DE2161164B2 - Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen und Verwendung des proteinhaltigen Produkts - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur b> mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen unter Verwendung von Methanol als Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und auf die Verwendung des nach dem Verfahren hergestellten, proteinhaltigen Produkts als proteinhaltige Nahrungsmittelergänzung zur Ernährung von Mensch und Tier.

Zur Zeit herrscht in der ganzen Welt eine Proteinknappheit In neuerer Zeit bekanntgewordene, mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von Proteinmassen durch Züchten von Mikroorganismen auf verschiedenen kohlenstoffhaltigen Substraten können zur Lösung dieses Problems einen Beitrag leisten. Es ist erwünscht daß bei solchen Verfahren billige und leicht verfügbare kohlenstoffhaltige Substrate verwendet werden, daß die Proteine mit einer hohen Geschwindigkeit hergestellt werden und daß die erzeugten Proteinmassen eine geeignete Aminosäurev»rteilung besitzen.

Es sind Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Protein aus Methan (FR-PS 20 16 899) bzw. aus n-aliphatischen Kohlenwasserstoffen (FR-PS 14 60 155) bekannt Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß für den Einsatz von Methan und gasförmigen Kohlenwasserstoffen besondere Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen und daß besondere Maßnahmen notwendig sind, um die Kohlenwasserstoffe in dem wäßrigen Nährmedium zu dispergieren.

Aus der DE-OS 17 92 187 ist ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von proteinhaltigen Produkten aus oxidierten Kohlenwasserstoffen, insbesondere aus Äthanol, bekannt Von den bei diesem Verfahren eingesetzten Mikroorganismen ist nur Micrococcus cerificans zur Verwertung von Methanol als Kohlenstoffquelle geeignet, führt jedoch zu relativ schlechten Ergebnissen.

Aus der DE-OS 20 59 277 ist ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Protein aus Methanol unter Verwendung von Stämmen der Gattung Pseudomonas bekannt Die bei diesem Verfahren eingesetzten Pseudomonas-Stämme, die im übrigen bis nach dem Anmeldungszeitpunkt der Erfindung der Öffentlichkeit nicht zur Verfugung standen, haben jedoch eine relativ niedrige optimale Wachstumstemperatur (30° C oder niedriger), was nachteiligerweise dazu führt, daß eine relativ starke, mit hohen Betriebskosten verbundene Kühlung erforderlich ist.

Aufgabe der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen unter Verwendung von Methanol als Kohlenstoffquelle, bei dem man eine hohe Produktionsgeschwindigkeit und Ausbeute des Proteins erzielt

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen durch aerobes Kultivieren von Bakterien in einem wäßrigen Kulturmedium, das Methanol als Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und anorganische Nährstoffe aufweist, und Gewinnen der Proteinmassen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen methanolausnutzenden Stamm der Arten Pseudomonas methylotropha, Microcyclus polymorphum, Hyphomicrobium variabile und Pseudomonas rosea oder mehrere dieser Stämme verwendet, wobei diese Arten die nachstehend zu diesen Arten angegebenen allgemeinen Eigenschaften besitzen.

Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten proteinhaltigen Produkts in Form von getrockneten Zellen als proteinhaltige Nahrungsmittelergänzung, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Nährmitteln, zur Ernährung von Mensch und Tier.

Die erfindungsgemäß isolierten, methanolausnutzenden Bakterienstämme gehören Arten an, die offenbar

bisher unbekannt waren und denen-die Namen Pseudomonas methylotropha, Pseudomonas rosea, Microcyclus polymorphum und Hyphomicrobiium variabile gegeben wurden. Sie sind in der Lage, auf Methanol zu wachsen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt man ein gutes Wachstum in kontinuierlicher Kultur, einen hohen Proteingehalt, gute Wachstumsgeschwindigkeiten, eine gute Ausbeute und ein günstiges AminosäureprofiL Die erfindungsgemäß eingesetzten Stämme der kennzeichengemäßen Arten haben eine im Vergleich mit bekannten, methanolausnutzenden Bakterien beträchtlich höhere, optimale Wachstumstemperaturen (37"C), was dazu führt, daß die Kühlanlagen reduziert werden können und daß das Verfahren technisch-wirtschaftlich vorteilhafter durchführbar ist

Repräsentative Kulturen geeigneter Stämme der neuen 4 Arten sind hinterlegt worden bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Schottland, Großbritannien, wobei ihnen die folgenden NCI B-Zugangsnummern gegeben wurden:

Art: Pseudomonas methylotropha:

Stämme WKM-3, WKM-I, SA, SB, SD, SE, SF, AS-'. MP4, F16/1, F16/2, MPI/Sh/37/1 und 28/D/37 mit den NCIB-Nummern 10508-15 und 10592-96.

Art: Microcyclus polymorphum: Stamm Pia 5 - NCIB-Nr. 10516. Art: Hyphomicrobium variabile: Stamm S/30/4 - NCIB-Nr. 10517. Art: Pseudomonas κ sea:

Stämme MA2/3, BDD/3, MA3D/1, MW4/4, MPlD/2, MP3D/2, MP1/2. MA2/2, 20D, MAI/5, MA3D/3, BDD/2, MPl, ChD, W? MP3 mit den NCIB-Nummem 10597-10612.

Die allgemeinen mikrobiologischen Eigenschaften der neuen 4 Arten wurden Standardtests bestimmt.

Die Tests, die zur Identifizierung der Stämme angewandt wurden, werden nachstehend beschrieben:

1. Medien

Das für die Tests verwendete Methanol-Mineralsalz-Medium hat folgende Zusammensetzung:

KH₇PO₄

Na₂HPO₄

(NH₄J₂SO₄

MgSO₄ · 7 H₂O

CaCI₂

FeSO₄

MnSO₄

Na₂MoO₄ · 2 H₂O

destilliertes Wasser

Methanol

1,4 g 2,1g 0,5 g 0,2 g 0,01g 0,005 g 0,003 g 0,0025 g 1,0 Liter 5,0 ml

25

JO

55

Für die Züchtung von Microcyclus polymorphum werden zu dem vorstehend angegebenen Medium 0,01% Hefeextrakt hinzugesetzt. Dieses Medium kann durch den Zusatz von 2% (Gewicht/Volumen) hochreinen Agars (beispielsweise Agar mit Oxid-Markierung »I.D.«) verfestigt werden.

2. Tests der Kohlenstoffquelle

Tests für die Ausnutzung der verschiedenen Kohlenstoffquellen werden in dem vorstehend beschriebenen Medium durchgeführt, wobei man anstelle des Methanols 0,5% (Gewicht/Volumen) der zu testenden Kohlenstoffquelle hinzusetzt Negative Ergebnisse dieser Tests bedeuten, daß auf dieser bestimmten Kohlenstoffquelle innerhalb 7tägiger Inkubation bei 37°C kein sichtbares Wachstum des Testorganismus erfolgt Positive Ergebnisse bedeuten, daß ein deutliches, sichtbares Wachstum des Organismus innerhalb von 7 Tagen erfolgt, und daß das Wachstum wiederum beim Verfolgen der Subkultur in diesem bestimmten Medium erfolgt

Im Falle der Stämme von Pseudomonas methyltropha kann eine Anpassungsperiode über etliche Subkulturen zum Wachstum auf verschiedenen anderen Kohlenstoffquellen führen, die nachstehend für diese Stämme beschriebenen Ergebnisse beziehen sich auf Tests, die ohne eine vorherige Anpassung, wie sie vorstehend erwähnt wurde, durchgeführt wurden.

Die getesteten Kohlenstoffquellen sind Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Formiat, Acetat, Propionat. Butyrat, Pyruvat, Oxalat, Succinat, Glutarat, Adipat, Methylamin, Dimethylamin. Äthylamin. Saccharose. Lactose, Glucose, Mannose, Mannit, Ribose, Ribit, Xylose, Fructose, Naphthalin, Phenol, Benzoat, Hexan, Hexadecan. Aspartet, Alanin, Glycin, Glutamat, Arginin und Serin.

3. Aridere Tests

Die für die folgenden Tests angewandten Methoden werden beschrieben in »Abstracts of Microbiological Methods« von V.B.D. Sherman, veröffentlicht von Wiley-Interscience, New York, 1969.

i Oxidasetests — Methode von Kovacs.

ii Katalasetest — wie beschrieben in »Manual of Microbiological Methods«, veröffentlicht für Soc. of American Bacteriologists von McGraw-Hill, 1957.

iii Nitratreduktionstest — dieser wird in dem vorstehend beschriebenen Methanol-Mineralsalz-Medium durchgeführt, jedoch wird Natriumnitrat (0,5 g/l) anstelle von Ammoniumsulfat als Stickstoffqulle verwendet Mit diesem Unterschied wird die Methode in Society of American Bacteriologists Manual of Microbiological Methods beschrieben.

iv GeUtinehydrolyse — es wird die Modifizierung von Manuroy der Methode von Frazier angewandt.

ν Test nach Hugh & Liefson — es wird die Originalmethode von Hugh & Liefson angewandt.

xi Lipaseproduktion — Hydrolyse von Tween 80 unter Verwendung der Methode von Sierra.

xii Lecithinaseproduktion — es wird die Methode von

Knight & Proom angewandt.

xiii Ureaseproduktion — es wird die Methode von Koser angewandt bestätigt durch die Methode von Monteverde und Mitarbeitern unter Verwendung des Buenos-Aires-modifizierten Mediums, wie in »The Oxoid Manual« (3. Ausgabe), 1971, veröffentlicht von Oxoid Ltd., Southwark Bridge Road, London, SEI, beschrieben, xiv Schwefelwasserproduktion — es wird die Methode von Monteverde und Mitarbeitern angewandt, wie sie in »The Oxoid Manual« (3. Ausgabe) beschrieben wird.

xv Citratausnutzung — es wird die Methode von Koser angewandt.

