DE2638024C2

DE2638024C2 - Verfahren zur Erhöhung der Cephamycin C-Ausbeute beim Züchten eines Cephamycin C erzeugenden Stammes der Gattung Streptomyces

Info

Publication number: DE2638024C2
Application number: DE2638024A
Authority: DE
Inventors: Jerome Morganville N.J. Birnbaum; Edward Rahway N.J. Inamine
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1975-11-21
Filing date: 1976-08-24
Publication date: 1985-05-02
Also published as: DE2638024A1; JPS5910200B2; US3977942A; ES451318A1; FR2332323A1; JPS5264490A; FR2332323B1; CA1064419A; GB1515809A; AU1687576A; AU517298B2

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1 b), dadurch gekennzeichnet, daß man DL-Lysln und 1,3-DlamInopropan In einem Anteil von 0,1% (Gew./Vol.) (ausgedrückt als das Hydrochlorid bzw. Dihydrochlorid) zusetzt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute des bekannten Antibiotikums Cephamycin C [7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramldo)-3-(carbamoyloxymethyI)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure; vgl. Antimicrobial Agent and Chemotherapy, Bd. 2, (September 1972), Selten 121 bis 131, 132 bis 135, 281 bis 286 und 287 bis 290] beim Züchten eines Cephamycin C erzeugenden Stammes der Gattung Streptomyces.

Cephamycin C bildet sich während der unter garegelten Bedingungen erfolgenden aeroben Gärung von geeigneten wäßrigen Nährmedien. Geeignet sind wäßrige Medien, wie sie für die Synthese anderer Antibiotika verwendet werden. Solche Medien enthalten Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, welche durch die Mikroorganismen assimilierbar sind. Außerdem enthalten die Gärmedien Spurenanteile von für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Metallen, welche gewöhnlich als zufällige Verunrelnigungen der anderen Bestandteile des Mediums eingeschleppt werden. Als assimilierbaren Kohlenstoff liefernde Substanzen können im allgemeinen Kohlenhydrate, wie Zucker, z. B. Glucose, Maltose, Fructose oder Lactose, und Stärkematerialien, wie Getreide, z. B. Hafer und Roggen, Maisstärke oder Maismehl, einzeln oder In kombinierter Form eingesetzt werden. Die genaue dem Medium einverleibte Kohlenhydratmenge hängt teilweise von den übrigen Bestandteilen ab. Es wurde jedoch festgestellt, daß ein Kohlenhydratanteil von etwa 1 bis 6 Gew.-% (bezogen auf das Medium) ausreicht. Man kann eine einzige kohlenstoffllefernde Substanz verwenden oder mehrere derartige Substanzen kombinieren.

Beispiele für geeignete stickstoffliefernde Substanzen sind die unzähligen protelnhaltlgen Materialien, wie verschiedene Formen von Caselnhydrolysaten, Sojamehl, Maisquellwasser, lösliche Schlempeanteile, Hefeprodukte oder Tomatenpaste. Die verschiedenen stickstoffllefernden Substanzen können entweder einzeln oder Im

•)5 Gemisch eingesetzt werden. Ihre Anteile liegen Im Bereich von 0,2 bis 6 Gew.-% (bezogen auf das wäßrige Medium).

Die Fermentation (Gärung) erfolgt bei Temperaturen von 20 bis 37° C. Die besten Resultate werden jedoch erzielt, wenn man die Fermentation im bevorzugten Temperaturbereich von etwa 24 bis 32" C durchführt. Der pH-Wert des zur Züchtung der Streptomyces-Kulturen und zur Synthese des Antibiotikums geeigneten

5» Nährmediums soll im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 liegen.

Cephamycin C bildet sich während der vorstehend beschriebenen aeroben Gärung durch einen zur Bildung dieser Verbindung befähigten Stamm von Streptomyces lactamdurans, beispielsweise durch den In der Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Branch des U.S. Department of Agriculture In Peorla, Illinois unter der Registernummer NRRL 3802 hinterlegten Stamm. Auch andere Stämme dieser Species

5-^s sind verwendbar, beispielsweise durch Mutationsmittel erhaltene oder aus Natursubstanzen Isolierte Mutanten.

Das Antibiotikum Cephamycin C wurde nach der In den US-PS 37 69 169, 37 70 590 und 38 86 044 beschriebenen Scheiben-Platten-Methode unter Verwendung von 0,375 cm Filterpapieischelben einem biologischen Test unterworfen. Die Testplatten wurden unter Verwendung von Dlfco-Nähragar und 2 g Dlfeo-Hefeextrakt/1 bei' einer Menge von 10 ml/Platte hergestellt. Eine über Nacht gewachsene Kultur des Testorganismus (Vibrio

M¹ percolans ATCC 8461) wurde mit steriler Kochsalzlösung so weit verdünnt, bis eine Suspension mit einer Transparenz von 40% bei 660 πιμ erhalten wurden. Diese Suspension wurde dem Medium vor dem Gießen der Platten In einem Anteil von 20 ml/l einverleibt.

