DE2638024A1

DE2638024A1 - Verfahren zur herstellung von cephamycin c

Info

Publication number: DE2638024A1
Application number: DE19762638024
Authority: DE
Inventors: Jerome Birnbaum; Edward Inamine
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1975-11-21
Filing date: 1976-08-24
Publication date: 1977-05-26
Also published as: JPS5910200B2; DE2638024C2; FR2332323A1; AU1687576A; US3977942A; GB1515809A; JPS5264490A; AU517298B2; CA1064419A; FR2332323B1; ES451318A1

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Gär- bzw. IFermentationsverfahren zur Herstellung des bekannten, wertvollen Antibiotikums Cephamycin C [7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido ) -3-carbamoyloxymethyl) -^-methoxy-^-cephem-^-carbonsäure; vgl. Antimicrobial Agent and Chemotherapy, Bd.2 (September 1972), Seiten 121 bis 131, 132 bis 135» 281 bis 286 und 287 bis 290\ Im besonderen betrifft die Erfindung ein verbessertes "Verfahren zur Herstellung des genannten Antibiotikums durch Fermentation von Nährmedien mit geeigneten Stämmen von Mikroorganismen, wie Streptomyces.

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Das genannte Antibiotikum bildet sich während der unter geregelten Bedingungen erfolgenden aeroben Gärung von geeigneten wäßrigen Nährmedien. Geeignet sind wäßrige Medien, wie sie für die Synthese anderer Antibiotika verwendet werden. Solche Medien enthalten Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen, welche durch die Mikroorganismen assimilierbar sind. Außerdem enthalten die Gärmedien Spurenanteile von für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Metallen, welche gewöhnlich als zufällige Verunreinigungen der anderen Bestandteile des Mediums eingeschleppt werden. Als assimilierbaren Kohlenstoff liefernde Substanzen können im allgemeinen Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Glucose, Maltose, Fructose oder lactose,und Stärkematerialien, wie Getreide, z.B„ Hafer und Roggen, Maisstärke oder Maismehl, einzeln oder in kombinierter Form eingesetzt werden. Die genaue dem Medium einverleibte Kohlenhydratmenge hängt teilweise von den übrigen Bestandteilen ab. Es wurde jedoch festgestellt, daß ein Kohlenhydratanteil von etwa 1 bis 6 GeWp-$ (bezogen auf das Medium) ausreicht. Man kann eine einzige kohlenstoffliefernde Substanz verwenden oder mehrere derartige Substanzen kombinieren.

Beispiele für geeignete stickstoffliefernde Substanzen sind die unzähligen proteinhaltigen Materialien, wie verschiedene Formen von Caseinhydrolysaten, Sojamehl, Maisquellwasser (corn steep liquor), lösliche Brauerei- und Brennereirückstände (distillers solubles), Hefeprodukte oder Tomatenpaste. Die verschiedenen stickstoffliefernden Substanzen können entweder einzeln oder im Gemisch eingesetzt werden. Ihre Anteile liegen im Bereich von 0,2 bis 6 Gew.-$ (bezogen auf das wäßrige Medium).

Die Fermentation (Gärung) erfolgt bei Temperaturen von 20 bis 37⁰C. Die besten Resultate werden jedoch erzielt, wenn man die Fermentation im bevorzugten Temperaturbereich von

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etwa 24 bis 32⁰G durchführt. Der pH-Wert des zur Züchtung der Streptomyces-Kulturen und zur Synthese des Antibiotikums geeigneten Nährmediums soll im Bereich von etwa 6»O "bis 8,0 liegen.

Cephamyein G "bildet sich während der vorstehend beschriebenen aeroben Gärung durch einen zur Bildung dieser Verbindung befähigten Stamm von Streptomyces lactamdurans_f beispielsweise durch den in der KuI tür Sammlung der Northern Utilization Research and Development Branch des U.S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois unter der Registernummer NERL 3802 hinterlegten Stamm. Auch andere Stämme dieser Species sind verwendbar» beispielsweise durch Mutationsmittel erhaltene oder aus Natursubstanzen isolierte Mutanten.

Cephamyein C und seine Salze sind nicht nur gegenüber Penicillinase» sondern auch gegenüber den Cephalosporinasen resistent. Die Verbindung hemmt das Wachstum von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen. Anders als Cephalosporin C, welches eine relativ geringe antibakterielle Aktivität aufweist, entfaltet Cephamyein C in vivo eine ausgeprägte gram-negative Wirkung, welche im allgemeinen stärker als jene von Cephalothin ist. Ton dieser Wirkung werden u.a. folgende gram-negative Bakterien erfaßt: Escheriehia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella schottmuelleri, Klebsieila pneumoniae AD, Klebsiella pneumoniae B und Paracolonbacterium arizonae.

Das Antibiotikum Cephamycin C wurde nach der in den US-PS en 3 769 169» 3 770 590 und 3 886 044 beschriebenen Scheiben-Platten-Methode unter Verwendung von 0,375 cm (3/8 in)-Filterpapierscheiben einem biologischen Test unterworfen. Die Festplatten wurden unter Verwendung von Difeo-Uähragar und 2 g/l Difeo-Hefeextrakt bei einer Menge von 10 ml/Platte

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hergestellt. Eine über Nacht gewachsene Kultur des Testorganismus (Vibrio percolans ATCC 8461) wurde mit steriler Kochsalzlösung so weit verdünnt, bis eine Suspension mit einer Transparenz von 40 $ bei 660 πιμ erhalten wurde. Diese Suspension wurde dem Medium vor dem Gießen der Platten in einem Anteil von 20 ml/1 einverleibt.