Man erhielt folgende Ergebnisse: A. Pseudomonas methyltropha Die allgemeinen Eigenschaften dieser Art sind:

1. Mikroskopische Morphologie (beim Wachsen auf Methanol-Mineralsalz-Agarplatten oder in Metanol-Mineralsalz-Medium): Gestalt — gerade Stäbchen; Länge — 0,8 bis 1,5 μΐη; Breite — 0,3 bis 0,5 μπί; Aggregate — Zellen treten einzeln und' in Paaren auf; Beweglichkeit — wenn vorhanden durch polare Geißeln; Gramfärbung — gramnegativ, ebenmäßige Färbung, jedoch wird Färbung oft nicht gut aufgenommen; intracellulare Ablagerungsprodukte — Poly-jJ-hydroxybutyrat wird nicht erzeugt; Endosporen — nicht erzeugt; Kapseln — nicht erzeugt; extracellular Schleim — Bildung geringer Mengen.

2. Kolonienmorphologie

a) auf iviethanoi-fviineralsaiz-Agarpiaiien. 2 Tage bei 37° C inkubiert Gestalt — kreisförmig; Größe — 1—2 mm Durchmesser; Erhebung — konvex; Oberfläche — glatt; Kante — vollständig; Gefüge — granulös; Dichte — dicht; Pigment — grau-weiß; Konsistenz — butterähnlich; Emulgierbarkeit. — im allgemeinen schwierig zu emulgieren.

b) auf Nähragar (2 Tage bei 37°C) - Wachstum ist im allgemeinen sehr schwach, nur sichtbar als transparenter Schleier oder als winzige, nadelspitzartige Kolonien mit einem Durchmesser von weniger als 0,5 mm.

3. Physiologische und biochemische Tests

a) Wachstum in Nährmedium — kein Wachstum oder sehr mangelhaftes Wachstum, hauptsächlich an der Oberfläche.

b) Gelatinestich — weder Wachstum noch Verflüssigung.

c) Reduktion von Nitraten — Niirate zu Nitriten reduziert

d) Beziehung zu Sauerstoff — aerob.

e) Indolproduktion — schwach positiv, schwache Indolproduktion.

Temperaturbeziehungen — kein Wachstum

bei 4°C oder 42°C, gutes Wachstum bei 30⁰C

und 37° C g) Stoffwechsel von Kohlenhydraten (Test nach

Hugh & Liefson) — oxidierter Stoffwechsel,

wenn Wachstum erfolgt h) Lipaseproduktion (Hydrolyse von Tween 80)

— negativ, i) Lecithinaseproduktion (Eidotterreaktion) —

negativ, j) Ureaseproduktion — variabel, gewöhnlich positiv.

k) Schwefelwasserstoffproduktion — negativ. 1) Citratausnutzung (Citrattest nach Koser) — negativ.

m) Methylrottest — negativ, n) Test nach Voges-Proskauer — negativ, o) Wachstum in Lackmus-Milch — mangelhaft,

gerir.ge Säureproduktion, p) Fluoresceinproduktion (Kings-Medium A) — nicht erze·, gt.

q) Pyocyaninproduktion (Kings-Medium B) — nicht erzeugt

<·) Antibiotische Empfindlichkeit — empfindlich gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin und Tetracyclin, beständig gegenüber Peni

cillin, Novobiocin und Oleandomycin, veränderliche Empfindlichkeit gegenüber Erythromycin und Sulfafurazol.

s) Wachstum auf Blutagar — geringes Wachsturn, keine Haemolyse.

t) Oxidatetest (nach Kovacs) — positiv.

Stoffwechsel von Kohlenstoffquellen. Die Kohlenstoffqueilen, die von den einzelnen Stämmen ausgenutzt werden, variieren in gewissem Ausmaß. Im vorliegen-

den Fall besitzen die meisten Stämme ein sehr eingeschränktes Ernährungsspektrum und wachsen auf vielen Kohlenstoffquellen nicht gut Methanol und Fructose werden jedoch von aiien Stämmen, auf die in dieser Beschreibung speziell Bezug genommen wird, aus-

genutzt Nach einer Anpassunpsperiode über einige Subkulturen können andere Kuiilenstoffquellen angewandt werden.

Die Stämme mit den NCIB-Nummern 10508—15 und 10592—96, sind einander ähnlich und sind Stimme der

gleichen Art Denn die allgemeinen Eigenschaften dieser Stämme sind die gleichen wie diejenigen, die vorstehend für die Art beschrieben wurden, mit den folgenden unterscheidenden Merkmalen:

Stamm WKM-3 (NCIB 10508)

Quelle — Ästuarschlick. Es werden ausgenutzt Acetat Butyrat Propionat Pyruvat Succinat und Adipat als alleinige Quellen von Kohlenstoff und Energie. Katalase negativ, beständig gegen Ery-

J5 thromyciR, empfindlich gegen SulfafurazoL Stamm WKM-I (NCIB 10509)

Quelle — Ästuarschlick. Es werden ausgenutzt Acetat Butyrat Propionat Pyruvat, Succinat, Glutarat und Adipat als alleinige Kohlenstoff/ Energie-Quelle. Urease wird nicht erzeugt Katalase negativ, beständig gegen Erythromycin und Sulfafurazol.

Stamm SA (NCIB 10510)

Quelle — Abwasserschlamm. Beständig gegen Erythromycin und Sulfafurazol. Katalase positiv.

Stamm SB (NClB 10511)

Quelle — Abwasserschlamm. Katalase positiv, empfindlich gegen Erythromycin und Sulfafurazol.

Stamm SD (NCIB 10512)

Quelle — Abwasserschlamm. Kataiasc positiv. Beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

,. Suimm SE (NCIB 10513)

Quelle — Abwasserschlamm. Katalase positiv, empfindiicii gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm SF (NClB 10514)

Quelle — Abwasserschlamm. Katalase positiv, Urease rjgativ, empfindlich gegen Sulfafurazol, beständig gegen Erythromycin.

Stamm ASt (NCIB 10515)

Quelle — Aktivschlamm. Katalase positiv, empfindlich gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm MP4 (ΝΓ.ΙΒ 10592)

Quelle — Wasserstaubecken. Katalase positiv, beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm FI6/I (NCiB 10593)

Quelle — Teichschlamm. Katalase positiv, beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm FI6/2 (NCIB 10594)

Quelle — Teichwasser. Katalase positiv, beständig ' gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Stamm MPI/Sh/37/l (NCIB 10595)

Quelle — Wasserstaubecken. Katalase negativ, beständig gegen Sulfafurazol und Erythromycin. in

Stamm 28/D/37 (NCIB 10596)

Quelle — Flußwasser. Katalase positiv. Urease negativ, empfindlich gegen Sulfafurazol und Erythromycin.

Ähnliche Stämme wie die vorstehend beschriebenen können aus mannigfachen unterschiedlichen natürlichen Quellen isoliert werden, zu denen Erdboden, fau-

Unrle Voi»lg>;_nn T>;/-It,,.nr.»_r ..~A Cl..11... i-~

.-·· — - · «._e*..»«..v,., . ww, ». U.1.J«.! UMU ι iuunaJJV.1 gttidren. Zu geeigneten Isolierungstechniken für das Gewin- >o nen solcher Stämme zählen das Ausstreifen der Probe auf Methanol-Mineralsalz-Agarplatten und das Abnehmen geeigneter Kolonien zur weiteren Reinigung oder die statische Anreicherung oder Schüttelanreicherung in flüssiger Kultur (mit oder ohne laufende Subkulturen) > > im Methanol-Mineralsalz-Medium. Das Isolieren kann bei Temperaturen von 25° bis 45^CC durchgeführt werden, wird jedoch vorzugsweise bei 37°C und bei pH-Werten von 5.5 bis 8.0. vorzugsweise von 6,5 bis 7.2. durchgeführt.

Identität der Stämme mit den NCIB-Nummern
10508-15 und 10592-96

Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme verweisen sie gemäß Bergey's Manual of Determinative 1-, Bacteriology (7. Ausgabe). Herausgeber Breed. Murray & Smith, veröffentlicht von Williams & Wiikins, Baltimore 1957. in die Gattung Pseudomonas.

Wenn man dem Leitweg zu den Arten dieser Gattung folgt, findet man in Bergey's Manual keine Art. die die vorstehend beschriebenen Eigenschaften aufweist, in der Literatur findet man keine Bezugnahme auf Bakterien mit ähnlichen Eigenschaften.

Daraus wurde geschlossen, daß diese Stämme einer bisher unbekannten Art angehören, da die Unter- 4-, schiede zwischen diesen Stämmen hinreichend gering sind, um sie als Stämme der gleichen Art zu betrachten (ähnliche Variation zwischen Stämmen einer gegebenen Art findet man bei Arten der Gattung Pseudomonas wie von R. T. Stanier. N. V. Palleroni & M. Dondoroff in »The aerobic pseudomonas: a toxanomic study«. Journal of General Microbiology 1966. Band 43, Seite 159, gezeigt wird). Die neue Art wird in dieser Beschreibung als Pseudomonas methylotropha bezeichnet

B. Microcyclus polymorphum

Die allgemeinen Eigenschaften dieser neuen Art, beschrieben am Beispiel von Microcyclus polymorphum. Stamm Pl a5 (NCIB-Nr. 10516) sind wie folgt:

Dieser Mikroorganismus ist in seinen mikrobiologisehen Eigenschaften sehr verschieden von Pseudomonas methylotropha und von den in der Literatur bekannten, methanolausnutzenden Bakterien.

1. Mikroskopische Morphologie:

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a) Meihanoi-Mineraisaiz-Hefeextrakt-Agarpiatten nach 3 Tagen Inkubation bei 37⁼C: Schmale, stark gekrümmte, gramnegative Stäbchen.

die sich während des Wachstums an den Enden vereinigen und geschlossene Ringe von etwa 1,5 μπι Durchmesser bilden. Die Breite der Stäbchen beträgt etwa 0,3 bis 0.5 μπι. Es sind auch hufeisenförmige Gestaltungen, die sich an den Enden nicht vereinigt haben, und gekrümmte Stäbchen sichtbar. Nicht beweglich, keine sichtbaren Speichergranula, keine Sporenbildung, keine Bildung von Kapseln oder merklichen Mengen von Schleim,
b) Nähragar - 3 Tage Inkubation bei 37" C: gramnegative Stäbchen, etwas größer als im Falle ihres Wachstums auf Methanol-Mineralsalz-Hefeextrakt-Agar. Die Stäbchen sind gerade oder gekrümmt, treten einzeln auf und scheinen im allgemeinen keine geschlossenen Ringe oder Hufeisenformen zu bilden.

