Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Biosynthese'eines mikrobiellen Insektizides, enthaltend Sporen und kristallines Endotoxin, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Mikroorganismus Bacillus thuringiensis oder einen verwandten Bazillus derart in einem Nährmedium unter Sporenbildung züchtet, dass die durch die Belüftung im Laufe der submersen Kultivierung vor Beendigung der Sporenbildung hervorgerufene frühe Zell-Lyse verhindert wird.
Es ist bekannt, dass die frühe Lyse von Zellen im Laufe der Züchtung zu niederen Ausbeuten und herabgesetzter Wirksamkeit des Bioinsektizides sowie zu einer Erhöhung seiner Toxizität führt.
Die vorliegende Erfindung liefert eine verbesserte Methode zur Erzeugung von Sporen und kristallinem Endotoxin in dem Verfahren, bei welchem frühe Lyse von Bakterienzellen üblicherweise auftritt als Resultat enzymatischer Vorgänge, welche durch die Belüftung induziert werden.
Die Verzögerung der Sporenbildung während des vegetativen Wachstums von Bakterien wird der Wirkung von einem oder mehreren Inhibitoren von eiweissartiger Natur zugeschrieben. Die proteolytische Zersetzung von vorgeschlagenen Inhibitoren führt zu einem Beginn der Sporenbildung. Abgesehen davon, wurden verschiedene Theorien betreffend der Funktion der Protease vorgelegt, welche eine der frühen Erscheinungen ist, die mit dem Einsetzen der Sporenbildung verbunden ist (J. Mandelstam und W. M. Waites, Biochem. J. Vol. 109, Seiten 793 bis 801, 1968).
Gemäss Schaeffer wurde vorgeschlagen, dass im Laufe des Wachstums von Bakterien in einem rasch metabolisierten Nährsubstrat und in Gegenwart einer verwendbaren Stickstoffquelle Stoffwechselprodukte entstehen, welche die Synthese extracellularer Proteasen und eines für die Sporenbildung spezifischen Enzyms unterdrücken würden, möglicherweise ähnlich wie im Krebs-Zyklus (P.
Schaeffer, Bacteriol. Rev., Vol. 33, Seiten 48 bis 71, 1969).
Die Resultate einer derartigen Unterdrückung ist die Anhäufung von Essigsäure und Brenztraubensäure, wodurch ein Abfall des pH-Wertes und frühe Lyse von Bakterienzellen im allgemeinen hervorgerufen werden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es nun gelungen, bei der Sporulierung die frühe Lyse von Bakterienzellen zu verhindern, indem man die Biosynthese unter anaeroben Bedingungen während 4 bis 6 Stunden durchführt und den pH-Wert im Laufe der Biosynthese im Bereich von 6,3 bis 7 hält.
Es wurde unter anderem mit Hilfe der vorliegenden Erfindung möglich, die proteinkristall-parasporalen Körper (a Endotoxin) zu gewinnen und vom wasserlöslichen Exotoxin (ss-Exotoxin) zu reinigen, welches infolge seiner Toxizität für Säugetiere entfernt werden muss. Die beste Methode zur Entfernung des Exotoxins gemäss der vorliegenden Erfindung bedient sich semipermeabler Membranen.
Es ist bekannt, dass die Bacillus thuringiensis-Gruppe von Mikroorganismen gekennzeichnet ist durch die Bildung von proteinhaltigen parasporalen Endotoxin-Kristallen. Die insektenpathogene Natur von Bacillus thuringiensis auf eine grosse Reihe von lepidoptären Larven durch Ingestion ist in erster Linie auf die Wirkung von Endotoxin zurückzuführen. Gewisse Stämme von Bacillus thuringiensis bilden neben intracellularem Endotoxin ein extracellulares, wasserlösliches, wärmestabiles Exotoxin. Unter der Bezeichnung Exotoxin wird hier ein aktiver Stoff von lebenden Zellen verstanden, welcher in das Medium ausgeschieden wird, im Gegensatz zu Endotoxin, welches erst nach der vollständigen Auflösung der Zellen freigesetzt wird.
Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die Charakteristiken der oben erwähnten Toxine eingehender beschrieben.
Das kristalline Endotoxin
Ein proteinhaltiger kristalliner Einschluss wurde aus der sporulierten Kultur von Bacillus thuringiensis durch Hannay und Fitz-James isoliert (C. L. Hannay und P. Fitz-James, Can. J. Microbiol., Vol. 1, Seiten 694 bis 710, 1955). Die elektronenmikroskopischen Studien zeigten, dass während der Sporenbildung von Bakterien von Bacillus thuringiensis ein asporaler kristalliner Körper zusammen mit den Sporen entwickelt wurde. Es wurde ferner gefolgert, dass eine neue Beziehung zwischen der Bildung der Sporen und der Endotoxin Kristalle vorhanden ist. Kürzliche Untersuchungen zeigten, dass das kristalline Endotoxin aus einer hochmolekularen Proteinkomponente und einem Siliciumskelett besteht. Die Sporen und die Endotoxin-Kristalle können aus dem Kulturmedium im Sediment einer Hochleistungszentrifuge gewonnen werden.