Die Testplatten wurden bis zur Verwendung bei 4⁰C gehalten (maximal 5 Tage). Nach der Aufbringung der mit dem Antibiotikum gesättigten Testscheiben wurden die Platten 8 bis 24 Std. bei 28⁰C inkubiert. Die Bereiche der Hemmung wurden als mm Durchmesser gemessen. Aus den Werten wurden die relativen Wirksamkeiten oder - gegenüber einem gereinigten Vergleichsstandard von Cephamycin C - die Wirksamkeit in μg/ml bestimmt.

Wegen der schwierigen Abtrennung von reinem Cephamycin C von den großen Mengen von Verunreinigungen in der Gärbrühe besteht ein ausgeprägter Bedarf an einer Methode zur Erhöhung der Konzentration dieses Antibiotikums relativ zum Gesamtfeststoffanteil der Brühe.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute des genannten Antibiotikums bei einem Gär- bzw. üPermentationsprozeß zur Verfugung zu stellen. Die Aufgabe der Erfindung besteht ferner darin_f ein Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute des Antibiotikums zu schaffen, welches die Verwendung relativ billiger» leicht verfügbarer chemischer Zusätze beim Fermentationsprozeß gestattet. Die nachfolgende Beschreibung erlaubt eine Präzisierung dieser Aufgabe.

Erfindungsgemäß wurde nunmehr festgestellt, daß durch Zugabe von D- oder DL-Arginin, D- oder DL-Ornithin oder verschiedenen Polyaminen, wie 1,3-Diaminopropan, 1,3-Diamino-2-

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2-hydroxypropan, N-Methyl-1,3-diaminopropan, Agmatin, Spermidin, Spermin, Cadaverin oder Putrescin, zu komplex zusammengesetzten organischen Gärmedien die Bildung von Cephamycin C gefördert wird. Um die Gärausbeute weiter zu verbessern, kann man ferner die Aminosäuren D- oder DI-Arginin, D- oder DL-Ornithin oder D- oder DL-lysin in Kombination mit einem Polyamin, wie 1,3-Diaminopropan, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, IT-Methyl-1,3-diaminopropan, Agmatin, Spermidin, Spermin, Cadaverin oder Putrescin, zusetzen.

Unter "komplex zusammengesetzten organischen Medien" sind Medien zu verstehen, bei denen einige Bestandteile chemisch nicht definiert sind. Ein derartiges Medium besteht beispielsweise aus löslichen Brauerei- und Brennereirückständen, primärer Trockenhefe, Glycerin, Dimethylformamid, Glycin, L-Phenylalanin, Hatriumthiοsulfat und einem Schauminhibitor; dabei stellen die löslichen Brauerei- und Brennereirückstände sowie die primäre IDrockenhefe chemisch Undefinierte Substanzen dar.

Der zur Anregung der Bildung des Antibiotikums Cephamycin C erforderliche Anteil der Aminosäure und/oder des Polyamins hängt in gewissem Maße von der jeweiligen Kultur und dem jeweiligen Medium ab. Im Falle einer Kultur von Streptomyces lactamdurans wurde eine erhöhte Bildung von Cephamycin C in komplex.zusammengesetzten organischen Medien festgestellt, welche etwa 0,025 bis etwa 0,40 fo (Gew./Vol.) der Aminosäure D- oder DL-Arginin oder D- oder DL-Ornithin (ausgedrückt als das Hydro chi ο rid), etwa 0,01 bis etwa 0,2 fo (Gew./Vol.) 1,3-Diaminopropan (ausgedrückt als das Dihydrochiorid), etwa 0,0025 bis 0,05 f° (Gew./Vol.) Spermidin oder Spermin (ausgedrückt als das Trihydrochlorid bzw. Tetrahydrochlorid), etwa 0,025 "bis 0,2 fo (Gew./Vol.) Cadaverin oder Putrescin (ausgedrückt als das Dihydrochlorid), etwa 0,025 bis 0,2 fo

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(Gew./Vol.) Agmatin (ausgedrückt als das Sulfat) oder etwa 0,05 "bis etwa 0,2 36 (Gew./Vol.) 1,3-Diamino-2-hydroxypropan oder N-Methyl-1,3-diaminopropan (als freie Base) enthielten.

Die Aminosäuren und Polyamine können nicht nur als Einzelsubstanzen, sondern auch in kombinierter Form als Zusatz "verwendet werden, welcher die Ausbeute an Cephamycin C in komplex zusammengesetzten organischen Hahrmedien bei Verwendung von Streptomyces lactamdurans erhöht. Es hat sich gezeigt, daß die Cephamycin C-Ausbeute bei gemeinsamer Zugabe der Aminosäuren (Arginin, Lysin und Ornithin) und der Polyamine stärker gesteigert wird als bei getrennter Einverleibung der einzelnen Verbindungen.

Eine Erhöhung der Bildung des Antibiotikums wurde ferner festgestellt bei Zugabe der Aminosäuren D- oder DL-Arginin, 33- oder DL-Ornithin oder D- oder DL-Lysin, wobei der Anteil der Aminosäure etwa 0,1 bis etwa 0,2 <fi (Gew./Vol.) (ausgedrückt als das Hydrochlorid) betrug, in Kombination mit etwa 0,1 ia (Gew./Vol.) 1,3-Diaminopropan, Cadaverin oder Putrescin (ausgedrückt als das Dihydrochlorid), mit etwa 0,02 io (Gew./Vol.) Spermidin oder Spermin (ausgedrückt als das Trihydrochlorid bzw. Tetrahydrochlorid), mit etwa 0,1 io (Gew./Vol.) Agmatin (ausgedrückt als das Sulfat) oder mit etwa 0,05 bis etwa 0,2 <$> (Gew./Vol.) 1,3-Diamino-2-hydroxypropan oder ΪΤ-Methyl-i,3-diaminopropan (als freie Base). Optimale Antibiotikumausbeuten werden erzielt, wenn das Medium etwa 0,1 bis etwa 0,2 io Aminosäuren und etwa 0,1 "ja Polyamine (mit Ausnahme von Spermidin und Spermin, welche bei einem Anteil von etwa 0,02 io am wirksamsten sind) enthält. Die bevorzugte Aminosäure/Polyamin-Kombination besteht aus DL-Lysin und 1,3-Diaminopropan bei einem zugesetzten Anteil von etwa 0,1 $ (Gew./Vol.) (ausgedrückt als das Hydrochlorid bzw. Dihydrochlorid).

