung wurde nach folgenden Methoden durchgeführt. Durch Zählen von vorhandenen lebenden Sporen nach der Plattenmethode und durch Ausführung von Bioversuchen an Testinsekten.
Die erhaltenen Produkte werden gemäss den Standard-Bestimmungen geprüft, welche von den französischen Laboratoires de Lutte Biologique et de Biocinétique de la Miniere (I. N. R. A.) ausgearbeitet wurden.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden im folgenden Beispiele beschrieben, welche jedoch in keiner Weise eine Beschränkung der Erfindung darstellen.
Beispiel l : Ausgehend von der Kultur vom Bacillus thuringlensis, var. Berliner wird die Kultivierung in flüssigem belüfteten Medium unter Verwendung von Medium I (siehe oben) nach der beschriebenen Methode durchgeführt. Die Inkubationstemperatur im Laufe der submersen Kultivierung beträgt etwa 280C. Die Kultur wird mit 150 Umdr/min bewegt und die Belüftungsgeschwindigkeit beträgt 0, 5 I Luft/min je Liter Kulturflüssigkeit. Bei der zwölften bis vierzehntenKultivierungsstunde wird die Belüftung für 3 bis 6 h unterbrochen.
Der Zeitpunkt der Unterbrechung der Belüftung wurde mit Hilfe des Sauerstoffanalysators bestimmt ; die Belüftung wurde unterbrochen, sobald der Prozentsatz an Löslichkeit und an Verbrauch von Sauerstoff abnimmt, und der PH auf etwa 5,8 abfällt. Nach 3 bis 6 h wird die Belüftung in derselben Geschwindigkeit von 0, 5 l Luft/ min je Liter Kulturflüssigkeit weitergeführt. Die Kultivierung ohne frühe Lyse kann ohne Anaeroblose durchgeführt werden, wenn der PH des Mediums im Bereich von 6,3 bis 6,5 gehalten wird. Die submerse Kultivierung wird weitergeführt bis die Sporen und das kristalline Endotoxin In das Medium abgegeben werden (durchschnittlich 35 bis 40 h). Das Kulturmedium wird sodann in den Behälter gegeben, in welchem die Reinigung vom wasserlösichen Exotoxin durchgeführt wird. Die Reinigung erfolgt mittels Dialyse.
Hiezu kann eine Vorrichtung verwendet werden, wie in der Zeichnung dargestellt. Das Kulturmedium wird aus dem Fermentator in den Behälter --A-- eingefüllt, welcher mit einemRührer --e-- und einerDialysenmembran --a-- ausgerüstet ist. Die Membran kann kolloidal sein oder von jedem anderen in der Praxis üblichen Typus. Die Dialyse erfolgt rascher, wenn deionisiertes Wasser --b-- in den Behälter --B-- zugesetzt wird. Die Gegenwart oder Abwesenheit von wasserlöslichem Exotoxin wird durch den oben beschriebenen Biotest bestimmt. Zu dem erhaltenen Gemisch von Sporen und kristallinen Endotoxinen wird ein pulverförmiges Füllmaterial zugesetzt und das Gemisch in einem Trockenofen auf Platten getrocknet.
Das erhaltene Produkt wird in einem Zerkleinerungsapparat (Scheibenmühle) gemahlen und gesiebt, um ein Pulver zu erhalten.
Beispiel 2 : Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 ausgeführt, jedoch für die submerse Kultivierung im Fermentator das Nährmedium II (siehe oben) verwendet.
Beispiel 3 : Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 ausgeführt, jedoch nach der submersen Kultivierung der Bakterien und nach Durchführung der Dialyse, d. h. nach der Abtrennung vom Exotoxin, wird das erhaltene Produkt in einem Zentrifugaltrockner getrocknet und anschliessend in einer Zerkleinerungsvorrichtung vermahlen.