Die Abtrennung des kristallinen Endotoxins von den Sporen wurde auf verschiedene Weise durchgeführt, z. B.
durch fraktionierte Sedimentation, stufenweise Sedimentation und Abtrennung in einem zweiphasigen System.
Das Exotoxin
Zusätzlich zum kristallinen Endotoxin scheiden gewisse Stämme von Bacillus thuringiensis während der vegetativen Wachstumsphase eine toxische Fraktion in das Medium aus, welche chemisch verwandt ist mit den Adeninnucleotiden. Es besteht kein Zusammenhang zwischen der Erzeugung von kristallinem Endotoxin und Exotoxin. Gemäss Untersuchungen kann Exotoxin nur von gewissen Genotypen von besonderen Varietäten von Bacillus thuringiensis gebildet werden.
Die Methode für die Erzeugung von Exotoxin wurde von De Barjac entwickelt. Gemäss dieser Methode wird Bacillus thuringiensis in einem Medium gezüchtet, welches Mineralsalze zusätzlich zu Pepton 0,75% und Glucose 1 % enthält, und zwar während 70 Stunden bei 30 C.
Die Herstellung der mikrobiellen Insektizide gemäss der vorliegenden Erfindung erfolgt vorzugsweise mittels folgender Stufen:
A. Kultivierung
Die Kulturen werden erhalten, ausgehend von den Sporen einer Stammkultur der Bakterien Bacillus thuringiensis.
Das Nährmedium zur Herstellung des vegetativen Inoculums in Schüttelfiaschen enthält folgende Bestandteile:
Gewichtsprozent
Bacto-trypton ( Difco ) 0,8
Glucose 2,5 MgSO4 7H2O 0,2 ZnS04 zu 7H20 0,2 Fe2(SO4)4 0,2 MnSO4 5H2O 0,1
Das Medium für Schrägagarkulturen war dasselbe wie oben mit einem Zusatz von 2% Agar.
Gute Resultate wurden erhalten, wenn die Züchtung in folgenden Medien erfolgte:
Medium I
Gewichtsprozent
Melasse (50% Feststoffe) 1,4
Hefe 0,3 (NH4)2S04 0,1
C.S.L. (Maiseinweich flüssigkeit) 0,1 CaC03 0,1
Der pH-Wert nach der Sterilisation 6,8.
Oder mit dem Medium, welches anstelle von Melasse Stärke enthält.
Medium II
Gewichtsprozent
Stärke 1,3
Hefe 1,0
Na2HP04 0,4
C.S.L. (Maiseinweich flüssigkeit) 0,2 CaCO3 0,8 pH-Wert nach dem Sterilisieren 6,8.
Das Nährmedium für das vegetative Inoculum (300 ml) war in sterilisierbaren Flaschen mit flachem Boden und einem Liter Fassungsvermögen enthalten. Das Nährmedium in den Flaschen wurde während 45 Minuten bei 121" C sterilisiert.
Die Glucose wurde getrennt sterilisiert nach der Tindalisationsmethode und aseptisch zum sterilisierten Medium zugesetzt. Das Nährmedium für die Kultivierung in Fermentatoren wurde hergestellt und portionenweise im Fermentator während 45 Minuten bei 121" C sterilisiert. Die Kultivierung wurde in Fermentatoren aus rostfreiem Stahl durchgeführt.
Die Kultur wurde mit 150 Umdrehungen pro Minute bewegt, und die Belüftung betrug 0,5 Liter pro Liter pro Minute und die Inkubationstemperatur 28 bis 30 C. Die Anwendung eines anaeroben Schocks wurde durchgeführt durch Unterbrechung der Belüftung während 3 bis 6 Stunden in der zwölften Stunde der submersen Kultivierung. Die Zeit für den Unterbruch der Belüftung wurde mit Hilfe des Sauerstoffanalysators bestimmt. Die Kultivierung kann durchgeführt werden ohne frühe Lyse von Zellen und ohne Anwendung des beschriebenen anaeroben Schocks , wenn im Laufe der Kultivierung der pH-Wert derart reguliert wird, dass er nicht unter 6,3 fällt. Die Sporenbildung unter Freisetzung von Endotoxin-Kristallen ist in 35 bis 40 Stunden Kultivierung beendet.
