AT232192B - Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure 
Die 6-Aminopenicillansäure ist bekannt. 



   Ihre Existenz wurde erstmals von T. Kato vermutet (J. Antibiotics, Series A, 6,130, 184 [1953]) und dann von S. Murao (J. Agric. Chem. Soc. Japan, 29, 400-07, Juni 1955) beobachtet. Der letztgenannte Autor arbeitete in der Weise, dass er Penicillinamidase aus Penicillium Chrysogenum Q 176 auf Penicillin-GNatrium einwirken liess. Hiebei wurde Phenylessigsäure abgespalten. Die Vorbereitung des Stammes Penicillium Chrysogenum Q 176 zur Penicillinamidasebildung geschah durch vorherige Einwirkung von Sulfathiazol auf den Mikroorganismus. Dieses Verfahren ist jedoch schwierig durchzuführen und gestattet praktisch nicht, die 6-Aminopenicillansäure herzustellen. 



   Ein anderes Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure ist aus der belg. Patentschrift Nr.   569. 728   bekannt. Nach diesem Verfahren wird Penicillium chrysogenum in den üblichen Nährlösungen und unter den üblichen Kulturbedingungen kultiviert, jedoch unter Fortlassung des Precursors, wie Phenylessigsäure oder Phenoxyessigsäure. Nach diesem Verfahren werden relativ geringe Ausbeuten erhalten, deren Aufarbeitung ausserdem grosse technische Schwierigkeiten bereitet. Somit ist auch dieses Verfahren für die Anwendung im industriellen Massstabe nicht geeignet. 



   Es wurde nun gefunden, dass man 6-Aminopenicillansäure in sehr guten Ausbeuten ohne grosse technische Schwierigkeiten auf mikrobiologischem Weg erhalten kann, wenn man auf Penicilline bestimmte Bakterien, die bei Einwirkung auf Penicillinlösungen die antibiotische Aktivität dieser Lösungen weitgehend aufheben, jedoch durch Zusatz von Phenylacetylchlorid wiederherstellbar belassen, oder Mutanten dieser Bakterien und bzw. oder Suspensionen und bzw. oder Extrakte und bzw. oder Enzympräparate derselben einwirken lässt, wobei im wesentlichen nur die Amidbindung in 6-Stellung des Penicillinmoleküls gespalten wird, und anschliessend das erhaltene Endprodukt isoliert. 



   Die Eignung ausgewählter Bakterien zur Durchführung der Spaltung kann unter Verwendung einer zum Stand der Technik gehörenden Nachweismethode (F. R. Bachelor, E. P. Doyle, J. H. C. Nayler und G. N. Robinson, Nature, London 183 [4656], 257 vom 24. Juni 1959) auf folgende einfache Weise überprüft werden. 



   10 cm3 einer Phosphatpufferlösung von PH 7, 0, die 10. 000 i. E. Penicillin G/cm3 enthält, wird mit dem gleichen Volumen einer Bakteriensuspension in   Phosphatpufferlösung   von PH 7, 0 versetzt und nach Zusatz von 0, 2% Toluol 5 Stunden bei   370 C   aufbewahrt. 



   Die Bakteriensuspension wird folgendermassen hergestellt : 
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 resuspendiert. 



   Nach der fünfstündigen Einwirkung der Bakterienzellen auf das Penicillin G wird in der zellfrei geschleuderten Lösung mikrobiologisch der verbliebene Penicillingehalt ermittelt. 



   Bei verschiedenen Bakterienstämmen wird hiebei gefunden
1. die Lösung enthält die volle Anfangsaktivität. In diesem Falle haben die Bakterienzellen keine enzymatische Wirkung gegenüber dem Penicillin G entfaltet. Die Bakterien sind daher zur Herstellung penicillinspaltender Enzyme ungeeignet. 



   2. Die Lösung ist inaktiv oder hat eine stark verminderte Aktivität. In diesem Falle lässt man unter Eiskühlung und gleichzeitiger Zugabe von Natriumbicarbonat 500 mg Phenylacetylchlorid auf die Lösung einwirken. Sie wird nun erneut getestet. Findet man bei diesem Test a) gegenüber der nicht acylierten Lösung keine Erhöhung der Aktivität, so ist, daraus zu schliessen, dass das Penicillin durch Penicillinase oder ähnliche Enzyme irreversibel abgebaut wurde, b) eine volle Reaktivierung der Penicillinwirkung auf 10. 000 i. E./cm3 Lösung, so geht aus dem Versuch hervor, dass das Penicillin G durch Enzymeinwirkung so gespalten wurde, dass   6-Aminopenicillin-   

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 säure und Phenylessigsäure entstand.

