JPS5910200B2 - セフアマイシンｃの改良された醗酵 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、既知の且つ有用な抗生物質セファマイシンＣ
Ｃ７−（Ｄ−５−アミノー５−カルボキシバレラミド）
−３−カルバモイルオキシメチル）−７−メトキシ−３
−セフエム−４−カルボン酸〕を製造する改良された醗
酵法に関するものである。

〔アンチミクロピアル・エージェント・アンド・ヘモセ
ラピー（１９７２年９月）第２巻１２１〜１３１、１３
２〜１３５、２８１〜２８６及び２８７〜２９０頁〕。

特に、本発明は、例えばストレプトミセスのような微生
物の適当な菌株を使用して栄養培地の醗酵によって抗生
物質を製造する改良された方法に関するものである。

抗生物質は、調節された条件下における適当な水性栄養
培地の好気的醗酵中に生産される。

他の抗生物質の生産に対して使用されている水性培地の
ような水性培地が適当している。

このような培地は、微生物によって同化される炭素、窒
素及び無機塩源を含有している。

更に、醗酵培地は、微生物の生長に対して必要な微量の
金属を含有しておりそしてこれは普通培地の他の成分に
附随する不純物として供給される。

一般に、糖類例えばグルコーズ、マルトーズ、フラクト
ーズ、ラクトーズなど及び澱粉例えば穀類例えばカラス
ムギ及びライムギ、とうもろこし澱粉、とうもろこし粉
末のような炭水化物を、単独でまたは同化性炭素源と組
合せて使用することができる。

培地に利用される炭水化物源の正確な量は、部分的に、
他の成分によってきまってくる。

しかしながら、培地の約１〜６重量％の炭水化物の量が
充分であることが判った。

単一の炭素源を使用し得るまたは幾つかの炭素源を使用
することができる。

満足な窒素源は、種々な加水分解物の形態のカゼイン、
大豆粉、玉蜀黍浸出液、デイスチラーズ・ソリューブル
ス、酵素生成物、トマト・ペーストなどのような種々な
蛋白質物質を包含する。

種々な窒素源を単独でまたは組合せて使用することがで
きるそして水性培地の０．２〜６重量％の範囲の量で使
用される。

醗酵は、２０℃〜３７℃の範囲の温度で実施される。

しかしながら、最適の結果に対しては、醗酵を約２４〜
３２℃の温度で行うことが好適である。

ストレプトミセス培養物を生長せしめそして抗生物質を
生産するのに適当した栄養培地のｐＨは、約６．０〜８
．０の範囲にあらねばならない。

セファマイシンＣは、アファマイシンＣを生産すること
のできるストレプトミセス・ラクタムジュランス（ Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）
（微工研菌寄第８７４号）の菌株による、例えば、イ
リノイス州ペオリアの米国農務省の北部利用研究開発所
（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｂｒａｎ
ｃｈ ）の培養菌収集にＮＲＲＬ ３ ８ ０ ２の受
託番号で保管されている菌株による前述した好気的醗酵
によって生産される。

変異剤によって得られたまたは性質から単離された変異
体のようなこの菌種の他の菌株もまた使用することがで
きる。

セファマイシンＣ及びその塩は、ペニシリナーゼに対し
てのみでなく、セファロスポリナーゼに対しても抵抗性
を示す。

この化合物は、グラムー陽性及びグラムー陰性微生物の
生長の抑制に活性である。

比較的低い抗菌活性を有するセファロスポリンＣとは異
なってセファマイシンＣは一般にセファロチンより大で
ある力価をもって顕著な生体内グラムー陰性効果を示す
。

この活性は、次のグラムー陰性菌即ちエシエリヒア・コ
リー、プロテウス・ブルガリス、プロテウス・ミラビリ
ス、サルモネラ・ショットムエレリ、クレブシエラ．プ
ノイモニーＡＤ，クレブシエラ・プノイモニーＢ及びパ
ラコロンバクテリウム・アリゾナエに対する有効性を包
含する。

抗生物質セファマイシンＣに対する生物試験を、米国特
許第３７６９ １６９号、第３７７０５９０号及び第３
８８６０４４号に説明されている操作に従って、３／８
吋のＰ紙ディスクを使用してジイスクープレート操作に
よって行った。

これらの米国特許の内容は参考として本明細書中に示す
ものである。

１プレート当り１０ｍｌのジフコ栄養寒天＋２．０Ｐ／
Ｊジフコ・イースト・エキスを使用して試験プレートを
製造する。

試験微生物ビブリオ パーコランス（Ｖｉｂｒｉｏ Ｐ
ｅｒｃｏｌａｎｓ ）ＡＴＣＣ８４６ １の一夜生長
物を殺菌塩溶液でうすめて６６０ｍμの波長で４０％ト
ランスミツタンスを有する懸濁液を得る。

この懸濁液をプレートに注加する前に媒質１ｌ当り２０
ｒＩＬｌで加える。

試験プレートは使用するまで（最高５日）４℃に保持す
る。

抗生物質一飽和試験ディスクの適用後に、プレートを２
８℃で８〜２４時間放置する。

阻止帯域を１Ｌ１ＩＬ直径として読む。

これらは、相対的力価または精製された標準セファマイ
シンＣと比較した場合の力価（μ′？／ＴＩＬｌ）を測
定するために使用される。

醗酵母液中の犬なる量の不純物から純粋なセファマイシ
ンＣを分離することの困難さのために、全母液固体に関
連する抗生物質の濃度を増加する方法を見出すのに、こ
れらの方法はかなり重要である。