Die Testplatten wurden bis zur Verwendung bei 4⁰C gehalten (maximal 5 Tage). Nach der Aufbringung der mit dem Antibiotikum gesättigten Tes'scheiben wurden die Platten 8 bis 24 Std. bei 28° C Inkublcrt. Die Berel-

^ ehe der Hemmung wurden als mm Durchmesser gemessen. Aus den Werten wurden die relativen Wirksamkelten oder - gegenüber einem gereinigten Vergleichsstandard von Cephamycin C - die Wirksamkell In ng/ml bestimmt.
Wegen der schwierigen Abvfcnnung von reinem Cephamycin C von den großen Mengen von Verunrelnlgun-

gen In der Gärbrühe besteht ein ausgeprägter Bedarf an einer Methode zur Erhöhung der Konzentration dieses Antibiotikums relativ zum Gesamtfeststoffanteil der Brühe.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung der Cephamycln C-Ausbeute beim Züchten eines Cephamycln C erzeugenden Stammes der Gattung Streptomyces zur Verfugung zu stellen, welches die Verwendung leicht verfügbarer chemischer Zusätze gestattet.

Diese Aufgabe wird durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 angegebenen Maßnahmen gelöst. Eine vorteilhafte Ausgestaltung dieses Verfahrens ist im Anspruch 2 angegeben.

Zweckmäßig wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein komplex zusammengesetztes organisches Medium eingesetzt. Hierunter 1st ein Medium zu verstehen, bei dem einige Bestandteile chemisch nicht definiert sind. Ein derartiges Medium besteht beispielsweise aus löslichen Schlempeantellen, Trocken-Primärhefe, Glycerin, Dimethylformamid, Glycin, L-Phenylalanln, Natrlumthiosulfat und einem Schauminhibitor, dabei steilen die löslichen Schbmpeantelle sowie die Trocken-Primärhsfe chemisch Undefinierte Substanzen dar.

Als Art der Gattung Streptomyces wird vorzugsweise Streptomjces lactamdurans verwendet.

Der zur Anregung der Bildung des Antibiotikums Cephamycin C erforderliche Anteil der Aminosäure und/oder des Polyamine hängt in gewissem Maße von der jeweiligen Kultur und dem jeweiligen Medium ab.

Die Aminosäuren und Polyamine können nicht nur als Einzelsubstanzen, sondern auch in kombinierter Fornc als Zusatz verwendet werden, welcher die Ausbeute an Cephamycin C in komplex zusammengesetzten organischen Nährmedien, bei Verwendung von Streptomyces lactamdurans erhöht. Es hat sich gezeigt, daß die Cephamycin C-Ausbeuie bei gemeinsamer Zugabe der Aminosäuren (Arginin, Lysin und Ornithin) und der Polyamine stärker gesteigert wird als bei getrennter Einverleibung der einzelnen Verbindungen.

Optimale Antibiotikumausbeuten werden erzielt, wenn das Medium etwa 0,1 bis etwa 0,296 Aminosäuren und etwa 0,1% Polyamine (mit Ausnahme von Spermidin und Spermin, weiche bei einem Anteil von etwa 0,0296 am wirksamsten sind) enthält. Die bevorzugte Amlnosäure/Polyamin-Kombinatlon besteht aus DL-Lysln und 1,3-Dlamlnopropan bei einem zugesetzter Anteil von etwa 0,\% (Gew./Vol.) (ausgedrückt als das Hydrochlorid bzw. Dihydrochloride

Außer den vorgenannten Aminosäuren und Polyaminen eignen sich auch deren Salze für den erfindungsgemäßen Zweck. Man kann dem Basis-Produktionsmedium zur Erhöhung der Ausbeute des Antibiotikums beispielsweise die Hydrochloride, Sulfate oder Phosphate einverleiben.

Der Zeitpunkt dt. Zugabe der ausbeuteerhöhenden Zusätze zum Gäransatz ist nicht ausschlaggebend. Die Zugabe kann z. B. bei der Peimpf»".g mit der Streptomyces-Kultur oder bis zu 72 Std. danach erfolgen. Vorzugswelse werden die Aminosäuren und Polyamine unmittelbar vor der Beimpfung zugesetzt.

Die obigen Ausführungen und die -ichfolgenden Beispiele betreffen hauptsächlich Gärungen, weiche mit Hilfe eines bestimmten Stammes der Kultur von Streptomyces lactamdurans durchgeführt werden. Mann kann für die Synthese dieses Antibiotikums jedoch auch andere Stämme des genannten Organismus (z. B. entsprechende Mutanten) verwenden.

