DE2108214C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Serin - Google Patents

Description

Apoenzyms zu Pyridoxal phosphat beträgt 2,5 · 10"⁷M. Das kristalline Präparat dieses Enzyms erweist sich als einheitlich, wenn es der Disk-Elektrophorese und Sedimentationsmessungen in der Ultrazentrifuge unterwoifen wird. Die Sedimentationskonstante (S₂₀ ⁰, w) und die Diffusionskonstante des kristallinen Präparates betragen 11,6 S bzw. 4,06 · 10⁷ cm²/sec. Aus diesen Daten errechnet sich ein Molekulargewicht von etwa 277000.

Für die erfindungsgemäße Kondensationsrecktion von Glycin und Formaldehyd zu L-Serin kann die in der beschriebenen Weise hergestellte Threonin-Aldolase in praktisch beliebiger Form eingesetzt werden. So empfiehlt es sich gemäß der Erfindung, die Threonin-AldoIase in einer ungereinigten Fc rm zu verwenden, welche noch Bestandteile der die Threcnin-Aldolase bildenden mikrowellen Stufe enthält. Vorzugsweise wird die Threonin-Aldolase in Form der mikrobiellen Zellen verwendet. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird gewöhnlich in einem wäßrigen Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 7 bis 11 ausgeführt, wobei besonders gute Ergebnisse bei einem pH-Wert von etwa 8,5 erhalten werden. Die Reaktionstemperatur beträgt 20 bis 50' C. Je höher die Reaktionstemperatur gewählt wird, umso bessere Ergebnisse werden erzielt. Der Einsatz äquimolarer Mengen Glycin und Formaldehyd ist vorzuziehen, jedoch nicht unbedingt erforderlich. Die Reaktion verläuft am besten, wenn sie mit einer Glycin-Konzentration größer als 1 mg/ml und mit einer Formaldehyd-Konzentiation größer als 1 mg/ml durchgeführt witd. Vorteilhaft ist es auch, die Reaktion in Gegenwart von Mercaptoäthanol ablaufen zu lassen, dessen Konzentration zwischen 5 · 10-'¹ und 5 · 10¹ M, vorzugsweise bei 10 ² M liegen sollte. Nach Vollendung der Reaktion kann das L-Serin aus dem Reaktionsmedium in herkömmlicher Weise, z. B. durch Behandlung mit einem lonenaustauscherharz, isoliert werden.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen erläutert. Bei den Prozent-Angaben handelt es sich um Gewichtsprozente.

Beispiel 1

Candida humicola ATCC 20 264 wurde zwecks Züchtung auf 100 ml eines Kulturmediums beimpft, welches folgende Zusammensetzung besaß: 0,05% L-Threonin, 0,2% KH₄PO₄, 0,1% (NH₄)SjSO₄, 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5% Hefeextrakt. Nach Vollendung der Züchtung wurde die Zuchtbrühe zentrifugiert, wobei man 0,2 g Naßzellen erhielt. Letztere wurden einer Lösung zugesetzt, weiche aus 0,25 ml einer 1 M-Glycinlösung, 0,25 ml einer 1 M-Formaldehydiösung, 0,20 ml einer 0,001 M-Pyridoxalphosphatlösung, 0,20 ml einer 1 M-Kaliumchloridlösung und 1,00 ml einer 0,2 M-TRIS-Pufferlösung (pH 10) bestand (100 ml dieser Pufferlösung wurden durch Lösen von 6,075 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan in aqua dest. und Zugabe von N/10-Salzsäure hergestellt). Die Reaktion wurde bei 30⁰C in 24 h durchgeführt. Die Menge des im Reaktionsmedium gebildeten L-Serins betrug 20 mg.

Beispiel 2

Arthrobacter simplex ATCC 6946 wurde — wie im Beispiel I beschrieben — auf gleiche Weise und unter gleichen Bedingungen gezüchtet. Aus der Zuchtbrüht wurden durch Zentrifugieren wiederum 0,2 g Naßzellen gewonnen. Die Naßzellen wurden einer Lösung zugesetzt, weiche aus 0,25 ml einer 1 M-Glycinlösung, 0,25 ml einer 1 M-Formaldehydlösung, 0,10 ml einer

ίο 0,001 M-Pyridoxalphosphatlösung, 0,20 ml einer 1 M-Kaliumchloridlösung und 1,00 ml der im Beispiel 1 bereits erwähnten 0,2 M-TR1S-Pufferiösung (pH 10) bestand. Bei einer Reaktionstemperatur von 30° C war die Reaktion nach 24 h beendet. Man erhielt 18,5 mg L-Serin.