   Die in diesem Experiment ermittelten Bakterien eignen sich hervorragend zur enzymatischen Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillin, c) eine nur partielle Reaktivierung der ursprünglichen Penicillinaktivität von 10. 000 i.   E./cm3   Lösung, so geht aus dem Versuch hervor, dass neben dem Phenylessigsäure abspaltenden Enzym Penicillinase in den Bakterien vorhanden war. Solche Bakterien sind nur dann zur Herstellung von 6-Amino-penicillansäure geeignet, wenn die vorliegende Penicillinase nur einen geringen Teil des Penicillins inaktiviert oder wenn es gelingt, die Penicillinaseaktivität selektiv weitgehend auszuschalten. 



   Der beschriebene Test kann auch in abgeänderter Weise durchgeführt werden, indem man die enzymaische Aktivität gegenüber Penicillin G in zellfreie Kulturfiltraten untersucht. 



   Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eignen sich besonders Suspensionen oder Extrakte von gramnegativen Bakterien, z. B. von Escherichia coli, Proteus, Aerobacter aerogenes, Salmo-   nella-und   Shigella-Arten. Dies ist besonders überraschend, da es bekannt ist, dass gerade Escherichia coli in der Lage ist, Penicillinase zu bilden, die den ss-Lactamring im Molekül der Penicilline spaltet. 



   An Stelle der Bakterienextrakte oder-Suspensionen können auch aus diesen gewonnene zellfreie Enzyme oder Enzymanreicherungen verwendet werden. 



   Das   erfindungsgemässe   Verfahren wird zweckmässig in der Weise durchgeführt, dass man Suspensionen der genannten Bakterien oder auch von Mutanten dieser Bakterien in Gegenwart von Toluol, Chloroform oder einem andern bei Enzymarbeiten gebräuchlichen Isolierungsmittel auf Penicilline einwirken lässt. 



  Man legt dabei die Penicilline in Konzentrationen von 5. 000 bis 600. 000 E und mehr pro cm3 vor. Je nach Art der verwendeten Bakterien wird das Verfahren bei Temperaturen von 0 bis   400 C   durchgeführt, wobei jedoch solche von 20 bis 40   C, vor allem um 37   C, bevorzugt sind. Das Verfahren wird bei PHWerten von 5 bis 9, vorzugsweise 6, 5 bis 8, durchgeführt. Die Zeit der Umsetzung hängt von der Menge der verwendeten Penicilline und Enzyme ab und kann zwischen 15 Minuten und 24 Stunden betragen. 



  Es ist jedoch zweckmässig, die Menge der Reaktionsteilnehmer so zu wählen, dass die Umsetzungszeit etwa 5 Stunden beträgt. 



   Unter Einhaltung dieser Versuchsbedingungen werden die Penicilline praktisch quantitativ in 6-Aminopenicillansäure übergeführt. 



     Beispiel l :   Eine dichte Suspension von gewaschenen E. coli-Zellen des Stammes ATCC 11. 105 wurde in einem Phosphatpuffer von pH-6 suspendiert. Dieser Suspension wird Penicillin-G-Natrium in einer Konzentration von 5. 000 E pro cm3 zugegeben. Nach Zusatz von   0, 4% Toluol   wird die Lösung 18 Stunden bei   370 C   aufbewahrt. 



     7, 5 I   des Enzymansatzes werden mit Aceton auf 301 aufgefüllt. Die hiebei auftretende Ausfällung wird abzentrifugiert. Die Lösung wird dann im Vakuum auf   3, 88 I   eingeengt, wobei eine Ausscheidung auftritt. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 2, 6 wird mit   2 1   Butylacetat extrahiert. Der Extrakt wird verworfen und der wässerige Rückstand mit einer Natriumhydrogencarbonatlösung auf pH 4, 3 eingestellt und nach Klärung über ein Seitz-K3-Filter im Vakuum auf 300 cm3 eingeengt. Hiebei tritt spontan Kristallisation ein. Die Kristalle werden abgeschleudert und portionsweise mit 300 cm3 eiskaltem Wasser und 150   cm   Aceton gewaschen und getrocknet.

   Aus der Mutterlauge kann eine weitere, etwas unreinere Fraktion von   6-Amino-penicillan-säure   gewonnen werden.   Schmelzpunkt : 2080 C   unter Zersetzung ; Ninhydrin-Probe einer verdünnten wässerigen Lösung : orange bis braunrote Färbung. 
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2 :HC1 auf pH 7, 5 zurückgestellt, und die verbliebenen, nicht lysierten Zellen und sonstigen unlöslichen Rückstände werden abzentrifugiert. Der überstehende, klare Extrakt wird bis zu einer Konzentration von 15. 000 E/cm3 mit Penicillin-G-Kalium versetzt und nach Zugabe von   0, 4%   Toluol 12 Stunden bei   300 C   gehalten. Zur Isolierung der entstandenen 6-Aminopenicillansäure wird der Ansatz mit dem gleichen Volumen Aceton versetzt und kurze Zeit stark gerührt. Der entstandene Niederschlag wird abgetrennt. 