本発明の目的は、醗酵法における抗生物質の収率を増加
する方法を提供せんとするものである。

本発明の他の目的は、醗酵法に比較的安い容易に入手し
得る化学添加剤を使用して抗生物質の収率な増加する方
法を提供せんとするものである。

本発明の他の目的は以下の説明から明らかとなるであろ
う。

Ｄ−またはＤＬ−アルギニン、Ｄ−またはＤＬ−オルニ
チンまたは１・３−ジアミノプロパン、１・３−ジアミ
ノ−２−ヒドロキシプロパン、Ｎ−メチル−１・３−ジ
アミノプロパン、アグマチン スペルミシン スペルミ
ン、カダベリン及びプトレツシンのような幾つかのポリ
アミンの１種を複合有機醗酵培地に添加すると、セファ
マイシンＣの生産が強化されるということを発見した。

更に、アミノ酸Ｄ−またはＤＬ−アルギニン、Ｄ−また
はＤＬ−オルニチンまたはＤ−またはＤＬ−リジンを１
・３−ジアミノプロパン、１・３−ジアミノー２−ヒド
ロキシプロパン、Ｎ−メチル−１・３−ジアミノプロパ
ン、アクマチン、スペルミシン、スペルミル、カダベリ
ン及ヒフトレツシンのようなポリアミンと組合せて培地
に添加すると、更に醗酵収率が改善される。

”複合有機゛培地なる語は、或る成分が化学的に明確に
できない培地を意味するものである。

このような培地の例は、デイスチラーズ・ソリューブル
ス、プライマリー・ドライド・イースト、グリセロール
、ジメチルフォルムアミド、グリシン、Ｌ−フエニルア
ラニン、チオ硫酸ナトリウム及び脱泡剤（デイスチラー
ス・ソリューブルス及びプライマリードライド・イース
トは化学的に明確にできない。

）からなるものである。抗生物質セファマイシンＣの生
産を刺激するために必要なアミノ酸及び（または）ポリ
アミンの量は、或る程度、使用される培養菌及び培地に
よってきまってくる。

ストレプトミセス・ラクタムジュランス培養菌の場合に
おいては、抗生物質セファマイシンＣの生産の増加は、
塩酸塩として計算してアミノ酸Ｄ一またはＤＬ−アルギ
ニンまたはＤ−またはＤＬ−オルニチン約０．０２５〜
０．４０重量／容量％、またはジ塩酸塩として計算して
１・３−ジアミノプロパン約０．０１〜０．２重量／容
量％、またはそれぞれトリ塩酸塩及びテトラ塩酸塩とし
て計算してスペルミジンまたはスペルミン約０．００２
５〜０．０５重量％、またはジ塩酸塩として計算してカ
ダベリンまたはプトレツシン約０．０２５〜０．２重量
／容量％、または硫酸塩として計算してアグマチン約０
．０２５〜０．２重量／容量％または遊離塩基として１
・３−ジアミノー２−ヒドロキシプロパンまたはＮ−メ
チル−１・３−ジアミノプロパン約０．０５〜０．２重
量／容量％を含有する複合有機培地において観察される
。

単一で使用する以外に、アミノ酸及びポリアミンを一緒
にして、ストレプトミセス・ラクタムジュランスを使用
した複合有機栄養培地のセファマイシンＣの収率な刺激
する添加物を与えることができる。

アミノ酸（アルギニン、リジン及びオルニチン）及びポ
リアミンの合した添加は、化合物を別々に添加した場合
よりも犬なる程度にセファマイシンＣ生産能力を増大す
ることが判った。

抗生物質の生産の増大は、また、ジ塩酸塩として計算し
て１・３−ジアミノプロパンまたはカダベリンまたはプ
トレツシン約０．１重量／容量％、またはそれぞれトリ
塩酸塩及びテトラ塩酸塩として計算してスペルミジンま
たはスペルミン約０．０２重量／容量％、または硫酸塩
として計算してアグマチン約０．１重量／容量％または
遊離塩素として１・３−ジアミノー２−ヒドロキシプロ
パンまたはＮ−メチル−１・３−ジアミノプロパン約０
．０５〜０．２重量／容量％と一緒にしてアミノ酸Ｄ一
またはＤＬ−アルギニン、ＤまたはＤＬ−オルニチンま
たはＤ一またはＤＬ−リジン（アミノ酸は塩酸塩として
計算して約０．１〜０．２重量／容量％の程度に存在す
る。

）を加えることによって観察される。

抗生物質の最高の収率は、培地が約０．１〜０．２％の
程度のアミノ酸及び約０．１％の程度のポリアミン化合
物を含有する場合に得られる。

但し、スペルミジン及びスペルミンの場合は別であって
そしてこれらは約０．０２％の程度において、もつとも
有効である。

アミノ酸及びポリアミンの好適な組合せは、それぞれ塩
酸塩及びジ塩酸塩として計算して約０．１重量／容量％
の程度に添加されるＤＬ−リジン及び１・３−ジアミノ
プロパンである。

