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Verfahren zur Herstellung von Vitaminsubstanzen Die Erfindung bezieht
sich auf die Herstellung von therapeutisch und ernährungsmäßig wertvollen Vitaminsubstanzen,
insbesondere solchen, welche wachstumsfördernde Eigenschaften für den Mikroorganismus
Lactobacillus Lactis Dorner besitzen. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf
ein verbessertes Verfahren für die mikrobiologische Herstellung von Vitamin B12
enthaltenden Substanzen und zur Gewinnung von Vitamin B12 in reiner Form. Vitamin
B12 ist eine aus der Leber stammende wasserlösliche rote kristalline Verbindung,
die besonderen Wert besitzt für die Behandlung gewisser Arten von Anämie bei Menschen,
insbesondere der perniciösen Anämie, und die einen wertvollen Nährfaktor für Tiere
darstellt.
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Die erfindungsgemäß herstellbaren Vitaminsubstanzen, wie z. B. Vitamin
B12, werden üblicherweise erprobt, indem man das Wachstum der Mikroorganismen Lactobacillus
Lactis Dorner unter Versuchsbedingungen verwendet, welche durch S h o rb (J. Biol.
Chem. 169, S. 455 und 456) beschrieben sind. Die Aktivitäten dieser Vitaminsubstanzen
und der fermentierten Flüssigkeiten und Konzentrate werden ausgedrückt durch die
LLD-Aktivität auf Basis eines Leberstandard-Präparats, - das eine Potenz von zooo
LLD-Einheiten pro mg hat. Es wurde festgestellt, daß reines kristallines Vitamin
B12 eine LLD-Aktivität von etwa zz Millionen LLD-Einheiten pro mg aufweist.
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Vitaminsubstanzenvon LactobacilluS-LactiS-DOrner-Aktivität (LLD-Aktivität)
können durch Gärung von Nährmedien mit Hilfe ausgewählter Stämme verschiedener Species
von subphyllum Fungi hergestellt werden. Die Stärke der durch die Gärung gewöhnlicher
Nährmedien
mit diesen Organismen entstehenden Gärflüssigkeiten ist jedoch im Vergleich zu der
Stärke des reinen Vitamins B12 sehr gering. Die auf diese Art gewonnenen Produkte
weisen je nach der Art des verwendeten Fungus einen sehr unterschiedlichen Gehalt
an LLD-aktiven Stoffen auf; im allgemeinen zeigen sie eine LLD-Aktivität, die einem
Vitamin-B1,-Gehalt von 0,00003 mg/ccm entspricht. Reines Vitamin B12 oder
hochwirksame LLD-aktive Konzentrate lassen sich von den großen Mengen der in den
Nährmedien befindlichen Verunreinigungen nur sehr schwer trennen.
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Es wurde nun gefunden, daß man die LLD-Wirksamkeit der Gärflüssigkeit
erheblich steigern und gleichzeitig auch den Gehalt der LLD-wirksamen Stoffe der
Gärflüssigkeit erheblich erhöhen kann, wenn man LLD Aktivität erzeugende Fungi-Stämme
in wäßrigen Nährmedien züchtet, die entweder Kobalt enthalten oder denen Kobalt
zugefügt wird. Hierdurch erhält man eine Endflüssigkeit von wesentlich gesteigerter
LLD-Wirksamkeit und eine starke Erhöhung der Vitamin-B"-Konzentration in bezug auf
den Gesamtfeststoffgehalt der Gärflüssigkeit. Diese erhöhte mikrobiologische Ausbeute
an LLD-wirksamen Stoffen erleichtert nicht nur die Isolierung des Reinvitamins B12
aus der vergorenen Flüssigkeit, sondern ermöglicht auch die vorteilhafte Verwertung
des Feststoffgehalts der Gärflüssigkeit als wertvollen Zusatz für Viehfutter.
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Es ist zwar schon versucht worden (vgl. biochem. Zeitschrift,
132, S.563 bis 565 [z922]), das Mycelwachstum auf Aspergillus-niger-Kulturen
durch den Zusatz großer Mengen Zink-, Kobalt- oder Quecksilbersalze zu beeinflussen.
