AT234273B - Verfahren zur Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäuren - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäuren 
Es ist vorgeschlagen worden,   6-Aminopenicillansäure   auf mikrobiologischem Wege herzustellen, indem man auf Penicilline Bakterien, die bei Einwirkung   auf Penicillinlösungen   die antibiotische Aktivität dieser Lösungen weitgehend aufheben, jedoch durch Zusatz von Phenylacetylchlorid   wieder herstellbar   belassen, oder Mutanten dieser Bakterien und bzw. oder Suspensionen und bzw. oder Extrakte und bzw. oder Enzympräparate derselben einwirken lässt, wobei im wesentlichen nur die Amidbindung in 6-Stellung des Penicillinmoleküls gespalten wird, und anschliessend das erhaltene Endprodukt isoliert. 



   Es wurde nun gefunden, dass die gleichen Bakterien bzw. aus diesen gewonnene Extrakte, Enzyme oder Enzymanreicherungen in der Lage sind, bei pH-Werten von höchstens 6,5, vorzugsweise höchstens 5, 0 in Gegenwart von Carbonsäuren, deren Salzen oder Derivaten, die 6-ständige Aminogruppe der 6-Aminopenicillansäure mit den betreffenden Carbonsäuren unter Wasseraustritt amidartig zu verknüpfen. 



  Dabei entstehen 6-Acylaminopenicillansäuren, also Verbindungen von der   KonstitutionderPenicilline.   



   Es ist bekannt, dass penicillinbildende lebende Pilze, z. B. Penicillium chrysogenum, der Nährlösung zugefügte Phenylessigsäure zum Aufbau von Penicillin verwenden können. Anderseits ist von zahlreichen Bakterienarten bekannt, dass sie Penicillin allenfalls zu inaktivieren vermögen. Umso überraschender ist es, dass, wie gefunden wurde, Bakterien im lebenden oder abgetöteten, enzymatisch jedoch aktiven Zustand auch befähigt sind, aus 6-Aminopenicillansäure und Carbonsäuren 6-Acylaminopenicillansäuren zu bilden. 



   Es hat sich gezeigt, dass zu dieser Synthese von   6-Acylaminopenicillansäuren   solche Bakterien geeignet sind, die bei höheren pH-Werten die Amidbindung in der 6-Stellung des Penicillinmoleküls unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure angreifen. Man kann deshalb auch so vorgehen, dass man die gleichen Bakterien zunächst zur Abspaltung von   6-Aminopenicillansäure   aus Penicillin und sodann zur Acylierung von   6-Aminopenicillansäure   verwendet. 



   Als geeignet zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens haben sich beispielsweise die im folgenden genannten Bakterienarten erwiesen : 1. Pseudomonas aureofaciens 2. Pseudomonas fluorescens 3. Pseudomonas aeruginosa 4. Alcaligenes faecalis 5. Escherichia coli 6. Aerobacter aerogenes 7. Serratia marcescens 8. Proteus rettgeri 9. Proteus OX 19 10. Salmonella sp. 



  11. Shigella sp. 



  12. Micrococcus roseus 13. Micrococcus lysodeicticus 14. Sarcina lutea 15. Arthrobacter sp. 



  16. Bacillus subtilis var. niger 17. Mycobacterium phlei 
Es ist leicht, die Eignung der Bakterien im Vorversuch zu   überprüfen,   indem man eine   10/oige   wässerigeLösung von Kaliumphenylacetat, die 0,   025%   6-Aminopenicillansäure enthält, auf PH   4.   5 bringt und mit einer Suspension der zu prüfenden Bakterien versetzt. Findet man nach einer 2stündigen   Bebrütung-   

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 zeit bei   370C   in 1   cm3   der Lösung mehr als 10 Einheiten Penicillin G, so sind die Bakterien zur Synthese geeignet. 