当該技術に精通せし者に判るように、アミノ酸及びポリ
アミンを使用する以外に、これらの物質の塩を本発明の
実施に使用することができる。

例えば、−ＨＣＩ，−ＳＯ４、及びーＳＯ，塩を基生産
培地に使用して抗生物質の収率を増大することができる
。

醗酵液に対する収率一増加添加剤の添加時については制
限はない。

このように、添加は７２時間後である限りストレプトミ
セス培養菌による接種時に行われる。

一般に接種時以前にアミノ酸及びポリアミンを加えるこ
とが好適である。

前述した説明及び以下の例は、主として、ストレプトミ
セス・ラクタムジュランス培養菌の特定の菌株を使用し
た醗酵について説明した。

しかしながら、変異種のようなこの微生物の他の菌株も
また抗生物質を生産するために使用することができる。

そして当該技術に精通せし者に明らかであるように、本
発明の教示に従って、Ｄ−またはＤＬ−アルギニン、Ｄ
−４たはＤＬ−オルニチン及び（または）ポリアミン、
またはポリアミンと組合せたＤまたはＤＬ−リジンをこ
のような菌株を含有する醗酵液に加えることによって、
抗生物質の収率を増大することができる。

本発明の教示によって、醗酵液に対する添加剤の最適の
濃度または添加時の明らかな変性または変化は当該技術
者の精通の範囲内にあって、問題なく、ストレプトミセ
ス・ラクタムジュランスの菌株を使用して抗生物質セフ
ァマイシンＣを生産することができる。

抗生物質セファマイシンＣは液表面及び液表面下培養に
よって生産されるけれども、醗酵を液面下状態で実施す
ることが好適である。

小規模な醗酵は、適当な量の栄養培地フラスコに入れ、
フラスコ及び内容物を１２０℃に加熱することによッテ
殺菌し、フラスコにストレプトミセスのセファマイシン
生産菌株の胞子または細胞状生長物を接種し、フラスコ
の頚を綿でゆるく栓をし、次に醗酵を振盪機上で約２８
℃の一定の温度で１〜４日進行せしめることによって有
利に実施することができる。

大規模の実施に対しては、攪拌機及び醗酵培地に通気す
る装置を具備した適当なタンク中において醗酵を実施す
ることが好適である。

この方法においては、栄養培地をタンク中で製造し次に
１２０℃に加熱することによっては殺菌する。

冷却後に、殺菌培地をストレプトミセス培養菌の植物細
胞生長物の適当な源で接種し次に栄養培地を攪拌及び（
または）通気しそして温度を約２８℃に維持し乍ら醗酵
を３〜５日進行せしめる。

セファマイシンＣを生産するこの方法は、特に、多量の
抗生物質の製造に対して適当している。

本発明の実施においては、セファマイシンＣ生産微生物
の寒天斜面培養物に殺菌培地を加えることによって細胞
懸濁液を製造する。

斜面培養物からの生長物を培地中に懸濁し次にこの懸濁
液を使用して種子フラスコに接種し次に種子フラスコを
約２８℃で１〜３日振盪して良好な生長物を得る。

次にこの種子フラスコを使用して生産フラスコに接種す
る。

このようにする代りに、種子フラスコを凍結培養物また
は凍結接種体から接種することができる。

そしてまた１回より多くの種子段階を使用することもで
きる。

基生産培地を、生産フラスコ中に分配した約ｐＨ７に調
整した脱イオン化水中で製造しそして約２０分オートク
レープ処理することによって殺菌する。

所望の濃度の殺菌添加剤を生産フラスコに添加し次に一
般に生産培地４０Ｔｔｌ当り約１ ｍｌを使用して接種
を実施する。

栄養培地を攪拌及び（または）通気しそして温度を約２
８℃に維持しながら醗酵を２〜４日進行させる。

すべての生産フラスコ即ち前述した添加剤を含有するフ
ラスコ及び比較対照として使用したフラスコを一般に９
６時間後に試験してそれぞれのフラスコ中に生産された
抗生物質の量を測定する。

試料をｐＨ７の０．０２モルフオスフエート緩衝液中に
適当な濃度にうすめることによって生産フラスコからの
一部分について試験する。

試験微生物はビブリオ・パーコランスＡＴＣＣ８４６
１でありそして試験培地はジフコ栄養寒天＋０．２％ジ
フコ酵素エキスである。

３／８吋の直径のディスクをＩＴｎｌ当り標準抗生物質
５μ１を含有する溶液に浸漬しそして試験すべき試料に
対して交互の位置においてプレート上におく。

次にプレートを２８℃で１８時間培養する。

帯域直径（ ｘｔ ）を測定する。

２．５μグ／ｍｌ〜２０μグ／ＴＩＬｌの範囲の標準抗
生物質の４レベルを含有する５つの標準ディスクを使用
する。

試験試料中の抗生物質の量は、標準抗生物質溶液の既知
濃度からつくった標準曲線によって計算する。

結果は、遊離酸の形態の抗生物質のｒｎ９／ｒｒＬｌで
記録する。

抗生物質は、多数の方法によって醗酵培地から採取する
ことができる。

ｒ過液を１またはそれ以上のイオン交換カラムを通して
通過せしめ得る。

抗生物質の両性的性質は、採取を最適にする陽イオン及
び陰イオン性交換樹脂の選択を可能にする。

次に、吸着した抗生物質を、好適にはピリジンのような
揮発性溶剤中の溶離によって除去することができる。

ピリジンのような揮発性溶剤は後で容易に除去すること
ができる。

以下の例は、説明のために与えるものであってそして限
定のために与えるものではない。

例１ 接種体の製造 ストレプトミセス・ラクタムジュランス ＮＲＲＬ３８０２の凍結管を殺菌的に開きそしてその内
容物を２５０１Ｌｌのバツフル付三角フラスコ中に含有
されている殺菌培地４０１ＩＬｌに移す。