Obwohl Cephamycln C sowohl durch Oberflächen- als auch durch Submerskulturen gebildet wird, führt man die Gärung derzeit vorzugsweise nach dem Submersverfahren durch. Im Kleinmaßstab werden du, Gärungen zweckmäßig dadurch vorgenommen, daß man geeignete Anteile des Nährmediums in Kolben einfüllt, die Kolben samt Inhalt durch Erhitzen auf 120° C sterilisiert, entweder mit Sporen oder einer vegetativen Zellkultur eines Cephamycin C erzeugenden Streptomyces-Stammes beimpft und lose mit Baumwolle zustöpselt und die Gärung an einem Schüttelapparat 1 bis 4 Tage bei einer konstanten Temperatur von etwa 28° C erfolgen läßt.

Im größeren Maßstab wird die Gärung vorzugsweise In geeigneten, mit einem Rührer und einer Vorrichtung zum Belüften des Gärmediums ausgestatteten Behältern durchgeführt. Bei dieser Methode wird das Nährmedium Im Behälter zubereitet und durch Erhitzen auf 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen beimpft man das sterilisierte Medium mit einem geeigneten Ausgangsmaterial für ein vegetatives Zellwachstum der Streptomyces-Kultur und läßt die Gärung unter Rühren und/oder Belüften des Nährmedi'ims und Aufrechterhaltung einer Temperatur von etwa 28° C während 3 bis 5 Tagen stattfinden. Diese Synthesemethode für Cephamycln C eignet sich insbesondere zur Herstellung großer Mengen des Antibiotikums.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt man zunächst eine Zellsuspension her, Indem man eine Schrägagarkullur des Cephamycln C erzeugenden Mikroorganismus mit sterilem Nährmedium versetzt. Das Wachstumsprodukt der Schrägkultur wird Im Medium suspendiert. Anschließend beimpft man einen Kolben (»Impfkolben«) mit der Suspension und schüttelt Ihn I bis 3 Tage bei etwa 28° C, um ein gutes Wachstum zu erzielen. Aus dem Impfkolben werden dann die Produktionskolben beimpft. Man kann den Impfkolben auch wahlweise aus einer gefriergetrockneten Kultur oder einem eingefrorenen Inokulum beimpfen. Außerdem kann man mehr als eine Impfstufe (Überimpfung) vornehmen.

Das Basismedium wird In entionisiertem Wasser zubereitet, auf einen pH-Wert von etwa 7 eingesteht, in Produktionskolben abgefüllt und etwa 20 Min. Im Autoklaven sterilisiert. Dann bringt man die gewünschten Anteile des sterilen Zusatzes In die Produktionskolben ein und führt die Beimpfung - Im allgemeinen unter Verwendung von etwa 1 ml Inokulum/40 ml Produktionsmedium - durch. Hierauf läßt man die Gärung während 2 bis 4 Tagen unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums und Aufrechterhaltung einer Tempe- ω ratur von etwa 28° C stattfinden. Anschließend (Im allgemeinen nach 96 Std.) bestimmt man in sämtlichen Produktlonskolben (d. h. In jenen, welche die vorgenannten Zusätze enthalten, sowie In den zum Vergleich dienenden Kolben) jeweils die gebildete Menge des Antibiotikums.

Man analysiert Teilmengen des Inhalts der Produktlonskolben, indem man die Proben mit 0,02 m Phosphatpuffer (pH 7) bis zu einer geeigneten Konzentration verdünnt. Als Testorganismus dient Vibrio percolans ATCC w 8461, während als Analysemedium Dlfco-Nähragar mit 0,2% Difco-Hefeextrakt verwendet wird. Scheiben mit einem Durchmesser von 9,525 mm werden In eine 5 μξ des Standard-Antlblotlkums/ml enthaltende Lösung izetauehi und dann In abwechselnder Position zu den Testproben auf die Platte gegeben. Die Platten werden

hierauf 18 Std. bei 28° C inkubiert. Anschließend bestimmt man die Zonendurchmesser (in mm). Es werden fünf Standardscheiben mit vier Gehalten des Standard-Antibiotikums im Bereich von 2,5 bis 20 ug/ml verwendet. Der Anteil des Antibiotikums in der Testprobe wird anhand der Eichkurve bestimmt, welche aus den bekannten Konzentrationen der Lösungen des Standard-Antibiotikums erhalten wird. Die Resultate werden in Ug des Antibiotikums (la Form der freien Säure) pro ml wiedergegeben.