   Die synthetisierende Aktivität der Bakterien kann ebenso wie bei den Bakterien, die zur Herstellung von   6-Aminopenicillansäure   verwendet werden, dadurch gesteigert werden, dass man die Bakterien unter Belüftung in, vorzugsweise Maisquellwasser enthaltenden, Nährlösungen züchtet, die   höchstens   unbedeutende Mengen von vergärbaren Kohlehydraten, vorzugsweise unter 0,   5%,   enthalten und denen Phenylessigsäure oder deren Derivate in Mengen von etwa 0,002 bis   2ale,   vorzugsweise 0,   2%,   zugesetzt sind, wobei gegebenenfalls während des Wachstums Kohlendioxyd zugeleitet wird. 



   Mit Hilfe dieser Bakterien können zahlreiche 6-Acylderivate der 6-Aminopenicillansäure hergestellt werden, wenn man die entsprechenden Carbonsäuren, ihre Salze oder Derivate dem Reaktionsgemisch zusetzt. Besonders geeignet sind als Derivate die N-substituierten Amide dieser Carbonsäuren, insbesondere solche Amide, die als Substituenten einen Carboxyalkylrest tragen, wie z. B. die von den entsprechenden Carbonsäuren sich ableitenden Acylglycokolle und Acylglutaminsäuren. 



   Die Synthesen werden zweckmässig bei pH-Werten zwischen 4, 0 und 5, 5, vorzugsweise bei PH 4, 5, in Gegenwart von Toluol, Chloroform oder andern bei Enzymarbeiten gebräuchlichen Konservierungsmitteln   durchgeführt.   Die Reaktionstemperatur kann   10 - 450C   betragen, doch arbeitet man vorzugsweise bei   370C.   



   Die zur Acylierung der 6-Aminopenicillansäure verwendeten Carbonsäuren sollen im Reaktionsge- 
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 quantitativen Acylierung der vorliegenden 6-Aminopenicillansäure erforderliche Menge   überschreiten.   



   Die Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer können im übrigen beliebig abgeändert werden. 



   Die gebildeten 6-Acylaminopenicillansäuren lassen sich aus den Reaktionsgemischen nach den zur Isolierung von Penicillinen üblichen Methoden gewinnen. 



   Nach den in den folgenden Beispielen   1 - 16   beschriebenen Verfahrensvarianten wurde eine Reihe   weitererCarbonsäurederivate   (Herstellung durch Acylierung der entsprechenden Aminosäuren nach Schotten und Baumann) auf ihre acylierenden Fähigkeiten in Gegenwart des Enzyms untersucht. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse zusammengestellt. In der   Rubrik "Einhe1ten/cm3 "wurde   die PenicillinAktivität, gemessen an einem Penicillin-G-Standard im Plattentest gegen Bac.   subtilis ATCC   6633, angegeben. 
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<tb> 
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  Konzentration <SEP> der <SEP> acy- <SEP> Konzentration <SEP> der <SEP> PH <SEP> Einwirkung <SEP> des <SEP> Einheiten/
<tb> lierenden <SEP> Carbonsäure-6-Aminopenicillansäure <SEP> Enzyms <SEP> bei <SEP> 370C <SEP> cm3
<tb> derivate
<tb> l, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Phenylacetylglycokoll <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 45 <SEP> min <SEP> 507
<tb> 2,0 <SEP> % <SEP> Phenylacetylglycokoll <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> % <SEP> 4,5 <SEP> 60 <SEP> min <SEP> 5658
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> Phenylacetylglutaminsäure <SEP> 0, <SEP> 0250/o <SEP> 4,5 <SEP> 25 <SEP> min <SEP> 387
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Phenylacetylasparagin <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP> 4,5 <SEP> 40 <SEP> min <SEP> 424
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Phenylacetylalanin <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 40 <SEP> min <SEP> 424
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> Phenylacetylleucin <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP> 4,

   <SEP> 5 <SEP> 40 <SEP> min <SEP> 252
<tb> 0, <SEP> 25% <SEP> Phenoxyacetylglycokoll <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP> 5. <SEP> 8 <SEP> 40 <SEP> min <SEP> 204
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> p-Nitrophenylacetylglycokoll <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> 45 <SEP> min <SEP> 190
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> p-Aminophenylacetylglycokoll <SEP> 0, <SEP> 025% <SEP> 5,0 <SEP> 45 <SEP> min <SEP> 492
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> p-Aminophenylacetylglycokoll. <SEP> 0, <SEP> 125% <SEP> 5,0 <SEP> 45 <SEP> min <SEP> 2142
<tb> 
 

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   Beispiel l : 16012 VoL- igeMaisquellwasserlösung, enthaltend 0, 2% Kaliumphenylacetat, wer-    den mit KOH auf PH 7,0 eingestellt und 30 min auf 1200C erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und 40 min bei 1100C im Fermenter sterilisiert.