培地は、脱イオン化水中のｐＨ７のプライマリー・ドラ
イド・イーストＮ．Ｆ．（Ｎ．Ｊ．パターソンのイース
ト・プロダクツ・カンパニーにより供給される。

） １ ０ ？／ｌを含有している。このフラスコを２
２０ｒｐｍに固定された回転振盪機（２吋ディスプレー
スメント）上で２８℃で４８時間培養する。

この時間において、微生物の豊富な生長物がみられる。

フラスコ内容物の一部を殺菌管中に入れそして使用する
まで−７８℃にて貯蔵する。

第１種子段階 凍結した接種体を３６℃でとかしそしてｌ１ｒＬｌを使
用して２５０１ｎｌのバツフル付三角フラスコ中の脱イ
オン化水中のｐＨ ７のプライマリー・ドライド・イー
スト・Ｎ．Ｆ （Ｎ．Ｊ．パターソンのイースト・プ
ロダクツ・カンパニーにより供給される。

）１０ｆ／Ｊを含有する殺菌培地４０ＴｒＬｌに接種す
る。

微生物を２２Ｏｒｐｍに固定された回転振盪機（２吋デ
ィスプレースメント）上で２８℃で約４５時間培養する
。

第２種子段階 第１段階の種子１ｒＩＬｌを使用して２５０ｒｒＬｌの
バツフル付三角フラスコ中のｐＨ ７の脱イオン化水中
の１％アルダミンＹＥＰイースト・オートリゼート（Ｎ
．Ｊ．パターソンのイースト・プロダクツ・カンパニー
により供給される。

）を含有する殺菌培地４０ｒＩＬｌに接種する。

微生物を２２Ｏｒｐｍの回転振盪機（２吋ディスプレー
スメント）上で２８℃で２４時間培養しそして生産培地
に対する接種体として使用する。

基生産培地 基生産培地は次の組成を有す。

％ デイスチラーズ・ソリュープルス ３．０ Ｗ／Ｖプ
ライマリー・ドライド・イース ０．７５Ｗ／ＶトＮ．
Ｆ グリセロール １．２５Ｗ／Ｖジメチ
ルフォルムアミド １．Ｏ ｖ／Ｖグリシン
０．０５Ｗ／ＶＬ−フエニ
ルアラニン ０．３ Ｗ／Ｖモビル・パー
−Ｓ一脱泡剤 ０．２５Ｗ／Ｖチオ硫酸ナトリウ
ム＊０．１ Ｗ／Ｖ ＊ Ｐ過殺菌濃厚貯蔵溶液から接種後Ｏ 〜２４時で殺菌的に加えて上述したよ うな最終濃度を与える。

培地を脱イオン化水中で製造し、水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ ７に調整し、２５０７７ｌｌの三角フラスコ中に４
０ｍｌづつ分配し、２０分オートクレープ処理すること
によって殺菌し次に冷却する。

前述したようにして製造した一連のフラスコに、Ｄ一ま
たはＤＬ−アルギニンＨＣ１、Ｄ一またはＤＬ−オルニ
チンＨＣＩ を加える。

フラスコはアミノ酸の存在以外すべての点で同一である
。

アミノ酸添加剤の濃厚貯蔵溶液を水中で製造しそして塩
酸または水酸化ナトリウムで中和してＰＨ７にする。

沢過殺菌貯蔵溶液を、微生物によ−：る接種前に、所望
の最終濃度において基生産培地を含有するフラスコに加
える。

アミノ酸添加剤の添加後に、培地を第２段階種子の２．
５容量％で接種しそして２２０ｒｐｍに固定された回転
振盪機（２吋ディスプレースメント）上で２８℃で９６
時間培養する。

醗酵完了後に、細胞を遠心分離処理によって除去し次に
透明な液を試験微生物としてビブリオ・パーコランスＡ
ＴＣＣ８４６ １を使用して前述した方法でセファマイ
シンＣに対して試験する。

例２ 接種体の製造 ストレプトミセス・ラクタムジュランス ＮＲＲＬ３８０２の凍結乾燥管を殺菌的に開きそしてそ
の内容物を２５０ｍｌのバツフル付三角フラスコ中に含
有されている殺菌培地４０ｍｌに移す。

培地はｐＨ ７の脱イオン化水中のプライマリー・ドラ
イド・イースＮ．Ｆ．（Ｎ，Ｊ，パターソンのイースト
・プロダクツ・カンニーにより供給される。

）１０ｆ／Ｊを含有している。

フラスコを２２０ｒｐｍに固定された回転振盪機（２一
吋デイスプレースメント）上で２８℃で４８時間培養す
る。

この時間で微生物の豊富な生長がみられる。

フラスコ内容物の一部を殺菌した管に移しそして使用す
るまで−７８℃にて貯蔵する。

第１種子段階 凍結接種体を３６℃でとかし次に１ｍｌを使用して２５
０１ｒＬｌのバツフル付三角フラスコに含有されている
ｐＨ ７の脱イオン化水中のプライマリー・ドライド・
イーストＮ．Ｆ．（Ｎ．Ｊ．パターソンのイースト・プ
ロダクツ・カンパニーにより供給される。