Das Antibiotikum kann nach mehreren Verfahren aus dem Gärmedium isoliert werden. Man kann die filtrierte Brühe durch eine oder mehrere Ionenaustauschsäule(n) leiten. Aufgrund des amphoteren Charakters des Antibiotikums kann man sowohl Kationen- als auch Anlonenaustauscherharze heranziehen, um eine optimale Ausbeute zu erzielen. Das adsorbierte Antibiotikum kann dann eluiert werden, wobei man als Elutlonsmittel vorzugsweise ein nächtiges, leicht abtrennbares Losungsmittel (wie Pyiidln) verwendet.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1
Herstellung des Inokulums

Ein lyophllisiertes Rohrchen mit Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 wird unter aseptischen Bedingungen geöffnet und sein Inhalt in 40 m! eines sterilen Mediums übertragen, welches sich in einer- mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-ErIenmeyer-KoIb3n befindet. Das Medium enthält pro Liter (In tntionlslertem M Wasser) 10 g Trocken-Primärhefe beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28° C an einen Drehschüttelapparat (5,08 cm bzw. 2 in. Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert. Nach dieser Zeltspanne laßt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbeninhalts werden dann in sterile Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei - 78° C aufbewahrt.

Erste Impfkultur

Man taut das eingefrorene Inokulum bei 36° C auf und verwendet einen Milliliter zur Beimptung von 40 ml

sterilem Medium, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und pro Liter (in entionisiertem Wasser) IC g der vorgenannten Trocken-Primärhefe (pH 7) enthält.

M Der Mikroorganismus wird etwa 45 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert.

Zweite Impfkultur

Ein Milliliter der ersten Impfkultur wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium verwendet, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und 1% Hefeauto'ysat in ention'siertem Wasser (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert und dient als Inokulum für das Basis- oder Produktionsmedium.

Basismedium

Das Bislsmedlum weist folgend; Zusammensetzung auf:

%
« Lösliche Schlempeantelle 3,0 (Gew./Vol.)

Trocken-Primärhefe 0,75 (Gew./Vol.)

Glycerin 1,25 (Gew./Vol.)

Dimethylformamid 1,0 (Vol./Vol.)

Glycin 0,05 (Gew./Vol.)

L-Phenylalanin 0,3 (Gew./Vol.)

Schauminhibitor 0,25 (Gew./Vol.)

Natrlumthlosulfat *) 0,1 (Gew./Vol.)

*) 0 bis 24 Std. nach der Beimpfung unter aseptischen Bedingunger, aus einer sterllflllrlerten, konzentrierten Vorratslosung In einem für die angegebene Endkonzentration ausreichenden Anteil zugesetzt.

Das Medium wird mit entionisiertem Wasser zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Jeweils 40 ml des Mediums werden dann In 250-rril-Erlenfneyer-Kölben eingegeben, 20 MIn. Im Autoklaven sterilisiert und danach abgekühlt.

In mehrere In der vorgenannten Weise präparierte Kolben werden dann D- oder DL-Arglnln · HCI bzw. D- oder DL-Ornlthln · HCJ eingegeben. Abgesehen von der jeweiligen Aminosäure werden die Kolben In Identischer Welse beschickt.

Es werden konzentrierte wäßrige Vorratslösungen der jeweiligen Aminosäurezusätze hergestellt. Die Lösungen werden entweder mil Salzsäure oder mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterilfiltrierten Vorratslösungen werden unmittelbar vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus In die das Basismedium enthaltenden Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzentrationen eingegeben.

Nach der Einverleibung der Aminosäurezusätze beimpft man das Medium mit 2,5 Vol.-¹M der zweiten Impfkultur und Inkubiert es 96 Sld. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei einer Dreh-

zahl von 220 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen Ist, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare Brühe In der vorstehend beschriebenen Welse unter Veiwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus auf Cephamycln C. Die Ergebnisse sind aus Tabelle I ersichtlich.

Tabelle	I	Konzentration der Zusätze des Basismediums. %	0,20	0,30	0,40
Zusätze	des Basismediums	0 0.025 0.05 0,10
		gebildete Menge von Cephamycin C, μg/ml

keiner (Vergleichsprobe) 199

D-Arginin HCl D-Ornithin · HCl DL-Ornithin HCl

keiner (Vergleichsprobe) 162

D-Arginin · HCl DL-Arginin · HCl D-Ornithin · HCi DL-Ornithin · HCi

keiner (Vergleichsprobe) 172

D-Arginin· HCI DL-Arginin · HCI D-Ornithin · HCl DL-Ornithin · HCl

keiner (Vergleichsprobe) 160

D-Arginin · HCl DL-Arginin · HCl D-Ornithin · HCl DL-Ornithin · HCl

202	232	des Inokulunis	282	234	264	-
230	229	221	264	246	-
212	218	199	246	301	-
_	238	206	196		193
-	200	193	215	-	246
-	224	232	222	-	254
-	185	202	187	-	168
_	268	23;,	219	_	210
-	209	219	223	-	200
-	218	216	230	-	251
-	191	222	270	-	288
215	232	239	247	_	_
216	218	237	259	-	-
-	202	221	301	-	3Ü4
-	201	201	232	-	250
Beispiel 2
Herstellung

Ein lyophillslertes Röhrchen mit Streptmoyces lactamdurans NRRL 3802 wird unter aseptischen Bedingungen geöffnet und sein Inhalt In 40 ml eines sterilen Mediums übertragen, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-K.olben befindet. Das Medium enthält pro Liter (In entionisiertem Wasser) 10 g Trocken-Prlmärhefe beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28° C an einem Drehschütteiapparat (5,08 cm bzw. 2 In. Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert. Nach dieser Zeltspanne läßt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbenlnhalts werden dann In sterile Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei - 78° C aufbewahrt.