2. Kolonienmorphologie:

a) auf Methanol-Mineralsalz-Agar und Hefeextraktplatten, 2 Tage bei 37"C inkubiert. Gestalt — kreisförmig; Größe — weniger als 1 mm Durchmesser; Erhebung — konvex: Oberfläche — glatt; Kante — vollständig: Dichte — durchscheinend; Farbe — kremfarbig; Konsistenz — butterähnlich: Emulgierbarkeit — leicht emulgierbar.

b) tJ Nähragarplatten, 2 Tage bei 37°C inkubiert. Gestalt — kreisförmig; Größe — I bis 3 mm Durchmesser; Erhebung — konvex; Oberfläche — glatt; Kanten — vollkommen: Dichte — dicht; Pigment — kremfarbig bis braun, nicht wasserlöslich; Konsistenz — butterähnlich; Emulgierbarkeit — schwierig zu emulgieren.

3. Physiologische und biochemische Eigenschaften:

a) Wachstum in Nährbrühe — Wachstum ziemlich homogen mit etwas Sediment, jedoch kein Häutchen.

b) Gelatinestich — Wachstum, jedoch keine Verflüssigung.

c) Reduktion von Nitraten — Nitrate zu Nitriten reduziert.

d) Indolproduktion — Indol wird erzeugt (schwach positiv).

e) Temperaturbeziehungen — kein Wachstum bei 4°C oder 42°C. Optimale Temperatur 37⁰C

Beziehung zu Sauerstoff — aerob bis gelegentlich aerob.

g) Stoffwechsel von Kohlenhydraten (Test nach Hugh & Liefson) — oxidativ mit etwas erzeugter Säure.

h) Stoffwechsel von verschiedenen Kohlenstoffquellen — von den getesteten werden die folgenden Kohlenstoffquellen von diesem Stamm ausgenutzt: Methanol, Äthanol, Propanol, Acetat, Pyruvat, Oxalat. Succinat, GIutarat. Sucrose, Lactose, Glucose, Mannit, Ribose, Ribit Xylose. Fructose, Hexan, Hexadecan, Serin.

i) Lipasproduktion (Hydrolyse von Tween 80) — negativ.

j) Lecithinaseproduktion (Eidotterreaktion) — negativ.

k) Ureaseproduktion — negativ.
1) Schwefelwasserstoffproduktion — negativ.

ι >

2(1

m) CitratausnutzuFig (Citrattest nach Koser) — negativ.

η) Methylrottest — negativ,
ο) Test mch Voges Proskauer — negativ,
p) Wachstum in Lackmusmilch — Wachsen.

etwas Alkali erzeugt,
q) Fluorescinproduktion (Kings-Medium A) —

nicht erzeugt,
τ) Pyocyaninproduktion (Kings-Medium B) —

nicht erzeugt,
s) Antibiotische Empfindlichkeit — empfindlich gegen Chloramphenicol, Stroptomycin und Tetracyclin, bestandig gegen Penicillin, Erythromycin, Sulfafurazol, Novobiocin und

Oleandomycin.
t) Wachstum auf Blutagar — Wachstum, jedoch keine Haemolyse.

u) Oxidasetest nach Kovacs — positiv,
v) Katalasetest — positiv.

4. Quelle - Flußschlick

Identität des Stammes Pia 5 (NCIB 10516)

Aus den mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stammes ergibt sich, daß er der Gattung Microcyclus gemäß Bergey's Manual of Derteminative Bacteriology angehört. Nur eine Art dieser Gattung wird in Bergey's Manual beschrieben, und der Stamm NCIB 10516 unterscheidet sich insofern von dieser Art, daß NCIB 10516 kleiner ist, bei 37°C gut wächst, und einen Wachstumsfaktor erfordert. In der Literatur findet sich keine Bezugnahme auf eine Art der Gattung Microcyclus, die die gleichen Eigenschaften besitzt wie der Stamm NCIB 10516. Daraus wird geschlossen, daß dieser Stamm einer bisher nicht bekannten Art angehört.

C. Hyphomicrobium variabile

Die allgemeinen Eigenschaften dieser neuen Art, beschrieben am Beispiel von Hyphomicrobium variabile, Stamm S/30/4 (NCIB-Nr. 10517) sind v/ie folgt:

Dieser Mikroorganismus unterscheidet sich beträchtlich von den vorstehend beschriebenen Stämmen und von Bakterien, die in der Literatur dafür bekannt sind, daß sie Methanol als Kohlenstoffquelle ausnutzen.

1. Mikroskopische Morphologie (7 Tage Wachstum bei 30⁰C auf Methanol-Mineralsalz-Agar-PIatten):

gramunterschiedliche, kurze, kräftige Stäbchen mit spitzen Enden. Breite: 0,6 bis 1,0 μπι, Länge: 1,0 bis 1,5 μιτι. Jeder Mikroorganismus kann 1 Granulum (oder gelegentlich mehrere) Poly-0-hydroxybutyrat enthalten. Die Stäbchen erzeugen schmale Fäden von 0,2 bis 0,3 μιτι Breite, die in der Länge variieren, an deren Ende sich jedoch eine Tochterzelle entwickelt, die sich gelegentlich unter Bildung einer getrennten Einheit abspaltet.

2. Kolonienmorphoiogie (7 Tage Wachstum bei 30⁰C auf Methanol-Mineralsalz-Agar-Platten):

kleine Kolonien (1 bis 2 mm Durchmesser) mit to kreisförmiger Gestalt und einem vollkommenen Rand, konvex, glatt, opak, kremfarbig.

3. Physiologie:

a) Beziehung zu Sauerstoff: aerob.

b) Temperaturbeziehungen: optimale Temperatur 30⁰C, wächst bei 37⁰C Kein Wachstum bei 4° C oder 42° C.

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c) Wachstum in Nährbrühe — Wachstum homogen, kein Häutchen oder Sediment.

d) Gelatinestich — Wachstum, jedoch keine Verflüssigung.

e) Reduktion von Nitraten — Nitrate nicht zu Nitriten reduziert.

f) Indolproduktion — Indol nicht erzeugt.

g) Stoffwechsel von Kohlenhydraten (Test nach Hugh & Liefson) — oxidativ mit erzeugter Säure.

h) Stoffwechsel von verschiedenen Kohlenstoffquellen .— die folgenden Kohlenstoffquellen (von den getesteten) werden ausgenutzt: Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Formiat, Acetat, Propionat, Butyrat, Pyruvat, Oxalat, Succinat, Glutarat, Adipat, Sucrose, Lactose, Mannose, Mannit, Ribose, Ribit, Xylose, Fructose, Naphthalin, Benzoat, Hexadecan.

i) Lipaseproduktion (Hydrolyse von Tween 80) — negativ.

j) Lecithinaseproduktion (Eidotterreaktion) — negativ.

k) Ureaseproduktion — positiv.

I) Schwefelwasserstoffproduktion — negativ,
m) Citratausnutzung (Citrattest nach Koser) — negativ.

n) Methylrottest — negativ.

o) Test nach Voges-Proskauer — negativ.

p) Wachstum in Lackmusmilch — Wachstum, alkalische Reaktion, etwas klumpenbildend.

q) Fluoresceinproduktion (Kings-Medium A) — Fluorescein nicht erzeugt.

r) Pyocyaninproduktion (Kings-Medium B) — Pyocyanin rieht erzeugt.

s) Antibiotische Empfindlichkeit — empfindlich gegen Penicillin, Chloramphenicol, Oleandomycin, Streptomycin, Tetracyclin.

t) Wachstum auf Blutagar — Wachstum, jedoch keine Haemolyse.

u) Oxidasetest nach Kovacs — positiv.

v) Katalasetest — positiv.

4. Quelle — faulendes Silofutter
Identität des Stammes NCIB 10517

Dieser Organismus kann leicht als ein Angehöriger der Gattung Hyphomicrobium identifiziert werden, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology beschrieben wird, doch hinsichtlich des Größenunterschieds, der variierenden Reaktion gegenüber der Gramfärbung und anderer vorstehend aufgeführter Eigenschaften unterscheidet sich dieser Stamm von der einen Art, die in Bergey's Manual beschrieben wird. In der Literatur findet man keine Bezugnahme auf eine Art von Hyphomicrobium, die die gleichen Eigenschaften wie NCIB 10517 besitzt. Darajs wird geschlossen, daß der Stamm NCIB 10517 einer bisher nicht bekannten Art angehört.

D. Pseudomonas rosea
Die allgemeinen Eigenschaften dieser Art sind:

1. Mikroskopische Morphologie (von Zellen, die in MeOH-Mineralsalz-Medium gewachsen sind):

Große, gramnegalive, gerade oder leicht gekrümmte, 2—3 μπι lang und 1 μπι breii, die einzeln auftreten. Die Stäbchen sind durch polare Geißeln beweglich. PoIy-^-hydroxybutyrat wird erzeugt

und intraceliular gelagert unter Bildung eines oder mehrerer gesonderter Speichergranula. Sporen, Schleim und Kapseln sind nicht ersichtlich.

2. Kolonienmorphologie:

a) auf Methanc'-Mineralsalz-Agarplatten, 2 Tage bei 37°C inkubiert. Kreisförmige Kolonien mit konvexer Erhebung. Durchmesser 1 bis 2 mm. Kante vollständig, Oberfläche glatt. Die Kolonien werden leicht emulgiert, und ihre Konsistenz ist butterähnlich. Es wird ein lachsfarbenrosa bis rotes, wasserunlösliches Pigment erzeugt.

b) auf Nähragarplatten, 2 Tage bei 37°C inkubiert. Die Kolonienmorphologie ist die gleiche wie diejenige, die für das Wachstum auf Methanol-Mineralsalz-Agar beschrieben wurde, jedoch sind die Nähragarkolonien gewöhnlich p|U/9G H*»inf*r öle /ilA Molhonnl. Minoralcn It

Agar-Kolonien.