   Diese Nährlösung wird nach
Abkühlung mit 400 cm einer 18stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC   11 105   beimpft. Der Ansatz wird dann mit 150   l   Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 h bei   310C   ohne Überdruck kultiviert. Während der gesamten Wachstumszeit werden durch eine von der Luftleitung des Fermenters getrennte Leitung 5   l   Kohlendioxyd pro Minute in die Kultur eingeleitet. Die Bakterien- zellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 11/15 m Phosphatpufferlösung von pH 6,0 ge- waschen und nach dem Abzentrifugieren zu einer dichten Suspension in 1/15 m Phosphatpufferlösung von
PH 6,0 resuspendiert.

   Zu dieser dichten Suspension setzt man 0, 025% 6-Aminopenicillansäure, 1, 0% Ka- liumphenylacetat und   0,'2f1/0   Toluol. Das Reaktionsgemisch wird dann mit HC1 auf pH 4,5 eingestellt und
2 h bei   370C   aufbewahrt. Nach dieser Zeit enthält der Ansatz 420 I. E. Penicillin   G/cm'.   



   Beispiel 2 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Kalium- salz der p-Nitrophenylessigsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Bei- spiel 1. Es entsteht bei der enzymatischen Reaktion   p-Nitrophenylacetylaminopenicillansäure.   



     Beispiel 3 :   Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Natrium- salz der p-Aminophenylessigsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Bei- spiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht p-Aminophenylacetylaminopenicillansäure, welche das im Biochem. Journ. 69 [1959] S.   478   beschriebene antibakterielle Wirkungsspektrum zeigt. 



   Beispiel 4 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Kaliumsalz der p-Chlorphenylessigsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht p-Chlorphenylacetylaminopenicillansäure. 



   Beispiel 5 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels   1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Kalium-   salz der o-Chlorphenylessigsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht   o-Chlorphenylacetylaminopenicillansäure.   



   Beispiel 6 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Natriumsalz der m-Chlorphenylessigsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht m-Chlorphenylacetylaminopenicillansäure. 



   Beispiel 7 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Kaliumsalz der 3, 4-Dichlorphenylessigsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht   3, 4-Dichlorphenylacetalaminopenicillansäure.   



   Beispiel 8 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Kaliumsalz der   p-Nitrophenyläthylessigsäure.   Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie im Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht p-Nitrophenyläthylacetylaminopenicillansäure. 



   Beispiel 9 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Kaliumsalz der Phenoxyessigsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht Phenoxyacetylaminopenicillansäure, welche das für Penicillin V charakteristische antibakterielle Wirkungsspektrum zeigt. 



   Beispiel 10 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels l enthält statt Kaliumphenylacetat das Natriumsalz der n-Valeriansäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. 



  Bei der enzymatischen Reaktion entsteht   n-Valeroylaminopenicillansäure.   



     Beispiel 11 :   Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Natriumsalz der n-Capronsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht   N-Caproylaminopenicillansäure.   



     Beispiel 12 :   Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Natriumsalz der n-Caprylsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht   n-CapryloyIaminopenicillansäure.   



   Beispiel 13 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Kaliumsalz der Isocapronsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht Isocaproylaminopenicillansäure. 



