DE1695318B2 - Verfahren zur Herstellung von ö-Mercaptoparinribosyl-S'-monophosphat. Ausscheidung aus: 1268622 - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von ö-Mercaptoparinribosyl-S'-monophosphat. Ausscheidung aus: 1268622

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Kioshi Kamitsuruma Sagamihara Nakayama
Zenroku Minami-Oya Machida Sato
Haruo Setagaya Tokio Tanaka
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Description

Il
HO—Ρ—Ο—CH
OH
OH OH
to
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung »on o-Mercaptopurinribosylo'-monophosphat. Die-•er Verbindung entspricht die Formel
35
40
45
Aus. J. Biol. Chem. 236 (1961), S. 1158 bis 1162. ist es bekannt, o-Mercaptopurinribosyl-S'-monophosphat auf chemischem Wege herzustellen.
In J. Biol. Chem. 231 (1958), S. 467 bis 480, ist ferner die Herstellung dieser Verbindung auf enzymatischem Wege unter Verknüpfung des 6-Mercaptopurinrests mit dem 5-Ribosylphosphatrest beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von 6-Mercaptopurinribösyl-S'-monophosphat zur Verfügung zu stellen, das in wirtschaftlicher Weise und im industriellen Mäßstab durchführbar ist.
fM&se Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß fn&n 6revfbacterwm ammoniagenes ATCC «0 w. Μ7Ϊ, fetvfeactertörti ammoniagenes ATCC Nr. 687a, fcrevtbaeteritiin «mrtiöwtegenes ATCC 1Nr. 15 750 oäe? SrevfbatteriaTfi «mnioniagenes ATCC Nr. i 5 "751 *h einem Penmemattioftsmeduim, das außer den üblichen Bestandteilen 6-Mercaptöpurin m einer ■Kön^öhtf ittfon von etwa 0,1 bis 10 g je Liter Medium ^rtfhafo, taei einer Temperatur von 20 bis 40 C und «ifieffi pVhXVert von 3.5 bis 9 züchtet «nd -das ifn Kulturmedium angereicherte o-Mercapiapurinribosyl-S'-monophosphat nach öblicben Metltoden isoliert.
Während des Züchten« der genannten Mikroorganismen unter den angegebenen Bedingungen sammeln sich erhebliche Mengen 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophospbat in dem Medium an.
Als NShrmedium kann bei dem erfindungsgemäüen Verfahren jedes Medium verwendet werden, das eine Koblenstoffquelle, wie z. B. Kohlenhydrate (z. B. Glukose, Stärkehydrolyseprodukte und Melassen), eine SUckstoffquelle {z.B. Harnstoff. Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrate anorganische Substanzen (z. B. Kaliumpbosphat, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid) und stickstoffhaltige Naturprodukte (z. B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Pepton und Fischmehl» in geeignetem Mengenverhältnis enthält. Derartige Nährmedien sind für die Bakterienzüchtung bekannt Wenn einer der genannten Stämme von einem bestimmten Nährstoff abhängig ist. so nr»8 natürlich dieser Nährstoff in dem Medium enthalten sein.
Das 6-Mercaptopurin kann vom Anfang der 1 -er mentation an in dem Medium enthalten sein oder dem Fermentationsmedium während des Verlaufs der Fermentation zugegeben werden. Wenn das 6-Mcrcaptopurin während des Verlaufs der Fermentation zugegeben wird, kann die Zugabe auf einmal oder m mehreren Anteilen erfolgen.
Das 6-Mercaptopurin kann bei dem erfindung>,-gemäßen Verfahren auch in Form eines Derivats eingesetzt werden, das in dem Medium 6-Mercaptopurin Γη situ bildet. Als solche Derivate des 6-Mercaptopurins kommen z. B. Salze, wie z. B. das Sulfat, des 6-Mercaptopurins in Betracht.
Die Konzentration des 6-Mercaptopurins in dem Medium beträgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie oben angegeben ist, 0.1 bis 10 g je Liter Medium. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich liegt bei 1 bis 5 g je Liter Medium.
Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, wie z. B. in einer Schüttelkultur oder einer Submerskultur unter Belüften und Rühren, bei einer Temperatur von 20 bis 40" C und einem pH-Wert von 5,5 bis 9,0 durchgeführt. Die Züchtungsdauer beträgt im allgemeinen 2 bis 8 Tage. Die bei der Züchtung gebildeten erheblichen Mengen 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophosphat sammeln sich in dem Medium und in den Zellen an.