3. Physiologie:

a) Wachstum in Nährbrühe (nach 3 Tagen Inkubation bei 37°C): hauptsächlich am Boden des Rohres.

b) Gelatinehydrolyse: Gelatine wird in 7 Tagen nicht hydrolysiert.

c) Nitratreduktion: Nitrate werden im allgemeinen nicht zu Nitrit reduziert, obgleich Mitrat eine annehmbare Stickstoffquelle bildet.

d) Indolproduktion: Indol wird nicht erzeugt.

e) Temperaturbeziehungen: Optimaltemperatur 37° C, bei 4° C in 7 Tagen kein Wachstum ersichtlich, in 7 Tagen bei 42°C Wachstum.

Q Test nach Hugh & Leifson (Glucose als Kohlenstoffquelle) — Wachstum oxidativ mit etwas erzeugtem Alkali.

g) Oxidasetest — Oxidase negativ.

h) Katalasetest — Katalase positiv.

i) Methylrottest — negativ.

j) Tesi nach Voges—Proskauer — negativ.

k) Lackmusmilch — Vichstum, jedoch keine Erzeugung von Säure oder Alkali.

I) Produktion von Fluorescein und Pyocyanin in Kings-Medium (A und B) — Wachstum, jedoch kein Pigment erzeugt,
m) Antibiotische Empfindlichkeit (unter Anwendung von »Oxid«, Markierung »Multodisks«)

— beständig gegen Penicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Sulfafurazol, Novobiocin und Oleandomycin; empfindlich gegen Streptomycin und Tetracyclin.

n) Wachstum auf Blutagar — Wachstum, jedoch

keine Haemolyse.
o) Lipaseproduktion (Hydrolyse von Tween 80)

— negativ.

p) Lecithinaseproduktion — unterschiedliche Reaktion.

q) Ureaseproduktion — unterschiedliche Reaktion.

r) Schwefelwasserstoffproduktion — negativ.

s) Citratausnutzung — unterschiedliche Reaktion.

Stoffwechsel von Kohlenstoffqueüen

Zwischen den einzelnen Stämmen tritt eine gewisse Variation auf, doch im allgemeinen werden die folgen

den Verbindungen als alleinige Kohlenstoff/Energie-Quellen ausgenutzt:

Methanol, Äthanol, Propanol, Formiat, Acetat, Pyruvat, Succinat, Glucose, Fructose, Arginin und Serin.

Die folgenden Verbindungen werden im allgemeinen nicht als alleinige Kohlenstoff'/Energie-Quellen ausgenutzt:

Butanol, Propionat, Butyrat, Adipat, Methylamin, Dimethylamin, Äthylamin, Lactose, Mannit, Ribit, Xylose, Naphthalin, Phenol, Benzoat, Hexan. Aspartat, Alanin und Glycin.

Die Stämme mit den NCIB-Nummern 10597-10612 sind einander ähnlich und sind Stämme der gleichen Art. Denn die allgemeinen Eigenschaften dieser Stämme sind die gleichen wie diejenigen, die vorstehend für die Art beschrieben wurden, jedoch rnu den folgenden unterscheidenden Merkmalen:
Stamm MA2/3 (NCIB 10597)

Wächst langsam bei 4°C, ist empfindlich gegenüber Novobiocin, jedoch nicht gegen Streptomycin; Formiat, Oxalat, Mannose oder Ribose werden nicht ausgenutzt, jedoch werden Glutarat, Citrat.

Sucrose und Glutamat ausgenutzt. Quelle: Schlick von Fabrikplätzen, Lecithinase positiv, Urease positiv.

Stamm BDD/3 (NCIB 10598)

ⁱ⁽⁾ Wächst langsam bei 4°C, ist empfindlich gegen Sulfafurazol und Novobiocin, jedoch nicht gegen Streptomycin oder Tetracyclin. Citrat oder Pyruvat werden nicht ausgenutzt, jedoch werden Butanol, Oxalat, Glutarat Sucrose, Mannose, Ribose, Alanin, Glycin und Glutamat ausgenutzt. Urease positiv, Lecithinase negativ, Quelle: Hühnerdung.

Stamm MA3D/1 (NCIB 10599)

Oxalat, Glutarat Sucrose, Mannose, Ribose und Glutamat werden ausgenutzt Lecithinase positiv. Urease positiv. Quelle: Schlick von Fabrikpl?*zen. Citrat wird nicht ausgenutzt.

Stamm MW4/4 (NCIB 10600)

Wächst langsam bei 4°C und nutzt Oxalat, Glutarat Sucrose, Mannose, Ribose, Alanin, Glycin und Glutamat aus. Lecithinase positiv, Urease positiv, Citrat wird nicht ausgenutzt. Quelle: Sumpfwasser.

Stamm MP1D/2 (NCIB 10601)

Wächst langsam bei 4° C und ist empfindlich gegen Erythromycin. Pyruvat wird nicht ausgenutzt jedoch werden Oxalat Citrat Glutarat Sucrose, Mannose, Ribose, Xylose, Alanin und Glutamat ausgenutzt Lecithinase negativ. Urease positiv: Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm MP3D/2 (NCIB 10602)

Beständig gegen Tetracyclin; Citrat Oxalat Glutarat Sucrose, Mannose oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch wird Ribose ausgenutzt Lecithinase positiv. Urease negativ. Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm MP1/2 (NCIB 10603)

Empfindlich gegen Streptomycin; Propanol, Format Oxalat Glutarat Sucrose, Mannose, Ribose, Glutamat oder Arginin werden nicht ausgenutzt Lecithinase negativ, Urease positiv; Citrat wird ausgenutzt Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm MA2/2 (NCIB 10604)

Propanol, Formiat, Oxalat, Glutarat, Sucrose, Mannose, Ribose, Glutamat oder Arginin weiden nicht ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ; Citrat wird ausgenutzt. Q'ielie: Fabrikplatzschlick.

Stamm 20/D(NClB 10605)

Empfindlich gegen Novobiocin; Propanol, Oxalat, Glutarai, Mannose oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch werden Sucrose, Citrat und Ribose, ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ. Quelle: faulende Pflanzen.

Stamm MAI/5 (NCIB 10606)

Empfindlich gegen Erythromycin; Oxalat, Glutarai, Sucrose, Mannose, Ribose, Arginin oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat und Glutamat ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease negativ. Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm MA3D/3 (NCIB 10607)

Empfindlich gegen Penicillin und Chloramphenicol·. Butanol, Propanol, Formiat, Oxalat, Glutarat. Sucrose, Mannose, Glutamat, Arginin oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat und Ribose ausgenutzt. Lecithinase positiv. Urease positiv. Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm BDD/2 (NCIB 10608)

Empfindlich gegen Novobiocin; Glutarat, Mannose oder Serin werden nicht ausgenutzt, doch werden Oxalat, Sucrose, Citrat, Ribose, Alanin und Glutamat ausgenutzt. Lecithinase negativ. Urease positiv. Quelle: Hühnerdung.

Stamm MPl (NCIB 10609)

Dieser Stamm nutzt Acetat, Glutarat, Glutamat, Arginin oder Serin nicht aus, doch werden Oxalat, Citrat, Mannose, Mannit, Sucrose, Ribit, Ribose und Xylose ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ. Quelle: Fabrikplatzschlick.

Stamm ChD (NCIB 10610)

Empfindlich gegen Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin und Oleandomycin. Formiat, Glutarat, Glutamat, Arginin oder Serin werden

211

SO nicht ausgenutzt, doch werden Citrat, Oxalat, Sucrose, Mannose, Mannit, Ribose, Ribit und Xylose ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ. Quelle: Hühnerdung.

Stamm WS(NCIB 10611)

Empfindlich gegen Novobiocin; Oxalat, Glutarat, Arginin, Serin oder Glutcmat werden nicht ausgenutzt, doch werden Citrat, Sucrose, Mannose, Mannit, Ribose, Ribit und Xylose ausgenu^i. Lecithinase positiv, Urease positiv. Quelle: Waldboden.

Stamm MP3 (NCIB 10612)

Empfindlich gegen Novobiocin; Äthanol, GlutPrat, Sucrose, Mannose, Ribose, Arginin, Serin oder Glutamat werden nicht ausgenutzt, doch werden Oxalat, Citrat, Mannit und Xylose ausgenutzt. Lecithinase negativ, Urease negativ. Quelle: Fabrik platzschlick.

Identität der Stämme mit den NCIB-Nummerri 10597-10612

Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme verweisen diese gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology in die Gattung Pseudomonas. Wenn man dem Leitweg zu den Arten dieser Gattung folgt, so findet man in Bergey's Manual keine Art, die die vorstehend beschriebenen Eigenschaften besitzt. Ähnliche Arten sind Pseudomonas (Vibrio) extorquens und Protaminobacter ruber. Bestimmte andere rosa pigmentierte, methanolausnutzende Bakterien sind in der mikrobiologischen Literatur beschrieben worden, hauptsächlich Pseudomonas sp, Stamm AMI (Peel & Quayle, 1961, Biochem. J., 81, 465). Von Fachleuten wird allgemein angenommen, daß Pseudomonas extorquens, Protaminobacter ruber, Pseudomonas sp Stamm AMl und andere ähnliche bekannte Stämme rosa pigmenterter, methanolausnutzender Bakterien in Wirklichkeit unterschiedliche Stämme der gleichen Art sind (Stocks & McCleskey, 1964, J. Bacteriol. 88, 1065).

Die Stämme NCIB 10597—10612 unterscheiden sich charakteristisch von diesen bekannten Stämmen auf der Basis der folgenden Merkmale:

Bekannte Pseudomonas extorquens-Stämme

Stämme NCIB 10597-10612

Oxidasetest
Wachstum bei 42⁰C
Optimale Temperatur
Wachstum auf Methylamin
Wachstum auf Lactose
Wachstum auf Naphthalin
Koloniegröße auf Methanol
Salzagar (48 Stunden Wachstum)
Pigment

schwach positiv

kein Wachstum

30⁰C

Wachstum

Wachstum

Wachstum < 1 mm Durchmesser
tief rosa bis rot

negativ

Wachstum

37°C

kein Wachstum

kein Wachstum

kein Wachstum

1 —2 mm Durchmesser lachsfarben bis tief rosenrosa

Daher wird geschlossen, daß die Stämme 10597 bis 10612 einer bisher unbekannten Art angehören. Die Unterschiede zwischen diesen Stämmen sind hinreichend gering, um sie als Stämme der gleichen Art zu betrachten (ähnliche Variationen zwischen Stämmen einer gegebenen Art findet man bei anderen Arten der Gattung Pseudomonas, wie durch die vorstehend erwähnte Arbeit von Stanier und Mitarbeitern gezeigt wird).

