DE2541198A1

DE2541198A1 - Antibiotikum y-g19z d3, verfahren zu dessen herstellung und seine verwendung

Info

Publication number: DE2541198A1
Application number: DE19752541198
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Gushima; Takashi Osono; Takeshi Saito; Shunichi Watanabe
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-09-24
Filing date: 1975-09-16
Publication date: 1976-04-01
Also published as: ES441247A1; FR2286141A1; FR2286141B1; US4039660A; GB1486096A; JPS5718880B2; JPS5144694A

Description

Antibiotikum T-G19Z D3, Verfahren zu dessen Herstellung und seine Verwendung

Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd., Nihonbashi-Honcho 2 chome, Ghuo-ku, Tokyo (Japan)

Diese Erfindung bezieht sich auf eine neue antibiotische Substanz Y-G19Z D3. Weiterhin betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend genannten antibiotischen Substanz durch Züchtung einee neu entdeckten Mikroorganismus Streptomyces oganonensis Y-G19Z oder dessen Mutanten. Die antibiotische Substanz gehört zur 7-Methoxycephalosporingruppe. Die Gruppe der 7-Methexycephalosporine wurde kürzlich als gegen graapesltive und gramnegative Bakterien und cephalosporinresistente Bakterien wirksam festgestellt.

Wir haben gefunden, daß die antibiotische Substanz Y-G19Z D3 in einer KulturbrUhe von Streptomyces oganonensis Y-G19Z hergestellt wird, welcher aus einer Erdprobe in der Stadt Ogano, Chichibu, Saitama-Präfektur in Japan gefunden und isoliert worden war.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Antibiotikums Y-GI9Z D3, welches durch diese Erfindung hergestellt wird, werden nachstehend angegeben. Diese Daten wurden mit der, reinsten gereinigten Probe, die derzeitig zur Verfügung steht, erhalten und können sich noch ändern, wenn die Probe weiter gereinigt wird.

(1) Aussehen: weißes Pulver

(2) Schmelzpunkt: 16O - 170° C (unter Zersetzung)

(3) Löslichkeit: leicht löslich in V/asser; schwer löslich in

Methanol und Äthanol; nahezu unlöslich in anderen organischen Lösung»mitteln

(4) Elementaranalyse (als Natriumsalz)

Gefunden: G - 31,0% H- 3,3$ N - 7,1# S - 16,5£ Na - 7 + 0

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(5) Optische Drehung:

[oC]

²⁰ - + 42° (C- 1#, in Wasser)

(6) Hochspannungspapierelektrophorese:

(auf Whatman Nr- 1 Papier bei 42 V/cm in 10biger Essigsäure bei pH - 2,2 ausgeführt).

Die Entfernung betrug für 1 Stunde Y-G19Z D3 -5,2 cm; Cysteinsflure -6,5 cm; Glutathion -0,9 cm; Cephalosporin C -2,7 cm; 7-Methexycephalosporin C -2,0 cm.

(7) Farbreaktion: Positiv für Ninhydrin (Ö) Natur der Substanz: Amphoter

(9) Hydrolyseprodukt:d -Aminoadipinsäure bei der Hydrolyse mit

6n HCl

(10) Ultraviolettabs«rptionsspektrum gemessen in 1/100 molarer Phosphafcpufferlösung bei pH 6,4 (wie in Fig. 1 der Zeichnung dargestellt)

X max: 272 np ( E J^ 176), 243 mu (Schulter)

(11) Infrarotabsorptionsspektrum gemessen mit der KBr-Tablette (wie in Fig. 2 der Zeichnung dargestellt) Absorptiensmaxima: 3420, 1765, I625, 1520, 1405, 1220, 1030 und 640 cm"¹

(12) Kernmagnetischee Resonanzspektrum in schwerer Wasser-Lösung gemessen:

6 (ppm) 1,30 (4H, Multiplett), 2,43 (2H, Multiplett) 3,35-3,02 (2H, Quartett, J - 1Ö Hz) 3,47 (3H, Singlett), 3,02 (1H, Multiplett) " 4,01 (2H, Singlett), 5,13 (1H, Singlett)

(13) Dünnschi^htchromatographie (aufsteigende Methode)unter Avicel SF*^ (mikrokristalline Zellulose. Hersteller: Pharmacia, Uppsala, Schweden) ergibt die in der Tabelle 1 wi ed ergegebenen Rf-Werte:

Verwendung von

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Tabelle 1

Entwi cklungs-

jsmittel I II III

Y-G19Z D3	(A)	0	,35	V o,	16	0	,19
Referenz-Substanz	(B)	0	,32	o,	27	0	,33
Referenz-Substanz	0	,31	o,	27	0	,32

Komponenten Volumen-

Verhältnis

Entwi cklungs-'

Lösungsmittel: I Acetonitril:Wasser 5 : 2

II n-ButanolEssigsäure:Wasser 6 : 1,5 : 2,5

III n-ButanolEssigsäure:Wasser 4:1:2

Referenz substanz (A)

7- (5- Amino-5-carboxyval er amido) -7-methoxycephalosporansäure [R.Nagarajan und Mitarbeiter, JACS, <£ (9) 2303 - 2312 (1971)3

Referenz substanz (B)

7- (5-Amino-5-carboxyval eramido )-3-carbamoyl-oxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure

[be-PS 764 1.60; DT-QS 2 166 462 und 2 166 463; FR-PS 2 0Ö5 702; GB-PS 1 321 412; Ca-PS 960 169; NL-PS 71 O336o7f

Die vorstehenden Ergebnisse, besonders die typischen Infrarot-Bande 1765 cm" (cyclisches Lactam), die kernmagnetischen Resonanzsignale bei 3,47 ppm (3H, Singlett, 7-0CH~)und 5,13 ppm (1H, Singlett, 6-CH) zeigen an, daß die antibiotische Substanz Y-G19Z D3 zu einem der 7-Methoxycephalosporingruppen-Antibiotika gehört.

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MIC (mcg/ml)

50 50

Die Minimum-Inhibitionskonzentration gegen verschieden« Mikr·- ben sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt:

Tabelle

Minimum-Inhibitions-Konzentrationen des Antibiotikums T-G19Z D3 (Agar Verdünnungsmethode unter Verwendung von Herz-Infusions-Agar bei pH 7,4) Organismus

Escherichia coli Kauffmann 0-1 Escherichia coli NIHJ Klebsiella pneumoniae ATCC 100 Salmonella cholerae-euis 134 Salmonella typhi H901W Salmonella enteritidie 1891 Shigella flcxneri 2a 1675 Shigella sonnei ti 37148 Proteus vulgaris OXK US Proteus mirabilis IFM OM-9 Peeudomonas aeruginosa ATCC 8689 Pseudomonas ovalis IAM 1002 Pseudomonas melanogenum IAM 1655 Bacillus megatherium 10778 Bacillus subtilie ATCC 6633 Micrococcus flavue ATCC 10240 Sarcina lutea ATCC 9341 Staphylococcus aureue 209P Staphylococcus aureue Smith Staphylococcus aureus Terashima Corynebactörium xerosis

6,25 6,25 6,25 6,25

50 100

3,13

Mycobacterium 607 Mycobacteriiun' phlei

12,5 >100 >100 ?100 >100 >100 >100 > 100 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Antimikrobielle Aktivitäten ν·η Y-G19Z D3 im Voreleich mit jenen von Cephalosporin C gegen verschiedene Mikroorganismen sind in der Tabelle 3 wiedergegeben. Die Darstellung zeigt, daß der Durchmesser (mm der erhaltenen Inhibitionszone mit einer Platte, welche 125 mcg/ml Lösung von Herzinfusi»ne-Agar aufgetragen erhielt, beimpft· mit jedem Organismus gemessen wurde.

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Tabelle 3	Organismus	Y-G19ZD3
Bacillus subtilis ATCC 6633	0
Staphylococcus aureus 209 P	0
Sarcina lutea ATCC 9941	Ov
Klebsiella pneumoniae	14,2
Escherichia coli NIHJ	15,4
Proteus mirabilis IMF-QM9	15,7
Proteus vulgaris	15_;0
Proteus morganii	0

Cephalosporin C

13,5 0 0 0

17,6 0 0

Wie aus den Tabellen 2 und 3 ersichtlich ist, zeigt Y-G19Z D3 hohe bakterielle Aktivitäten gegen gramnegative Bakterien. Daher ist die antibiotische Substanz Y-G19Z D3 für die Behandlung von Erkrankungen, die durch gramnegative Bakterien hervorgerufen sind, wirksam und die Substanz ist auch als Zwischenprodukt zur Herstellung anderer, halbsynthetischer Antibiotika geeignet·