Hierbei wurde aber die Beobachtung gemacht, daß durch den Zusatz solcher Salze zwar
das Mycelwachstum beschleunigt werden kann, gleichzeitig aber die Bildung des Stoffwechselproduktes
- Oxalsäure - sehr stark zurückging, teilweise sogar vollständig unterblieb. Diese
Versuchsergebnisse führten allgemein zu der Auffassung, daß die Zink- und die Kobaltsalze
auf Mikroorganismen einen toxischen Effekt ausüben.
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Es war daher völlig überraschend, daß durch den Zusatz von Kobalt
zu dem Nährmedium die Gewinnung von LLD-wirksamen Stoffen, wie Vitamin B12, auf
mikrobiologischem Wege erhöht werden konnte.
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Wie gefunden wurde, wirkt Kobalt erst in höheren Konzentrationen auch
auf die LLD-wirksame Stoffe erzeugenden Fungi-Stämme toxisch. So verhindert z. B.
eine Kobaltmenge in Form von Kobaltnitrat in einem Überschuß von mehr als 2o Teilen
je z ooo ooo Teile des Nährmediums die Bildung der LLD-wirksamen Stoffe durch den
besonders empfindlichen Fungus. Streptomyces griseus.
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Die erfindungsgemäß anzuwendenden .Mengen von Kobalt können je nach
dem verwendeten Nährmedium schwanken. Im allgemeinen kann man aber etwa o,z bis
2o Teile Kobalt auf z ooo ooo Teile Nährmedium verwenden. Im übrigen richtet sich
die anzuwendende Kobaltmenge auch nach der toxischen Wirkung auf den jeweiligen
Organismus.
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Bei Zusatz von etwa 2 Teilen Kobalt in Form von Kobaltnitrat auf r
ooo ooo Teile des Nährmediums würden- Gärflüssigkeiten von hoher LLD-Wirksamkeit
erhalten, aus denen hohe Ausbeuten an kristallinem Vitamin Bit gewonnen werden konnten.
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Das Kobalt kann als Metall zugesetzt werden. Vorteilhaft wird es in
Form einer Kobaltverbindung, vorzugsweise eines Kobaltsalzes, wie z. B. Kobaltnitrat,
angewendet. Man kann auch in der Natur vorkommende Kobaltsalze oder kobalthaltige
Komplexe verwenden, wie sie in kobaltreichen mikrobischen Nährmedien vorliegen können.
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Bei der Verwirklichung der Erfindung können Nährmedien Verwendung
finden, die bei der Züchtung von Fungi gewöhnlich benutzt werden. Die Erzielung
der LLD-Wirksamkeit kann bei Anwendung eines bestimmten Fungus von dem verwendeten
Nährmedium abhängen. Wie gefunden wurde, führen aber Zusätze geringer Kobaltmengen
regelmäßig zu Steigerungen der Ausbeuten an LLD-wirksamen Stoffen.
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Die anzuwendenden Nährmedien enthalten im allgemeinen assimilierbaren
Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff, anorganische Salze und erforderlichenfalls
noch Wachstumsfaktoren. Der Kohlenstoff kann in Form von Kohlehydraten, wie Dextrose,
Maltose, Xylose, Invertzucker, Maissyrup, in das Nährmediurh eingeführt werden.
Der Stickstoff kann in Form von Ammonsalzen, Aminosäuren oder Proteinen, wie Sojabohnenmehl,
Hafer, Hefe, Hefeextrakten, tryptisch verdautem Casein, Fleischextrakt, Blutmehl,
Fleisch, Knochenmehl, Fischmehlen, löslichen Anteilen von Schlempen vorhanden sein.
Erforderlichenfalls können die Fungi unter Verwendung von Proteinen oder Aminosäuren
auch in Abwesenheit von Kohlehydraten in Nährmedien gezüchtet werden, wobei die
Proteine (oder Aminosäuren) den von dem Mikroorganismus benötigten Kohlenstoff und
Stickstoff liefern.