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Außer äen Torgenannten Aminosäuren und Polyaminen eignen sich auch deren Salze für den erfindungsgemäßen Zweck. Man kann dem Basalproduktionsmedium (Basalmedium) zur Erhöhung der Ausbeute des Antibiotikums beispielsweise die Hydrochloride, Sulfate oder Phosphate einverleiben.

Der Zeitpunkt der Zugabe der ausbeuteerhöhenden Zusätze zum G-äransatz ist nicht ausschlaggebend. Die Zugabe kann z.B. anläßlich der Beimpfung mit der Streptomyces-Kultur oder bis zu 72 Std. danach erfolgen. Vorzugsweise werden die Aminosäuren und Polyamine unmittelbar vor der Beimpfung zugesetzt.

Die obigen Ausführungen und die nachfolgenden Beispiele betreffen hauptsächlich Gärungen, welche mit Hilfe eines bestimmten Stammes der Kultur von Streptomyces lactamdurans durchgeführt wurden. Man kann für die Synthese dieses Antibiotikums jedoch auch andere Stämme des. genannten Organismus (z.B. Mutanten) verwenden. Der Fachmann kann der erfindungsgemäßen Lehre ohne weiteres entnehmen, daß die Antibiotikumausbeute durch Zugabe von D- oder DL-Arginin» D- oder DL-Ornithin und/oder eines Polyamins oder von D- oder DL-Lysin zusammen mit einem Polyamin zu der solche Stämme enthaltenden Gärhrühe erhöht werden kann. Unabhängig davon, welcher Stamm von Streptomyces lactamdurans für die Synthese von Cephamycin C verwendet wird, werden sich dem Durchschnittsfachmann aufgrund der erfindungsgemäßen Lehre ohne weiteres die jeweils erforderlichen Abwandlungen oder Änderungen der optimalen Zusatzanteile oder des Zeitpunkts der Zugabe zum Gärmedium erschließen.

Obwohl Cephamycin C sowohl durch Oberflächen- als auch durch Submerskulturen gebildet wird, führt man die Gärung derzeit vorzugsweise nach dem Submersverfahren durch. Im KLeinmaßstab werden die Gärungen zweckmäßig dadurch vorgenommen, daß

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man geeignete Anteile des Nährmediums in Kolben einfüllt, die Kolben samt Inhalt durch Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert, entweder mit Sporen oder einer vegetativen Zellkultur eines Cephamycin C erzeugenden Streptomyees-Stammes "beimpft und lose mit Baumwolle zustöpselt und die Gärung an einem Schüttelapparat 1 bis 4 Tage bei einer konstanten Temperatur von etwa 28⁰C erfolgen läßt.

Im größeren Maßstab wird die Gärung vorzugsweise in geeigneten, mit einem Rührer und einer Vorrichtung zum Belüften des Gärmediums ausgestatteten Behältern durchgeführt. Bei dieser Methode wird das Uährmedium im Behälter zubereitet und durch Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert. Hach dem Abkühlen beimpft man das sterilisierte Medium mit einem geeigneten Ausgangsmaterial für ein vegetatives Zellwachstum der Streptomyces-Kultur und läßt die Gärung unter Rühren und/oder Belüften des ifährmediums und Aufrechterhaltung einer Temperatur von etwa 28⁰C während 3 bis 5 Tagen stattfinden. Diese Synthesemethode für Cephamcycin C eignet sich insbesondere zur Herstellung großer Mengen des Antibiotikums .

Zur Durchführung des erfindungs gemäß en Verfahrens stellt man zunächst eine Zellsuspension her, indem man eine Schrägagarkultur des Cephamycin C erzeugenden Mikroorganismus mit sterilem Nährmedium versetzt. Das Waehstumsprodukt der Schrägkultur wird im Medium suspendiert. Anschließend beimpft man einen Kolben ("Impfkolben") mit der Suspension und schüttelt ihn 1 bis 3 Tage bei etwa 28⁰C, um ein gutes Wachstum zu erzielen. Aus dem Impfkolben werden dann die Produktionskolben beimpft. Man kann den Impfkolben auch wahlweise aus einer gefriergetrockneten Kultur oder einem eingefrorenen Inokulum beimpfen. Außerdem kann man mehr als eine Impfstufe (Überimpfung) vornehmen.

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Das Basalmedium wird in entionisiertem Wasser zubereitet, auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestellt, in Produktionskolben abgefüllt und etwa 20 Min. im Autoklaven sterilisiert. Dann bringt man die gewünschten Anteile des sterilen Zusatzes in die Produktionskolben ein und führt die Beimpfung - im allgemeinen unter Verwendung von etwa 1ml Inokulum/40 · ml Produktionsmedium - durch. Hierauf läßt man die Gärung während 2 bis 4 Tagen unter Rühren und/oder Belüften des Hahrmediums und Aufrechterhaltung einer Temperatur von etwa 28⁰C stattfinden. Anschließend (im allgemeinen nach 96 Std.) bestimmt man in sämtlichen Produktionskolben (d.h. in jenen, welche die vorgenannten Zusätze enthalten, sowie in den zum Vergleich dienenden Kolben) jeweils die gebildete Menge des Antibiotikums.