Beispiel 4 : Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurde das nach der submer-
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sen Kultur der Bakterien und nach Durchführung der Dialyse erhaltene Produkt in einer gewissen Wassermenge wieder suspendiert und diese Suspension in einem Sprühtrockner versprüht. Die Temperatur des Trockners betrug 90 bis IOOOC. Am besten eignen sich zu diesem Zweck Sprühtrockner, welche Scheiben mit 10000 bis 15000 Umdr/min aufweisen. Das Produkt ist ein sehr feines Pulver, welches weder vermahlen noch gesiebt zu werden braucht. Das Exotoxin ist in diesem Endprodukt nicht vorhanden.
A) Pulverförmiges Präparat
4,0 Gew.-% der aktiven Komponente mit einer Wirksamkeit von 15000 IU/mg 25, 0 Gew.-% amorphes Silikagel ("Vesalon") 5, 0 Gew.-% Kalzium-Lignin-Sulfonat ("Jogopon") 66, 0 Gew.-% Porzellanerde (China-clay).
B) Flüssiges Präparat 8, 0 Gew.-% der aktiven Komponente mit einer Wirksamkeit von 6000 IU/mg
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C) Körniges Präparat
98,0Gew. -%Calciumcarbonat 2, 0 Gew.-% aktive Komponente (2, 4. 103 Sporen/g).
Diese Präparate sind besonders wirksam gegen Insekten der Gruppe Lepidoptera.
Die insektizide Wirkung des erfindungsgemäss erhaltenen Sporen des B. thuringienses und kristallines Endotoxin enthaltenden Produktes kann entweder in Anzahl Sporen pro Gramm des Produktes oder in internationalen Einheiten (I. U.) ausgedrückt werden.
Die in den nachstehenden Präparate-Beispielen enthaltende, nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte aktive Komponente wies eine Wirksamkeit von
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auf. Hiebei ist zu beachten, dass 100 IU/mg der insektiziden Wirksamkeit einer Standard-Probe E-61 (einem Gemisch von Sporen der Endotoxinkristallen von B. thuringiensis) entspricht, die an Ephestia KUhniella als Testinsekt bestimmt wurde.
Folgende insektizide Präparate wurden hergestellt :
Das flüssige Präparat wird im allgemeinen in einer Menge von 0, 8 bis 1, 5 l/ha, verdUnnt mit 500 bis 1000 l Wasser verwendet. Die Verdünnung hängt vor allem von der Art der Applikation, der Anzahl der Insekten und der Dichte der Pflanzen ab. Das Produkt eignet sich auch sehr gut zum Versprühen aus der Luft.
Das pulverförmige Präparat weist ähnliche Eigenschaften und Anwendungsbereiche auf wie das flüssige Präparat. Seine Dosierung beträgt im allgemeinen 0, 6 bis 1, 0 kg/ha.
Das körnige Präparat C) eignet sich vor allem zur Bekämpfung von Pyrausta nubilalis in Maisfeldern.
Die Dosierung beträgt vorteilhafterweise 30 kg/ha.
Das erfindungsgemäss hergestellte aktive Produkt lässt sich ohne weiteres mit chemischen Insektiziden mischen und weist gute Verträglichkeit damit auf.
Geeignete Mischungen sind z. B. :
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2 Gew.-% + aktive Komponente 0, 12 Gew.-%c) "Sevin" 0, 1 bis 0, 2 Gew.-% + aktive Komponente 0, 15 Gew.-%.
Dieselben Wirkungen können mit niedrigeren Konzentrationen an chemischen Insektiziden erzielt werden, indem die Toxizität herabgesetzt wird.
Auch andere chemische Insektizide sind verträglich mit dem erfindungsgemäss erhaltenen Produkt, wie z. B. "Methylparathion", "Diazinon", "DDT", "Pyrethrum", "Phosdrin", usw.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäss erhaltenen Insektizide wurde an etwa 50 verschiedenen Insekten untersucht. Im folgenden sind einige der wichtigsten Ergebnisse in Tabellen zusammengestellt, wobei in den Versuchen der Tabellen 1 bis 3 das flüssige Präparat B indenjenigenderTabelle4das körnige Präparat C verwendet wurde.