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Die erfindungsgemäß in Form ausgewählter Stämme anzuwendenden Mirkoorganismen
gehören zu den Fungi, wie solche in dem Werk »Introduction to industrial Mycqlogy«
von Smith und Raistrick (London, Edward Arnold & Co., 3. Auflage, z946) beschrieben
sind. Es sind Myxomyceten, Schizomyceten und Eumyceten. Als besonders geeignet haben
sich Schizomyceten und insbesondere gewisse Stämme von Streptomyces griseus erwiesen,
die auch für die Herstellung der Antibiotica Streptomycin und Grisein verwendbar
sind. Andere Streptomycesarten, wie Streptomyces- albidoflavus, Streptomyces colombiensis
nov. sp.,.Streptomyces roseochromogenus und Streptomyces antibioticus, weisen Stämme
auf, die hohe Ausbeuten an LLD-wirksamen Stoffen ergeben. Andere geeignete Schizomyceten
gehören zum Genus Clostridium. Es wurde unter anderem gefunden, daB ausgewählte
Stämme der folgenden Species unter den Fermentationsbedingungen gemäß Erfindung
LLD-wirksame Stoffe bilden: Clostridium tetanomorphum, Clostridium cochlearium,
Clostridium flabelliferum und Clostridium butyricum. Weitere Mikroorganismen unter
den Fungi, die in ähnlicher Art LLD-Wirksamkeit erzeugen, sind Torula, Eremothecium
ashbyü und Escherichia coli. Es sei indessen hervorgehoben, daß für jede bestimmte
Fungusspecies Stämme ausgewählt werden müssen, die LLD-wirksame Stoffe zu
erzeugen
vermögen. Die Erfindung ist weder auf bestimmte Fungi beschränkt, noch umfaßt sie
jeden Stamm eines bestimmten Fungus. Andererseits wird jeder untersuchte Mikroorganismus,
der LLD-wirksame Stoffe erzeugt, diese LLD-wirksamen Stoffe in einer beträchtlich
gesteigerten Ausbeute liefern, wenn er in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet wird,
das einen optimalen Kobaltgehalt aufweist.
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Das Nährmedium wird sterilisiert und das eine geeignete Kobaltmenge
enthaltende sterile Medium mit einer Kultur des ausgewählten Fungus geimpft, worauf
das Gemisch bis zur Erreichung der optimalen LLD-Wirksamkeit bebrütet wird. Der
Gärvorgang dauert gewöhnlich etwa 2 bis 7 Tage. Doch können auch kürzere oder längere
Gärungszeiten in Frage kommen. Das Bebrüten erfolgt vorteilhaft submers unter Belüftung
und bei bestimmten, für jeden spezifischen Fungus vorgesehenen Temperaturen.
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Die Isolierung des Vitamins B12 in kristalliner Form aus dem vergorenen
Gemisch kann durch Filtrieren der Gärflüssigkeit und Behandeln der filtrierten Flüssigkeit
mit Aktivkohle, die das Vitamin B12 adsorbiert, erfolgen. Die Aktivkohle wird dann
mit einer wäßrigen Pyridin- oder a-Picohnlösung ausgewaschen und das Eluat zur Trockne
eingedampft. Das feste Konzentrat wird mit einem niederen aiiphatischen Alkohol,
z. B. Methylalkohol, ausgezogen und der alkoholische Extrakt durch eine mit aktiver
Tonerde beschickte Kolonne geführt, in der das Vitamin B12 von der Tonerde adsorbiert
wird. Die Kolonne wird sodann mit einer weiteren Menge des niederen aliphatischen
Lösungsalkohols beschickt, worauf diejenigen Anteile des Eluats, die auf Grund einer
mikrobiologischen Prüfung Vitamin-B,-Wirksamkeit aufweisen, vereinigt und die vereinigten
Eluate eingeengt werden. Die eingeengte alkoholische Lösung wird nun mit einer mit
ihr mischbaren Flüssigkeit vermischt, in der die wirksame Substanz unlöslich ist.
Hierfür kommt z. B. Aceton in Frage. Der entstehende Niederschlag wird durch Umfällen
aus Alkohol unter Zusatz von Aceton gereinigt und das erhaltene Produkt durch Umkristallisieren
aus Wasser unter Zusatz von Aceton weitergereinigt. Man erhält so das kristalline
Vitamin B12.