Charakteristiken des vorstehend erläuterten Antibiotikum Y-GI9Z D3 erzeugenden Mikroorganismus Streptomyces oganonensis Y-G19Z D3 sind die folgenden:

I. Morphologische Charakteristiken von, Streptomyces oganonensia

Y-G19Z:

Wachstum erfolgt auf natürlichen und synthetischen Medien unter Bildung von gut verzweigtem Substratmycel, wobei die Bildung von an der Luft lebendem Mycel nicht ausreichend ist, da die Bildung von Sporen zu gering ist. Sporenketten sind gerade, gehören zum R (Rectus) oder RF (rectiflexiblen) Typ und tragen 10-50 Sporen an jeder Kette. Die Sporen nind ellyptisch, kugelig oder zylindrisch gestaltet und besitzen eine Größe von 0,45 - 0,60 χ 0,55 - 0,90 Jim. Die Sporeneberfläche ist glatt. Es wurden weder Flagellatensporen noch Sporangium beobachtet·

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II Kultur-Charakteristiken für Streutomvces ocanonensis Y-G19Z

Γ. ed ium	Wachstum	gelblich grau bis schwach gelb lich braun	Luft-Mycel	Lösliches Pigment
Czapek's Agar	sehr gering weiß	gut schwach gelb	ungenügend weiß _s	nein
Glukose Czapek's Agar	gut kremegelb	gut echwach gelb bis gfelblich braun	tadellos gelblich grau	nein sehr wenig
Glukose Asparagin- Agar	ßUtf weiß	gut schwach gelblich braun	gering weiß	nein
Glycerin- Asparagin- A gar	gut weiß bis gelblich weiß	gering (weiß bis gelblich weiß	nein
Anorganisches gut Salz	gering	nein
Stärke Agar	gelblich grau
Tyrosin Agar	gering gelblich grau	wenig schwach gelblich grau
Eisen und Hefe- extrakt Tyrosin Agar	gut braunweiß bis gelblich grau	sehr gering leicht bräunlich grau
Ϊ Jähr a gar	gut, pulvrig schwach orange bis schwach braun	leicht gelblich braun

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Medium	liachstum
Bennett*s	gut
Agar	schwach gelblich
	braun
Calciuin-	mäßig
malat	schäumend
Agar
Kartoffel	gut
pfropf	schwach gelblich
	braun
Blut Agar	gut
	olivgrau bis
	dunkelolivgrün
Loeffer^fs	gut
Serum
Medium

Luft-Mycel Lösliches Pigment

sehr gering

bräunlich grau schwach orange bis schwach rosa

nein

gut bräunlich grau

gelblich grau bis bis dunkel gelb*

schwach bräunlich lieh braun grau

nein gelblich grau

bis dunkel rötlich braun

nein

III Physiologische Eigenschaften von S.oganonensis Y-G19Z

Tyrosinase Bildung Nitrat Reduktion

Entrahmte Milch Koagulation Entrahmte Milch Peptonisation Hydrolyse der Stärke Verflüssigung von Gelatine Cellulose Abbau

Hämolyse

Auflösung von Calciummalat negativ positiv positiv, achwach positiv, sehwach positiv positiv, schwach negativ positiv positiv

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Verwendbarkeit von Kohlenstoffverbindungen durch S.oganonensis Y-G19Z

Kohlenstο ffquelle Verwendbarkeit

Glukose +

Arabinose +

Sukrose -

Xylose *■

Inosit -

Mannit +

Fruktose +

Rhamnose Rhaffinose

Die charakteristischen Eigenschaften des Streptomyces oganonensis T-G19Z können,wie im folgenden angegeben, zusammengefaßt werden:

1. Er gehört zu dem nicht Farbstoff bildenden Streptomyces-Stamm,

2. Sein Luftmycel ist gerade, ohne Abzweigungen (R oder RF Typ),

3. Sporen sind kugelförmig oder ellyptisch,

4. Sporenoberfläche ist glatt,

5. Er wächst schwach gelblich grau bis gelblich braun in verschiedenen Medien,

6. Färbung des Luftmycels bräunlich weiß, gelblich weiß und gelblich grau,

7. Die gebildete antibiotische Substanz Y-GI9Z D3 gehört zur 7-Methoxycephalosporingruppe.

Bei der Überprüfung bekannter Stämme, die die vorstehenden Eigenschaften aufweisen, können die folgenden Spezies als die am nächsten verwandten Stämme bezeichnet werden. Streptomyces globisporus, beschrieben in S.A. YJaksman: The Actinomycetes 2_, 21Ö(1961) und International Journal of Systematic Bacteriology, (4) 324-325 (196Ö).