Man analysiert Teilmengen des Inhalts der Produktionskolben, indem man die Proben mit 0,02 m Phosphatpuffer (pH 7) bis zu einer geeigneten Konzentration verdünnt. Als Testorganismus dient Vibrio percolans ATCC 84-61, während als Analysemedium Difco-Nähragar mit 0,2 $ Difco-Hefeextrakt verwendet ■wird. Scheiben mit einem Durchmesser von 9,525 mm (3/8 in) werden in eine 5 μg des Standard-Antibiotikums/ml enthaltende Lösung getaucht und dann in abwechselnder Position zu den Testproben auf die Platte gegeben. Die Platten werden hierauf 18 Std. bei 28⁰C inkubiert. Anschließend bestimmt man die Zonendurchmesser (in mm). Es werden fünf Standardscheiben mit vier Gehalten des Standard-Antibiotikums im Bereich von 2,5 bis 20 μg/ml verwendet. Der Anteil des Antibiotikums in der Testprobe wird anhand der Eichkurve bestimmt, welche aus den bekannten Konzentrationen der Lösungen des Standard-Antibiotikums erhalten wird. Die Resultate werden in μg des Antibiotikums (in Form der freien Säure) pro ml wiedergegeben.

Das Antibiotikum kann nach mehreren Verfahren aus dem Gärmedium isoliert werden. Man kann die filtrierte Brühe durch

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eine oder mehrere Ionenaustauschsäule(n) leiten. Aufgrund des amphoteren Charakters des Antibiotikums kann man sowohl Kationen- als auch Anionenaustauscherharze heranziehen» um eine optimale Ausbeute zu erzielen. Das adsprMerte Antibiotikum kann dann eluiert werden, wobei man als Elutionsmittels vorzugsweise ein flüchtiges, leicht abtrennbares Lösungsmittel (wie Pyridin) verwendet.

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel

Herstellung des Inokulums

Ein lyophilisertes Röhrchen mit Streptomyces lactamdurans NEE! 3802 wird unter aseptischen Bedingungen geöffnet und sein Inhalt in 40 BiI eines sterilen Mediums übertragen, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet. Das Medium enthält pro Liter (in entionisiertem Wasser) 10 g primäre Irockenhefe (Primary Dried Yeast, H.P.; Yeast Products Co., Paterson, ÜT.J.) beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm bzw. 2 in. Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert. Nach dieser Zeitspanne läßt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbeninhalts werden dann in sterile Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei -78⁰C aufbewahrt.

Erste Impfkultur

Man taut das eingefrorene Inokulum bei 36⁰C auf und verwendet einen Milliliter zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und pro Liter (in .entionisiertem Wasser) 10 g der vorgenannt en primären Trocken-

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hefe (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird etwa 45 Std. "bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert.

Zweite Impfkultür

Ein Milliliter der ersten Impfkultur wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium· verwendet» welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und 1 $ Jrdamine YEP-Hefeautolysat (Yeast Products Co., Paterson, IT.J.) in entionisiertem Wasser (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert, und dient als Inokulum für das Basal- bzw. Produktionsmedium.

Basalmedium

Das Basalmedium weist folgende Zusammensetzung auf:

lösliche Brauerei- und Brennereirückstände	3,0	(Gew./YoI.)
primäre Trockenhefe IT. S¹.	0,75	(Gew./YoI.)
Glycerin	1,25	(Gew./YoI.)
Dimethylformamid	1,0	(YoI./Vol.)
Glycin	0,05	(Gew./YoI.)
Ii-Phenylalanin	0,5	(Gew./Vol.)
Mobil Par S (SchauminMbitor)	0,25	(Gew./YoI.)
Uatriumthio sulfat*	0,1	(Gew./YoI.)

* 0 bis 24 Std. nach der Beimpfung unter aseptischen Bedingungen aus einer sterilfiltrierten, konzentrierten Vorratslösung in einem für die angegebene Endkonzentration ausreichenden Anteil zugesetzt.

Das Medium wird mit entionisiertem Wasser zubereitet und mit

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natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Jeweils 40 ml des Mediums werden dann in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben eingegeben, 20 Min. im Autoklaven sterilisiert und danach abgekühlt.

In mehrere in der vorgenannten Weise präparierte Kolben werden dann D- oder DL-Arginin«HCl bzw. D- oder DL-Oraithin»HCl eingegeben. Abgesehen von der jeweiligen Aminosäure werden die Kolben in identischer Weise beschickt.

Es werden konzentrierte wäßrige Vorratslösungen der jeweiligen Aminosäurezusätze hergestellt. Die lösungen werden entweder mit Salzsäure oder mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterilfiltrierten Vorratslösungen werden unmittelbar vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus in die das Basalmedium enthaltenden Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzentrationen eingegeben.

Nach der Einverleibung der Aminosäurezusätze beimpft man das Medium mit 2,5 Vol.-^ der zweiten Impfkultur und inkubiert es 96 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm Verdrängung) bei einer Drehzahl von 220 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen ist, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare Brühe in der vorstehend beschriebenen Weise unter Verwendung von Vibrio percolans ATGC 8461 als Testorganismus auf Cephamycin G. Die Ergebnisse sind aus Tabelle I ersichtlich.

