DE1261468B

DE1261468B - Verfahren zur biochemischen Herstellung von D-Ribose

Info

Publication number: DE1261468B
Application number: DEK53465A
Authority: DE
Inventors: Shukuo Kinoshita; Kunizo Mizuhara; Takeo Suzuki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1963-03-08
Filing date: 1964-07-14
Publication date: 1968-02-22
Also published as: BE651090A; DE1295505B; NL6408606A; CH476025A; ES307168A1; US3303101A; FR1411111A; BR6461184D0; ES302471A1; GB1067840A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C12d

Deutsche Kl.: 6b-16/03

Nummer: 1261 468

Aktenzeichen: K 53465 IV a/6 b

Anmeldetag: 14. Juli 1964

Auslegetag: 22. Februar 1968

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Herstellung von D-Ribose durch Züchtung von Mikroorganismen in geeigneten Medien.

Bei den bisherigen Verfahren zur Herstellung von D-Ribose (z. B. durch Hydrolyse von Hefenucleinsäure) erfolgt eine Zersetzung von ribonucleinsäurehaltigen Substanzen. Diese Verfahren sind daher ziemlich kostspielig, über die Herstellung von D-Ribose durch direkte Fermentation mit Mikroorganismen ist bisher noch nicht berichtet worden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur biochemischen Herstellung von D-Ribose, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Mikrococcus glutamicus ATCC Nr. 15 455, Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 oder Bacillus cereus ATCC Nr. 9139 in einem übliche Kohlenhydrate und Stickstoffsubstanzen enthaltenden Nährmedium, das einen Gehalt von 0,01 bis 0,2 Gew./Volumprozent Magnesiumionen, 0,1 bis 1,5 Gew./Volumprozent Kaliumionen und 0,001 bis 1 Gew./Volumprozent Mangan-, Eisen- oder Zinkionen bzw. von deren Gemisch aufweist, züchtet.

Das erfindungsgemäß verwendete Nährmedium enthält geeignete Mengen an Kohlenhydraten und anderen Kohlenstoffquellen, wie z. B. Glucose, Stärke, Stärkehydrolysate und Melassen, Stickstoffquellen wie z. B. Harnstoff, Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat, anorganische Verbindungen, wie z. B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Eisensulfat, Eisenchlorid, Zinkchlorid und Calciumchlorid, und stickstoffhaltige Naturprodukte, wie z. B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Proteinhydrolysate und Fischmehl.

Zur Bildung von D-Ribose müssen den Medien Magnesium- und Kaliumsalze in einer Menge zugesetzt werden, daß diese einen Gehalt von 0,01 bis 0,2 Gew./Volumprozent Mag'nesiumionen und 0,1 bis 1,5 Gew./Volumprozent Kaliumionen enthalten. Weiterhin müssen den Medien Mangan-, Eisen- und Zinksalze zugesetzt werden, und zwar entweder einzein oder in Form von Gemischen sowie in solcher Menge, daß in den Medien 0,001 bis 1 Gew./Volumprozent dieser Metallionen enthalten sind.

Erfindungsgemäß wird die Fermentation aerob, wie z. B. mit einer Schüttel- oder Belüftungs-Fermentationsvorrichtung, bei einer Züchtungstemperatur von 20 bis 4O⁰C durchgeführt.

Nach einer Züchtungsdauer von 2 bis 8 Tagen hat sich eine bemerkenswert große Menge an D-Ribose in der Kulturflüssigkeit und in den Zellen gebildet.

Nach Beendigung der Fermentation kann die D-Ribose durch Behandlung mit Ionenaustauscher-Verfahren zur biochemischen Herstellung von
D-Ribose

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke und Dipl.-Ing. H. Agular,

Patentanwälte,

8000 München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt:

Shukuo Kinoshita, Tokio;

Kunizo Mizuhara, Minami-Oya, Machida-shi;

Takeo Suzuki, Kogasaka, Machida-shi (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 29. Juli 1963 (37 734)

harzen, Adsorption, Fällung und Extraktion isoliert werden, wie es in den folgenden Beispielen beschrieben wird.

In den folgenden Beispielen beziehen sich — wenn nicht anders angegeben — sämtliche Prozentangaben auf das Gewicht.