B. Abtrennung und Reinigung
Nach vollständiger Auflösung der Bakterien unter Freisetzung von Sporen und Endotoxin-Kristallen wird die Trennung der Sporen und des kristallinen Endotoxins vom Exotoxin ausgeführt. Wasserlösliches Exotoxin wird vorzugsweise mittels Dialyse entfernt. Nach dieser Methode wird ein Gemisch von Sporen und kristallinem Endotoxin, welches für Säugetiere nichttoxisch ist, erhalten. Die Gegenwart oder Abwesenheit von wasserlöslichem Exotoxin wurde durch den biologischen Test bestimmt, welcher von Bond et al. beschrieben ist. Ein Nährmedium für den biologischen Test wurde hergestellt durch Erhitzen des Gemisches von 10 g pulverisiertem Agar, 500 ml frischer Milch und 7 g Hefe. Eine 10-ml-Probe wurde sodann in eine Petri-Schale von 9 cm Durchmesser übertragen, in welcher 250,ul der Testlösung bereits eingefüllt worden waren.
Sobald sich die Gele verfestigt hatten, wur den 20 Eier von Musca domestica zugesetzt. Die Platten wurden während 48 Stunden in einem Inkubator bei 30 C gehalten. Die Entwicklung von Larven und die Disturbanz des Agargels wurden beobachtet (R. P. M. Bond, C. B. C. Boyce und S. J. French, Biochem. J. Vol. 114, Seiten 477 bis 488, 1969). Das erhaltene Produkt, welches vom wasserlöslichen Exotoxin befreit ist, kann auf die für die Herstellung von Insektiziden übliche Weise weiterverarbeitet und verwendet werden.
C. Trocknung
Die Trocknung kann nach einer der folgenden Methoden erfolgen: - Durch Vermischen des erhaltenen Gemisches von Sporen und Endotoxin-Kristallen mit bentonitischen Tonen und Einführen in einen belüfteten Trockner mit Platten in Form von dünnen Filmen bei einer Temperatur von etwa 40 bis 45 C.
- Das erhaltene Gemisch wird in Wasser suspendiert und in rotierenden oder pneumatischen Trockner getrocknet.
- Durch Versprühen des erhaltenen Gemisches in einer Sprühtrocknung.
D. Zerkleinern und Sieben
Wenn das Trocknen in einem Sprühtrockner erfolgt, benötigt das erhaltene Produkt keine Zerkleinerung mehr. Beim Trocknen in belüfteten Trocknern auf Platten wird das Produkt in einer Vorrichtung zum Typ Alpina zerkleinert und durch ein Sieb gesiebt, dessen Feinheit mindestens derjenigen eines Siebes No. 180 entspricht.
E. Bestimmung der Wirksamkeit
Die Bestimmung wurde nach folgenden Methoden durchgeführt. Durch Zählen von vorhandenen lebenden Sporen nach der Plattenmethode und durch Ausführung von Bioversuchen an Testinsekten.
Die erhaltenen Produkte werden gemäss den Standard Bestimmungen, welche von den französischen Laboratoires de Lutte Biologique et de Biocinetique de la Miniere (I.N.R.A.) standardisiert.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden im folgenden Beispiele beschrieben, welche jedoch in keiner Weise eine Beschränkung der vorliegenden Erfindung darstellen.
Beispiel 1
Ausgehend von der Kultur vom Bacillus thuringiensis, var. Berliner, wird die Kultivierung in flüssigem belüftetem Medium unter Verwendung von Medium I (siehe oben) nach der beschriebenen Methode durchgeführt. Die Inkubationstemperatur im Laufe der submersen Kultivierung beträgt etwa 28" C. Die Kultur wird mit 150 Umdrehungen pro Minute bewegt und die Belüftungsgeschwindigkeit beträgt 0,5 Liter pro Liter pro Minute. Bei der zwölften bis vierzehnten Kultivierungsstunde wird die Belüftung für 3 bis 6 Stunden unterbrochen. Der Zeitpunkt der Unterbrechung der Belüftung wurde mit Hilfe des Sauerstoffanalysators bestimmt; die Belüftung wurde unterbrochen, sobald der Prozentsatz an Löslichkeit und an Verbrauch von Sauerstoff abnimmt und der pH auf etwa 5,8 abfällt.
Nach 3 bis 6 Stunden wird die Belüftung in derselben Geschwindigkeit von 0,5 Liter pro Liter pro Minute weitergeführt. Die Kultivierung ohne frühe Lyse kann ohne Anaerobiose durchgeführt werden, wenn der pH des Mediums im Bereich von 6,3 bis 6,5 gehalten wird. Die submerse Kultivierung wird weitergeführt, bis die Sporen und das kristalline Endotoxin in das Medium abgegeben werden (durchschnittlich 35 bis 40 Stunden). Das Kulturmedium wird sodann in den Behälter gegeben, in welchem die Reinigung vom wasserlöslichen Exotoxin durchgeführt wird. Die Reinigung erfolgt mittels Dialyse. Hierzu kann eine Vorrichtung verwendet werden, wie in der beiliegenden Figur dargestellt. Das Kulturmedium wird aus dem Fermentator in den Behälter A eingefüllt, welcher mit einem Rührer e und einer Dialysemembran a ausgerüstet ist.