Erste impfkultur

Man taut das eingefrorene Inokulum bei 36° C auf und verwendet einen Milliliter zur Beimpfung von 40 ml steriiem Medium, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-m!-Er!enmeyer-Kolben befindet und pro Liter (in entionisiertem Wasser) 10 g der vorgenannten Trocken-Primärhefe (pH T) enthält. Der Mikroorganismus wird 45 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert.

Zweite Impfkultur

Ein Milliliter der ersten Impfkultur wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium verwendet, welches sich In einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und 1% Hefeautolysat in entionisiertem Wasser (pH T) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei 28° C an einem DrehschüiteiaDparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert und dient als Inokulum für das Basis- oder Produktions-

Basismedium

Das Basismedium weist folgende Zusammensetzung auf: Lösliche Schlcmpcantelle Trocken-Prlmärhefe

Glycerin

Dimethylformamid

Glycin

L-Phenylalanln Schauminhibitor Natrlumthlosulfat ·)

3,0 (Gew./Vol.) 0,75 (Gew./Vol.) 1,25 (Vol./Vol.) 1,0 Gew./Vol.) 0,05 (Gew./Vol.) 0,3 (Gew./Vol.) 0,25 Gew./Vol.) 0,1 (Gew./Vol.)

*) 0 bis 24 Std. nach der Beimpfung unter aseptischen Bedingungen aus einer sterilfiltrierten, konzentrierten Vorratslosung In 15 einem für die angegebene Endkonzentration ausreichenden Anteil zugesetzt.

Das Medium wird mit entionisiertem Wasser zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Jeweils 40 ml des Mediums werden dann In 250-ml-Erlenmeyer-Ko!ben eingegeben, 20 MIn. Im Auto-20 klaven sterilisiert und danach abgekühlt.

In mehrere In der vorgenannten Welse präparierte Kolben werden dann D- oder DL-Lysln ■ HCl, D-Arglnln · HCI, D-Ornlthln · HCl und/oder 1,3-Dlamlnopropan · 2HCl,eingegeben. Abgesehen von der jeweiligen Aminosäure werden die Kolben In Identischer Welse beschickt.

Es werden konzentrierte wäßrige Vorratslosungen der jeweiligen Polyamlnzusätze hergestellt. Die Lösungen 25 werden entweder mit Salzsäure oder mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterllflltrlerten Vorratslösungen werden unmittelbar vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus In die das Basismedium enthaltenden Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzentration eingegeben.

Nach Einverleibung der Polyamlnzusätze beimpft man das Medium mit 2,5 Vol.-% der zweiten Impfstufe und

inkubiert es 96 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei einer Drehzahl von 220

30 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen Ist, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare Brühe in der vorstehend beschriebenen Welse unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus auf

Cephamycln C. Die Ergebnisse sind aus Tabelle II ersichtlich.

laoene

Zusätze des Basismediums Konzentration der Zusätze des Basismediums, %

0,0025 0,005 0,010 0,020 0,025

gebildete Menge von Cephamycin C, μξ/π\\

0,05 0,10

keiner (Vergleichsprobe) 1,3-Diaminopropan- 2HQ

Agmatinsulfat Spermidin ■ 3HCl Spermin ■ 4HCI

keiner (Vergleichsprobe) 1,3-Diaminopropan· 2HCl

Spermidin · 3HCl Spermin · 4HCl Cadaverin · 2HCl

keiner (Vergleichsprobe) 1,3-Diaminopropan ■ 2HCl

Agmatinsulfat Spermidin ■ 3HCl Spermin ■ 4HCl Cadaverin ■ 2HCl Putrescin ■ 2HCl

keiner (Vergleichsprobe) 1,3-Diamino-2-hydroxypropan N-Methyl-13-diaminopropan

237

263 202

282 247

290

257

-	262	304	315	-	320	-	-
197	278	275	-	-	-	-	-
_		198	—		330	309	_
219	230	255	282	-	-	-	-
-	234	341	296	-	318	-	-
-	-	-	-	224	244	255	272
		263		299	332	368	344
-	-	-	-	288	215	219	215
285	331	387	361	-	248	-	-
276	282	369	494	-	377	-	-
-	-	_	-	226	258	271	254
-	-	-	-	272	265	276	284
_	_			_	184	203	199
_	_	_			226	192	202

.;;./ Beispiel 3

!$] Herstellung des Inokulums

|i Hin lyophlllslertes Röhrchen mit Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 wird unter aseptischen Bedingungen

P geöffnet und sein Ii.'.ialt In 40 ml eines sterilen Mediums übertragen, welches sich In einem mit einem DIap phragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet. Das Medium enthält pro Liter (In entionisiertem Wasser) 10 g Trocken-Prlmitrhefe beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28° C an einem Drehsehütlcluppanil (5,08 cm bzw. 2 In. Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert. Nach dieser Zeitspanne IMIt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbenlnhalts werden dann In sterile in Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei - 78° C aufbewahrt.