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	Zusätze des Basalmediums	TABEIIE I	199	202	162	-	172	—	160	215	der	Zusätze	des Basalmediums, fi	0,30	234	264	0,40	-j.
		Konzentration	230	—	—	226	0,05	0,10 O	,20	von Cephainycin C, \|.	264	246	ig/ml	VJl 00 IV)
		O 0,025	212	—	_	—	Menge			246	301
	keiner (YergleichsprolDe)	gebildete	-	-	-			282			—
	D-Arginin HCl		232		221	196	-
	D-Ornithin·HCl	229	199	215	-	-
	DI-Ornithin-HCl	218		222	—
	keiner (YergleichsprolDe)		206	187	—	193
-4 CO	D-Arginin·HCl	238	193			246
CO	DI-Arginin*HCl	200	232	219	—	254
OO	D-Ornithin*HCl	224	202	223	—	168
ro	¹ DI-Ornithin'HCl	185		230	—
	keiner (YergleichsprolDe)		235	270	-	210
O OO	¹ D-Arginin-HCl	268	219			200	afc
co	DI-Arginin-HCl	209	216	247	—	251
O	D-Ornithin.HCl	218	222	259	-	288
	DI-Ornithin·HCl	191		301	—
	keiner (VergleichsprolDe)		239	232	—	-
	D-Arginin'HCl	232	237		—
	DI-Arginin·HCl	218	221	304
	D-Ornithin»HCl	202	201	250
	DI-Ornithin.HCl	201

OO CO OO CD K3

Beispiel 2

Herstellung des Inokulums

Ein lyophilisertes Röhrchen mit Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 wird unter aseptischen Bedingungen geöffnet und sein Inhalt in 40 ml eines sterilen Mediums übertragen, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet. Das Medium enthält pro Liter (in entionisiertem Wasser) 10 g primäre Trockenhefe (Primary Dried Yeast, N.I¹.; Yeast Products Co., Paterson, N.J.) beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm bzw. 2 in. Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert. Nach dieser Zeitspanne läßt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbeninhalts werden dann in sterile Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei -78⁰C aufbewahrt.

Erste Impfkultür

Man taut das eingefrorene Inökulum bei 36⁰C auf und verwendet einen Milliliter zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 25O ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und pro Liter (in. entionisiertem Wasser)10 g der vorgenannten primären Trockenhefe (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 45 Std. "bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert.

Zweite Impfkultür

Ein Milliliter der ersten Impfkultür wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium verwendet, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und 1 i» Ardamine YEP-Hefeautolysat (Yeast Products Co., Paterson, N.J.) in entionisiertem Wasser (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei

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28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5>08 cm Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert und dient als Inokulum für das Basal- bzw. Produktionsmedium.

Basalmedium

Das Basal/medium weist folgende Zusammensetzung auf:

Lösliche Brauerei- und Brennereirückstände 5>0 (Gew./Vol.)

primäre Troekenhefe N.P. 0,75 (Gew./Vol.)

Glycerin 1,25 (Gew./Vol.)

Dimethylformamid 1,0 (VoI./VoI.)

Glycin 0,05 (Gew./Vol.)

!-Phenylalanin 0,3 (Gew./VoI.)

Mobil Par S (Schaumixihibitor) 0,25 (Gew./Vol.)

Natriumthiosulfat* 0,1 (Gew./VoI.)

Das Medium wird mit entionisiertem Wasser zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-¥ert von 7 eingestellt. Jeweils 40 ml des Mediums werden dann in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben eingegeben, 20 Min. im Autoklaven sterilisiert und danach abgekühlt.

In mehrere in der vorgenannten Weise präparierte Kolben werden dann 1,3-Diaminopropan«2HCl, Agmatinsulfat, SpermidinOHGl, Spermin·4HCl, Cadaverin»2HCl, Putrescin^HCl, 1, ^-Diamino^-hydroxypropan bzw. N-Methyl-1,3-diaminopropan eingegeben. Abgesehen von der jeweiligen Aminosäure werden die Kolben in identischer Weise beschickt.

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Es werden konzentrierte "wäßrige Torratslösungen der jeweiligen Polyaminzusätze hergestellt. Die Lösungen werden entweder mit Salzsäure oder mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterilfiltrierten Vorratslösungen werden unmittelbar vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus in die das Basalmedium enthaltenden Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzentrationen eingegeben.

Nach der Einverleibung der Polyaminzusätze beimpft man das Medium mit 2,5 Vol. -fo der zweiten Impf stufe und inkubiert es 96 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm Verdrängung) bei einer Drehzahl von 220 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen ist, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare Brühe in der vorstehend beschriebenen Weise unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus auf Cephamyein C. Die Ergebnisse sind aus Tabelle II ersichtlich.

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O OO CO O

Zusätze des Basalmediums

keiner (Vergleichsprobe) 1,3-Diaminopropan·2HCl Agmat in sulfat Spermidin-3HG1 Spermin«4HCl

keiner (Vergleichsprobe) 1,3-Diaminopropan·2HGl Spermidin«3HCl Spermin·4HC1 Cadaverin.2HCl

keiner (Vergleichsprobe) 1,3-Diaminopropan·2HC1 Agmatinsulfat Spermidin«3HCl Spermin·4HCl Cadaverin«2HCl Putrescin«2HCl

keiner (Vergleichsprobe) 1,3-Diamino-2-hydroxypropan U-Methyl-1,3-diaminopropan

[PABELIE II

Konzentration der Zusätze des Basalmediums ι $>
O 0,0025 0,005 0,010 0,020 0,025 0,05 0,10 0,20

gebildete Menge von Cephamycin C, μg/ml

VJl 00

	—	237	—	263	282	290	235	ro
—	262	-	315	202	247	257		CD
—	278	304	—	—	320		—	CO
197		275	_	—■	—	·—		CO
*mmt*	230	198	282	232	330	309	_	CD
219	234	255	296	—	—		_	ro
—	·—	341	—	—	318	—	272
		—		224	244	255	344
	-	263	—	299	332	368	215
-	331	—	361	288	215	219
285	282	387	494	—	248		—
276	—	369		-	377	_	254
—		—		226	258	271	284
			mm	272	265	276	199
	■■·		mm		184	203	202
mm		mm		mm	226	192

15812

Beispiel Herstellung des Inokulums

Ein lyophilisertes Röhrchen mit Streptomyces lactamdurans NERL 3802 wird unter aseptischen Bedingungen geöffnet und sein Inhalt in 40 ml eines sterilen Mediums übertragen, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet. Das Medium enthält pro Liter (in entionisiertem V/asser) 10 g primäre Trockenhefe (Primary Dried Yeast, Ή.Έ.; Yeast Products Co., Paterson, ET.J.) beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm bzw. 2 in. Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert. Wach dieser Zeitspanne läßt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbeninhalts werden dann in sterile Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei -78⁰C aufbewahrt.