   Beispiel 14 : Das Reaktionsgemisch des Beispiels 1 enthält statt Kaliumphenylacetat das Natriumsalz der Äthylmercaptoessigsäure. Die weitere Behandlung des Reaktionsgemisches geschieht wie in Beispiel 1. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht Äthylmercaptoacetylaminopenicillansäure. 
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 und 0,   20%   Kaliumphenylacetat enthält, werden 40 min bei 1100C im Fermenter sterilisiert und nach Abkühlung mit 400 mS einer 18stündigen Schüttelkultur von Proteus. rettgeri beimpft. Der Ansatz wird dann mit 150 l Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 20 h bei   250C   kultiviert. 



   Die Bakterien werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in   16 l 0, 9% iger NaCl-Lösung   gewaschen und nach erneutem Abzentrifugieren in 1/15 m Phosphatpuffer-Lösung von pH 6,0 resuspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 0,05% 6 - Aminopenicillansäure, 1,0% p - Nitrophenylacetylglycokoll und 0,   21o   Toluol. Das Reaktionsgemisch wird dann mit HC1 auf PH 4,5 eingestellt und 2 h bei   370C   aufbewahrt. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht p-Nitrophenylacetylaminopenicillansäure. 



   Beispiel 16: 160 12 Vol.-%ige Maisquellwasserlösung erhalten einen Zusatz von 0,   Sla   Phenylacetylglutaminsäure, werden mit KOH auf PH 7, 0 eingestellt und dann 30 min bei 1200C erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und 40 min bei   1100C   im Fermenter sterilisiert. 



  Diese Nährlösung wird nach Abkühlung mit 400   cams   einer 24stündigen Schüttelkultur eines aus dem Erd- 
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Die Bakterien werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16   10, 9%oiger NaCl-Lösung   gewaschen und nach erneutem Abzentrifugieren in 1/15 m Phosphatpufferlösung vom pH 6,0 resuspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 0, 05% 6-Aminopenicillansäure, 1, 0% p-Aminophenylacetylglycokoll und 0,   2%   To-   luol.   Das Reaktionsgemisch wird dann mit HC1 auf PH 4,5 eingestellt und 2 h bei   370C   aufbewahrt. Bei der enzymatischen Reaktion entsteht pAminophenylacetylaminopenicillansäure. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur   Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäuren,   dadurch gekennzeichnet, dass man auf   6-Aminopenicillansäure   in Gegenwart von Carbonsäuren, deren Salzen oder Derivaten solche Bakterienstämme bzw. aus diesen gewonnene Extrakte, Enzyme oder Enzymanreicherungen, welche bei einem pH-Wert oberhalb 6, 5 bevorzugt die Amidbindung in der 6-Stellung des Penicillinmoleküls anzugreifen imstande sind, wie insbesondere Enterobacteriaceen der Gattungen Alcaligenes,   Escherichia,   Aerobacter; Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, aber auch Bakterien der Gattungen Pseudomonas, Micrococcus, Sarcina,.

   Arthrobacter, Bacillus   subtilis,   Mycobacterium unter abgeänderten Verfahrensbedinungen, wie insbesondere bei pH-Werten unter 6, 5, vorzugsweise höchstens 5, 0, zur Acylierung   einwirken lässt.   

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die 6-Aminopenicillansäure in Form ihrer Rohlösung verwendet, wie sie durch Einwirkung von Suspensionen oder Extrakten der penicillinspaltenden Bakterien, bzw. aus diesen gewonnenen Enzymen oder Enzymanreicherungen auf Penicillin gewonnen wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Suspensionen oder Extrakte der penicillinspaltenden Bakterien bzw. aus diesen gewonnene Enzyme oder Enzymanreicherungen auf Penicilline einwirken lässt, dann das pH aaf einen Wert von weniger als 6,5, vorzugsweise weniger als 5 erniedrigt, den Ansatz nach Zugabe von Carbonsäuren, deren Salzen oder Derivaten stehen lässt und aus denReaktionsgemischen die neu gebildeten i3-Acylaminopenicillansäuren nach Methoden wie sie zur Isolierung von Penicillinen üblich sind, gewinnt.

   4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als Carbonsäure die Phenoxyessigsäure, deren Salze, z. B. Kaliumphenoxyacetat, oder Derivate, z. B. Phenoxyacetylglycokoll, verwendet.