）１ｏＰ／Ｊを含有する殺菌培地４０ｍｌに接種する。

微生物を２２Ｏｒｐｍに固定された回転振盪機（２吋デ
ィスプレースメント）上で２８℃で４５時間培養する。

第２種子段階 第１段階の種子１ｒｒＬｌを使用して２５０ｒｕｌのバ
ツフル付三角フラスコに含有されているｐＨ ７の脱イ
オン化水中の１％アルダミンＹＥＰイースト・オートリ
ゼート（Ｎ．Ｊ．パターンンのイースト・プロダクツ・
カンパニーにより供給される。

）を含有する殺菌培地４０ＴｒＬｌに接種する。

微生物を２２０ｒｐｍの回転振盪機（２吋デイスプリー
スメント）上で２８℃で２４時間培養する。

そして生産培地に対する接種体として使用する。

基生産培地 基生産培地は次の組成を有す。

％ デイスチラーズ・ソリューブルス ３．０ Ｗ／Ｖ％ プライマリー・ドライド・゛イース ０．７５Ｗ／Ｖ｝
Ｎ，Ｆ， グリセロール １． ２ ５Ｗ／Ｖジ
メチルフォルムアミド １．Ｏ Ｖ／Ｖグリ
シン ０．０５Ｗ／ＶＬ−フ
エニルアラニン ０．３ Ｗ／Ｖモヒルパ
ーＳ一脱泡剤 ０．２５Ｗ／Ｖチオ硫酸ナト
リウム＊ ｏ．Ｉ Ｗ／Ｖ＊ 沢過殺菌濃
厚貯蔵溶液から接種後Ｏ 〜２４時間で殺菌的に加えて上述した ような最終濃度を与える。

培地を脱イオン化水中で製造し、水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ７に調整し、それぞれの２５０ｒｒＬｌの三角フラス
コに４０７７ｌｌづつ分配し、２０分オートクレープ処
理することによって殺菌し次に冷却する。

前述したようにして製造した一連のフラスコに、１・３
−ジアミノプロパン２ＨＣｌ，アグマチンサルフエート
、スペルミジン゜３ＨＣ１１スペルミン・４ＨＣｌ、カ
ダベリン・２ＨＣｌ、プトレツシン・２Ｉ｛ＣＩ，
１・３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン及びＮ−メ
チル−１・３−ジアミノプロパンを加える。

フラスコは、アミノ酸の存在以外はすべての点で同じで
ある。

ポリアミン添加剤の濃厚貯蔵溶液を水中で製造しそして
塩酸または水酸化ナトリウムで中和してｐＨ ７にする
。

ｒ過殺菌貯蔵溶液を、微生物による接種直前に所望の最
終濃度で、基生産培地を含有するフラスコに加え，る。

ポリアミン添加剤の添加後に、培地を第２段階種子２．
５容量％で接種し次に２２Ｏｒｐｍに固定された回転振
盪機（２吋ディスプレースメント）、上で２８℃で９６
時間培養する。

醗酵の完了後に、細胞を遠心分離処理によって除去し次
に透明な液を試験微生物としてピプリオ・パーコランス
ＡＴＣＣ８４６１を使用して前述した方法でセファマイ
シンＣに対して試験する。

例３ 接種体の製造 ストレプトミセス・ラクタムジュランス ＮＲＲＬ ３ ８ ０ ２の凍結乾燥管を殺菌的に開き
そしてその内容物を２５０ｍｌのバツフル付三角フラス
コに含有されている殺菌培地４０ｍｌに移す。

培地はｐＨ ７の脱イオン化水中のプライマリー・ドラ
イド・イーストＮ，Ｆ （Ｎ．Ｊ パターンのイース
ト・プロダクツ・カンパニーによって供給される。

） １ ０ ｆ？／ｌ：を含有している。フラスコを２
２Ｏｒｐｍに固定した回転振盪機（２吋ディスプレース
メント）上で２８℃で４８時間培養する。

この時間において、微生物の豊富な生長がみられる。

フラスコ内容物の一部を殺菌管に入れて使用するまで−
７８℃で貯蔵する。

第１種子段階 凍結した接種体を３６℃でとかし次に１７７１ｌを使用
して２５０７７ｌｌのバツフル付三角フラスコに含有さ
れているｐＨ７の脱イオン化水中のプライマリー・ドラ
イド・イーストＮ．Ｆ （Ｎ，Ｊ．ペーターソンのイ
ースト・プロダクツ・カンパーによって供給される。

）１０′ｉＩ／Ｊを含有する殺菌培地４０ｒｕｌに接種
する。

微生物を２ ２ ０ ｒ， ｐ．ｍに固定された回転振
盪機（２吋ディスプレースメント）上で２８℃で約４５
時間培養する。

第２種子段階 第１段階の種子１ ｍｌを使用して２５０ｍｌのバツフ
ル付三角フラスコ中のｐＨ ７の脱イオン化水中の１％
アルダミンＹＥＰ・イースト・オートリセ−｝（Ｎ，Ｊ
．パターソンのイーストプロダクツ・カンパニーによっ
て供給される）を含有する殺菌培地４０ｍｌに接種する
。