Erste Impfkultür

Man taut das»eingefrorene Inokulum bei 36⁰C auf und verwendet einen Milliliter zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und pro Liter fc entionisiertem Wasser)10 g der vorgenannten primären Trockenhefe (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird etwa 45 Std. bei 28⁰C an e,inem Drehschüttelapparat (5,08 cm Ver drängung) bei 220 UpM inkubiert.

Zweite Impfkultür

Ein Milliliter- der ersten Impfkultur wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium verwendet, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 25O ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und 1 <f> Ardamine YEP-Hefeautolysat (Yeast

- 18 709821/0890

Products Co., Paterson, Έ.3.) in entionisiertem Wasser (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert und dient als Inokulum für das Basal- bzw. Produktionsmedium.

Basalmedium

Das Basalmedium weist folgende Zusammensetzung auf:

Lösliche Brauerei- und Brennereirückstände 3,0 (Gew./Vol.)

primäre Trockenhefe Ή.E. 0,75 (G-ew./Vol.)

Glycerin 1,25 (Gew./Vol.)

Dimethylformamid 1,0 (VoI./Vol.)

Glycin 0,05 (Gew./Vol.)

!-Phenylalanin 0,3 (Gew./VoI.)

Mobil Par S (Schauminhibitor) 0,25 (Gew./Vol.)

Fatriumthiosulfat* 0,1 (Gew./VoI.)

0 bis 24 Std. nach der Beimpfung unter aseptischen Bedingungen aus einer sterilfiltrierten, konzentrierten Vorratslösung in einem für die angegebene Endkonzentration ausreichenden Anteil zugesetzt.

Das Medium wird mit entionisiertem Wasser zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Jeweils 40 ml des Mediums werden dann in 250 ml-Erlenmeyer-Eolben eingegeben, 20 Min. im Autoklaven sterilisiert und danach abgekühlt.

In mehrere in der vorgenannten Weise präparierte Kolben werden dann D- oder DL-Lysin-HCl, D-Arginin*HCl, D-Ornithin»HCl und/oder 1,3-Diaminopropan*2HCl eingegeben. Abgesehen von der jeweiligen Aminosäure werden die Kolben

- 19 709821/0890

15812

in identischer Weise "beschickt.

Es werden konzentrierte wäßrige Vorratslösungen der jeweiligen Zusätze hergestellt. Die Lösungen werden entweder mit Salzsäure oder mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterilfiltrierten Vorratslösungen gen werden unmittelbar vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus in die das Basalmedium enthaltenden Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzentrationen eingegeben.

Nach der Einverleibung der Zusätze beimpft man das Medium mit 2,5 V0I.-5& der zweiten Impfkultür und inkubiert es 96 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei einer Drehzahl von 220 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen ist, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare Brühe in der vorstehend beschriebenen Weise unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus auf Cephamycin C. Die Ergebnisse sind aus Tabelle III ersichtlich.

TABELLE III

Zusätze des Basalmediums

keiner

D-Lysin-HCl, 0,1 % DL-Lysin»HCl, 0,1 # D-Arginin»HCl, 0,1 D-Ornithin-HCl, 0,1

Konzentration des dem Basalmedium einverleibten 1,3-Diaminopropan·2HCl, f

0 0,10

gebildete Menge von	Ϊ, Hg/ml
Cephamycin C	235
129	286
182	264
152	243
173	282
188

- 20 -

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Beispiel 4 Herstellung des Inokulums

Ein lyophilisertes Röhrchen mit Streptomyces lactamdurans NEEL 3802 wird unter aseptischen Bedingungen geöffnet und sein Inhalt in 40 ml eines sterilen Mediums übertragen» welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet. Das Medium enthält pro Liter (in entionisiertem Wasser) 10 g primäre Trockenhefe (Primary Dried Yeast» Ν.]Γ.; Yeast Products Co.» Paterson, N.J.) beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5*08 cm bzw. 2 in. Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert. Nach dieser Zeitspanne läßt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbeninhalts werden dann in sterile Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei -78⁰C aufbewahrt.

Erste Impfkultur

Man taut das eingefrorene Inokulum bei 36⁰C auf und verwendet einen Milliliter zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und pro Liter entionisiertem Wasser)10 g der vorgenannten primären Trockenhefe (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 45 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5,08 cm Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert.

Zweite Impfkultur

Ein Milliliter der ersten Impfkultur wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium verwendet, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und *1 $ Ardamine YEP-Hefeautolysat (Yeast Products Co., Paterson, N.J.) in entionisiertem Wasser

- 21 709871 /0890

(pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm Verdrängung) "bei 220 UpM inkubiert und dient als Inokulum für das Basal- bzw. Produktionsmedium.

Basalmedium

Das Basalmedium weist folgende Zusammensetzung auf:

Lösliche Brauerei- und Brennereirückstände 3,0 (Gew./YoI.)

primäre Trockenhefe N.F. 0,75 (Gew./Vol.)

Glycerin 1,25 (Gew./Vol.)

Dimethylformamid 1,0 (VoI./VoI.)

Glycin 0,05 (Gew./Vol.)

!-Phenylalanin 0,3 (Gew./VoI.)

Mobil Par S (Schauminhibitor) 0,25 (Gew./Vol.)

Natriumthiοsulfat* 0,1 (Gew./VoI.)

Das Medium wird mit entionisiertem Wasser zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Jeweils 40 ml des Mediums werden dann in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben eingegeben, 20 Min. im Autoklaven sterilisiert und danach abgekühlt.