Beispiel 1

Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 verwendet. Der Mikroorganismus wird unter Schütteln in einem Impfkulturmedium, das 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,25% NaCl enthält und sich in 30-ccm-Mengen in 250-ccm-Erlenmeyerkolben befindet, 24 Stunden bei 30° C gezüchtet. Ein Fermentationsmedium der unten angegebenen Zusammensetzung wird in 20-ccm-Anteilen in 250-ccm-Erlenmeyerkolben gegeben und mit etwa 10 Volumprozent der obigen Impfkultur angeimpft. In dem Fermentationsmedium wird ebenfalls durch Schütteln bei 30⁰C gezüchtet.

809 509/97

I 261468

Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

100 g Glucose, 6 g Harnstoff, 10 g KH₂PO₄, 10 g K₂HPO₄, 1Og MgSO₄ · 7H₂O, 3Oy Biotin, 0,1 g CaCl₂-2H₂O und 2g MnSO₄ ■ 4H₂O werden in Wasser zu 1 1 gelöst, und der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 8,0 eingestellt.

Nach 120stündigem Züchten in der Fermentationsflüssigkeit haben sich 11 mg D-Ribose je Kubikzentimeter Flüssigkeit gebildet. In den Zellen wird eine ähnliche Ansammlung von D-Ribose festgestellt. Die Glucose ist nahezu vollständig verbraucht worden.

Die Zellen werden aus der Fermentationsflüssigkeit entfernt, und 1 1 des Filtrats wird mit Salzsäure auf pH 5,0 eingestellt und sodann durch eine mit »Dia-ion SK Nr. 1« in der Η-Form gefüllte Harzsäule gegeben.

Sodann wird durch die Säule destilliertes Wasser gegeben. Die Ribose enthaltenden Fraktionen des Eluats werden gesammelt und durch eine mit »Dia-ion SA Nr. 21A« in der OH-Form gefüllte Säule gegeben, wobei der pH-Wert unverändert gehalten wird. Die Ribosefraktionen des Eluats werden miteinander vereinigt, auf pH 6,5 eingestellt und sodann unter vermindertem Druck bei 50° C eingeengt. Die eingeengte Lösung wird mit Aktivkohlepulver entfärbt, und nach Zugabe von Alkohol wird in einem Kühlschrank stehengelassen. Es werden 8,6 g Ribose in kristalliner Form erhalten.

D-Ribose, die sich nach 96 Stunden angesammelt haben, sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II Beispiel 2

Es werden der gleiche Mikroorganismenstamm und das gleiche Züchtungsverfahren wie im Beispiel 1 verwendet. Zu dem wie oben beschrieben hergestellten Kulturmedium werden dabei verschiedene Arten von Metallsalzen einzeln sowie Gemische von Mangansalzen mit anderen Metallsalzen zugegeben. Die Mengen an D-Ribose, die sich nach 96 Stunden Züchtung angesammelt haben, werden in der folgenden Tabelle I angegeben:

Tabelle I

30

Metallion	Konzentration des Zusatzes P/o)	Gebildete D-Ribose (mg/ccm)
O Fe⁺⁺ Mn⁺⁺ Co⁺⁺ Ni⁺⁺ Zn⁺⁺ Mn ^{+ +}+ Fe⁺⁺ ... Mn⁺⁺+ Zn ^{+ +} ... Mn⁺⁺+ Co⁺-*- ... Mn⁺⁺ + Ni ^{+ +} ...	0 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 + 0,05 0,05 + 0,05 0,05 + 0,05 0,05 + 0,05	0,08 4,2 7,9 0,0 0,0 3,0 8,3 7,7 0,0 0,0

35

40

45

55

60

Beispiel 3

Unter Verwendung des gleichen Mikroorganismen-Stammes und der gleichen Züchtigungsbedingungen wie im Beispiel 1 wird die dem Medium zugesetzte Menge an MnSO₄ · 4H₂O variiert. Die Mengen an

Zugegebene Menge an Mn⁺⁺	0	Menge an gebildeter D-Ribose
P/o)	0,0001	(mg/ccm)
0,0008	0,1
0,008	2,0
0,004	3,8
0,08	7,4
0,4	10,7
0,8	6,5
5,1
1,2

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird als Mikroorganismenstamm Micrococcus glutamicus ATCC Nr. 15 455 verwendet. Es wird nach dem gleichen Fermentationsverfahren und mit der gleichen Zusammensetzung des Impfkulturmediums gearbeitet wie im Beispiel 1.