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Beispiel s Nährmedien, welche 9,0/, Trockenhefe in destilliertem Wasser
und verschiedene Mengen von Kobalt (als Koba.Itnitrat) enthalten, wurden #n Mengen
von je 4o ccm im Erlenmeyer-Kolben eingefüllt. Nach Sterilisierung der Füllungen
durch 1/2stündige Behandlung bei 12o° wurden die Flaschen mit etwa 2,5 Volumprozent
einer 48stündigen vegetativen Kultur von Streptomyces griseus 25 G geimpft, die
auf einem Fleischextrakt und tryptisch verdautes Casein enthaltendem Nährmedium
gewachsen waren. Die geimpften Flüssigkeiten wurden unter ständigem Schütteln auf
einer Rotationsmaschine 4 Tage bei 28° gehalten. Nach Beendigung der Fermentierung
wurden die Aktivitäten der Gärflüssigkeiten mit Hilfe von Lactobacillus Lactis Dorner
ermittelt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Kobaltgehalte der einzelnen Proben
und die ermittelten LLD-Einheiten je ccm.
LLD-Einheiten/ccm |
Teile Kobalt pro Million der fermentierten |
Flüssigkeit |
0 300 |
1 276o |
2 - 3000 |
10 460o |
20 3000 |
Beispiel 2 Ein Nährmedium, das
80/, Fleischeiweiß und Knochenmehl, o,5 °/o
Chlornatrium und 15 Teile Fe S04 - H20 pro Million enthielt und mit destilliertem
Wasser auf Zoo °% aufgefüllt war, wurde, wie im Bei-'spiel 1 beschrieben, sterilisiert,
beimpft und fermentiert. Eine zweite Portion des gleichen Mediums wurde mit 2 Teilen
pro Million in Form von Kobaltnitrat versetzt und in gleicher Weise sterilisiert,
beimpft und fermentiert.
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Die fermentierte kobaltfreie Gärflüssigkeit zeigte 16o LLD-Einheiten/ccm,
während die mit Kobalt versetzte Gärflüssigkeit 5g0 LLD-Einheiten/ccm aufwies. .
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Beispiel 3 Fermentationsmedien, welche i0/,) tryptisch verdautes Casein,
0,304 Fleischextrakt, 0,50/, Chlornatrium, 0,150/, Sojabohnenöl (letzteres als Schaumbildung
verhinderndes Mittel), So Teile Fe S04 - 7 H20 pro Million enthielten und mit Wasser
auf Zoo °/o aufgefüllt waren, wurden in einem 113551 fassenden Fermentator hergestellt
und sterilisiert. Das Medium wurde mit 10401 eines vegetativen Wachstums eines Grisein
produzierenden Stammes von Streptomyces griseus (bezeichnet als 25 G) beimpft und
die Mischung 48 Stunden bei 28° unter Umrühren im submersen Verfahren unter Vermeidung
von Luftzutritt fermentiert. Die vergorene Flüssigkeit wurde mit Hilfe von Lactobacillus
Lactis Dorner als. Testmittel geprüft und alsdann zwecks Gewinnung von kristallinem
Vitamin B12 weiterbehandelt. Hierbei wurde die Flüssigkeit filtriert und das darin
befindliche aktive Material mit Hilfe von Aktivkohle adsorbiert; das Kohleadsorbat
wurde mit einer wäßrigen Lösung von Pyridin ausgezogen und der Extrakt unter vermindertem
Druck zur Trockne eingedampft. Das erhaltene feste Konzentrat wurde mit Methylalkohol
ausgezogen und der alkoholische Extrakt durch eine mit aktiver Tonerde beschickte
Kolonne geleitet und das aktive Material mit Hilfe von frischem Mathylallkohol ausgezogen.
Diejenigen Fraktionen, welche ausgeprägte mikrobiologische Aktivität zeigten, wurden
zusammen konzentriert. Aus der konzentrierten Lösung wurde durch Zugabe von Aceton
rohes Vitamin B12 niedergeschlagen und gewonnen. Das
Rohprodukt
wurde durch Lösen in Äthylalkohol und Zugabe von Aceton in gereinigter Form ausgefällt.