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde mit der Änderung wiederholt, daß die Naßzellen einer Lösung zugesetzt wurden, die ao neben den im Beispiel 2 genannten Bestandteilen zusätzlich noch 0,20 ml einer 0,1 M-Mercaptoäthanollösung enthielt. Bei der gleichen Reaktionstemperatur von 30 C war die Reaktion bereits nach 16 h beendet. Man erhielt 21,4 mg L-Serin.

Beispiel 4

Die Mikroorganismen der nachfolgenden Tabelle wurden jeweils getrennt auf ein Kulturmedium mit der im Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung beimpft und gezüchtet. Die Zuchtbrühen wurden zur Abtrennung der Naßzellen zentrifugiert.

Jeweils 0,2 g der Naßzellen wurden einerseits einer Lösung entsprechend Beispiel 1 (Lösung 1) und andererseits einer Lösung entsprechend Beispiel 1, welche zusätzlich 0,2 ml einer 0,1 M-Mercaptoäthanollösung enthielt, (Lösung 2) zugegeben und die Reaktion bei 30' C in 24 h durchgeführt. Die jeweils gebildeten L-Serin-Mengen in mg sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben, deren erste Spalte die Ergebnisse mit der

Lösung 1 und deren zweite Spalte die Ergebnisse mit der Lösung 2 wiedergibt.

Candida humicola ATCC 20 265 29,4 34,1

Candida utilis ATCC 20 262 9,4 10,9

Candida rugosa ATCC 20 263 9,4 10,9

Bacterium cadaveris ATCC 9760 16,5 19,1

Escherichia coli E 8 ATCC 21 523 4,7 5,5

Klebsieila pneumoniae ATCC 21 524 4,5 5,2

Xanthomonas campestris ATCC 7381 12,9 15,0

Beispiel 5

Candida humicola ATCC 20 265 wurde in einen konischen 250 ml-Kolben gegeben, welcher 50 ml eines Kulturmediums mit 0,2% Threonin, 0,1% Pepton, 0,3% Hefeextrakt und 0,3% Malzextrakt enthielt, und unter Schütteln bei 30 C für 24 h gezüchtet. 800 mg der gewonnenen Naßzellen wurden 10 ml einer 0,2 M-TRIS-Pufferlösung (pH 8,5) mit 10 mg/ml Glycin, 10 mg/ml Formaldehyd sowie 7,5 mg/ml KCl zuge-

setzt. Die Reaktion wurde bei 30C 20 h durchgeführt. Die im Reaktionsgemisch angesammelte L-Serin-Menge betrug 10,5 mg/ml.

Claims (7)

Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21 221 in Patentansprüche: einem wäßrigen Kulturmedium anzusammeln und aus dem Kulturmedium zu isolieren. Neben der geringen

1. Verfahren zur Herstellung von L-Serin aus Ausbeute sind hier die zur Erzeugung des L-Serins Glycin und Formaldehyd unter Verwendung von 5 erforderliche fortwährende Züchtung und die nach Threonin-Aldolase, dadurch gekenn- Tagen zählende Züchtungszeit als nachteilig anzusehen, zeichnet, daß man eine Threonin-Aldolase Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Ververwendet, die durch Züchtung der Mikroorganis- fahren zur Herstellung von L-Serin zu finden, welches men Candida humicola ATCC 20 264, Candida in kurzer Zeil mit geringen Kosten zu hohen L-Serinhumicola ATCC 20 265, Candida utilis ATCC io ausbeuten führt.

20 262, Candida rugosa ATCC 20 263, Bacterium Die Erfindung besteht darin, daß man bei dem eincadaveris ATCC 9760, Escherichia coli E 8 ATCC gangs genannten Verfahren eine Threonin-Aldolase

21 523, Klebsieila pneumoniae ATCC 21 524, verwendet, die durch Züchtung der Mikroorganismen Arthrobacter simplex ATCC 6946 oder Xantho- Candida humicola ATCC 20 264, Candida humicola monas campestris ATCC 7381 in wäßrigem Me- 15 ATCC 20 265, Candida utilis ATCC 20 262, Candida dium erhalten worden ist, und die L-Serin-Synthese rugosa ATCC 20 263, Bacterium cadaveris ATCC in einem wäßrigen Lösungsmitte! bei einem pH- 9760, Escherichia coli E 8 ATCC 21 523, Klebsiella Wert zwischen 7 und 11 sowie bei einer Temperatur pneumoniae ATCC 21524, Arthrobacter simplex zwischen 20 und 50° C in Gegenwart vonPyridoxal- ATCC 6946 oder Xanthomonas campestris ATCC phosphat und/oder Kaliumchlorid durchführt. ao 7381 in wäßrigem Medium erhalten worden ist, und

