AT234274B - Verfahren zur Züchtung von Bakterien zwecks Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen - Google Patents
Verfahren zur Züchtung von Bakterien zwecks Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus PenicillinenInfo
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Description
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Verfahren zur Züchtung von Bakterien zwecks Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen
Der wesentlicheinhalt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Penicillin spaltenden Aktivität von solchen Mikroorganismen, die zur Herstellung von 6-Amino-pemcillansäure durch Spaltung von Penicillin verwendet werden sollen.
Als geeignet zur Durchführung des oben genannten Verfahrens haben sich beispielsweise die folgenden Bakterienarten erwiesen :
EMI1.1
<tb>
<tb> 1. <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> 10. <SEP> Shigella
<tb> 2. <SEP> Pseudomonas <SEP> aureofaciens <SEP> 11. <SEP> Micrococcus <SEP> roseus
<tb> 3. <SEP> Pseudomonas <SEP> fluorescens <SEP> 12. <SEP> Micrococcus <SEP> lysodeicticus
<tb> 4. <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 13. <SEP> Sarcina <SEP> lutea
<tb> 5. <SEP> Alcaligenes <SEP> faecalis <SEP> 14. <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> var. <SEP> niger
<tb> 6. <SEP> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 15. <SEP> Mycobacterium <SEP> phlei
<tb> 7. <SEP> Serratia <SEP> marcescens <SEP> 16. <SEP> Proteus <SEP> rettgeri
<tb> 8. <SEP> Proteus <SEP> OX <SEP> 19 <SEP> 17. <SEP> Arthrobacter
<tb> 9.
<SEP> Salmonella
<tb>
Für die Eignung der benötigten Bakterien zur Penicillinspaltung ist es nun keineswegs gleichgültig, unter welchen Bedingungen die Organismen kultiviert worden sind. Beimpft man eine Nährlösung von PH 7, 0, welche neben den zur Züchtung von Mikroorganismen erforderlichen Ionen als N-Quelle Ammoniumionen, Caseinhydrolysat oder Fleischpepton und als Energie- und C-Quelle Glukose, Lactose oder Saccharose enthält, mit einem geeigneten Bakterienstamm, so erhält man nach der Kultivierung unter Belüftung bei zirka 300C wohl eine recht hohe Ausbeute an Bakterienzellmaterial, doch ist das Penicillinspaltungsvermögen dieser Zellen gering. Eine gewisse Steigerung der gewünschten enzymatischen Aktivität erhält man bei Verwendung von Glycerin oder Salzen organischer Säuren, wie z. B.
Milchsäure oder Bernsteinsäure als Energie- und C-Quelle.
Es wurde nun gefunden, dass man die penicillinspaltende Aktivität der einleitend genannten Bakterien steigern kann, wenn man sie-bevor man sie auf Penicilline einwirken lässt - nach an sich üblichen Methoden unter Belüftung in Nährlösungen züchtet, die höchstens unbedeutende Mengen von vergärbaren Kohlenhydraten, vorzugsweise unter 0, 5%, enthalten und denen Phenylessigsäure oder deren Derivate in Mengen von etwa 0, 002 bis 2f'/o, vorzugsweise 0, Wo, zugesetzt sind, wobei gegebenenfalls während des Wachstums Kohlendioxyd zugeleitet wird.
Gemäss der vorliegenden Erfindung lässt sich Bakterienzellmasse von gutem Penicillinspaltungsvermögen gewinnen, wenn man als hauptsächliche Energie- und Stickstoffquelle Aminosäuregemische in Form von Eiweisshydrolysaten oder Peptidgemische in Form von Peptonen oder noch höher molekulare Proteine zur Herstellung der Nährlösung verwendet. Es ist zweckmässig, solchen Nährlösungen neben den üblichen anorganischen Ionen, wie SO PO"", Mg , K , Na+, Cl* noch ein Vitamin-und Wuchsstoffge- misch, wie z. B. Hefewasser, in geringen Mengen zuzusetzen.
Durch Zusatz von Phenylessigsäure, ihren Salzen und Derivaten zur Nährlösung kann man die ge-
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wünschte enzymatische Aktivität der Bakterien steigern. Fermer kann man das Penicillinspaltungsvermögen der Bakterienmasse dadurch weiter erhöhen, dass in solchen Kulturen während des Wachstums der Bakterien ausser Luft noch Kohlendioxyd eingeleitet wird.
Erfindungsgemäss wird vorzugsweise als Hauptnährbodengrundlage Maisquellwasser verwendet. Dieses enthält gut geeignete Energie- und Stickstoffquellen, Vitamine und Wuchsstoffe und ferner die oben genannten anorganischen Ionen. Dieser Grundnährlösung werden erfindungsgemäss Phenylessigsäure, Phenylacetamid, Phenacetursäure, Phenacetylglutaminsäure oder andere Derivate der Phenylessigsäure zugesetzt. Das Kohlendioxyd kann entweder der zur Sauerstoffversorgung der Kulturen verwendeten Luft beigemischt werden oder aber von der Belüftung getrennt in die wachsenden Kulturen eingeleitet werden.