In mehrere in der vorgenannten Weise präparierte Kolben werden dann D- oder DL-Lysin·HCT, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan bzw. N-Methyl-1,3-diaminopropan eingegeben. Abgesehen von der geweiligen Aminosäure werden die Kolben in identischer Weise beschickt.

- 22 70982 1/0890

Es werden konzentrierte wäßrige Vorrat si ösungen der jeweiligen Zusätze hergestellt. Die Lösungen werden entweder mit Salzsäure oder mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterilfiltrierten Vorratslösungen werden unmittelbar vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus in die das Basalmedium enthaltenden Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzentrationen eingegeben.

Fach der Einverleibung der Zusätze beimpft man das Medium mit 2,5 V0I.-5& der zweiten Impfkultur und inkubiert es 96 Std, bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5t08 cm Verdrängung) bei einer Drehzahl von 220 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen ist, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare Brühe in der vorstehend beschriebenen Weise unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus auf Cephamycin C. Die Ergebnisse sind aus Tabelle IV ersichtlich.

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TABEILE IV

VJl OO

Zusätze des Basalmediums Zusätze des Basalmediums D-Iysin.HCl DI-Lysin-HOl

CD	I
CD	ro
OO
NJ	I
O
OO
co
O

keiner

1,3-Diamino-2-hydroxypropan, 0,05 io

1,3-Diamino-2-hydroxypropan, 0,10 io

1,3-Diamino-2-hydroxypropan, 0,20 io

N-Methyl-1,3-diaminopropan, 0,05 i>

N-Methyl-1,3-diaminopropan, 0,10 io

IT-Me thyl-1,3-diaminopropan, 0,20 $

keines	0,1 io	0,1 %	0,2 i>	is
gebildete	Menge	von Cephamycin C,	pg/ml
154	234	169	150
222	264	311	240
229	276	333	255	2638024
246	355	-	-
248	285	311	255
189	307	304	271
151	247

Beispiel 5 Herstellung des Inokulums

Ein lyophilisertes Röhrchen mit Streptomyces lactaiiidurans NRRL 3802 wird unter aseptischen Bedingungen geöffnet und sein Inhalt in 40 ml eines sterilen Mediums übertragen, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 250 ml-Erlenmeyer-Kolben befindet. Das Medium enthält pro Liter (in entionisiertem Wasser) 10 g primäre Trockenhefe (Primary Dried Yeast, U.]?.; Yeast Products Co., Paterson, Ή,J.) beim pH-Wert 7. Die Kolben werden 48 Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm bzw. 2 in. Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert. Nach dieser Zeitspanne läßt sich ein üppiges Wachstum des Mikroorganismus feststellen. Teilmengen des Kolbeninhalts werden dann in sterile Röhrchen eingegeben und bis zum Gebrauch bei -78⁰C aufbewahrt.

Erste Impfkultür

Man taut das eingefrorene Inokulum bei 36⁰C auf und verwendet einen Milliliter zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 25O ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und pro Liter (in entionisertem Wasser) 10 g der vorgenannten primären Trockenhefe (pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 45 Stunden bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm Verdrängung) bei 220 UpM inkubiert.

Zweite Impfkultur

Ein Milliliter der ersten Impfkultur wird zur Beimpfung von 40 ml sterilem Medium verwendet, welches sich in einem mit einem Diaphragma ausgestatteten 25Ο ml-Erlenmeyer-Kolben befindet und 1 ?S Ardamine YEP-Hefeautolysat (Yeast Products Co., Paterson, N.J.) in entionisiertem Wasser

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(pH 7) enthält. Der Mikroorganismus wird 24 Std. bei 28⁰G
an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm Verdrängung) bei
220 UpM inkubiert und dient als Inokulum für das Basal-
bzw. Produktionsmedium.

Basalmedium

Das Basalmedium weist folgende Zusammensetzung auf:

Lösliche Brauerei- und Brennereirückstände 3»0 (Gew./Vol.)

primäre Trockenhefe N.F. 0,75 (Gew./Vol.)

Glycerin 1,25 (Gew./Vol.)

Dimethylformamid 1,0 (Vol./Vol.)

Glycin 0,05 (Gew./Vol.)

L-Phenylalanin 0,3 (Gew./VoI.)

Mobil Par S (Schauminhibitor) 0,25 (Gew./Vol.)

Natriumthiosulfat* 0,1 (Gew./Vol.)

Das Medium wird mit entionisiert an Wasser zubereitet und mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Jeweils
40 ml des Mediums werden dann in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben
eingegeben, 20 Min. im Autoklaven sterilisiert und danach
abgekühlt.

In mehrere in der vorgenannten Weise präparierte Kolben
werden dann D- oder DL-Lysin-HCl, Agmatinsulfat,
Cadaverin«HCl, 1,^-Diaminopropan^HCl, Putrescin-2HC1,
Spermidin*3HCl bzw. Spermin«4HCl eingegeben. Abgesehen
von der jeweiligen Aminosäure werden die Kolben in identischer Weise beschickt.

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Bs werden konzentrierte wäßrige Vorratslösungen der Jeweiligen Zusätze hergestellt. Die Lösungen werden entweder mit
Salzsäure oder mit natronlauge auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die sterilfiltrierten Vorratslösungen werden unmitterbar vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus in die das Basalmedium enthaltenden Kolben unter Berücksichtigung der gewünschten Endkonzentrationen eingegeben.

Nach der Einverleibung der Zusätze beimpft man das Medium
mit 2,5 Vol.-$ der zweiten Impfkultür und inkubiert es 96Std. bei 28⁰C an einem Drehschüttelapparat (5»08 cm Verdrängung) bei einer Drehzahl von 220 UpM. Wenn die Gärung abgeschlossen ist, zentrifugiert man die Zellen ab und analysiert die klare Brühe in der vorstehend beschriebenen Weise unter Verwendung von Vibrio percolans AiDCC 8461 als Testorganismus
auf Cephamycin C. Die Ergebnisse sind aus Tabelle V ersichtlich.