Wenn man jedoch einen Vergleich mit Streptomyces globisporus, der in der vorstehend genannten Litaratur beschrieben ist,

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durchführt, ergibt sich, daß der Stamm Y-G19Z von diesem sich durch die folgenden Eigenschaften, die in der folgenden Tabelle angegeben sind, unterscheidet:

Tabelle

Charakteristik^

Y-G19Z S.globisporus

Größe der Spore (μ) 0,45-0,60x0,55-0,90 1,2-1,4x1,8-2,0 oder

0,9-1,4 kugelig. Lösliches Pigment oder

gelb bis grünlich gelb

positiv schwach negativ

stark negativ

Glycerin Asparagin	nein
Medium
Rhamnose Verwendung	negativ
Stärke Hydrolyse	stark
Entrahmte Milch	positiv
koagulation
Entrahmte Milch-	schwach
peptonisation
Produktion von	positiv
Cephalosporinanti-
biotika

Aufgrund der vorstehenden Unterschiede wurde der Stamm Y-G19Z als eine neue Art, die deutlich verschieden ist in Bezug auf Streptomyces globisporus, festgestellt und mit der Bezeichnung Streptomyces oganonensis Y-G19Z gekennzeichnet· Der Stamm Y-G19Z ist zur ständigen Hinterlegung ohne Beschränkungen zu der Erhältlichkeit unter der Akzessions-Nr, FERM-P2725 im Technischen Forschungsinstitut für Kikrobielle Industrie, einer Zweigstelle für Industrielle Wissenschaft & Technologie des Ministeriums für Internationalen Handel und Industrie in Japan, und ebenso als ATCC Nr.31 16? in American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville Maryland 20Ö52, USA, hinterlegt worden.

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Nachdem wir vorstehend die Charakteristiken des Stammes Y-G19Z erläutert haben, ist es gut bekannt, daß verschiedene Eigenschaften von Streptomyces änderungsfähig und leicht natürlich und künstlich geändert werden können. Daher gehören zu den Stämmen, die gemäß dieser Erfindung verwendet werden können, alle die Stäime, die zum Genus Streptomyces gehören und die Fähigkeit zur Produktion des Antibiotikums Y-G19Z D3 besitzen. Weiterhin kann die Produktivität an Y-G19Z D3 durch die in dieser Erfindung benutzten Stämme durch Behandlung mit Röntgenstrahlen oder UV-Licht Bestrahlung mit chemischen Mutagenen, radiometrischen Mitteln und durch Transformation, Transduktion, Rekombination und anderen genetischen Methoden, die zur Herstellung von Mutanten verwendbar sind, gesteigert werden.

Die Produktion von Y-G19Z D3 wird durch Kultivieren von Streptomyces oganonensis Y-G19Z D3 oder anderen Y-G19Z D3-hersteilenden Stämmen, die zu den Streptomyceten zahlen, in verschiedenen Kulturmedien durchgeführt.

Die Züchtung bei dem Verfahren dieser Erfindung kann gemäß den allgemeinen bekannten Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen durchgeführt werden, aber die submerse Kultur im flüssigen Medium wird bevorzugt.

Als Medium für die Züchtung kann jedes Medium Verwendung finden, welches Nährstoffe für Y-G19Z D3 herstellende Stämme, die zu den Streptomyceten zählen, enthalten. Es sind geeignet synthetische, halbsynthetische oder natürliche Medien* die als assimilierbare Kohlenstoffquellen enthalten beispielsweise Glukose, Mannit, Glycerin, Dextrin, Stärke, vegetabiles Öl und dgl, und als assimilierbare Stickstoffquellen Fleischextrakt, Pepton, Glutenmehl, Baumwollaaatmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Korneinweichlaugen, getrocknete Hefe, Hefeextrakt, Ammo-niumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff und andere organische oder anorganische Stickstoffquellen. Metallsalze, wie Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate, Natriumphosphat, Kalium-, Magnesium-, Calcium-, Zink-, Eisen-und andere Metall-Salze könen,

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falls erforderlich, hinzugefügt werden.