Das so erhaltene Produkt kann durch Kristallisation aus einem Wasser-Aceton-Gemisch
als reines kristallines Vitamin Bit gewonnen werden.
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Bei Durchführung des vorstehenden Verfahrens ohne Zusatz von -Kobalt
zeigte die vergorene Flüssigkeit 173 LLD-Einheiten/ccm. Die Ausbeute an Vitamin
B12 (Kristallen) betrug 18,4 mg. Bei Zugabe von 2 Teilen Kobalt pro Million zeigte
die vergorene Flüssigkeit 225o LLD-Einheiten/ccm. Die Ausbeute an kristallinem Vitamin
B12 betrug 1o6,7 mg.
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Beispiel 4 Ein Fermentationsmedium, das 3)/, Sojabohnenmehl, 20/,
Dextrose, 0,--50/, NaCl,
0,750/, bei der Destillation von Trinkalkohol anfallende
Schlempe enthielt und mit Wasser auf Zoo °/o aufgefüllt wurde, wurde in 25o-ccm-Erlenmeyer-Kolben
aufgeteilt, von denen jeder mit 40 ccm dieses Mediums beschickt wurde. Den einzelnen
Proben wurden verschiedene Mengen von Kobalt in Form von Kobaltnitrat zugeführt.
Die Flaschenfüllungen wurden durch 1/2stündiges Erhitzen auf 12o° sterilisiert.
- Die Flaschen wurden mit etwa 2,5 Volumprozent einer 48 Stunden alten vegetativen
Kultur eines Streptomycin produzierenden Stammes von Streptomyces griseus beimpft.
Die beimpften Proben wurden 3 Tage unter ständigem Schütteln auf 27° gehalten. Nach
Vergärung wurden die Streptomycin- und LLD-Aktivitäten ermittelt. Die Ergebnisse
finden sich in nachfolgender Tabelle:
Teile Kobalt Steptomycin LLD |
pro Million y/ccm Einheiten/ccm |
0,0 85o- 300 |
o,5 825 3000 |
1,0 845 3100 |
2,0 650 4200 |
4,0 235 5000 |
6,o < 150 2400 |
8,o < 150 2000 |
12,0 < 150 220 |
Beispiel 5 Ein Nährmedium, enthaltend 18,5 g einer Hirn-Milz-Infusion, 1,85 g Agar,
495 ccm Wasser, p$ = 7 bis 7,2, wurde in Portionen von je ioo ccm aufgestellt und
diese Portionen in Erlenmeyer-Kolben, deren Fassungsvermögen je 125 ccm betrug,
eingefüllt. Die Füllungen wurden durch 25 Minuten dauerndes Erhitzen auf i2o° sterilisiert,
dann auf 37° gekühlt und die Flaschen mit je i ccm einer Suspension von Clostridium
tetanomorphum, die anaerob auf einem Barto-Hirn-Herz-Medium gewachsen war, beimpft.
Der Bacto-Hirn-Herz-Nährboden hat folgende Zusammensetzung Wasserfrei Rinderleber-Infusion
. . . . . . . . . . . . . . . .
50,009
Kalbhirn-Infusion ..................
2oo,0o g Rinderherz-Infusion ................. 25o,oo g Pepton.............................
13,259 Trypton............................
3,259
Dextrose ..........................
2,oo g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,00 g Dinatriumphosphat
. . . . . . . . . . . . . . .
2,509
Agar............................... 1,759
Die beimpften Proben wurden unter stationären Bedingungen bei 37° 4 bzw. 7 Tage
gehalten.
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Eine zweite Gruppe von Flaschen, welche dieselben Beschickungen, aber
mit Zusätzen von io ,u Kobaltnitrat Hexahydrat pro ccm erhielten (entsprechend 2
Teilen von Kobalt auf 1 ooo ooo Teile des Mediums) wurden in gleicher Weise sterilisiert,
beimpft und fermentiert.
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Die Ergebnisse der Vergleichsversuche, welche nachstehend aufgeführt
sind, stellen Durchschnittswerte von je vier Versuchen dar.
Fermentations- LLD-Aktivität/ccm |
- periode Kein Kobalt 2 Teile Kobalt pro |
Tage Million |
4 66o 46oo |
7 76ö 6500 |