Tabelle 1
Wirksamkeit gegen Trychoplusia ni auf Kohlpflanzen
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<tb>
<tb> Menge <SEP> % <SEP> getöteter <SEP> Larven <SEP> Total <SEP> der <SEP> unterPräparat <SEP> suchten <SEP> Larven
<tb> l/ha <SEP> Dauer <SEP> des <SEP> Testes
<tb> 1-5 <SEP> 5-7 <SEP> 10
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> 20 <SEP> 27 <SEP> 90 <SEP> 180
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> 63 <SEP> 80 <SEP> 112 <SEP> 220
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 75 <SEP> 92 <SEP> 200 <SEP> 222
<tb> Kontrolle------650
<tb>
Tabelle 2 Wirksamkeit gegen Hyponomeuta mallinellus auf Äpfeln
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<tb>
<tb> Menge <SEP> Insectarium <SEP> Feldversuche
<tb> Präparat
<tb> l/ha <SEP> % <SEP> Morta11 <SEP> - <SEP> korr. <SEP> Mor- <SEP> % <SEP> Morta- <SEP> korr.
<SEP> Mortät <SEP> talität <SEP> lität <SEP> talität
<tb> 0, <SEP> 4 <SEP> 15 <SEP> 13, <SEP> 8 <SEP> 12 <SEP> 11, <SEP> 05 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 6 <SEP> 32 <SEP> 31, <SEP> 2 <SEP> 31 <SEP> 30, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 85 <SEP> 84, <SEP> 2 <SEP> 86, <SEP> 0 <SEP> 85, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 1,5 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb>
Tabelle 3 Wirksamkeit gegen Heliothis virescens und Heliothis zea auf
Tabak- und Baumwollpflanzen
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<tb>
<tb> Konzentration
<tb> an <SEP> Präparat <SEP> Baumwolle <SEP> Tabak
<tb> l/ha <SEP> Tage
<tb> % <SEP> Mortalität <SEP> % <SEP> Mortalität
<tb> 0, <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 30 <SEP> 75
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 95 <SEP> 100
<tb> 1,
5 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb>
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Tabelle 4 Wirksamkeit gegen Pyrausta nubilalis auf Maispflanzen
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<tb>
<tb> Dosis <SEP> An-Pflan-Durchschnitt-WirksamPräparat <SEP> kg/ha <SEP> zahl <SEP> zen <SEP> mit <SEP> liehe <SEP> Anzahl <SEP> keit <SEP> des
<tb> Pflan-leben-Larven <SEP> pro <SEP> Präparates
<tb> zen <SEP> den <SEP> Lar- <SEP> Pflanze <SEP> in <SEP> %
<tb> ven <SEP> (%)
<tb> Präparat <SEP> C <SEP> 20 <SEP> 80 <SEP> 41, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 82 <SEP>
<tb>
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sotto, Bacillus thuringiensis var. subtoxicus angewandt werden. Alle diese Bakterien sind in der Literatur eingehend beschrieben.
Ein Vorteil der Erfindung liegt in der höheren Wirksamkeit des erhaltenen Produktes auf der ausgezeichneten Reinheit des Produktes in bezug auf Exotoxin bei hohen Ausbeuten an Sporen und kristallinen Endotoxinen.
PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Biosynthese eines mikrobiellen Insektizides enthaltend Sporen und kristallines Endotoxin, wobei der Mikroorganismus Bacillus thuringiensis oder ein verwandter Bazillus in einem Nährmedium submers bei Einstellung des pH-Wertes zwischen vorgewählten Grenzen unter Sporenbildung gezüchtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass eine vor Beendigung der Sporenbildung hervorgerufene frtthe Zell-Lyse dadurch verhindert wird, dass entweder die Belüftung unterbrochen und die Fermentierung zeitweise unter anaeroben Bedingungen durchgeführt wird, oder der PH-Wert im Laufe der gesamten Kultivierung im Bereich von 6, 3 bis 7 gehalten wird.