Erste Impfkultur

Man taut das eingefrorene lnokulum bei 36° C auf und verwendet einen Milliliter zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium, welches sich In einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befinde! und pro Liter {In er.ticrilslertem Wasser) !0 g der vorgenannten Trockcn-PrlfnSrhefc (pH 7) p.nthsit Der Mikroorganismus wird etwa 45 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert.

:o Zweite Impfkultur

Ein Milliliter der ersten Impfkultur wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium verwendet, welches sich In einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und 196 Hefeautolysat In entionisiertem Wasser (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert und dient als lnokulum für das Basis- oder Produktionsmedium.

Basismedium

Das Basismedium welstftfolgende Zusammensetzung auf:

3,0 (Gew./Vol.)

Lösliche Schlempeanteile 0,75 (Gew./Vol.)

Trocken-Prlmärhefe 1,25 (Gew./Vol.) .u

Glycerin 1,0 (Vol./Vol.)

Dimethylformamid 0,05 (Gew./Vol.)

Glycin 0,3 (Gew./Vol.)

L-Pheny!alanln 0,25 (Gew./Vol.)

Schaumlnlhlbltor 0,1 Gew./Vol.)

Natriumsulfat *)

*) 0 bis 24 Std. nach der Beimpfung unter aseptischen Bedingungen aus einer sterllflltrierten, konzentrierten Vorratslösung In einem für die angegebene Endkonzentrailon ausreichenden Anteil zugesetzt.

Das Medium wird mit entionisiertem Wasser zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Jeweils 40 ml des Mediums werden dann In 250-ml-Erlenmeyer-Kolben eingegeben, 20 Min. im Autoklaven sterilisiert und danach abgekühlt.

In mehrere in der vorgenannten Welse präparierte Kolben werden dann D- oder DL-Lysin ■ HCl, D-Arginln · HCl, D-Ornlthin ■ HCl und/oder 1,3-Dlaminopropan · 2HCl eingegeben. Abgesehen von der jeweiligen Aminosäure werden die Kolben in identischer Weise beschickt.

Es werden konzentrierte wäßrige Vorratslösungen der jeweiligen Zusätze hergestellt. Die Lösungen werden entweder mit Salzsäure oder mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterilfiltrierten Vorratslösungen werden unmittelbar vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus in die das Basismedium enthaltenden Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzentrationen eingegeben.

Nach der Einverleibung der Zusätze beimpft man das Medium mit 2,5 Vol.-96 der zweiten Impfkultur und Inkubiert es 96 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei einer Drehzahl von 220 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen 1st, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare Brühe in der vorstehend beschriebenen Weise unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus auf Cephamycin C. Die Ergebnisse sind aus Tabelle III ersichtlich.

Tabelle ill

Zusätze des Basismediums Konzentration des dem Basismedium einverleibten I,3-Diaminoprop«η - 2UC.\,'

0 0,10

gebildete Menge von Cephamycin C, μg/ml

	keiner	129	Beispiel 4	235
	D-Lysin· HCl, 0,1%	182	286
IO	DL-Lysin· HCl, 0,1%	152	264
	D-Argip.in · HCl, 0,1%	173	243
	D-Ornithin · HCl, 0,1%	188	282
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Herstellung des Inokulums

Ein lyophlllslertes Röhrchen mit Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 wird unter aseptischen Bedingungen geöffnet und sein Inhalt In 40 ml eines sterilen Mediums übertragen, welches sich In einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet. Das Medium enthält pro Liter (In entionisiertem Wasser) 10 g Trocken-Primärhefe beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28" C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm bzw. 2 In. Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert. Nach dieser Zeltspanne läßt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbeninhalts werden dann In sterile Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei - 78° C aufbewahrt.

Erste Impfkultur

Man taut das eingefrorene Inokulum bei 36° C auf und verwendet einen Milliliter zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium, welches sich In einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und pro Liter (In entionisiertem Wasser) 10 g der vorgenannten Trocken-Primärhefe (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 45 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert.

Zweite Impfkultur

Ein Milliliter der ersten Impfkultur wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium verwendet, welche sich In einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und 1% Hefeautolysat In entionisiertem Wasser (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert und dient als Inokulum für das Basis- oder ProdtVtlonsmedlum.

Basismedium

Das Basismedium weist folgende Zusammensetzung auf:

S6

Lösliche Schlempeanteile 3,0 (Gew./Vol.)