V/eiterhin können als Beschleuniger für die Antibiotikaproduktion Methionin, Cystein, Cystin, Thiosulfat, Methyloleat, Schweinefett, Silikonöl, OberflächenentSpannungsmittel als Antischaummittel hinzugefügt werden.

Die Züchtung wird vorteilhafterweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt und die Temperatur kann gewöhnlich bei Id — 35 C, vorzugsweise bei etwa 30 C gehalten werden, und das pH des Mediums kann bei 5-10, vorzugsweise bei pH 6 - Ö gehalten werden. Die Züchtungsperiode variiert mit der Zusammensetzung des Mediums, der Züchtungstemperatur· und dgl. Gewöhnlich beträgt die Periode 3 bis 10 Tage und die antibiotische Substanz Y-G19Z D3 wird in dem Kulturmedium angereichert.

Die Trennung und Reinigung der antibiotischen Substanz Y-G19Z D3 wird durch eine oder durch Kombination von herkömmlichen Methoden, die für die Abtrennung und Reinigung von Antibiotika aus dem Kulturmedium üblich sind, ausgeführt.

Die antibiotische Substanz Y-G19Z D3 ist in Wasser löslich; so kann nach Beendigung der Züchtung Mycel und andere feste Rückstände durch Zentrifugieren oder Filtration entfernt werden. Y-G19Z D3 ist im Viasser oder Filtrat enthalten und kann daraus durch irgendeine oder durch Kombination von bekannten Methoden unter Ausnutzung ihrer physiko-chemischen Eigenschaften abgetrennt werden wie z.B. durch die Differenz der Löslichkeiten in Lösungsmitteln, Differenz in der Tendenz aus Lösungen auszutreten und an Adsorbentien adsorbiert zu werden, Verteilungskoeffizient zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten und anderen. Diese Methoden können einzeln oder in Kombination willkürlich oder wiederholt verwendet werden.

Das Verfahren dieser Erfindung wird deutlicher durch die folgenden Beispiele erläutert, jedoch kann die Herstellung jemäß

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dieser Erfindung in verschiedener Weise praktisch ausgeübt werden, die auf den beschriebenen Eigenschaften von Y-G19Z D3 beruhen.

Die Erfindung ist nicht auf die nachfolgend beschriebenen Beispiele beschränkt, umfaßt jedoch alle Methoden zur Herstellung, Abtrennung und Reinigung von Y-G19Z D3 mit gut bekannten Mitteln, die auf den vorstehend angegebenen Eigenschaften von Y-G19Z D3 durch diese Erfindung unter Verwendung von T-G19Z Stämmen oder ihren Mutanten oder Y-G19Z D3 herstellenden Stämmen, die zu den Streptomyceten gehören, basieren.

Beispiel 1

Beimpfungsdurchführung

Eine Sakaguchi-Flasche zur Beimpfung mit Streptomyces oganonensis Y-G19Z wurde vorbereitet durch Einfüllen von 100 ml Nährmedium, welches sich in einer 500 ml Flasche befand. Es wurde 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Der Flascheninhalt wurde mit einer schräg liegenden Agarkultur beimpft. Das folgende Medium wurde gewöhnlich verwendet!

Stärke 10 g

Glukose 10 g

Sojabohnenmehl 15g

Hefeextrakt 5 g

Wasser aufgefüllt auf tÖOO ml

Die Flaschen wurden bei 30° C 4$ Stunden auf einem rotierenden Schüttelappai*at inkubiert. 40 bis 60 ml Portionen der so erhaltenen Kultur wurden in einen 400 ml Ansatz desselben Mediums in 2000 ml Sakaguchi Flaschen zur Beimpfung gegeben und 24 Stunden bei 30° C inkubiert.

Fermentation

Zur Herstellung des Antibiotikums Y-G19Z D3 wurde das folgende Fermentationstttedium vorzugsweise verwendet (Hauptmedium):

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Stärke 45 g

Glycerin 7,5 β · .