微生物を２２Ｏｒｐｍの回転振盪機（２吋ディスプレー
スメント）上で２８℃で２４時間培養し次に生産培地に
対する接種体として使用する。

基生産培地 基生産培地は次の組成を有す。

％ デイスチラーズ・ソリューブルス ３．０ Ｗ／Ｖ％ プライマリー・ドライド・イース ０．７５Ｗ／ＶトＮ
．Ｆ． グリセロール １． ２ ５Ｗ／Ｖジ
メチルフォルムアミド １．Ｏ Ｖ／Ｖグリ
シン ０．０５Ｗ／ＶＬ−フ
エニルアラニン ０．３ Ｗ／Ｖモビルパ
ーＳ一脱泡剤 ０．２５Ｗ／Ｖチオ硫酸ナト
リウム＊ ｏ．Ｉ Ｗ／Ｖ＊ 沢過殺菌濃
厚貯蔵溶液から接種後に ０〜２４時で殺菌的に加えて上述した ような最終濃度を与える 培地を脱イオン化水中で製造し、水酸化ナ｝ Ｉ）ウム
でｐＨ７に調整し、２５０ｗＬｌの三角フラスコに４０
ｒｒＬｌづつ分配し次に２０分オートクレープで処理す
ることによって殺菌し次に冷却する。

前述したようにして製造した一連のフラスコにＤ−また
はＤＬ−リジン・ＨＣＩ，Ｄ−アルギニン・ＨＣＩ，Ｄ
−オルニチン・ＨＣＩ 及び（または）１・３−ジアミ
ノプロパン・２ＨＣｌを加える。

フラスコはアミノ酸の存在以外はすべての点で同一であ
る。

添加剤の濃厚貯蔵溶液を水中で製造しそして塩酸または
水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７にする。

Ｐ過殺菌貯蔵溶液を微生物による接種直前に所望の最終
濃度で基生産培地を含有するフラスコに加える。

添加剤の添加後に、培地を第２段階種子２．５容量％で
接種し次に２２Ｏｒｐｍに固定された回転振盪機（２０
吋ディスプレースメント）上で２８℃で９６時間培養す
る。

醗酵の完了後に、細胞を遠心分離処理によって除去し次
に試験微生物としてビブリオ・パーコランスを使用して
前述した方法でセファマイシンＣに対して試験する。

例４ 接種体の製造 ストレプトミセス・ラクタムジュランス ＮＲＲＬ ３ ８ ０ ２の凍結乾燥管を殺菌的に開き
そしてその内容物を２５０ｍｌのバツフル付三角フラス
コ中に含有されている殺菌培地４０ｍｌに移す。

培地はｐＨ ７の脱イオン化水中のプライマリー・ドラ
イド・イーストＮ．Ｆ．（Ｎ．Ｊ．パターソンのイース
ト・プロダクツ・カンパニーにより供給される。

）１ｏｆ／Ｊを含有している。フラスコを２２０ｒｐｍ
に固定された回転振盪機（２吋ディスプレースメント）
上で２８℃で４８時間培養する。

この時間において、微生物の豊富な生長がみられる。

フラスコ内容物の一部を殺菌管に移しそして使用するま
で−７８℃で貯蔵する。

第１種子段階 凍結した接種体を３６℃でとかし次に１一を使用して２
５０ｍｌのバツフル付三角フラスコ中のｐＨ ７の脱イ
オン化水中のプライマリー・ドライド・イーストＮ．Ｆ
．（Ｎ．Ｊ．パターソンのイースト・プロダクツ・カン
パニーにより供給される。

）１ ０ ｆｌ／ｌを含有する殺菌培地４０１ｎｌに接
種する。

微生物を２２Ｏｒｐｍに固定された回転振盪機（２吋デ
ィスプレースメント）上で２８℃で４５時間培養する。

第２種子段階 第１段階種子１ｍＡ’を使用して２５０ｒＩＬｌのバツ
フル付三角フラスコ中のｐＨ ７の脱イオン化水中の１
％アダルミンＹＥＰイースト・オートリゼート（Ｎ．Ｊ
．パターソンのイースト・プロダクッ・カンパニーによ
り供給される。

）を含有する殺菌培地４０ＴｒＬｌに接種する。

微生物を２２Ｏｒｐｍの回転振盪機（２吋ディスプレー
スメント）上で２８℃で２４時間培養し次に生産培地に
対する接種体として使用する。

基生産培地 ” 基生産培地は次の組成を有す。

％ デイスチラーズ・ソリューブルス ３．０ Ｗ／Ｖプ
ライマー・ドライド・イースト ０．７ ５Ｗ／ＶＮ．
Ｆ， グリセロール １． ２ ５Ｗ／Ｖジ
メチルフォルムアミド １．Ｏ Ｗ／Ｖグリ
シン ０．０５Ｗ／ＶＬ−フ
エニルアラニン ０．３ Ｗ／Ｖモビルパ
ーＳ一脱泡剤 ０．２５Ｗ／Ｖチオ硫酸ナト
リウム＊０．Ｉ Ｗ／Ｖ ＊ Ｐ過殺菌濃厚貯蔵溶液から接種後Ｏ 〜２４時間で殺菌的に加えて上述した ような最終濃度を与える。