Die Membran kann kolloidal sein oder von jedem anderen in der Praxis üblichen Typus. Die Dialyse erfolgt rascher, wenn deionisiertes Wasser b in den Behälter B zugesetzt wird. Die Gegenwart oder Abwesenheit von wasserlöslichem Exotoxin wird durch den oben beschriebenen Biotest bestimmt. Zu dem erhaltenen Gemisch von Sporen und kristallinen Endotoxinen wird ein pulverförmiges Füllmaterial zugesetzt und das Gemisch in einem Trockenofen auf Platten getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in einem Zerkleinerungsapparat vom Typ Alpina gemahlen und gesiebt, um ein Pulver zu erhalten.
Beispiel 2
Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 ausgeführt, jedoch für die submerse Kultivierung im Fermentator das Nährmedium II (siehe oben) verwendet.
Beispiel 3
Das Verfahren wird wie in Beispiel 1 ausgeführt, jedoch nach der submersen Kultivierung der Bakterien und nach Durchführung der Dialyse, d. h. nach der Reinigung vom Exotoxin, wird das erhaltene Produkt in einem Zentrifugaltrockner getrocknet und anschliessend in einer Alpina-Vorrichtung vermahlen.
Beispiel 4
Das Verfahren wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurde das nach der submersen Kultur der Bakterien und nach Durchführung der Dialyse erhaltene Produkt in einer gewissen Wassermene wieder suspendiert und diese Suspension in einem Sprühtrockner versprüht. Die Temperatur des Trocknens betrug 90 bis 100" C. Am besten eignen sich zu diesem Zweck Sprühtrockner, welche Scheiben mit 10 000 bis 15 000 Umdrehungen pro Minute aufweisen. Das Produkt ist ein sehr feines Pulver, welches weder vermahlen noch gesiebt zu werden braucht. Das Exotoxin ist in diesem Endprodukt nicht vorhanden.
A. Pulverförmiges Präparat BACTUCIDE-P
4,0 Gewichtsprozent der aktiven Komponente mit einer
Wirksamkeit von 15 000 IU/mg 25,0 Gewichtsprozent Aerosil ( Vesalon )
5,0 Gewichtsprozent Jugopon 66,0 Gewichtsprozent Porzellanerde (China-clay)
B. Flüssiges Präparat BACTUCIDE-S
8,0 Gewichtsprozent der aktiven Komponente mit einer
Wirksamkeit von 6000 IU/mg
1,0 Gewichtsprozent Carboxymethylcellulose
0,3 Gewichtsprozent Emulgator
3,0 Gewichtsprozent Erdöl-Kohlenwasserstoffe 87,7 Gewichtsprozent Wasser pH 6,8 bis 7,2
C. Körniges Präparat BACTUCIDE-G 98,0 Gewichtsprozent Calciumcarbonat
2,0 Gewichtsprozent aktive Komponente (2,4- 109 Sporen/g)
Diese Präparate sind besonders wirksam gegen Insekten der Gruppe Lepidoptera.
Die insektizide Wirkung des erfindungsgemäss erhaltenen Sporen des B. thuringiensis und kristallines Endotoxin enthaltenden Produktes kann entweder in Anzahl Sporen pro Gramm des Produktes oder in internationalen Einheiten (I.U.) ausgedrückt werden.
Die in den nachstehenden Präparate-Beispielen enthaltene, nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte aktive Komponente wies eine Wirksamkeit von
1010 Sporen/Gramm der aktiven Komponente
6000 bis 15 000 I.U./mg der aktiven Komponente auf. Hierbei ist zu beachten, dass 100 IU/mg der insektiziden Wirksamkeit einer Standard-Probe E-61 (einem Gemisch von Sporen der Endotoxinkristalle von B. thuringiensis) entspricht, die an Ephestia Kühniella als Testinsekt bestimmt wurde.
Folgende insektizide Präparate wurden hergestellt:
Das flüssige Präparat wird im allgemeinen in einer Menge von 0,8 bis 1,5 Liter/ha, verdünnt mit 500 bis 1000 Liter Wasser, verwendet. Die Verdünnung hängt vor allem von der Art der Applikation, der Anzahl der Insekten und der Dichte der Pflanzen ab. Das Produkt eignet sich auch sehr gut zum Versprühen aus der Luft.