Trocken-Primärhefe 0,75 (Gew./Vol.)

Glycerin 1,25 (Gew./Vol.)

Dimethylformamid 1,0 (Vol./Vol.)

Glycin 0,05 (Gew./Vol.)

L-Phenylalanln 0,3 (Gew./Vol.)

Schauminhibitor 0,25 (Gew./Vol.)

Natriumthiosuifat *) 0,1 (Gew./Vol.)

*) 0 bis 24 Std. nach der Beimpfung unter aseptischen Bedingungen aus einer sterllflltrierten, konzentrierten Vorratslösung In einem für die angegebene Endkonzentration ausreichenden Anteil zugesetzt.

so Das Medium wird mit entionisiertem Wasser zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Jeweils 40 ml des Mediums werden dann in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben eingegeben, 20 Min. Im Autoklaven sterilisiert und danach abgekühlt.

In mehrere in der vorgenannten V/eise präparierte Kolben werden dann D- oder DL-Lysln · HCl, 1,3-Dlamino-2-hydroxypropan bzw. N-Methyl-l,3-diamlnopropan eingegeben. Abgesehen von der jeweiligen Aminosäure werden die Kolben in identischer Weise beschickt.

Es werden konzentrierte wäßrige Vorratslösung?T der jeweiligen Zusätze hergestellt. Die Lösungen werden entweder mit Salzsäure oder mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterilflltrierten Vorratslösungen werden unmittelbar vor dem Beimpfen mit dem Mikroorganismus in die das Basismedium enthaltenden

Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzeiitration eingegeben.

Nach der Einverleibung der Zusätze beimpft man das Medium mit 2.5 Vol.-% der zweiten Impfkultur und inkubiert es 96 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei einer Drehzahl von 220 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen ist, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare Brühe in der vorstehend beschriebenen Weise unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus auf Cephamycin C. Die Ergebnisse sind aus Tabelle IV ersichtlich.

Tabelle IV

Zusätze des Basismediums

Zusätze des Basismedtums

DL-Lysin ■ HCl 0,1% 0,1%

gebildete Menge von Cephamycin C. pg/ml

D-Lysin· HCl
keines

0,2%

154	234	169	150	20	255
222	264	311	240	271
229	276	333	255
246	355	-
248	285	311
189	307	304
151	247	_

keiner

l^-Diamino^-hydroxypropaa, 0,05% l,3-Diamino-2-hydroxypropan, 0,10% 1,3-Diarnino-2-hydroxyprop2n, 0,20% N-Methyl-l^-diaminopropan, 0,05%
N-Methyl-l^-diaminopropan, 0,10%
N-Methyl-l,3-d;aminopropan, 0,20%

Beispiel 5 Herstellung des Inokulums

Ein lyophlllslertes Röhrchen mit Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 wird unter aseptischen Bedingungen geöffnet und sein Inhalt in 40 ml eines sterilen Mediums übertragen, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet. Das Medium enthält pro Liter (in entionisiertem Wasser) 10 g Trocken-Primärhefe beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm bzw. 2 In. Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert. Nach dieser Zeltspanne läßt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbeninhalts werden dann In sterile Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei - 78° C aufbewahrt.

Erste Impfkultur

Zweite Impfkultur

Ein Milliliter der ersten Impfkultur wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium verwendet, welches sich In einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und 1% Hefeautoiysat in entionisiertem Wasser (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei 28° C an einem Drehschüttela-, pparat (5.08 cm Verdrängung) bei 220 UpM Inkubiert und dient als Inokulum für das Basis- oder Produktionsmedium.

Basismedium Das Basismedium weist folgende Zusammensetzung auf:

Lösliche Schlempeanteile

Trocken.Prlmärhefe

Glycerin

Dimethylformamid

Glycin

L-Phenylalanln

Schauminhibitor

Natrlumthlosulfat *)

3,0 (Gew./Vol.) 0,75 (Qew./Vol.) 1,25 (Gew./Vol.) 1,0 (Vol./Vol.) 0,05 (Gew./Vol.) 0,3 (Gew./Vol.) 0,25 (Gew./Vol.) 0,1 (Gew./Vol.)

10

15

25

30

35

40

45

50

65

*) Π bis 24 Std nach der Beimpfung unter aseptischen Bedingungen aus einer sterilfiltrierten, konzentrierten Vorratslösung In einem für die angegebene Endkonzentralion ausreichenden Anteil zugesetzt.

Das Medium wird mit entionisiertem Wasser zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Jeweils 40 ml des Mediums werden dann in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben eingegeben, 20 MIn. im Autoklaven sterilisiert und danach abgekühlt

In mehrere in der vorgenannten Weise präparierte Kolben werfen dann D- oder DL-Lysln - HCl, Agmatinsulfat, Cadaverin - HCl, 1,3-Dlaminopropan ■ 2HCl, Putrescln · 2HCl, Spermidin ■ 3HCl bzw. Spermln - 4HCl eingegeben. Abgesehen von der jeweiligen Aminosäure werden die Kolben In identischer Welse beschickt.