培地を脱イオン化水中で製造し、水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ７に調整し、２５０ｍｌの三角フラスコに４０ｍｌづ
つ分配し、２０分オートクレープ処理することによって
殺菌し次に冷却する。

前述したようにして製造した一連のフラスコに、Ｄ一ま
たはＤＬ−リジン・ＨＣＩ，１・３−ジアミノー２−ヒ
ドロキシプロパン及びＮ−メチル−１・３−ジアミノプ
ロパンを加える。

フラスコは、アミノ酸の存在以外はすべての点で同じで
ある。

添加剤の濃厚貯蔵溶液を水中で製造し、次に塩酸または
水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７にする。

沢過殺菌貯蔵溶液を微生物による接種直前にに所望の最
終濃度において基生産培地を含有する冫フラスコに加え
る。

添加剤の添加後に、培地を第２段階種子２．５容量％で
接種しそして２ ２ Ｏ ｒ， ｐ．ｍに固定された回
転振盪機（２吋ディスプレースメント）上で２８℃で９
６時間培養する。

醗酵完了後に、細胞を遠心分離処理によって除去し次に
透明な液を試験微生物としてビブリオパーコランスＡＴ
ＣＣ８４６１を使用して前述した方法でセファロマイシ
ンＣについて試験する。

例５ 接種体の製造 ストレプトミセス・ラクタムジュランスの凍結乾燥管を
殺菌的に開きそしてその内容物を２５０１ｒｌｌのバツ
フル付三角フラスコに含有されている殺菌培地４０ｍｌ
に移す。

培地は、ｐＨ７の脱イオン化水中のプライマー・ドライ
ド・イーストＮ，Ｆ（Ｎ．Ｊ．パターンンのイースト・
プロダクト・カンパニーにより供給される。

） １ｏ？／ｌを含有する。

フラスコを２ ２ Ｏ ｒｐｍに固定した回転振盪機（
２吋ディスプレースメント）上で２８℃で４８時間培養
する。

この時間において、微生物の豊富な生長がみられる。

フラスコ内容物の一部を殺菌管に移しそして使用するま
で−７８℃で貯蔵する。

第１種子段階 凍結接種体を３６℃でとかし次に１ ｍｌを使用して２
５０ｒＩＬｌのバツフル付三角フラスコに含有されてい
るｐＨ ７の脱イオン化水中のプライマリー・ドライド
・イーストＮ．Ｆ．（Ｎ．Ｊ．パターソンのイースト・
プロダクツ・カンパニーにより供給される。

）１ｏｆ／Ｊを含有する殺菌培地４０ｒｒＬｌに接種す
る。

微生物を２２０ｒｐｍに固定された回転振盪機（２吋デ
ィスプレースメント）上に２８℃で４５時間培養する。

第２種子段階 第１段階の種子１ ｒｎｌを使用して、２５０ｒｒＬｌ
のバツフル付三角フラスコ中のｐＨの脱イオン化水中の
１％アルダミンＹＥＰ・イースト・オートリゼート（Ｎ
．Ｊ．パターソンのイースト・プロダクツ・カンパニー
により供給される）を含有する殺菌培地４０ｒｎｌに接
種する。

微生物を２２０ｒｐｍＯ回転振盪機（２吋ディスプレー
スメント）上で２８℃で２４時間培養し次に生産培地に
対する接種体として使用する。

基生産培地 基生産培地は次の組成を示す。

％ テイスチラーズ・ソリューブルス ３．０ Ｗ／Ｖプ
ライマリー・ドライド・イース ０．７５Ｗ／ＶトＮ．
Ｆ． グリセロール １． ２ ５Ｗ／Ｖジ
メチルフォルムアミド １．Ｏ Ｗ／Ｖグリ
シン ０．０５Ｗ／ＶＬ−７
エニルアラニン ０．３ Ｗ／ＶモビＡ／
Ｉ１パー−Ｓ一脱泡剤 ０．２５Ｗ／Ｖチオ硫酸
ナトリウム＊０．Ｉ Ｗ／Ｖ ＊ Ｆ過殺菌濃厚貯蔵溶液から接種後Ｏ 〜２４時間で殺菌的に加えて上述した ような最終濃度を与える。

培地を脱イオン化水中で製造し、水酸化ナトリ・ウムで
ｐＨ７に調整し、２５０１ｒＬｌの三角フラスコに４０
ｍｌづつ加え、２０分オートクレープ処理することによ
って殺菌し次に冷却する。

上述したようにして製造した一連のフラスコに、Ｄ一ま
たはＤＬ−リジン・ＭＣＩ、アグマチンサルフエート、
カダベリン・ｆ｛Ｃｌ１ １・３−ジアミノプロパン２
ＨＣｌ，プトレッシン２ＨＣｌ・スペルミジン・３ＨＣ
ｌ及びスペルミン・４ｆ｛ＣＩを加える。

フラスコはアミノ酸の存在以外はすべての点で同じであ
る。

添加剤の濃厚貯蔵溶液を水中で製造しそして塩酸または
水酸化ナトリウムで中和してｐＨ７にする。

ｒ過殺菌貯蔵溶液を、微生物による接種直前に所望の最
終濃度で基生産培地を含有するフラスコに加える。

添加剤の添加後に、培地を第２段階種子２．５容量％で
接種しそして２２０ｒｐｍに固定された回転振盪機（２
吋ディスプレースメント）上で２８℃で９６時間培養す
る。

醗酵完了後に、細胞を遠心分離処理によって除去し次に
透明な液を試験微生物としてビブリオ・パーコランスＡ
ＴＣＣ８４６１を使用して前述したようにセファマイシ
ンＣについて試験する。