- 27 -

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Zusätze des Basalmediums

TABEILE V

keiner

Zusätze des Basalmediums
D-Iysin.H01 D:D-Iqrsiii«H01

0,1 $ 0,2 Ji¹

-J	I	keiner	1 io	0,1 io
O co	ro	Agmatin-SO,, 0,	0,1 io	0,02 $>
co	00 ■	Cadaverin.2HCl,	1,3-Diaminopropan.2H01, 0,1	»02 %
			Putrescin»2HCl,
O	Spermidin«3HCl,
00 co	Spermin«4HCl, 0
O

	0,1 5	i 0,2 io
	gebildete	Menge v<
171	242	301
204	262	294
185	267	306
307	397	392
220	370	399
280	392	478
415	478	478

157	184
226	237
225	235
347	317
245	236
306	333
487	471

co co oo

Tabelle I zeigt deutlich, daß die Bildung von Cephamycin C durch. Zugabe von D- oder DL-Arginin bzw. von D- oder DL-Ornithin zum Gärmedium angeregt wird. Beispiele für die Anregung der Bildung von Cephamycin C durch Polyamine gehen aus !Tabelle II hervor. Die Tabellen III, 17 und V zeigen, daß die gemeinsame Zugabe einer Aminosäure und eines 'Polyamine im Vergleich zur getrennten Zugabe der Verbindungen eine verstärkte Bildung von Cephamycin C ergibt. Aus den Beispielen geht klar hervor, daß D- oder DL-Arginin bzw. D- oder DL-Ornithin allein oder in Kombination mit den Polyaminen 1,3-Diaminopropan, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, N-Methyl-1,3-diaminopropan, Agmatin, Spermidin, Spermin, Cadaverin oder Putrescin oder D- oder DL-Iiysin in Kombination mit den genannten Polyaminen jeweils überraschenderweise die Bildung von Cephamycin C anregen.

Dem Fachmann werden sich aufgrund der vorstehenden Beschreibung Abwandlungen erschließen, welche ebenfalls innerhalb des erfindungsgemäßen Rahmens liegen.

29 -

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C durch Züchten einer Cephamcycin O erzeugenden Species von Streptomyces in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium die Aminosäure D- oder DL-Arginin oder D- oder DL-Ornithin oder eines von mehreren Polyaminen aus der Gruppe "bestehend aus 1,3-Diaminopropan, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, N-Methyl-1,3-diaminopropan, Agmatin, Spermidin, Spermin, Cadaverin und Putrescin zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Streptomyces-Species Streptomyces lactamdurans verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nährmedium ein komplex zusammengesetztes organisches Nährmedium verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, welches etwa 0,025 "bis etwa 0,40 $ (Gew./Vol.) der Aminosäuren D- oder DL-Arginin oder D- oder DL-Ornithin (ausgedrückt als das Hydrochlorid), etwa 0,01 bis etwa 0,2 (Gew./Vol.) 1,3-Diaminopropan (ausgedrückt als das

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15812 ^

Dihydrochloride etwa 0,0025 bis 0,05 % (Gew./Vol.) Sperinidin oder Spermin (ausgedrückt als das Tri— hydroehlorid bzw. Tetrah.ydrocM.orid), etwa 0,025 bis 0,2 i> (Gew./ToI.) Cadaverin oder Putrescin (ausgedrückt als das DihydroChlorid), etwa 0,025 bis 0,2 $ (Gew./YoI.) Agmatin (ausgedrückt als das Sulfat) oder etwa 0,05 bis etwa 0,2 % (Gew./YoI.) 1,3-Diamino-2-hydroxypropan oder ÜT-Methyl-1,3-diaminopropan (als freie Base) enthält.

5. Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C durch Züchten einer Cephamycin C erzeugenden Species toe Streptomyces in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium die Aminosäure D- oder DL-Arginin, D- oder Dl-Ornithin oder D- oder DL-Lysin in Kombination mit einem Polyamin aus der Gruppe bestehend aus 1,3-Diaminopropan, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, N-Methyl-I»3-diaminopropan, Agmatin, Spermidin, Spermin, Cadaverin und Putrescin zusetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man als Streptomyces-Species Streptomyces lactamdurans verwendet.

7. Verfahren nach .Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als ITährmedium ein komplex zusammengesetztes organisches Nährmedium verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß man ein ITährmedium verwendet, welches die Aminosäuren D- oder DL-Arginin, D- oder DL-Ornithin oder D- oder DL-Lysin in einem Anteil von etwa 0,1 bis etwa 0,2 ^ (Gew./Vol.) (ausgedrückt als das Hydrochlorid) in Kombination mit etwa 0,1 % (Gew./Vol.) 1,3-Diaminopropan,

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Cadaverin oder Putrescin (ausgedrückt als das Dihydro-Chlorid), etwa 0,02 fo (Gew./Vol.) Spermidin oder Spermin (ausgedrückt als das Tr ihydr ο Chlorid "bzw. Setrahydrochlorid)» etwa 0,1 fo (Gew./Vol.) Agmatin (ausgedrückt als das Sulfat) oder etwa 0,05 "bis etwa 0,2 $
( Gew. /Vol.) 1,3-Diamino-2-hydroxypropan oder Ϊΐ-Methyl-1,3-diaminopropan (als freie Base) enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man DL-Lysin und 1,3-Eiaminopropan in einem Anteil von etwa 0,1 $ (Gew./Vol.) (ausgedrückt, als das Hydrochlorid bzw. Dihydrochlorid) zusetzt.

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