Das pulverförmie Präparat weist ähnliche Eigenschaften und Anwendungsbereiche auf wie das flüssige Präparat. Seine Dosierung beträgt im allgemeinen 0,6 bis 1,0 kg/ha.
Das körnige Präparat (C) eignet sich vor allem zur Bekämpfung von Pyrausta nubilalis in Maisfeldern. Die Dosierung beträgt vorteilhafterweise 30 kg/ha.
Das erfindungsgemäss hergestellte aktive Produkt lässt sich ohne weiteres mit chemischen Insektiziden mischen und weist gute Verträglichkeit damit auf.
Geeignete Mischungen sind z. B.: a) Malathion 0,2 Gewichtsprozent + aktive Komponente 0,12 Gewichtsprozent b) Dimethoat 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent + aktive Komponente 0,15 Gewichtsprozent c) Servin 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent + aktive Komponente 0,15 Gewichtsprozent
Dieselben Wirkungen können mit niedrigeren Konzentrationen an chemischen Insektiziden erzielt werden, indem die Toxizität herabgesetzt wird.
Auch andere chemische Insektizide sind verträglich mit dem erfindungsgemäss erhaltenen Produkt, wie z. B. Methylparathion , Diazinon , DDT , Pyrethrum , Phosdrin usw.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäss erhaltenen Insektizide wurde an etwa 50 verschiedenen Insekten untersucht.
Im folgenden sind einige der wichtigsten Ergebnisse in Tabellen zusammengestellt, wobei in den Versuchen der Tabellen 1 bis 3 das flüssige Präparat BACTUCIDE-S , in denjenigen der Tabelle 4 das körnige Präparat BACTUCIDE-G verwendet wurde.
Tabelle 1
Wirksamkeit gegen Trychoplusia ni auf Kohlpflanzen Menge % getöteter Larven Total der Präparat Dauer des Testes untersuchten Larven Liter/ha 1-5 Tage 5-7 Tage 10 Tage 0,2 20 27 90 180 0,5 63 80 112 220 1,0 75 92 200 222 Kontrolle - - 650
Tabelle 2
Wirksamkeit gegen Hyponomeuta mallinellus auf Äpfeln Menge Insectarium Feldversuche Präparat % Mortalität korr. Mortalität % Mortalität korr.
Mortalität Liter/ha 0,4 15 13,8 12 11,05 0,6 32 31,2 31 30,2 1,0 85 84,2 86,0 85,2 1,5 100 100 100 100
Tabelle 3
Wirksamkeit gegen Heliothis virescens und Heliothis zea auf Tabak- und Baumwollpflanzen Konzentration Tage Baumwolle Tabak an Präparat % Mortalität % Mortalität Liter/ha 0,2 4 30 75 0,5 6 50 100 1,0 8 95 100 1,5 10 100
Tabelle 4
Wirksamkeit gegen Pyrausta nubilalis auf Maispflanzen Präparat Dosis Anzahl Pflanzen mit Durchschnittliche Wirksamkeit kg/ha Pflanzen lebenden Larven Anzahl Larven des Präparates (%) pro Pflanze in % BACTUCIDE-G 20 80 41,0 0,9 82
Die vorliegende Erfindung kann auch für andere Variationen derselben Bakterienart, z. B. Bacillus thuringiensis var.
sotto, Bacillus thuringiensis var. subtoxicus, angewandt werden Alle diese Bakterien sind in der Literatur eingehend beschrieben.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der höheren Wirksamkeit des erhaltenen Produktes auf Grund der ausgezeichneten Reinheit des Produktes in bezug auf Exotoxin bei hohen Ausbeuten an Sporen und kristallinen Endotoxinen.
The present invention relates to a new method for the biosynthesis of a microbial insecticide containing spores and crystalline endotoxin, which is characterized in that the microorganism Bacillus thuringiensis or a related bacillus is cultured in a nutrient medium with spore formation that the aeration early cell lysis caused in the course of the submerged cultivation before the end of spore formation is prevented.
It is known that the early lysis of cells in the course of cultivation leads to low yields and reduced effectiveness of the bioinsecticide and to an increase in its toxicity.
The present invention provides an improved method of generating spores and crystalline endotoxin in the process in which early lysis of bacterial cells usually occurs as a result of enzymatic processes induced by the aeration.
The delay in sporulation during the vegetative growth of bacteria is attributed to the action of one or more inhibitors of a proteinaceous nature. The proteolytic decomposition of proposed inhibitors leads to an onset of spore formation. Apart from this, various theories have been put forward regarding the function of protease, which is one of the early phenomena associated with the onset of sporulation (J. Mandelstam and WM Waites, Biochem. J. Vol. 109, pp. 793-801, 1968 ).