Korneinweichlauge 1 g

Glutenmehl 1 g

Sojabohnenmehl 25 g

Kaseinhydrolysat 3 S !

Ferro sulfat 0,1 g ■

Wasser aufgefüllt auf 1000 ml

Adekanol^ 10 ml

( Antischaummittel Hersteller: Asahi-Denka Kogyo Co,)

Ein 60 Liter Ansatz des Hauptmediums wurde in einen 100 Liter Fermenter gegeben und bei 120° C für 30 Minuten sterilisiert. Eine 800 ml Lösung der vorstehend hergestellten Impfkultur wurde in das sterile Hauptmedium zur Beimpfung zugefügt. Die Fermentation wurde bei 30° G durchgeführt und für 90 Stunden fortgesetzt,und nach dieser Zeit wurde die Gärbrühe zur Antibiotikumgewinnung verwendet»

R eini gungsverfahren

Die Kulturbrühe aus zwei 100 Litern Fermentern wurde vereinigt und mit verdünnter Chlorwasser stoff säure auf pH 3,0 eingestellt. Radiolite Nr, 900 (Showa Chemical Industry Co, Ltd·) wurde zu der kombinierten Brühe unter Rühren hinzugefügt. Es wurde mittels einer Filterpresse filtriert, wobei etwa 100 Liter FiItrat erhalten wurde. Das Filtrat wurde auf pH 3,0 nachgestellt und durch eine Säule mit einer Packung aus 10 Liter Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas Co.) gegeben. Der Ablauf wurde mit Natriumhydroxyd auf pH 5,0 eingestellt und 2 Stunden durchgerührt. Nach Zugabe von 3,0 kg aktiver Holzkohle wurde das Antibiotikum Y-G19Z D3 an die Kohle adsorbiert. Die Aktivkohle wurde durch Filtration als Filterkuchen erhalten. Die erhaltene Aktivkohle wurde mit 60 Liter 50 Vol.-/Vol.-fo wässerigem Aceton extrahiert. Der Extrakt wurde auf etwa 30 Liter unter vermindertem Druck eingeengt, auf pH 2,5 niit verdünnter Chlorwasserstoff säure eingestellt und durch eine Säule mit einer Füllung mit 5 Liter

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Ionenaustauscher Duolite A-6(CH₃COO¹-Typ) (erhältlich von Chemical Process Co.) gegeben. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und das Antibiotikum wurde mit etwa 50 Liter eines Gemisches aus Pyridin : Essigsäure : V/asser (Volumenverhältnis 100 : 7 : 900» pH 6,0) eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 2-3 Liter eingeengt und durch eine Säule mit einer Füllung von 2 Liter . Amberlite CG-50 (H⁺-Typ) (Rohm & Haas Co.) gegeben. Die erhaltene aktive Fraktion wurde auf pH 3,0 eingestellt und mit dem gleichen Volumen n-Butanol gewaschen. Die wässerige Schicht wurde auf pH 4,0 eingestellt und auf 500 bis 1000 ml eingeengt. Hierzu wurden 25O - 5OO ml Methanol und 10-20 Liter Aceton nacheinander zugefügt, wodurch ein schleimiger Niederschlag gebildet wurde. Die Niederschläge wurden gesammelt und in Wasser auf gelöst ,und die wässerige Lösung· wurde auf pH 4,0 eingestellt und lyophilisiert. Es wurde ein Rohpulver im Gewicht von etwa 200 g erhalten.

100 g des Rohpulvers wurde in 50 bis 100 ml 0,5 molares Ammoniumbromid-Essigsäure-Gemisch (pH 3,0) aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde fraktioniert, indem diese durch eine Säule mit einer Füllung aus 1,5 Liter DEAE Sephadex A 25 (Hersteller: Pharmacia, Uppsala (Schweden)), die mit 0,5 molarem Ammoniumbromid - Essigsäure-Gemisch (pH 3,0) vorbehandelt war, gegeben. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden kombiniert und mit 5-10 Volumina Wasser verdünnt und auf pH 2,5 mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Die aktive Fraktion wurde wieder in eine Säule, gefüllt mit Duolite A-6 (CH₃COO'-Typ) zu ihrer Adsorption gegeben. Die Säule wurde sorgfältig mit Wasser gewaschen. Dann wurde mit dem Gemisch aus Pyridin : Essigsäure : Wasser (Volumenverhäitnis 100 : 7 : 900) eluiert. Die antimikrobiell aktiven Fraktionen wurden gesammelt und in eine Säule gegeben, die mit Amberlite CG-50 (H⁺-Typ) gefüllt war. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden eingeengt, und 10 Volumina Äthanol und 10 Volumina Aceton wurden nacheinander hinzugefügt, wodurch etwa '5 g schwach gelbes Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde in einer kleinen Menge eines Gemisches aus Isopropanol : Methanol : Wasser [Volumenverhäitnis 5:6:5) aufgelöst