Es werfen konzentrierte wäßrige Vorratslösungen der jeweiligen Zusätze hergestellt. Die Losungen werfen entweder mit Salzsäure oder mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterilflltrlerten Vorrats- !ösungen werfen unmittelbar vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus In die das Basismedium enthaltenden Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzentrationen eingegeben.

Nach der Einverleibung der Zusätze beimpft man das Medium mit 2,5 Vol.-% der zweiten Impfkultur und inkubiert es 96 Std. bei 28° C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei einer Drehzahl von 220 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen ist, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare BiHhe In der vorstehend beschriebenen Weise unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus auf Cephamycln C. Die Ergebnisse sind aus Tabelle V ersichtlich.

Tabelle V Zusätze des Basismediums Zusätze des Basismediums

keiner

D-Lysin · HCl 0,1% 02%

DL-Lysin - HCI 0,1% 0,2%

gebildete Menge von Cephamycin C, μ&/πιΙ

2> keiner 171

Agmatin-SO₄,0,1% 204

Cadaverin · 2HCl, 0,1% 185

1,3-Diaminopropan · 2HCl, 0,1% 307

³⁰ Putrescin ■ 2HCl, 0,1% 220

Spermidin · 3HCl, 0,02% 280 Spermin ■ 4HCI, 0,02% 415

242
262
267
397
370
392
478

301 294 306 392 399 478 478

157 226 225 347 245 306 487

184 237 235 317 236 333 471

^ Tabelle I zeigt deutlich, daß die Bildung von Cephamycln C durch Zugabe von D- oder DL-Arginln bzw. von D- oder DL-Ornlthln zum Gärmedium angeregt wird. Beispiele für die Anregung der Bildung von Cephamycln C durch Polyamine gehen aus Tabelle II hervor. Die Tabellen III, IV und V zeigen, daß die gemeinsame Zugabe einer Aminosäure und eines Polyamins im Vergleich zur getrennten Zugabe der Verbindungen eine verstärkte Bildung von Cephamycln C ergibt. Aus den Beispielen geht klar hervor, daß erfindungsgemäß D- oder DL- Arginin bzw. D- oder DL-Ornithln In Kombination mit den Polyaminen 1,3-Dlamlnopropan, l,3-DlamIno-2- hydroxypropan, N-Methyl-l,3-dlamlnopropan, Agmatin, Spermidin, Spermln, Cadaverin oder Putrescln oder D- oder DL-Lysln in Kombination mit den genannten Polyaminen jeweils überraschenderweise die Bildung von Cephamycln C stark anregen.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Erhöhung der Cephamycin C-Ausbeute beim Züchten eines Cephamycin C erzeugenden Stammes der Gattung Strepiomyces in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man
5

a) ein Nährmedium verwendet, welches 0,025 bis 0,40% (Gew./Vol.) der Aminosäuren D- oder DL-Arglnin oder D- oder DL-Oralthin (ausgedrückt als das Hydrochlorid), 0,01 bis 0,2% (Gew./Vol.) 1,3-Dlaminopropan (ausgerückt als das Dihydrochlorid), 0,0025 bis 0,05% (Gew./Vol.) Spermldln oder Spermin (ausgedrückt als das Trihydrochlorid bzw. TetrahydrocbJorid), 0,025 bis C,2% (Gew./Vol.) Cadaverin

•0 oder Putrescln (ausgedrückt als das Dihydrochlorid), 0,025 bis 0,2% (Gew./Vol.) Agmatln (ausgedrückt

als das Sulfat) oder 0,05 bis 0,2% (Gew./Vol.) l,3-DiamIno-2-hydroxypropan oder N-Methyl-l,3-diaminopropan (als freie Base) enthält, oder

b) ein Nährmedlum verwendet, welches die Aminosäuren D- oder DL-Arglnin, D- oder DL-Ornlthin oder D- oder DL-Lysin In einem Anteil von 0,1 bis 0,2% (Gew./Vol.) (ausgedrückt als das Hydrochlorid) in

^IS Kombination mit 0,1% (Gew./Vol.) 1,3-Diamlnopropan, Cadaverin oder Putrescln (ausgedrückt -*s das

Dihydrochlorid), 0,02% (Gew./Vol.) Spermldln oder Spermin (ausgedrückt als das Trihydrochlorid bzw. Tetrahydrochlorid), 0,1% (Gew./Vol.) Agmatln (ausgediückt als das Sulfat) oder 0,05 bis 0,2% (Gew./Vol.) i,3-D!am!üo-2-hydroxypropan oder N-Methyl-l.S-diamlnopropan (als freie Base) enthält.