In dieser Beschreibung wird die neue Art als Pseudomonas rosea bezeichnet

Es ist zu berücksichtigen, daß andere Stämme mit den allgemeinen Eigenschaften der vier neuen, vorstehend beschriebenen Arten, die iedoch leicht unterschiedliche

Eigenschaften von den beschriebenen Stämmen aufweisen mögen, aus natürlichen Quellen isoliert werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann als ansatzmäßiges Kuiturverfahren, als einstufiges kontinuier- Iiches Kulturverfahren oder als mehrstufiges kontinuierliches Kulturverfahren durchgeführt werden. Das Verfahrensprodukt ist eine Proteinmasse, die zusammen mit anderen Fermentationsprodukten, beispielsweise Aminosäuren, organischen Säuren, Nucleotiden oder ι ο deren Derivaten, bakterielle Zellen aufweist

Das als Kohlenstoffquelle für das erfindungsgemäße Verfahren dienende Methanol kann als Rohprodukt eines Methanolsyntheseverfahrens zugeführt werden.

Das Kulturmedium enthält Methanol, vorzugsweise in Mengen zwischen 0,05 und 10 Gew.-%, insbesondere zwischen 0,! und 7,5 Gew.-%.

Das Kulturmedium enthält eine stickstoffhaltige Verbindung, geeigneterweise Ammoniak, Harnstoff, ein Ammoniumsalz, beispielsweise (NHc)₂SO₄ oder ein Nitrat, beispielsweise KNQ₃, vorzugsweise Ammoniak oder ein Ammoniumsalz. Vorzugsweise liegt die stickstoffhaltige Verbindung im Medium in Mengen entsprechend 0,001 Gew.-% bis 3 Gew.-%, insbesondere 0,01 bis 1 Gew.-%, elementaren Stickstoffs vor. Zusatzlieh zu der stickstoffhaltigen Verbindung enthält das Medium auch anorganische Quellen von Elementen wie Kalium, Phosphor, Schwefel und Magnesium. Diese Elemente können in das Medium eingemischt werden, indem man Verbindungen wie beispielsweise Kalium- jo chlorid. Magnesiumsulfat Kaliuniphosphate und Phosphorsäure hinzusetzt

Die anorganischen Verbindungen, die diese Elemente enthalten, werden dem Medium vorzugsweise in Mengen zugesetzt, die ausreichen, um die folgenden J3 lonenhonzentrationen (Gew.-%) hervorzurufen:

K+ O₁O^-. bis 0,25

Mg²⁺ 0,001 bis 0,1

PO4³- 0,01 bis 03

SO4²- 0,01 bis 0,25

Das Kulturmedium kann auch Spurenmengen von ionen anderer metallischer Elemente wie beispielsweise Calcium, Kupfer, Eisen, Kobalt oder Mangan (die dem Medium als Salze wie Chloride oder Sulfate zugesetzt werden können) und besonders Natrium enthalten, das beispielsweise als Chlorid, Sulfat oder Phosphat zugesetzt werden kann, und zwar vorzugsweise in einer Menge, die zu einer Ionenkonzentration von 0,002 bis 0,06 Gew.-% führt Das Kulturmedium kann auch geringere Mengen von organischen Nährstoffen enthalten wie beispielsweise Hefeextrakt, Maiseinweichlauge, Pepton, Vitamin, Aminosäuren oder Baumwollsamenmehl.

Ein geeignetes Kulturmedium (nachstehend als Medium I bezeichnet) hat die folgende Zusammensetzung:

M)

CH3OH	20,0 g/l
H3PO4	0,0165 molar
(NH.fcSO.	9.0 g/l
MgSOi · 7 H2O	1.05 g/l
FeSO1 · 7 H2O	5.0 mg/l
CuSO1 5 H2O	0.1 mg/l
H3BOj	0,07 mg/l
MnSO4 4 H2O	0.5 mg/l
ZnSO1 · 7 H2O	0.5 mg/l
Na3MoO1	0.1 mg/l

CaCI₂ · 2 H₂O CoCl₂ · 6 H₂O Wasser

13,24 rng/l

Qi₁I m,g/l

ad 1 Liter

In diesem Medium wird der pH-Wert für das Wachstum eingestellt, indem man ein 1 :1-Gemisch von 4 η KOH/4 η NaOH hinziisetet

Bei kontinuierlichen Kuiturverfahren, kam: das Medium, in das ein Organismus eingeimpft wird, so zusammengesetzt sein, daß die elementaren Nährstoffe beispielsweise Stickstoff, Phosphor, Magnesium oder Eisen oder die Kohlenstoffquelle, in bezug auf die anderen Bestandteile des Mediums in solchen Mengen vorliegen, daß sie das Wachstum beschränken. Von dieser Tatsache kann zum Regulieren des Wachstums einer Kultur Gebrauch gemacht werden.

Zum Anlaufenlassen eines kontinuierlichen Kulturprozesses, wird eine Impfmenge des zu verwendenden Organismus bzw. der zu verwendenden Organismen zu einem Medium hinzugegeben, das die Kohlenstoffquelle und andere Nährstoffe enthält. Man laut die Kultur als Ansatzkultur wachsen und überführt sie zu im wesentlichen kontinuierlichen Kulturbedingungen, indem man beginnt, das Medium in eine Fermentiervorrichtung einzuführen. Während der Fermentierung verläßt das Medium kontinuierlich die Fermentiervorrichtung mit einer Geschwindigkeit, die derjenigen ähnlich ist, mit der frisches Medium eintritt. Die Konzentration des wachstumsbeschränkenden Nährstoffs wird stufenweise gesteigert, bis sich die Kultur in einem stationären Zustand befindet und das Medium, das in die Fermentiervorrichtung eintritt die gewünschte Zusammensetzung für den Fermentierungsprozeß besitzt.

Der begrenzende Nährstoff kann die Stickstoff- oder Phosphorquelle, oder, vorzugsweise, die Kohlenstoffquelle sein und kann auch zwischen zwei oder allen drei Vertretern dieser Nährstoffe hin- und herschwanken.

Vorzugsweise wird der pH-Wert des Mediums, in dem die Fermentierung stattfindet auf einer gewünschten Höhe gehalten, indem man stufenweise oder kontinuierlich ein geeignetes Mittel zur Regulierung des pH hinzusetzt Zu geeigneten Mitteln zahlen Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, sekundäres Natriumphosphat und Ammoniak, entweder als solche oder in wäßriger Lösung. Gemische dieser pH-Regulierungsmittel können angewandt: werden. Zu anderen geeigneten pH-Regulierungsmitteln zählen wäßrige Lösungen von Chlorwasserstoff, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure. Vorzugsweise wird der pH-Wert sowohl bei ansjitzweisen als auch bei kontinuierlichen Verfahren innerhalb einer halben pH-Einheit um den gewünschten pH-Wert herum, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 8,0, insbesondere von 5,8 bis 7,6, eingeteilt

Die optimale Wachstumstemperatur des erfindungsgemäßen Mikroorganismiis variiert je nach dem angewandten Organismus und wird gewöhnlich innerhalb eines Grades um die gewünschte Temperatur herum eingestellt, die vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 20 bis 50⁰C liegt. Benonders geeignete Temperaturen zur Durchführung des erfindungsgemäOen Verfahrens liegen innerhalb des Bereiches von 34 bis 45° C.

Sowohl bei der ansatzweisen als auch bei der kontinuierlichen Züchtung kann der Partialdruck des im Kulturmedium aufgelösten Sauerstoffs innerhalb des Bereichs von 4 bis 800 mbar, vorzugsweise von 40 bis 200mbar, eingestellt werden. Der Teildruck des Kohlendioxids im abgehetiden Gas wird innerhalb des

030 148/60

Bereichs von 0 bis 200 mbar und vorzugsweise innerhalb des Bereichs von 0 bis 53 mbar gehalten. Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter Anwendung jedes geeigneten Typs einer Fermentiervorrichtung durchgeführt werden. Eine sehr geeignete Fermentiervorrichtung zui' Durchführung eines kontinuierlichen Verfahrens ist in der britischen Patentanmeldung 35 285/70 beschrieben. Die Proteinmasse bildet sich als Aufschlämmung in der Fermentiervorrichtung und wird z. B. durch Zentrifugieren und/oder Abfiltrieren und Ausflocken aus der flüssigen Phase, die andere Produkte, beispielsweise gebildete Aminosäuren, enthält, abgetrennt Die Proteinmasse kann getrocknet werden und bildet eine Proteinergänzung zur Verwendung in Nahrungsmitteln für den Menschen oder für Tiere.

Falls erwünscht, kann Protein aus der Proteinmasse extrahiert werden, und man kann das extrahierte Protein als Ergänzung für Nahrungsmittel verwenden, die für den Menschen oder für Tiere vorgesehen sind.

Die Erfindung wird durch Beispiele näher erläutert:

CHjOH	• 7H2O	2H2O	5,0 g/l
H3PO4	7H2O	6H2O	0,0165 molar
	5H2O	9,0 g/I
		1,05 g/l
(NH4J2SO4	-4H2O	5,0 g/l
MgSO4	7H2O	0,1 mg/l
FeSO4 ■	Na2MoO4	0,07 mg/l
CuSO4 ·	CaCI2 ·	0,5 mg/l
H3BO3	CoCL2 ■	0,5 mg/l
MnSO4	0,1 mg/l
ZnSO4 ·	13,24 mg/l
0,1 mg/l

20

die nachstehenden

A. Pseudomoiias methylotropha — Versuche mit

ansatzmäßiger Kultur

Beispiel 1 Stamm WKM-3 (NCIB 10508)

Es wird eine Impfkultur bereitet indem man 10 cm³ einer sterilen Salzlösung zu einer Kultur des Mikro- w Organismus hinzusetzt, der auf Methanol-Mineralsalz-Agar im Schrägrohr wächst (Zusammensetzung wie vorstehend bei der Beschreibung der Stamme angegeben). Eine Suspension der Zellen wird bereitet, und man verwendet die gesamte Suspension zur Animpfung eines Impfkulturkolbens (1-l-Erlenmeyer), der 100 cm³ des gleichem Mediums enthält Der pH-Wert dieses Mediums wird vor der Animpfung auf 6,8 eingestellt Diese Impfkiiltur inkubiert man dann 36 h lang auf einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37° C.