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und chromategraphiert mittels einer Säule, die mit mikrokristalliner Zellulose (Avicel^, Hersteller: American Viscose Co.) gefüllt war und mit dem gleichen LSsungsmittelgemisch vorbehandelt war.

Die antimikrobiell aktiven und ninhydrin-positiven Fraktionen wurden gesammelt, kombiniert, konzentriert, und 50 - 100 Volumina Ä'thanol wurde hinzugefügt, um die aktive Substanz als, schwach gelbes Pulver abzuscheiden.

Das aktive Pulver wurde in einer kleinen Menge eines Gemisches aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (Volumenverhältnis 4:1 : 2) aufgelöst und mit einer Säule ehromatographiert, die mit mikrokristalliner Zellulose gefüllt war und die mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch vorbehandelt war. Fraktionen, die einen Rf von 0,19 bei einer Dünnschichtchromatographie auf einer Zelluloseplatte zeigten (Avicel SF -Platte, Hersteller:American Viskose Co.), wurden mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt und durch Besprühen mit 0,25$ Mnhvdrin-Lösung in Pyridin und anschließendem Erhitzen sichtbar gemacht, wurden dann gesammelt und konzentriert, und zum Konzentrat wurde Äthanol hinzugefügt. Es wurde 00 mg eines weißen Pulvers des Antibiotikums Y-G19Z D3 als freie Säure erhalten.

Beispiel 2

Die im Beispiel 1 erhaltene freie Säure des Antibiotikums Y-G19Z D3 wurde in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und dann mittels Chromatographie unter Verwendung von Dowex 50 V/ (H -Typ) (Hersteller: Dow Chemical Co.) und Entwickeln mit Wasser fraktioniert. Die mikrobiologisch aktiven Fraktionen wurden gesammelt und bei 40 - 45° C unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 7,0 mit Natriumhydroxyd eingestellt und lyophilisiert. Das erhaltene trockene Pulver wurde chromatographiert in einer Säule, gefüllt mit mikrokristalliner Zellulose (Avicel, Hersteller: American Viskose Cb,), die vorbehandelt und entwickelt wurde mit einem Lösungsmittelgemisch Isopropanol :

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Wasser (Volumenverhältnis 7 : 3). Aktive Fraktionen mit einem Rf von 0,19 "bei einem Zellulosedünnschichtchromatogramm (wie im Beispiel 1 beschrieben) wurden gesammelt und zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Pulver wurde in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst, und eine große Menge Ä'thanol wurde zur Bildung weißer Niederschläge hinzugefügt. Die Niederschläge ergaben nach dem Trocknen das Natriumsalz des Antibiotikums Y-G19Z D3.