According to Schaeffer, it was suggested that in the course of the growth of bacteria in a rapidly metabolized nutrient substrate and in the presence of a usable nitrogen source, metabolic products arise which would suppress the synthesis of extracellular proteases and an enzyme specific for spore formation, possibly similar to the Krebs cycle (p .
Schaeffer, Bacteriol. Rev., Vol. 33, pages 48-71, 1969).
The result of such suppression is the accumulation of acetic acid and pyruvic acid, which causes a drop in pH and early lysis of bacterial cells in general.
According to a preferred embodiment of the present invention, it has now been possible to prevent the early lysis of bacterial cells during sporulation by carrying out the biosynthesis under anaerobic conditions for 4 to 6 hours and the pH value in the course of the biosynthesis in the range of 6, 3 to 7 holds.
With the help of the present invention, among other things, it became possible to obtain the protein-crystal parasporal bodies (a endotoxin) and to purify them from the water-soluble exotoxin (ss-exotoxin), which has to be removed due to its toxicity for mammals. The best method for removing the exotoxin in accordance with the present invention uses semipermeable membranes.
It is known that the Bacillus thuringiensis group of microorganisms is characterized by the formation of protein-containing parasporal endotoxin crystals. The insect pathogenic nature of Bacillus thuringiensis on a large number of lepidoptic larvae by ingestion is primarily due to the action of endotoxin. In addition to intracellular endotoxin, certain strains of Bacillus thuringiensis also produce an extracellular, water-soluble, heat-stable exotoxin. The term exotoxin is understood here to mean an active substance from living cells that is excreted into the medium, in contrast to endotoxin, which is only released after the cells have completely dissolved.
For a better understanding of the present invention, the characteristics of the toxins mentioned above will be described in more detail.
The crystalline endotoxin
A proteinaceous crystalline inclusion was isolated from the sporulated culture of Bacillus thuringiensis by Hannay and Fitz-James (C.L. Hannay and P. Fitz-James, Can. J. Microbiol., Vol. 1, pp. 694-710, 1955). The electron microscopic studies showed that during the spore formation of Bacillus thuringiensis bacteria, an asporal crystalline body was developed along with the spores. It was further concluded that a new relationship exists between the formation of the spores and the endotoxin crystals. Recent studies have shown that the crystalline endotoxin consists of a high molecular protein component and a silicon skeleton. The spores and the endotoxin crystals can be obtained from the culture medium in the sediment of a high-performance centrifuge.
Separation of the crystalline endotoxin from the spores has been carried out in various ways, e.g. B.
through fractional sedimentation, gradual sedimentation and separation in a two-phase system.
The exotoxin
In addition to the crystalline endotoxin, certain strains of Bacillus thuringiensis excrete a toxic fraction into the medium during the vegetative growth phase, which is chemically related to the adenine nucleotides. There is no relationship between the production of crystalline endotoxin and exotoxin. According to studies, exotoxin can only be produced by certain genotypes of special varieties of Bacillus thuringiensis.
The method for producing exotoxin was developed by De Barjac. According to this method, Bacillus thuringiensis is grown in a medium which contains mineral salts in addition to peptone 0.75% and glucose 1%, for 70 hours at 30 C.
The production of the microbial insecticides according to the present invention is preferably carried out by means of the following steps:
A. Cultivation
The cultures are obtained starting from the spores of a stock culture of the bacteria Bacillus thuringiensis.
The nutrient medium for the production of the vegetative inoculum in shaking bottles contains the following components:
Weight percent
Bacto-trypton (Difco) 0.8
Glucose 2.5 MgSO4 7H2O 0.2 ZnS04 to 7H20 0.2 Fe2 (SO4) 4 0.2 MnSO4 5H2O 0.1
The medium for slant cultures was the same as above with the addition of 2% agar.
Good results were obtained when the cultivation was carried out in the following media:
Medium I.
Weight percent
Molasses (50% solids) 1.4
Yeast 0.3 (NH4) 2S04 0.1
C.S.L. (Corn steeping liquid) 0.1 CaC03 0.1
The pH after sterilization is 6.8.
Or with the medium, which contains starch instead of molasses.
Medium II
Weight percent
Strength 1.3
Yeast 1.0
Na2HP04 0.4
C.S.L. (Maize steeping liquid) 0.2 CaCO3 0.8 pH value after sterilization 6.8.
The nutrient medium for the vegetative inoculum (300 ml) was contained in sterilizable bottles with a flat bottom and a capacity of one liter. The nutrient medium in the bottles was sterilized at 121 ° C. for 45 minutes.
The glucose was sterilized separately by the tinalization method and added aseptically to the sterilized medium. The nutrient medium for cultivation in fermenters was prepared and sterilized in portions in the fermenter for 45 minutes at 121 ° C. The cultivation was carried out in fermenters made of stainless steel.