Das 6 - Mercaptopurinribosyl - 5' - monophosphat kann nach Beendigung der Züchtung nach an sich bekannten Methoden, wie z. B. durch Behandeln mit Ionenaustauscherharze^ durch Adsorption, durch Fällen oder Extrahieren, aus dem Medium isoliert werden.
In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentangaben, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.
Beispiel I
Is w#d eine Impfkuiter !hergestellt, intern &r«vibacteria«» amfnoniagenes ÄTOC ί*.ίί8?2 in «mem Medium, 4as 2% Qlcflcöse, I % Pejfton, 1 % fäsifeextrakt, 0,3% NaQ tmä 3Ö μ^/LÄter Siötin enÄiSh, 24 Standen bei 300C «ftgexächtet -wird. !Das 'Fernenta t iöfremediöTfi wird mn 10 Völämprozsm dieser fottpfkulttir angehnpft. leide Medien wwäen verwendet, nachdem 20-cctn-Anteiie to iSO-ccm-Britemiieyerieöl' ben gebracht und sodann sterilisiert worden waren.
Die Züchtung wird bei 30 C in einer Schlitteikultur durchgeführt Das Fermentationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:
Glukose IQQg
Harnstoff 6g
KHjPO4 lOg
K2HPO4 10g
MgSO4-7H,O !Og '
CaQ2 -2H2O 0.1g
Hefeextrakt 10 g
Biotin 30;xg
Die obigen Bestandteile werden in Wasser unter Auffüllen auf 11 gelöst Sodann werden die obengenannten Anteile der hergestellten Lösung nach Einstellen des pH-Wertes auf 8,0 — was mit Hilfe von
L· NaOH erfolgt — in die Kolben gegeben und in einem
|J: Autoklav unter einem Druck von I kg/cm210 Minuten
ζ sterilisiert.
H Wenn nach 72stündiger Züchtung dem Fermentationsmedium 6-Mercaptopurinsulfat in einer Menge von 2 mg/m! Fermentationsmedium zugesetzt und weitere 24 Stunden gezüchtet wird, haben sich 3,3 mg/ml 6 - Mercaptopurinribosyl - 5' - monophosphat gebildet und in dem Fertnentationsmedium angesammelt.
Das gebildete 5'-Ribosylphosphat des 6-Mercaptopurins wird in der folgenden Weise isoliert: Das durch Entfernen der Zellen aus der Züchtungsflüssigkeit erhaltene Filtrat (1,21) wird mit Aktivkohle behandelt, das an der Aktivkohle adsorbierte 5'-Ribosylphosphat des 6-Mercaptopurins wird mit 50%igem wäßrigem Äthanol, das 3% Ammoniak enthä't, eluiert. Das im Eluat enthaltene Ammoniak wird durch Abdampfen unter Vakuum entfernt Die erhaltene Lösung wird durch eine Säule siegeben, die mit einem stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscherhare beschickt ist Pie Harzsäule, die das S'-Ribosylphospbat des 6-Mercaptopurins adsorbiert enthält, wird mit Wasser
s gewaschen und sodann gradientenmäßig in der angegebenen Reibenfolge mit 0,01 n-HCL 0,05 n-HCl, 0,1 n-HCl und 0,Sn-MCl eluiert. Die Eluatfraktionen, die das o-Mercaptopurinribosyl-S'-phosphat enthalten, werden eingeengt und nach der Zugabe von Äthanol
ίο gekühlt Das abgeschiedene S'-Ribosylpbospbat des 6-Mercaptopurins wird durch Abzentrifugieren gewonnen und getrocknet. Die Ausbeute at 6-Mercaptopurinribosy!-5'-monophosphat beträgt 1,6 g.
'S Beispiel 2
Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet mit der Abwandlung, daß die in der Tabelle aufgeführten Stämme verwendet werden, wobei die in der Tabelle angegebenen Mengen an 6-Mercaptopurinribosy!-5'-phosphat gebiJde: und im Züchtungsmedium angereichert werden.
Tabelle
Mikroorganismen 6-Mercaptopurin-
ribosy!-5'-phosphai
(mg ml)
Brevibacterium ammoniagenes
ATCC Nr. 6871
Brevibacterium ammoniagenes
ATCCNr. 15 750
Brevibacterium ammoniagenes
ATCCNr. 15 751 		0,6
2,1
3.4

Claims (1)

  1. I 695318
    Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von 6-Mercaptopurinrfbosyl'5'-monopbospbat, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium araroonJagenes ATCC Nr. 6871, Brevibacterium aramoniagenes ATCC Nr. 6872, Brevibacterium amraoniagenesATCCNr. 15 750 oder Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 15 751 meinem Fermentationsmedium, das außer den üblichen Bestandteilen 6-Mercaptopurin in einer Konzentration von etwa ö,l bis 1Of je liter Medium enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 40° C und einem pH-Wert von 5,5 bis 9 züchtet und das im Kulturmedium angereicherte 6-Mercaptopurinribosyl-5'-raonophosphat nach üblichen Metboden isoliert.
DE1695318A 1963-11-27 1964-11-24 Verfahren zur Herstellung von 6-Mercaptopurinribosyl-5'-monophosphat Expired DE1695318C3 (de)

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