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- die L-Serin-Synthese in einem wäßrigen Lösungsmittel zeichnet, daß die Threonin-Aldolase in einer unge- bei einem pH-Wert zwischen 7 und 11 sowie bei einer reinigten Form verwendet wird, welche noch Be- Temperatur zwischen 20 und 50 C in Gegenwart von standteile der die Threonin-Aldolase bildenden Pyridoxalphosphat und/oder Kaliumchlorid durchmikrobiellen Stufe enthält. 35 führt. — Beim erfindungsgemäßen Verfahren führt die

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- enzymatische Kondensationsreaktion von Glycin und zeichnet, daß die Threonin-Aldolase in Form der Formaldehyd zu L-Serin überraschenderweise ohne mikrowellen Zellen verwendet wird. einen Zusatz an Tetrahydrofolat zum Erfolg.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, Die zuvor genannten Mikroorganismen, die bei der dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer Glycin- 30 American Type Culture Collection hinterlegt und Konzentration größer als 1 mg/ml durchgeführt somit der Öffentlichkeit zugänglich sind, werden zur wird. Herstellung der Threonin-Aldolase bei Temperaturen

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, zwischen 25 und 37 C, vorzugsweise zwischen 28 und dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer Formal- 30' C, für 10 bis 72 Stunden unter aeroben Bedingundehyd-Konzentration größer als 1 mg/ml durchge- 35 gen in einem wäßrigen Kulturmedium gezüchtet, welführt wird. ches in bekannter Weise Kohlenstoffquellen, Stick-

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, stoffquellen, anorganische Salze und andere Nährstoffe dadurch gekennzeichnet, daß es in Gegenwart von enthält. Als Kohlenstoffquellen werden vorzugweis-Mercaptoäthanol durchgeführt wird. se solche eingesetzt, die durch die sogenannten Mikro-

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn- 40 Organismen metabolisiert werden können, wie Zuckerzeichnet, daß Mercaptoäthanol in einer Konzen- stoffe (z. B. Glukose, Saccharose, Melasse, Stärketration von 5 · 10 ⁴ bis 5 · 10 ^l M eingesetzt wird. hydrolysat), organische Säuren (z. B. Essigsäure) und

Kohlenwasserstoffe. Als Stickstoffquellen werden vorzugsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harn-45 stoff, Ammoniak, Maiswasser, Hefeextrakt und

Fleischextrakt verwendet. Als anorganische Salze können Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat u. dgl. benutzt werden. Natürliche Nährstoffe, Vitamine u. dgl. können bei Bedarf dem Kultur-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung 50 medium ebenfalls zugesetzt werden. Kalium- und von L-Serin aus Glycin und Formaldehyd unter Ver- Ammoniumionen werden dem Kulturmedium zur Wendung von Threonin-Aldolase (EC 4. 1.2. 5). Erhöhung der enzymatischen Aktivität vorzugsweise

Untersuchungen über die Biosynthese von L-Serin in einer Konzentration von 10²M beigegeben. Der (vgl. J. Biol. Chem. 243 [1968], S. 5651 bis 5655, pH-Wert des Kulturmediums wird während der Züch-Chemical Abstracts 49 [1955], 9703 b) wurden mit aus 55 tung bei Einsatz der Hefepilze vorzugsweise bei 6,5 und der Leber von Säugetieren stammender Threonin- bei Einsatz der Bakterien vorzugsweise bei 7,0 gehalten. Aldolase durchgeführt; zusätzlich ist der Einsatz von Das aus dem Kulturmedium in bekannter Weise

Tetrahydrofolat erforderlich. Für eine technische An- isolierte, kristalline Enzym-Präparat ist gelblich und Wendung ist dieses Verfahren wenig geeignet, da Leber hat Absorptionsmaxima bei 280 nm und 420 nm. Es von Säugetieren nicht immer in beliebiger Menge zur 6° wurde festgestellt, daß 1 Mol dieses Enzyms mit 6 Mol Verfügung steht und der Tetrahydrofolat-Zusatz sehr Pyridoxalphosphat gekuppelt ist. Wird das kristalline kostspielig ist. Darüber hinaus sind auch die Ausbeuten Enzym mit Cystein behandelt, so wird das längeran L-Serin gering. wellige Absorptionsmaximum von 420 nm nach 330 nm

Auch ist es bekannt (vergleiche deutsche Offen- verschoben. Wenn das Enzym mit Ammoniumsulfat legungsschrift 19 16 421), L-Serin durch Züchtung der 65 behandelt wird, entsteht ein Apoenzym. Das Apo-Mikroorganismen Arthrobacter paraffineus ATCC enzym ist farblos und zeigt keine Aktivität. Seine 218, Arthrobacter paraffineus ATCC 21 219, Bre- Aktivität kann jedoch durch Zusatz von Pyridoxalvibacterium ketoglutamicum ATCC 21 222 oder phosphat zurückgewonnen werden. Der K_m-Wert des