Beispiel 3

In einem 1CX) Liter Fermenter wurde 60 Liter Kulturmedium mit einer Zusammensetzung aus 5$ Sojabohnenmehl, 7$ Stärke, 0'_t&% Glycerin, 0,1$ Kaseinhydrolysat, 0,5$ Natriumthiosulfat und weniger als 1$ Adekanol eingefüllt und bei 1 20 C 30 Minuten sterilisiert. Eine Ö00 ml Portion der Impfkultur, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde zur Beimpfung des sterilen Mediums hinzugegeben. Die Fermentation wurde bei 30° C unter Rühren 96 Stunden fortgesetzt. Die gewonnene Gärbrühe wurde filtriert, wie im Beispiel 1 angegeben. Das Filtrat wurde durch eine Säule, gefüllt mit 5 Liter Amberlite XAD-2,gegeben. Der Ablauf aus der Säule wurde weiter durch eine Säule mit einer Füllung aus 5 Liter Ionenaustauscher Dowex 1X2 (Cl'-Typ) (Hersteller: Dow Chemicals Co.) gegeben, die sorgfältig mit Wasser gewaschen wurde und mit 25 Liter 5$iger Natriumchloridlösung eluiert wurde. Zu dem Ablauf wurde 2$ (Gew./Vol.) Aktivholzkohle hinzugefügt, an die das Antibiotikum adsorbiert wurde. Die Aktivkohle wurde abfiltriert, und der Filterkuchen aus der Aktivkohle wurde mit Wasser gewaschen und mit 50$ wässerigem Aceton eluiert. Das Eluat wurde konzentriert und lyophilisiert. Es wurde 27,9 g rohes Pulver erhalten, welches 5,6 g aktive Substanz enthielt. Das lyophilisierte rohe Pulver wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Es wurden 510 mg Antibiotikum Y-G19Z D3 als freie Säure erhalten.

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Claims

Patentansprüche:

Das Antibiotikum Y-G19Z D3, eine Verbindung der 7-Methoxycephalbsporingruppe und ihre pharmazeutisch zulässigen Salze, welches im reinsten gereinigten Zustand

(a) ein weißes amorphes Pulver mit amphoterer Natur ist,

(b) einen Schmelzpunkt von I6O-17O⁰ C (unter Zersetzung) besitzt,

(c) leicht in Wasser löslich ist,

(d) schwierig löslich in Methanol und A'thanol ist,

(e) nahezu unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln ist,

(f) eine Elementar zusammensetzung (in fo) (als Natriumsalz) von C = 31,8 H - 3,8 N - 7,1 S- 16,5 Na - 7 + 0,7 aufweist,

(g) den folgenden Wert bei der Hochspannungspapierelektrophorese auf Whatmann Nr. 1 - Papier in 10biger Essigsäure bei pH 2,2 besitzt: Die Wanderungsentfernung bei 42 V/cm während einer Stunde betrug -5,2 cm,

(h) eine oC -Aminoadipinsaure bei der sauren Hydrolyse ergibt, (i) in I/IOO molarer Phosphatpufferlösung bei pH 6,4 das in Fig. 1 der Zeichnung dargestellte charakteristische Ultraviolettabsorptionsspektrum besitzt \ max 272 mu (E ]^ 176), 243 mu (Schulter)

(j) in der KBr-Tablette ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum, welches in Fig. 2 der Zeichnung dargestellt ist, zeigt,

(k) in schwerem Wasser ein charakteristisches kernmagnetisches ResonanzSpektrum, wie im folgenden angegeben, aufweist:

Wert (ppm): 1,80 (4H, Multiplett), 2,43 (2H, Multi«

plett)

3,35-3,82 (2H₁ Quartett, J«i8Hz),

3,47 (3H, Singlett), 3,82 (1H, Multiplett),

4,01 (2H, Singlett), 5,13 (1H, Singlett)

6098U/1 196

(1) die folgenden Rf-Werte bei der Dünnschicht Chromatographie unter Verwendung mikrokristalliner Zellulose-Systeme besitzt:

Losungsmittelsystem (Volumenverhältnis) Rf Wert Acetonitril : H₂O (5:2) 0,35

n-Butanol : Essigsäure : HgO (6:1,5:2,5) 0,16 n-Butanol : Essigsäure : H₂O (4:1:2) 0,19
2. Verfahren zum Herstellen des im Pat ent ansprach 1 definierten Antibiotikums Y-G19Z D3, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces oganonensis Y-G19Z ATCC-Nr. 31 167 in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Quellen für Kohlebhydrate, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kultiviert wird bis ein substantieller Betrag an antibiotischer Aktivität durch den Organismus in dem Kulturmedium hergestellt ist und das Y-G19Z D3 antibiotische Gemisch aus dem Kulturmedium abgetrennt wird,
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum Y-G19Z D3 aus dem Y-G19Z D3 antibiotischen Gemisch abgetrennt wird.
4. Verwendung des im Anspruch T genannten Antibiotikums Y-G19Z D3 in der Säureform oder in Form seiner pharmazeutisch zulässigen Salze als Wirkstoff zur Anfertigung von antibiotisch wirksamen Arzneimitteln.

$09814/1196