Diese Kultur wird dann verwendet um eine Fermentiervorrichtung anzuimpfen, die 21 des folgenden Mediums enthält:

ergeben sich 10,4 g getrockneter Zellen mit einem Gehalt von 65 Gew.-% Rohprotein (N χ 6,25).

Beispiel 2 Stamm WKM-I (NCIB 10509)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt Man erhält 9,5 g getrockneter Zellen. Der Proteingehalt (N χ 6,25) der Zellen beträgt 68 Gew.-%.

Beispiel 3 Stamm SE (NCIB 10513)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt Man erhält 10,6 g getrockneter Zellen. Der Rohproteingehalt (N χ 6,25) der Zellen beträgt 67 Gew.-%.

Beispiel 4 Stamm SF (NCIB 10514)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt Man erhält 123 g getrockneter Zellen. Der Rohproteingehalt der Zellen (N χ 6,25) beträgt 62 Gew.-%.

Beispiel 5 Stamm ASl (NCIB 10515)

Der Arbeitsgang des Beispiels 1 wird wiederholt Man erhält 11,6 g getrockneter Zellen. Der Rohproteingehalt (N χ 6,25) der Zellen beträgt 67 Gew.-%.

Beispiel 6 Stamm ASl (NCIB 10515)

Der Versuch wird im wesentlichen wie in den Beispielen 1 und 5 beschrieben durchgeführt Wenn die Fermentierung vollständig ist wird nach dem Abernten der Zellen die überstehende Flüssigkeit der Kultur auf Anwesenheit freier Aminosäuren analysiert, wobei man eine automatische Aminosäure-Analysiervorrichtung verwendet Man findet die folgenden Aminosäuren in den angegebenen Mengen:

45

50

55

Der pH-Wert dieses Mediums wird vor dem Animpfen auf 6,8 eingestellt Nach dem Animpfen dieses Mediums mit der Impfkultur wird die Kultur in der Fermentiervorrichtung bewegt und belüftet und zwar bei einer automatisch gesteuerten Kulturtemperatur von 37°C, wobei man den pH-Wert der Kultur automatisch auf 6,8 einstellt. Zu jedem I der Kultur werden nach etwa 36stündigem Wachstum, nach 40stündigem Wachstum und schließlich nach 44 Stunden jeweils f>5 weitere 5 g Methanol hinzugesetzt. Nach einer Gesamtdauer der Fermentierung von 48 Stunden werden die Zellen abgeerntet und getrocknet. Aus 21 der Kultur

Glutaminsäure

Alanin

Valin

iso-Leucin

Leucin

Lysin

135 mg/l 32 mg/l

111 mg/l 53 mg/l 40 mg/l 20 mg/l

Beispiel 7 Stamm MP4 (NCIB 10592)

Der Versuch *ird in Schüttelkolbenkulturen wie folgt durchgeführt: Es wird eine Impfkultur bereitet, indem man IOcm³ einer sterilen Mineralsalzlösung zu einer Schrägkultur des Mikroorganismus hinzufügt, der auf Methanol-Mineralsalz-Agar (Zusammensetzung wie vorstehend bei der Beschreibung der Stämme angegeben) in Schrägrohren wächst. Es wird eine Suspension der Zellen bereitet, und man verwendet die gesamte Suspension zum Animpfen eines 1-l-Crlenmeyer· Kolbens, der 200 cm' der gleichen Methanol-Mineralsalzsubstanz [0,5% Methanol (Gew7Vol.)] enthält. Den pH-Wert dieses Mediums stellt man vor dem Animpfen auf 6,8 ein. Dann inkubiert man diese Kultur 24 h lang auf einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37°C. Die Zellen werden dann durch Abzentrifugieren gewonnen und getrocknet, wobei sich aus den 200 cm¹

der Kultur 0,171 g Zellen (Trockengewicht) ergeben. Die Zellen enthalten 62 Gew.-% Rohprotein (N χ 6,25).

Beispiel 8 Stamm F16/1 (NCIB 10593;

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt Man erhält 0,222 g getrockneter Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 66 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 9 Stamm F16/2 (NCIB 10594)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt Man erhält 0,182 g getrocknete Zellen. Der Rohproteingehalt der Zeilen (N χ 6,25) beträgt 69 Gew.-°/o.

Beispiel 10 Stamm MPl/Sn/37/1 (NCIB 10595)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt 0,270 g getrockneter Zellen werden erhalten. Der Proteingehalt der Zellen (N χ 6,25) beträgt 64 Gew.-%.

Beispiel 11 Stamm 28/D/37 (NCIB 10596)

Der Arbeitsgang des Beispiels 7 wird wiederholt Man erhält 0,240 g getrockneter Zellen. Der Proteingehalt der Zellen beträgt 67 Gew.-% (N χ 6,25).

B. Pseudomonas tnethylotropha — Versuche mit kontinuierlicher Kultur

Beispiel 12 Stamm MP4 (NCIB 10592)

Man erzeugte eine Biomasse durch Züchtung des Bakteriums in einem kohlenstoffbegrenzten kontinuierlichen Kultivierungsprozeß bei einer Temperatur von 40⁰C. Die Kultur wird belüftet und gerührt, und der pH-Wert wird automatisch auf 6,8 eingestellt. Das Schäumen wird durch automatisch programmieite Zusätze von Siliconöl reguliert. Der Versuch wird wie folgt durchgeführt: Eine Impfansatzkultur des Organismus läßt man anfangs wie in Beispiel 7 beschrieben wachsen. Diese Impfkultur wird nach 24stündigem Wachstum verwendet, um eine Fermentiervornchtung anzuimpfen, die 2,01 eines Mediums (Medium 11) mit der folgenden Zusammensetzung enthält:

der Kultur automatisch auf 40⁰C und den pH-Wert der Kultur automatisch auf 63 einstellt

Die Kultur läßt man als ansaumäßige Kultur etwa 36 h lang wachsen. Nach dieser Zeit ist das Methanol im Medium vom Mikroorganismus vollständig ausgenutzt worden, und die Konzentration des Methanols im Medium beträgt nahezu Null. Zu dieser Zeit wird die Kultur kontinuierlich gemacht, indem man damit beginnt, der Kultur kontinuierlich Medium zuzuführen.

ίο Das Medium hat die gleiche Zusammensetzung wie das Medium II, und man führt es in zwei Teilen in die Kultur ein. Der eine Teil enthält die Mineralsalze, und der andere ist Methanol in Form einer 50%igen wäßrigen Lösung. Das Medium wird mit einer solchen Geschwin digkeit zugeführt, daß die Verdünnungsrate 0,1 Stunde-' beträgt Die Kultur läßt man dann etwa 24 h lang wachsen, so daß sie einen stabilen, kohlenstoffbegrenzten stationären Zustand erreichen kann. Die Zellen werden dann kontinuierlich gewonnen und ge trocknet Das Trockengewicht der Zellen im stationären Zustand beträgt 4,1 g/l, und die Zellausbeute beträgt 0,41 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (N χ 6,25). Der Aminosäuregehalt der Zellen, ausgedrückt als wasserfreie Aminosäuren in Prozent des Gesamtaminosäuregehaltes, ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 13 Stamm F16/1 (NCIB 10593)

Die Arbeitsweise des Beispiels 12 wird wiederholt, jedoch wird die Fermentierungstemperatur auf 37° C eingeregelt

J5 Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,8 g je I, und die Zellenausbeute beträgt 038 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 78 Gew.-°/o. Der Amino-

Säuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Methanol	10,0 g/l
(NH4J2SO4	1,15 g/l
H3PO4	0,0066 molar
MgSO4 · 7 H2O	0,42 g/l
FeSO4 · 7 H2O	5,0 mg/1
CuSO4 · 5 H2O	0,1 mg/1
H1BO3	0,07 mg/1
MnSO4 · 7 H2O	0,5 mg/1
ZnSO4 · 7 H2O	0,5 mg/1
Na2MoO4	0,1 mg/1
CaCI2 · 2 H2O	13,2 mg/1
CoCI2 ■ 6 H2O	0,1 mg/1

Der pH-Wert dieses Mediums wird auf 6,8 eingestellt, indem man ein 1 : !-Gemisch von 4 η KOH :4 π NaOH hinzusetzt. Nach dem Animpfen des Mediums Il mit der Impfkultur wird die Kultur in der Fermentiervo. richtung bewegt und belüftet, wobei man die Temperatur Beispiel 14 Stamm Fl 6/2 (NCIB 10594)

Das Beispiel 13 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt Das Trockengewicht im stationären Zustand beträgt 3,7 g/i, und die Zellenausbcute beträgt 0,37 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Roh proteingehalt von 76 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 15 Stamm MPl/Sh/37/1 (NClB 10595)

Beispiel 13 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen im stationären Zustand beträgt 3,7 g/l, und die Zellenausbeute in bezug auf Methanol beträgt 037 g/g. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 76 Gew.-°/o (N χ 6,25). Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 16 Stamm 28/D/37 (NCIB 10596)

Beispiel 13 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,8 g je I, und die Zellenausbeute

beträgt 0,38 g getrockneter Zellen je g des ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 78 Gew,-% (N χ 6,25), Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 17 Stamm AS-I (NCIB 10515)

Durch Züchten des Bakteriums in einem kohlenstoff- ι ο begrenzten, kontinuierlichen Kultivierungsprozeß wird bei einer Temperatur von 37° C Biomasse erzeugt Die Kultur wird belüftet und bewegt und der pH-Wert automatisch auf einen Wert von 6,8 einreguliert. Das Schäumen reguliert man durch automatisch programmierte Zusätze von Siliconöl. Der Versuch wird wie folgt durchgeführt:

Impfkulturen des Organismus !äßt man anfangs wie im ersten Ansatz des Beispiels 1 beschrieben wachsen, um 0,5 g Impfmaterial (Trockengewicht) je I zu schaffen. Diese Impfkulturen werden dünn zum Animpfen einer Fermentiervorrichtung verwendet, die 2,01 eines Mediums (Medium III) der folgenden Zusammensetzung enthält.