  Das klare Filtrat wird zur Extraktion des Acetons mit dem gleichen Volumen Butylacetat ausgeschüttelt. Die abgetrennte wässerige Phase wird dann zur Entfernung des nicht gespalteten Penicillins bei   0 0 C   mit HC1 auf pH 2, 8 eingestellt und mit dem gleichen Volumen gekühlten Butylacetats ausgeschüttelt. Die wässerige Phase wird abgetrennt, mit KOH auf pH 4, 3 eingestellt und im Vakuum bei   20-25   C   einge-   engt. Dabei entsteht ein weisser Niederschlag von 6-Aminopenicillansäure, welcher von der   Mutterlauge abgetrennt, mehrfach mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet wird. 



   Die Kristalle der so gewonnenen 6-Aminopenicillansäure schmelzen bei   205-208   C   unter Zersetzung. 



  Sie zeigen praktisch keine antibiotische Wirkung gegenüber Bac. subtilis. Nach Umsatz mit Phenylacetylchlorid erreicht man eine Wirkung von 2660 i. E. /mg eingesetzter 6-Aminopenicillansäure. NinhydrinProbe : orange bis braunrote Farbreaktion. 
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   Beispiel 4 : Einer dichten Suspension von gewaschenen Zellen des Laboratoriumstammes E. coli CM 2 in Phosphatpufferlösung von PH 7, 5 wird Penicillin G Natrium bis zu einer Konzentration von 10. 000 i.   E./cm zugegeben.   Nach Zusatz von   0, 00050 u 2, 4-Dinitrophenol als   Konservierungsmittel wird die Lösung 9 Stunden bei   370 C   aufbewahrt. Aus dieser Lösung kann die gebildete 6-Aminopenicillansäure, wie in Beispiel   l   beschrieben, isoliert werden. 
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 werden. 



   Beispiel 6 : Einer dichten Suspension von gewaschenen Zellen des Laboratoriumstammes E. coli CM 6 in Phosphatpufferlösung von PH 7, 5 wird Penicillin G Natrium bis zu einer Konzentration von 10. 000 i. E. pro cm3 zugegeben. Nach Zusatz von   0, 2% Chloroform   wird die Lösung 15 Stunden bei 37   C aufbewahrt. Aus dieser Lösung kann die gebildete   6-Aminopenicillansäure   nach Beispiel   l   isoliert werden. 



   Der Nachweis der   6-Aminopenicillansäure   erfolgt zweckmässig in der Weise, dass man die Lösung ohne weitere Vorbehandlung gegen einen der üblichen penicillinempfindlichen Organismen testet. Die 
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 an Phenylacetylchlorid und Natriumbicarbonat umgesetzt. Hiebei tritt Phenylacetylierung an der freien Aminogruppe ein. Man erhält dabei Penicillin-G in der Menge zurück, die ursprünglich vorgelegt war. 



   Ähnliche Ergebnisse erhält man auch bei Anwendung nachfolgender Stämme, wenn man nach den angegebenen Beispielen verfährt :
1. Pseudomonas aureofaciens,
2. Pseudomonas fluorescens,
3. Pseudomonas aeruginosa,
4. Alcaligenes faecalis,
5. Serratia marcescens,
6. Micrococcus roseus,
7. Micrococcus lysodeicticus,
8. Sarcina lutea,
9. Bacillus subtilis var. niger,
10. Mycobacterium phlei. 



   PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von   6-Aminopenicillansäure   durch Spaltung von Penicillin G mit Hilfe von Mikroorganismen oder aus diesen gebildeten Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung von reiner, nichthygroskopischer, bei etwa   2080 C   schmelzender   6-Aminopenicillansäure,   die sich durch Phenylacetylchlorid praktisch quantitativ zu Penicillin G reaktivieren lässt, zur Spaltung im wesentlichen nur der Amidbindung in 6-Stellung des Penicillinmoleküls als Mikroorganismen Bakterien, vorzugsweise grammnegative Bakterien, insbesondere Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Proteus rettgeri, Proteus OX 19, Salmonella, Shigella oder Mutanten dieser Bakterien und/oder Extrakte und/oder als Enzymrohlösungen daraus gebildete Enzympräparate verwendet werden.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionstemperaturintervall zwischen 0 und 40 C, vorzugsweise zwischen 30 und 40 0 C liegt.

   3. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einem pH-Wert von 5 bis 9, vorzugsweise von 7 bis 8, 5 durchgeführt wird und zweckmässigerweise 1-15 Stunden dauert.