Die Zusammensetzung des Fermentationsmediums ist wie folgt:

Zusammensetzung des Fermentationsmediums:

100 g Glucose, 3 g Harnstoff, 2 g KH₂PO₄, 1 g K₂HPO₄, 1 g MgSO₄ · 7H₂O, 10 γ Biotin, 0,1 g CaCl₂ · 2H₂O und 2 g MnSO₄ · 4H₂O werden in Wasser zu 11 gelöst, und der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 8,0 eingestellt.

Nach 120 Stunden Züchtung haben sich 8,2 mg D-Ribose je Kubikzentimeter Fermentationsfiüssigkeit angesammelt.

Die Fermentationsflüssigkeit wird auf pH 4,5 eingestellt, 10 Minuten auf 70⁰C erhitzt und zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Von der erhaltenen Flüssigkeit wird 11 der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, mit wäßriger NaOH auf pH 7,8 eingestellt und unter Zusatz von 50 g gepreßter Brothefe 10 Minuten bei 37°C umgesetzt, um die restliche Glucose zu verbrauchen. Die Flüssigkeit wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 behandelt. Es werden 5,7 g kristalline Ribose erhalten.

Beispiel 5

Bacillus cereus ATCC Nr. 9139 wird in dem im Beispiel 1 angegebenen Medium gezüchtet, sodann in das Medium der folgenden Zusammensetzung übergeführt und weiter 102 Stunden unter Zusatz von 0,05% Mn⁺⁺ und 0,02% Zn⁺⁺ gezüchtet. Die angesammelte Menge an D-Ribose beträgt 7,1 mg/ccm Fermentationsflüssigkeit.

Glucose 10%,

K₂HPO₄ 0,6%,

MgSO₄-7H₂O 0,6%,

NH₄Cl 0,7%,

KH₂PO₄ 0,6%,

Hefeextrakt 1,0%.

Nach der gleichen Behandlung wie im Beispiel 1 werden 5,7 g kristalline D-Ribose erhalten.

Beispiel 6

Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet. Das Impfkulturmedium wird in 150-ccm-Mengen in 2-1-Erlenmeyerkolben gegeben, und es wird unter Schütteln 18 Stunden gezüchtet. Sodann wird in 5-1-Fermentationsbehälter übergeführt, die das Fermentationsmedium in Anteilen von 3 1 enthalten, und dort unter Belüftung mit 3 1 Luft/ccm und unter Rühren mit 400 Umdrehungen pro Minute weitergezüchtet.

Die Zusammensetzung des wäßrigen Fermentationsmediums ist wie folgt:

10% Glucose, 1,0% KH₂PO₄, 1,0% K₂HPO₄, _tc 1,0% MgSO₄-7H₂O, 100 γ je Liter Biotin, 0,01% CaCI₂ · 2H₂O, 0,2% Harnstoff und 0,1% MnSO₄ · 4H₂O.

Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wird in geeigneter Weise mit Hilfe von Harnstoff eingestellt. Nach 66 Stunden Züchtung haben sich 12,7 mg D-Ribose je Kubikzentimeter der Fermentationsflüssigkeit angesammelt. Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 aufgearbeitet, wobei 30 g kristalline D-Ribose erhalten werden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biochemischen Herstellung von D-Ribose, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikrococcus glutamicus ATCC Nr. 15 455, Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 oder Bacillus cereus ATCC Nr. 9139 in einem übliche Kohlenhydrate und Stickstoffsubstanzen enthaltenden Nährmedium, das einen Gehalt von 0,01 bis 0,2 Gew./Volumprozent Magnesiumionen, 0,1 bis 1,5 Gew./Volumprozent Kaliumionen und 0,001 bis 1 Gew./Volumprozent Mangan-, Eisen- oder Zinkionen bzw. von deren Gemisch aufweist, züchtet.

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