The culture was agitated at 150 revolutions per minute and the aeration was 0.5 liters per liter per minute and the incubation temperature 28 to 30 C. The application of an anaerobic shock was carried out by interrupting the aeration for 3 to 6 hours at the twelfth hour of submerged cultivation. The time for the interruption of the ventilation was determined with the aid of the oxygen analyzer. The cultivation can be carried out without early lysis of cells and without the application of the anaerobic shock described, if the pH value is regulated in the course of the cultivation in such a way that it does not fall below 6.3. The formation of spores with the release of endotoxin crystals is complete in 35 to 40 hours of cultivation.
B. Separation and Purification
After complete dissolution of the bacteria with the release of spores and endotoxin crystals, the separation of the spores and the crystalline endotoxin from the exotoxin is carried out. Water-soluble exotoxin is preferably removed by dialysis. According to this method, a mixture of spores and crystalline endotoxin, which is non-toxic to mammals, is obtained. The presence or absence of water-soluble exotoxin was determined by the biological test described by Bond et al. is described. A nutrient medium for the biological test was prepared by heating the mixture of 10 g of powdered agar, 500 ml of fresh milk and 7 g of yeast. A 10 ml sample was then transferred to a Petri dish 9 cm in diameter into which 250 μl of the test solution had already been filled.
Once the gels had set, 20 Musca domestica eggs were added. The plates were kept in an incubator at 30 ° C. for 48 hours. The development of larvae and the distraction of the agar gel have been observed (R. P. M. Bond, C. B. C. Boyce and S. J. French, Biochem. J. Vol. 114, pp. 477-488, 1969). The product obtained, which has been freed from the water-soluble exotoxin, can be further processed and used in the manner customary for the production of insecticides.
C. Drying
Drying can be carried out by one of the following methods: - By mixing the obtained mixture of spores and endotoxin crystals with bentonitic clays and introducing it into a ventilated dryer with plates in the form of thin films at a temperature of about 40 to 45 C.
- The mixture obtained is suspended in water and dried in a rotary or pneumatic dryer.
- By spraying the mixture obtained in a spray drying process.
D. Chop and sift
If the drying is carried out in a spray dryer, the product obtained no longer needs grinding. When drying on plates in ventilated dryers, the product is comminuted in a device of the Alpina type and sieved through a sieve, the fineness of which is at least that of a sieve No. 180 corresponds.
E. Determination of effectiveness
The determination was carried out by the following methods. By counting the number of live spores present using the plate method and performing bioassays on test insects.
The products obtained are standardized according to the standard provisions, which are standardized by the French Laboratoires de Lutte Biologique et de Biocinetique de la Miniere (I.N.R.A.).
For a better understanding of the present invention, examples are described below which, however, in no way represent a restriction of the present invention.
example 1
Starting from the culture of Bacillus thuringiensis, var. Berliner, the cultivation is carried out in liquid aerated medium using medium I (see above) according to the method described. The incubation temperature in the course of the submerged cultivation is about 28 "C. The culture is agitated at 150 revolutions per minute and the aeration rate is 0.5 liters per liter per minute. At the twelfth to fourteenth hour of cultivation, the aeration is interrupted for 3 to 6 hours The timing of the interruption of the aeration was determined with the aid of the oxygen analyzer and the aeration was interrupted when the percentage of solubility and consumption of oxygen decreases and the pH drops to about 5.8.
After 3 to 6 hours, aeration is continued at the same rate of 0.5 liters per liter per minute. The cultivation without early lysis can be carried out without anaerobiosis if the pH of the medium is kept in the range of 6.3 to 6.5. The submerged cultivation is continued until the spores and crystalline endotoxin are released into the medium (average 35 to 40 hours). The culture medium is then placed in the container in which the purification from the water-soluble exotoxin is carried out. The cleaning is done by dialysis. For this purpose, a device can be used as shown in the accompanying figure. The culture medium is poured from the fermenter into container A, which is equipped with a stirrer e and a dialysis membrane a.
The membrane can be colloidal or of any other type common in practice. Dialysis is faster if deionized water b is added to container B. The presence or absence of water-soluble exotoxin is determined by the bioassay described above. A powdery filler material is added to the resulting mixture of spores and crystalline endotoxins, and the mixture is dried on plates in a drying oven. The product obtained is ground and sieved in an Alpina type grinder to obtain a powder.
Example 2
The process is carried out as in Example 1, but nutrient medium II (see above) is used for submerged cultivation in the fermenter.
Example 3
The procedure is carried out as in Example 1, but after the submerged cultivation of the bacteria and after carrying out the dialysis, i. H. After the exotoxin has been purified, the product obtained is dried in a centrifugal dryer and then ground in an Alpina device.