Die Temperatur der Kulturen kann 20 - 450e betragen. Zweckmässig lässt man die Kulturen 12 - 20 h bei 30-350C wachsen.
Nach dieser Zeit werden die Bakterienzellen zweckmässig abgetrennt und gewaschen. Man kann sie dann auf Penicilline einwirken lassen. Da das penicillinspaltende Enzym fest an die Zellwand der Bakterien und nicht an cytdplasmatische Bestandteile der Zellen gebunden ist, kann man das Enzymmaterial nach beendeter Einwirkung aus den Penicillinspaltungsansätzen durch Abzentrifugieren zurückgewinnen und für weitere Ansätze wieder verwenden.
EMI2.1
30 min auf 120 C erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und nach Zusatz von 0, 5% Glukose 40 min bei 110 C im Fermenter sterilisiert. Diese Nährlösung wird nach Abkühlung mit 400 cm* einer 18stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC 11105 beimpft.
Der Ansatz wird dann mit 150 l Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 h bei 31 C kultiviert.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 11/15 m Phosphatpufferlösung von PH 6. 0 gewaschen und nach dem Abzentrifugieren in 16 11/5 m Phosphatpufferlösung von PH 7, 0 resuspendiert. In dieser Suspension wird trockenes Penicillin G bis zu einer Konzentration von 5 000 I. E./ cm3 gelöst und 0,4% Toluol zugegeben. Der Ansatz wird 12 h bei 37 C gehalten und enthält nach dieser Zeit noch 4200 i. E. Penicillin G pro cm Suspension. Das Filtrat einer Probe dieser Suspension wird nach bekannten Methoden mit Phenylacetylchlorid umgesetzt und lässt sich so bis auf 4850 I. E. Penicillin G/cm reaktivieren.
Beispiel 2 : 1601 sterile. wie in Beispiel 1 hergestellte Maisquellwasserlösung, jedoch ohne Zusatz von Glukose, werden mit 400 cm eienr 18stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC 11105 beimpft. Der Ansatz wird mit 150 l Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 h bei 31 C kultiviert.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 11/15 m Phosphatpufferlösung von pH 6, 0 gewaschen und nach Abzentrifugieren in 16 11/5 m Phosphatpufferlösung von PH 7, 0 resuspendiert. In dieser Suspension wird trockenes Penicillin G bis zu einer Konzentration von 5 000 I. E./cms gelöst und 0, 40/0 Toluol zugegeben. Der Ansatz wird 5 h bei 37 C gehalten und enthält nach dieser Zeit noch 600 I. E. Penicillin G pro cm3 Suspension. Das Filtrat einer Probe dieser Suspension wird nach bekannten Methoden mit Phenylacetylchlorid umgesetzt und lässt sich so bis auf 4 650 I. E. Penicillin G/cm reaktivieren.
Bei den Beispielen 1 und 2 wurde dem Kulturmedium keine Phenylessigsäure zugesetzt. Dementsprechend waren die Ausbeuten schlecht. Aus den nun folgenden Beispielen geht hervor, welche hohe Ausbeuten dann erreicht werden, wenn in Gegenwart von Phenylessigsäure oder deren Derivaten gearbeitet wird.
Beispiel 3 : 160 l sterile, wie in Beispiel 2 hergestellte Maisquellwasserlösung, jedoch mit Zusatz von 0, 2% Kaliumphenylacetat, werden mit 400 cms einer 18stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC 11105 Beimpft. der Ansatz wird mit 150 1 Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 h bei 31 C kultiviert.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 11/15 m Phosphatpufferlösung
EMI2.2
kannten Methoden mit Phenylacetylchlorid umgesetzt und lässt sich dadurch bis auf 9 500 I. E. Penicillin G/cm3 reaktivieren.
Beispiel 4s 160 l sterile, wie in Beispiel 2 hergestellte Maisquellwasserlösung, jedoch mit Zusatz
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von 0, 2so Kaliumphenylacetat, werden mit 400 cm3 einer 18stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC 11105 beimpft. Der Ansatz wird mit 150 1 Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 h bei 310C ohne Überdruck kultiviert. Während der gesamten Wachstumszeit werden durch eine von der Luftleitung des Fermenters getrennte Leitung 5 1 Kohlendioxyd pro Minute in die Kultur eingeleitet.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert. in 16 11/15 m Phosphatpufferlösung von PH 6,0 gewaschen und nach erneuter Abtrennung in 16 11/5 m Phosphatpufferlösung von PH 7, 5, welche 100 000 i. E. Penicillin G/cm3 und 0,45 toluol enthält, resuspendiert. Der Ansatz wird 7 h bei 300C gehalten. Während dieser Zeit wird das pH des Reaktionsgemisches, welches durch die enzymatisch aus dem Penicillinmolekül abgespaltene Phenylessigsäure in den sauren Bereich absinkt, durch wiederhol-
EMI3.1
Suspension wird nach bekannten Methoden mit Phenylacetylchlorid umgesetzt und lässt sich dadurch bis auf 91000 I. E. Penicillin G/cm3 reaktivieren.