第１表の考察から容易に判るように、醗酵培地に対する
Ｄ−またはＤＬ−アルギニン及びＤ一またはＤＬ−オル
ニチンの添加はセファマイシンＣの生産を刺激する。

ポリアミン化合物によるセファマイシンＣの生産の刺激
に対する例は、第２表に示す通りである。

第３、４及び５表は、ポリアミン化合物とアミノ酸の合
した添加は、化合物の分離した添加によって生ずる刺激
に比較した場合により犬なるセファマイシンＣ生産能を
与えるということを証明する結果を示す。

例は、明らかに単独またはポリアミン１・３−ジアミノ
プロパン、１・３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン
、Ｎ一メチル−１・３−ジアミノプロパン、アグマチン
、スペルミジン、スペルミン、カタヘリン及ヒプトレツ
シンと組合せたＤ一またはＤＬ−アルギニン、Ｄまたは
ＤＬ−オルニチン；または前記ポリアミンと組合せたＤ
一またはＤＬ−リジンは、すべて抗生物質セファマイシ
ンＣの生産を刺激する意外な現象を示すということを証
明する。

本発明の前記説明からの離脱は何れも特許請求の範囲に
包含されるべく企図されるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 栄養培地中でストレプトミセスのセファマイシンＣ
   生産菌種を生長せしめることによりセファマイシンＣを
   製造する方法において、栄養培地にアミノ酸Ｄ一または
   ＤＬ−アルギニン、Ｄ一またはＤＬ−オルニチンまたは
   １・３−ジアミノプロパン、１・３−ジアミノ−２−ヒ
   ドロキシブロバン、Ｎ−メチル−１・３−ジアミノプロ
   パン、アグマチン、スペルミジン、スペルミン、カダベ
   リン及びプトレツシンからなる群から選択された幾つか
   のポリアミンの１種を添加することを特徴とする改良法
   。 ２ ストレプトミセス菌種がストレプトミセス・ラクタ
   ムジュランスである特許請求の範囲第１項の方法。 ３ 栄養培地が複合有機栄養培地である特許請求の範囲
   第２項の方法。 ４ 栄養培地が塩酸塩として計算したアミノ酸Ｄーまた
   はＤＬ−アルギニンまたはＤ一またはＤＬ−オルニチン
   約０．０２５〜０，４０重量／容量％、またはジ塩酸塩
   として計算した１・３−ジアミノプロパン約０．０１〜
   ０．２重量／容量％、またはそれぞれトリ塩酸塩及びテ
   トラ塩酸塩として計算したスペルミジンマタはスペルミ
   ４Ｊ０．０ ０ ２ ５〜０．０５重量／容量％、また
   はジ塩酸塩として計算したカタベリンまたはプトレツシ
   ン約０．０２５〜０．２重量／容量％、または硫酸塩と
   して計算したアグマチン約０．０２５〜０．２重量／容
   量％、または遊離塩基としての１・３−ジアミノー２−
   ヒドロキシプロパンまたはＮ−メチル−１・３−ジアミ
   ノプロパン約０．０５〜０．２重量／容量％を含有する
   特許請求の範囲第３項の方法。 ５ 栄養培地中でストレプトミセスのセファマイシンＣ
   生産菌種を生長せしめることによってセファマイシンＣ
   を製造する方法において、１・３ージアミノプロパン、
   １・３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、Ｎ−メチ
   ル−１・３−ジアミノプロパン、アグマチン、スペルミ
   ジン、スペルミン、カダベリン及びプトレツシンからな
   る群から選択されたポリアミンと組合せたアミノ酸Ｄ−
   またはＤＬ−アルギニン、Ｄ一またはＤＬ−オルニチン
   またはＤ一またはＤＬ−リジンを添加することを特徴と
   する改良法。 ６ ストレプトミセス菌種がストレプトミセス・ラクタ
   ムジュランスである特許請求の範囲第５項の方法。 ７ 栄養培地が複合有機栄養培地である特許請求の範囲
   第６項の方法。 ８ 栄養培地がジ塩酸塩として計算した１・３一ジアミ
   ノプロパンまたはカダベリンまたはプトレツシン約０．
   １重量／容量％、またはそれぞれトリ塩酸塩またはテト
   ラ塩酸塩として計算したスペルミジンまたはスペルミン
   約０．０２重量／容量％、または硫酸塩として計算した
   アグマチン約０．１重量／容量％または遊離塩基として
   の１・３−ジアミノー２−ヒドロキシプロパンまたはＮ
   −メチル−１・３−ジアミノプロパン約０．０５〜０．
   ２重量／容量％と組合された塩酸塩として計算した約０
   ．１〜０．２重量／容量％の程度のアミノ酸Ｄ−または
   ＤＬ−アルギニン、Ｄ−またはＤＬ−オルニチンまたは
   Ｄ一またはＤＬ−リジンを含有する特許請求の範囲第７
   項の方法。 ９ ＤＬ−リジン及び１・３−ジアミノプロパンをそ
   れぞれ塩酸塩及びジ塩酸塩として計算して約０．１重量
   ／容量％の程度に加える特許請求の範囲第８項の方法。