Example 4
The process was carried out as in Example 1, but the product obtained after the submerged culture of the bacteria and after carrying out the dialysis was resuspended in a certain amount of water and this suspension was sprayed in a spray dryer. The drying temperature was 90 to 100 "C. Spray dryers which have disks with 10,000 to 15,000 revolutions per minute are best suited for this purpose. The product is a very fine powder which does not need to be ground or sieved. The exotoxin is not present in this end product.
A. Powdered preparation BACTUCIDE-P
4.0 percent by weight of the active component with a
Efficacy of 15,000 IU / mg 25.0 percent by weight Aerosil (Vesalon)
5.0 percent by weight Jugopon 66.0 percent by weight china clay (China clay)
B. BACTUCIDE-S liquid preparation
8.0 percent by weight of the active component with a
Potency of 6000 IU / mg
1.0 weight percent carboxymethyl cellulose
0.3 weight percent emulsifier
3.0 weight percent petroleum hydrocarbons, 87.7 weight percent water pH 6.8 to 7.2
C. Granular preparation BACTUCIDE-G 98.0 percent by weight calcium carbonate
2.0 percent by weight active component (2.4-109 spores / g)
These preparations are particularly effective against insects of the Lepidoptera group.
The insecticidal effect of the product containing spores of B. thuringiensis and crystalline endotoxin obtained according to the invention can be expressed either in the number of spores per gram of the product or in international units (I.U.).
The active component produced by the process according to the invention and contained in the preparation examples below showed an effectiveness of
1010 spores / gram of active component
6000 to 15,000 I.U./mg of the active component. It should be noted that 100 IU / mg corresponds to the insecticidal effectiveness of a standard sample E-61 (a mixture of spores from the endotoxin crystals of B. thuringiensis), which was determined on Ephestia Kühniella as the test insect.
The following insecticidal preparations were made:
The liquid preparation is generally used in an amount of 0.8 to 1.5 liters / ha diluted with 500 to 1000 liters of water. The dilution depends mainly on the type of application, the number of insects and the density of the plants. The product is also very suitable for air spraying.
The powdery preparation has similar properties and areas of application as the liquid preparation. Its dosage is generally 0.6 to 1.0 kg / ha.
The granular preparation (C) is particularly suitable for controlling Pyrausta nubilalis in maize fields. The dosage is advantageously 30 kg / ha.
The active product produced according to the invention can be mixed easily with chemical insecticides and has good compatibility therewith.
Suitable mixtures are e.g. B: a) Malathion 0.2 percent by weight + active component 0.12 percent by weight b) Dimethoate 0.1 to 0.2 percent by weight + active component 0.15 percent by weight c) Servin 0.1 to 0.2 percent by weight + active component 0 , 15 weight percent
The same effects can be achieved with lower concentrations of chemical insecticides by reducing toxicity.
Other chemical insecticides are compatible with the product obtained according to the invention, such as. B. Methylparathion, Diazinon, DDT, Pyrethrum, Phosdrine etc.
The effectiveness of the insecticides obtained according to the invention was investigated on about 50 different insects.
Some of the most important results are summarized in tables below, the liquid preparation BACTUCIDE-S being used in the experiments in Tables 1 to 3 and the granular preparation BACTUCIDE-G being used in those in Table 4.
Table 1
Efficacy against Trychoplusia ni on cabbage plants Amount% of larvae killed Total of the preparation Duration of the test larvae examined liters / ha 1-5 days 5-7 days 10 days 0.2 20 27 90 180 0.5 63 80 112 220 1.0 75 92 200 222 control - - 650
Table 2
Efficacy against Hyponomeuta mallinellus on apples Amount of Insectarium field trials preparation% mortality corr. Mortality% mortality corr.
Mortality liters / ha 0.4 15 13.8 12 11.05 0.6 32 31.2 31 30.2 1.0 85 84.2 86.0 85.2 1.5 100 100 100 100
Table 3
Efficacy against Heliothis virescens and Heliothis zea on tobacco and cotton plants Concentration days cotton Tobacco on preparation% mortality% mortality liters / ha 0.2 4 30 75 0.5 6 50 100 1.0 8 95 100 1.5 10 100
Table 4
Efficacy against Pyrausta nubilalis on maize plants Preparation dose Number of plants with average effectiveness kg / ha of plants living larvae Number of larvae of the preparation (%) per plant in% BACTUCIDE-G 20 80 41.0 0.9 82
The present invention can also be used for other variations of the same bacterial species, e.g. B. Bacillus thuringiensis var.
sotto, Bacillus thuringiensis var. subtoxicus, can be used. All these bacteria are described in detail in the literature.
An advantage of the present invention lies in the higher effectiveness of the product obtained due to the excellent purity of the product with regard to exotoxin with high yields of spores and crystalline endotoxins.