25

JO

35

CH3OH	• 7H2O	2H2O	3,0 g/l
H3PO4		6H2O	0,0099 molar
MgSO4		0.67 g/I
Na2SO4	7H2O	0,03 mg/l
K2SO4	-5H2O	Z5 mg/l
FeSO4 ·		5,0 mg/l
CuSO4	-7H2O	0,1 mg/I
H3BO3	7H2O	0,07 mg/l
MnSO4	Na2MoO4	04 mg/l
ZnSO4	CaCI2 ·	04 mg/I
	CoCl2-	0,1 mg/I
	13,2 mg/l
0,1 mg/l

Den pH-Wert dieses Mediums stellt man durch geregeltes Hinzusetzen von gasförmigem Ammoniak auf 6,8 ein. Nach der Animpfung des Mediums HI mit den Impfkulturen wird die Kultur in der Fermentiereinrichtung bewegt und belüftet, wobei man die Kulturtemperatur automatisch auf 37"C einstellt und den pH-Wert der Kultur automatisch reguliert

Die Kultur IaBt man als ansatzmäßige Kultur etwa 1 h lang wachsen. Zu dieser Zeit ist das Methanol im Medium durch die Mikroorganismen vollständig ausgenutzt worden, und die Methanolkonzentration im Medium betragt etwr. 0. Zu dieser Zeit führt man Methanol der Kultur kontinuierlich mit langsam steigernder Geschwindigkeit zu, so daß das Wachstum der Kultur immer durch die Konzentration des Methanols im Medium begrenzt wird. Wenn die Geschwindigkeit der Methanolzufuhr nach etwa 2 h etwa 10 g/l erreicht, macht man die Kultur kontinuierlich, indem man damit beginnt, das Medium kontinuierlich zu der Kultur hinzuzufügen. Das Medium hat die gleiche Zusammensetzung wie Medium III und wird in zwei Teilen in die Kultur eingeführt Der eine Teil enthält die Mineralsalze, und der andere Teil ist Methanol in Form einer 50%igen wäßrigen Lösung. Das Medium wird mit einer solchen Geschwindigkeit zugeführt, daß die Verdünnungsrate 0,1 Stunde-' beträgt. Die Zellenausbeute beträgt 038 g getrocknete Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 78 Gew.-%. Der Aminosäurcgehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 18 Stamm SE (NCIB 10513)

Das Beispiel 17 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,5 g/l und die Zellenausbeute 0,35 g getrocknete Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingchalt (N χ 6,25) von 81 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 19 Stamm WKMl (NCIB 10509)

Beispiel 17 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt Das Trockengewicht des stationären ZuStands beträgt 2,7 g/I, und die Zellenausbeute beträgt 0,27 g getrocknete Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 88 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 20 Stamm SF (NCIB 10514)

Beispiel 17 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,4 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 034 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 77 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

C. Microcyclus poiymorphium, Stamm PIaS(NCIB 10516)

Beispiel 21 Kontinuierliche Kultur

Das Beispiel 17 wird unter Verwendung des Stammes Pla5 wiederholt Die Versuchsbedingungen sind die gleichen, jedoch wird bei einer Verdünnunpsrate von 0,05 Stunden -' ein kohlenstoffbegrenzter stationärer Zustand herbeigeführt Zusätzlich enthält das Medium 0,05% eines Hefeextrakts.

Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 2,2 g/l und die Zellenausbeute 0,22 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6,25) von 87 Gew.-%. Der Aminosäuregehait der Zellen ist in ^Tabelle I angegeben.

Beispiel 22 AnsatzmäDige Kultur

Unter Verwendung des Stammes Pia5 wird ein Versuch im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschriebenen durchgeführt, jedoch läßt man in diesem Falle die Impfkultur 48 K lang wachsen, und beim Fermentieren wird zu verschiedenen Zeiten weiteres Methanol zugesetzt. Der erste Zusatz von weiteren 5 g Methanol je 11 der Kultur erfolgt nach 48 Stunden, der zweite Zusatz nach 56 Stunden und der letzte Zusatz nach 64 Stunden.

Die Zellen werden nach einer Gesamtfermentierungszeit von 72 Stunden gewonnen und getrocknet, wobei sich aus den 21 der Kultur 9,6 g ergeben. Der Proteingehalt (N χ 6,25) der Zellen beträgt 67.5 Gew.-% Protein.

D. Hyphomicrobium variable. Stamm S/30/4
(NCIB 10517)

Beispiel 23
Ansatzmäßige Kultur

Beispiel 27 Stamm MA3D/1 (NCIB 10599)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erzielt 0,221 g Zellen (Trockengewicht). Der Pro· teingehalt der Zellen beträgt 53 Gew.-% (N χ 6,25).

Unter Anwendung des Stammes S/30/4 wird im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben ein Versuch durchgeführt, jedoch läßt man bei diesem Versuch die Impfkultur 72 h lang wachsen, und beim Fermentieren wird zu verschiedenen Zeiten weiteres Methanol zugesetzt. Der erste Zusatz von weiteren 5 g Methanol zu jedem 1 der Kultur erfolgt nach 54 Stunden, der zweite Zusatz nach 64 Stunden und der letzte Zusatz nach 74 Stunden. Die Inkubationstemperatur beträgt in diesem Beispiel in allen Fällen 3O⁰C. Die Zellen werden nach einer Gesamtfermentierungszeit von 96 Stunden gewonnen und getrocknet, und aus den 2 I der Kultur er^cich !^7 " "sirock^ete Zeilen Der Prcteiri^ Beispiel 28 Stamm Mw4/4 (NCIB 10600)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,224 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 55 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 29 Stamm MPID/2 (NCIB 10601)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0.202 g Zellen (Trockengewicht). Der ProleirxToKnll Aar 7ol!on kofrS». Κ.Λ /".«... (V„ /M „tTO

(N χ 6,25) der getrockneten Zellen beträgt 70 Gew.-%.

Beispiel 24
Kontinuierliche Kultur

Beispiel 17 wird unter Verwendung des Stammes S/30/4 wiederholt. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen, jedoch wird bei einer Verdünnungsrate von 0.05 Stunden' mit einer Methanolkonzentration im einströmenden Medium von 5 g/l ein kohlenstoffbegrenzter stationärer Zustand herbeigeführt.

Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 1.5 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0.3 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt (N χ 6.25) von 80 Gew.-%. Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

E. Pseudomonas rosea — Versuche mit
ansatzmäßiger Kultur

Beispiel 25
Stamm MA2/3 (NCIB 10597)

Der Versuch wird in Schüttelkolbenkulturen wie folgt durchgeführt: Es wird eine Impfkultur bereitet, indem man 10 cm³ sterile Mineralsalzlösung zu einer Schrägkultur des Mikroorganismus hinzusetzt, der auf Methanol-Mineralsalz-Agar-Schrägrohren (Zusammensetzung wie vorstehend bei den Tests zur Identifizierung der Stämme beschrieben) wächst. Es wird eine Suspension der Zellen bereitet, und man verwendet die gesamte Suspension zum Animpfen eines 1-l-Erlenmeyerkolbens. der 200 cm³ der gleichen Methanol-Mineralsalz-Substanz [0,5% Methanol (Gewicht/Volumen)] enthält. Den pH-Wert dieses Mediums stellt man vor dem Animpfen auf 6,8 ein. Diese Kultur wird dann auf einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37°C 24 h lang inkubiert. Die Zellen werden dann durch Abzentrifugieren gewonnen und getrocknet; aus den 200 cm³ der Kultur ergeben sich 0.227 g Zellen (Trokkengewicht). Die Zellen enthalten 55 Gew.-% Rohprotein (N χ 6.25).

Beispiel 26
Stamm BDD/3 (NCIB 10598)

Der Arbeitsgang des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0.226 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 58 Gew.-°/o (N χ 6.25). Beispiel 30 Stamm MP3D/2 (NCIB 10602)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,207 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 56 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 31 Stamm ΜΡ1Λ! (NCIB 10603)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,200 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 54 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 32 Stamm MA2/2 (NCIB 10604)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,225 g Zellen (Trockengewicht). Der Pro-■π teingehalt der Zellen beträgt 58 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 33 Stamm 20/D(NCIB 10605)

i-, Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,220 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 57 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 34 Stamm MA1/:5 (NCIB 10606)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,161 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 61 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 35 Stamm MA3D/3 (NCIB 10607)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,156 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 63 Gew.-°/o (N χ 6.25).

Beispiel 36 Stamm BDD/2 (NCIB 10608)

Die Arbeitsweise aes Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,188 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 61 Gew.-% (N χ 625).

Beispiel 37
Stamm MPI (NCIB 10609)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,217 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 59 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 38
Stamm ChD (NCIB 10610)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,210 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 64 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 39
Stamm WS(NCIB !061I)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man prhält 0 75Og 7pllpn (Trnrlcpngrwirht) Πργ Pmteingehalt der Zellen beträgt 64 Gew.-% (N χ 6.25).

Beispiel 40
Stamm MP3 (NCIB 10612)

Die Arbeitsweise des Beispiels 25 wird wiederholt. Man erhält 0,209 g Zellen (Trockengewicht). Der Proteingehalt der Zellen beträgt 59 Gew.-% (N χ 6,25).

F. Pseudomonas rosea — Versuche mit
kontinuierlicher Kultur

Beispiel 41
Stamm MPl (NCIB 10609)

Beispiel 12 wird unter Verwendung des Stammes MPl wiederholt. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen, jedoch wird der Versuch bei 37⁰C durchgeführt, wird die Kultur als ansatzweise Kultur 48 h lang wachsen gelassen und !äßt man die Kultur, nachdem sie kontinuierlich gemacht worden ist, etwa 36 h lang wachsen, um die Erzielung eines stabilen, stationären Zustands zu ermöglichen. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,38 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0,338 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die Trockenzellen haben einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (N χ 6,25). Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 42
Stamm MP3 (NCIB 10612)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,53 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0353 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 69 Gew.-% (N χ 6,25). Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 43
Stamm ChD (NCIB 10610)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,25 g/1, und die Zellenausbeute beträgt 0325 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 75 Gew.-% (N χ 6,25).