Die in diesem Ansatz gebildete 6-Aminopenicillansäure kann als farbloses, kristallines Pulver in guter Ausbeute isoliert werden.
Beispiel 5 : 1601 sterile, wie in Beispiel 2 hergestellte Maisquellwasser-Nährlösung, jedoch mit Zusatz von 0,'2f1/0 Kaliumphenylacetat werden mit 400 cm3 einer 18stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC 9637 beimpft. Der Ansatz wird mit 150 1 Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 h bei 310C ohne Überdruck kultiviert. Während der gesamten Wachstumszeit werden durch eine von der Luftleitung des Fermenters getrennte Leitung 10 1 Kohlendioxyd pro Minute in die Kultur eingeleitet.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 11/15 m Phosphatpufferlösung von pH 6,0 gewaschen und nach erneuter Abtrennung in 16 11/5 m Phosphatpufferlösung von pH 7,5, welche 50 000 1. E. Penicillin G/cm3 und 0, 4% Toluol enthält, resuspendiert. Der Ansatz wird 3 h bei 300C gehalten. Während dieser Zeit wird das PH des Reaktionsgemisches, welches durch die enzymatisch aus dem Penicillin-Molekül abgespaltene Phenylessigsäure in den sauren Bereich absinkt, durch wiederholte Zugaben von konzentrierter Na2 C03 -Lösung zwischen 7, 0 und 7,5 gehalten. Nach der 3stündigen Reaktion enthält der Ansatz noch 4700 I. E.
Penicillin G/cm3 Suspension. Das Filtrat einer Probe dieser Suspension wird nach bekannten Methoden mit Phenylacetylchlorid umgesetzt und lässt sich dadurch bis auf 46 500 I. E. Penicillin G/cm3 reaktivieren.
Die in diesem Ansatz gebildete 6-Aminopenicillansäure kann nun als farbloses, kristallines Pulver in guter Ausbeute isoliert werden.
Beispiel 6: 160 1 einer Nährlösung enthaltend
EMI3.2
werden 40 min bei 1100C im Fermenter sterilisiert und nach Abkühlung mit 400 cm'einer 18stündigen Schüttelkultur von Proteus rettgeri beimpft. Der Ansatz wird dann mit 150 1 Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 20 h bei 250C kultiviert.
Zur Prüfung der enzymatischen Aktivität werden die Bakterienzellen aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 l 0, 9% iger NaCl-Lösung gewaschen und nach Abzentrifugieren in16 11/15 mPhosphatpuffer-Lösung von pH 7, 5, welche 50000 I. E. Penicillin G/cm3 und 0, 40/0 Toluol enthält, resuspendiert. Der Ansatz wird 4 h bei 400C gehalten. Während dieser Zeit wird das PH des Reaktionsgemisches durch wiederholte Zugaben von Na2 CO -Lösung zwischen PH 7,5 und 8,0 gehalten. Nach der 4stündigen Reaktion enthält der Ansatz noch 3000 I. E. Penicillin G/cm3 Suspension. Das Filtrat einer Probe dieser Sus- pension wird nach bekannten Methoden mit Phenylacetylchlorid umgesetzt und lässt sich dadurch bis auf 43 000 1. E.
Penicillin G/cm3 reaktivieren.
EMI3.3
boden isolierten Arthrobacter-Stammes beimpft. Der Ansatz wird dann mit 150 1 Luft/min bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 22 h bei 250C kultiviert.
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
Das Filtrat einer Probe dieser Suspension wird nach bekannten Methoden mit Phenylacetylchlorid umgesetzt und lässt sich dadurch bis auf 21000 I. E. Penicillin G/cm reaktivieren.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Züchtung von Bakterien zwecks Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Peni- cillinen,-z. B. von in bekannter Weise als geeignet ausgewählten Bakterien der Gattungen Escherichia, Serratia, Alcaligenes, Aerobacter, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas u. a., dadurch gekenn- zeichnet, dass man solche Bakterien unter Belüftung in Nährlösungen züchtet, die höchstens unbedeutende Mengen von vergärbaren Kohlehydraten, vorzugsweise unter 0, 55o, enthalten und denen Phenylessigsäure oder deren Derivate in Mengen von etwa 0,002 bis 2Ço, vorzugsweise 0, 2%, zugesetzt sind, wobei gegebenenfalls während des'Wachstums Kohlendioxyd zugeleitet wird.
Claims (1)
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Hauptnährbodengrundlage Maisquellwasser verwendet.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE234274X | 1959-09-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| AT234274B true AT234274B (de) | 1964-06-25 |
Family
ID=5890582
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| AT708760A AT234274B (de) | 1959-09-24 | 1960-09-19 | Verfahren zur Züchtung von Bakterien zwecks Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | AT234274B (de) |
-
1960
- 1960-09-19 AT AT708760A patent/AT234274B/de active
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