Der Aminosäuregehalt der Zellen ist in Tabelle I angegeben.

Beispiel 44
Stamm WS(NCIB 10611)

Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,25 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0,325 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 75 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 45
'"' Stamm MA2/3 (NCIB 10597)

Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3.16 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0,316 g getrockneter Zellen je g ausgsnutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 72 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 46
Stamm BDD/3 (NCIB 10598)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das erzielte Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,42 g/l, und die so Zellenausbeute beträgt 0,342 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 74 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 47
Stamm MA3D/1 (NCIB 10599)

Das Beispiel 41 wird unter Verwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,30 g/l. und die Zellenausbeute beträgt 0,330 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 48
Stamm MW4/4 (NCIB 10600)

Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 2,94 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0,294 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 71 Gew.-°/o (N χ 6,25).

Beispiel 49
Stamm MP1D/2 (NCIB 10601)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt Das Trockengewicht der Zeilen des stationären Zustands beträgt 3,71 g/I, und die Zellenausbeute beträgt 0371 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 71 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 50
Stamm MP1/2 (NCIB 10603)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt Das Gewicht der trockenen Zellen des

stationären Zustands beträgt 3,02 g je I, und die Zellenausbeute beträgt 0,302 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 68 Gew.-% (N χ 6,25;.

Beispiel 51
Stamm MA2/2 (NCIB 10604)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Gewicht der trockenen Zellen des stationären Zustands beträgt 2,71 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0,271 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 75 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 52
Stamm 20/D(NCIB 10605)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Gewicht der trockenen Zellen des stationären Zustands beträgt 3,69 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0,369 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 67 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 53
Stamm MAI/5 (NCIB 10606)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Gewicht der trockenen Zellen des stationären Zustands beträgt 3,42g/l, und die Zellerausbeute beträgt 0,342 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 71 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 54
Stamm MA3DO (NCIB 10607)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stammes wiederholt. Das Trockengewicht der Zellen des stationären Zustands beträgt 3,12 g/l, und die Zellenausbeute beträgt 0312 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen haben einen Rohproteingehalt von 74 Gew.-% (N χ 6,25).

Beispiel 55 Stamm BDD/2 (NCIB 10608)

Das Beispiel 41 wird unter Anwendung dieses Stam-") mes wiederholt. Das Gewicht der trockenen Zellen des stetigen Stadiums betlägt 3,62g/l, und die Zellenausbeute, bezogen auf Methanol, beträgt 0,362 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols. Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 74 in Gew.-%(Nx6,25).

Beispiel 56 Fütterungsversuch bei Hühnchen

π Es wird ein Versuch unter Anwendung von drei Gruppen Hühnchen durchgeführt. Die ersten 10 Tage werden alle Gruppen mit »Promin«-Diät 1 gefüttert, bestehend aus Probe Sojabohnenmehl 21,7% (91% Rnhnrntein in der Diät). rl.l-Methionin 0.464%. Molken

jo 2.5%, Mineralstoffe 6,75%, Vitamine 2,0%, Äthoxychin 0,015%, Maisöl 8,0%, Dextrose 40,0%, Getreidestärke 18,391% und Glycin 0,2%. Für die nächsten 7 Tage wird die Diät 1 bei einer Gruppe fortgeführt, während die andere Gruppe mit den Diäten 2 und 3 gefüttert wird,

2" welche aus »Promin«-Diät bestehen, in welchen getrocknete Proteinmasse von Pseudomonas methylotropha bzw. getrocknete Bäckerhefe eingesetzt wurde, um 25% des Rohproteins in der Diät zu bilden. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben:

Ergebnisse

Futtermi-

schung
(Diät)

Durchschnittliche Zunahme
des Lebendgewichts

(g)

Durchschnitt
liche
Nahrungsauf nahme

(g)

Futterumwandlungsverhältnis:

Zunahme des Lebendgewichts (g/g)

Nahrungsaufnahme

87,6
95,3
85,0

150
160
167

0,585 0,595 0,508

Wie man sieht, wird unter Verwendung der erfindungsgemäßen Proteinmasse (Futtermischung 2) ein Futterumwandlungsverhältnis erzielt, das im Vergleich mit dem Futterumwandlungsverhältnis, das man unter Verwendung der anderen getesteten Proteinquellen erzielt, günstiger ist.

Tabehi I

Ä Sm	Aminosäure	Wasserfreie	Aminosäure	(in °i	b des Gesamtgehalts an	wasserfreien	Aminosäuren)	41	42	43
		Beispiel Nr.
		17 18	19	20	21 24 12	15	16 13

Asparaginsäure 11,1 II3 113 12,0 83 11,1 10,7 103 10,9 10,6 10,! 10,1 10,0

Threonin	5,4	5,1	53	5,1	4,4	4,7	5,4	53	6,0	53	4,7	5,1	53
Serin	33	3,4	3,6	33	33	3,4	4,9	4,4	4,7	4,2	4,2	3,5	4,3
Glutaminsäure	123	123	123	12,8	12,7	13,4	12,2	123	123	113	13,5	12,4	12,5
Prolin	43	33	53	4,2	5,8	5,1	5,0	5,2	sä	5,4	5,9	63	5,6
Glycin	5,7	6,4	6,7	63	5,0	53	5,4	5a	53	53	5,6	5,8	5,6
Alanin	7,7	8,1	83	73	7,7	7,0	73	73	sa	73	sa	7,4	73
Valin	6a	6,6	6,4	63	5,8	6,1	6,4	6,0	6,0	63	6,0	63	63
Methionin	33	3,4	33	2,7	2a	3,1	23	3,0	2,8	33	2,4	23	3,0

29 30

Fortsetzung

Aminosäure Wasserfreie Aminosäure (in % des Gesamtgehalls an wasserfreien Aminosäuren)

Beispiel Nr.
17 18 19 20 21 24 12 15 16 IJ 4! 42 43

Isoleucin	5,7	5,6	5,6	5,8	5,5	5,0	5,5	5,2	4,6	5,2	4,0	4,6	5,3
Leucin	9,0	8,8	8,5	9,1	9,9	7,7	9,2	8,5	8.7	8,3	8,6	8,5	ο, ι
Tyrosin	4,2	4,2	4,2	3,6	5,6	4,5	4,2	4,6	4.8	4.8	3,5	4,1	4,2
Phenylalanin	4,8	4,9	4,0	4,6	5,6	5.0	4,4	5.0	4,5	4.8	4,0	4,0	4.4
Lysin	8,1	7,7	7,2	7,7	7,0	8.2	7,5	7,8	7.3	7,5	7,5	7.3	7,5
Histidin	2,4	2,4	2,3	2,0	2,2	2,7	.'!,2	2,7	2.3	2,5	2,1	2.4	2.5
Arginin	5,8	5,7	5,1	5,9	8,5	7,1	6,2	6,1	6,1	6,3	9,6	8,1	7.1
Halbcystin	0,6	0,5	0,5	n.t.	n.t.	n.t.	0,6	0,6	0,7	0,6	0,8	0.8	0,7
Tryptophan	n.t.	2,0	n.t.	n.t.	n.t.	n.t.	1.5	1.6	n.t.	n.t.	1,1	1.6	1.5
Gesamte	56,4	58,1	61,1	55,2	41,9	50.7	49,0	55.6	50,0	58,4	46,7	54.3	53.2
wasserfrei;;
Aminosäuren
(in % der
Trocken
substanz)

n.t. = nicht getestet.

Aminosäurebestimmung durch die übliche Säulenchromatographietechnik nach Moore & Stein. Bestimmung von Halbcynin

als Cystinsäure nach Oxidation mil Perameisensäure. Tryptophiitmnalyse unter Anwendung alkalischer Hydrolyse.

Claims (8)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Proteinmassen durch aerobes Kultivieren von Bakterien in einem wäßrigen Kulturmedium, das Methanol als Quelle assimilierbaren Kohlenstoffs und anorganische Nährstoffe aufweist, und Gewinnen der Proteinmassen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen methanolaus- nutzenden Stamm der Arten Pseudomonas methylotropha, Microcyclus polymorphum, Hyphomicrobium variabile und Pseudomonas rosea oder mehrere dieser Stämme verwendet, wobei diese Arten die nachstehend zu diesen Arten angegebenen allgemeinen Eigenschaften besitzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der Stämme mit den NCIB-Nummem 10 508 bis 10 517 und 10 592 bis 10 612 oder mehrere dieser Stämme einsetzt

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium ein solches verwendet, das Ammoniak, ein Ammoniumsalz, Harnstoff oder ein Nitrat als Stickstoffquelle enthält

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß man ein Kulturmedium verwendet, das Ionen von Calcium, Kupfer, Eisen, Kobalt oder Mangan enthält

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden An-Sprüche, dadurch gekennzeichnet daß man ein Kulturmedium verwendet, das anorganische Quellen von Schwefel, Phosphor, Magnesium und Kalium und/oder Natrium enthält

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet das Methanol in Mengen zwischen 0,05 und 10 Gew.-%, insbesondere 0,1 und 7,5 Gew.-%, die Stickstoffquelle in Mengen zwischen 0,001 und 3 Gew.-%, insbesondere 0,01 und 1 Gew.-% elementaren Stickstoffs und die anorganischen Quellen an Phosphor, Schwefel, Magnesium, Kalium und Natrium in solchen Mengen enthält, die ausreichend sind, um folgende lonenkonzentrationen (in Gew.-%) zu schaffen: PO₄ ³" 0,01 bis 0,5, SO₄ ²- 0.01 bis 0,25, Mg²+ 0,001 bis 0,1, K+ 0,01 bis 0,25, und Na+ 0,002 bis 0,06.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kultivieren bei einer Temperatur innerhalb des w Bereiches von 20 bis 50° C, insbesondere von 34 bis 45° C ausführt

8. Verwendung des nach einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellten proteinhaltigen Produktes in Form getrockneter Zellen als protein- « haltige Nahrungsmittelergänzung, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Nährmitteln, zur Ernähung von Mensch und Tier.