DE2704212A1

DE2704212A1 - Verfahren zur herstellung von l-methionin

Info

Publication number: DE2704212A1
Application number: DE19772704212
Authority: DE
Inventors: Hirotaka Fukumitsu; Kazushige Sumino; Satomi Takahashi; Hideaki Prof Yamada; Koji Yoneda
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1976-02-04
Filing date: 1977-02-02
Publication date: 1977-08-11
Also published as: JPS52125692A; JPS5529678B2; US4148688A

Description

50 7^5 - Dr.T

Anmelder; Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha No. 3, Nakanoshima 3-chome, Klta-ku, Osaka-shi/Japan Verfahren zur Herstellung von L-Methionin

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Methionin aus BL- oder L-N-Carbamoylmethionin unter Verwendung von Zellen oder behandelten Zellen von Mikroorganismen; sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur großtechnischen und wirtschaftlichen Herstellung von L-Methionin, bei dem man auf DL- oder L-N-Carbamoylmethionin eine Kulturbrühe, Zellen oder behandelte Zellen von Mikroorganismen, welche die Carbamoylgruppe von K-Carbamoylmethionin asymmetrisch hydrolysieren können, einwirken läßt.

Im allgemeinen werden optisch aktive L-Aminosäuren durch Fermentation direkt hergestellt oder sie werden hergestellt durch Aufspaltung von chemisch synthetisierten DL-Aminosäuren in ihre optischen Antipoden· Bisher ist kein vorteilhaftes Verfahren zur direkten Herstellung von L-Methionin durch Fermentation bekannt_Tund das L-Methionin wird ausschließlich dadurch hergestellt, daß man chemisch synthetisiertes DL-Methionin einer N-Acetylierung unterwirft und

709832/0977

unter Verwendung des Enzyme Acy läse nur das L-N-Acetylmethionin selektiv hydrolysiert. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß es sehr kostspielig ist, weil die Acetylierung von DL-Methionin durchgeführt werden muß und weil darüber hinaus teure Acylase verwendet werden muß. Das so hergestellte L-Methionin ist teuer und dessen Verwendung ist deshalb bisher auf die Verwendung in Arzneimitteln beschränkt.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Methionin aus DL- oder L-N-Carbamoylnethionin anzugeben, bei dem billige Enzyme von Mikroorganismen verwendet werden. Ziel der Erfindung ist es ferner, ein Verfahren zur wirtschaftlichen Herstellung von L-Methionin anzugeben, das sich für eine großtechnische Herstellung von L-Methionin eignet. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur Aufspaltung von DL-Methionin in die optischen Antipoden anzugeben.

Diese und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung näher erläutert.

Ee wurde nun gefunden, daß die oben genannten Ziele erfindungsgemäß dadurch erreicht werden können, daß man Kulturbrühen, Zellen oder behandelte Zellen von Mikroorganismen bzw. aus diesen gewonnene Enzyme oder Enzymanreicherungen, die bevorzugt die Oarbamoylgruppe von L-N-Carbamoylmethionin (asymmetrisch) hydrolysieren können, auf DL- oder L-N-Carbamoyl-■ethionin einwirken läßt.

Andere ausgedrückt besteht das Verfahren gemäß der Erfindung darin, daß man DL- oder L-F-Carbamoylmethionin der Einwirkung einer Kulturbrühe, Zellen oder behandelten Zellen von Mikroorganismen unterwirft, welche die Fähigkeit haben, die Carb-

709832/0977

amoylgruppe von N-Carbamoylmethionin asymmetrisch zu hydrolysieren·

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann optisch aktives L-Methionin auf wirksame Weise hergestellt werden aus Dlroder L-N-Carbamoylmethionin durch katalytische Einwirkung von Enzymen von Mikroorganismen entsprechend der folgenden Gleichung:

CH_xSCH₀CH₀CHCOOH > CH_xSCH₀CH₀CHCOOH

rorrnim Zellen oder be- * hi HHCOKH_{2 handelte} zellen ^m2

von Mikroorga-[SL oder L] nismen [L]

Der hier verwendete Ausdruck "die Fähigkeit besitzen, die Carbamoylgruppe von N-Carbamoylmethionin(asymmetrisch)zu hydrolysieren" bedeutet,daß die so charakterisierten Produkte bzw. Mikroorganismen die Fähigkeit haben, die Carbamoylgruppe von L-N-Carbamoylmethionin selektiv zu hydrolysieren.

DL-N-Carbamoylmethionin, das durch Umsetzung von DL-Methionin mit Ealiumcyanat hergestellt werden kann, wird dann, wenn es der Einwirkung einer Kulturbrühe, von Zellen oder behandelten Zellen von Mikroorganismen mit der oben angegebenen Fähigkeit unterworfen wird, nur in L-Methionin umgewandelt, praktisch ohne daß D-Methionin gebildet wird. Deshalb stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein neues Verfahren zur Auf. spaltung (Auftrennung) von DL-Methionin in die optischen Antipoden dar. Bisher ist kein Fall bekannt, bei dem es erfolgreich gelungen wäre, unter Verwendung von Enzymen von Mikroorganismen L-Methionin aus N-Carbamoylmethionin herzustellen· Obgleich ein Fall bekannt ist, bei dem versucht wurde, Bacillus coagulans zu verwenden (vgl."Amino Acid and Nucleic Acid", Nr. 19, 48 (1969), wurde dabei keine Bildung

709832/0977

270Λ212

von Methionin "beobachtet. Die vorliegende Erfindung stellt daher die erste Erfindung dar, die sich auf die Reaktion der asymmetrisch hydrolysierbaren Carbamoylgruppe in der N-Stellung unter Verwendung von Enzymen von Mikroorganismen bezieht·

Der Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß optisch aktives L-Methionin in einem großtechnischen Maßstäbe hergestellt werden kann durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Endstufe eines Verfahrens zur Synthese von DL-Methionin, das derzeit in der Praxis bevorzugt .angewendet wird. So wird beispielsweise in dem Verfahren zur Synthese von DL-Methionin, ausgedrückt durch die nachfolgend angegebene Gleichung, 5-(2-Methylthioäthyl)hydantoin, das ein wichtiges Zwischenprodukt darstellt, in der DL-Form gebildet und es wird in der Regel unter alkalischen Bedingungen hydrolysiert unter Bildung von DL-Methionin.

a) CH₅SH + CE₂=CECRO * CH₅SCH₂CH₂CHO

b) CH₅SCH₂CH₂CHO + HCN +

' .' CH₅SCH₂CH₂CH CO

> NH^ yNH

DL-5-(2-Methyithioäthyl)hydantoin

c) CH-SCH₀CH₀CH CO

^{5 2 2}I I H₂O

TlfaTT

CH₅SCH₂CH₂CHCOOh

NHCONH₂ DL-N-C arbamoylme thi onin

CH,SCH_oCH_oCHC00H

CO₂ + NH₅

709832/0977

Es ist bekannt, daß DL-N-Carbamoylmethionin in hohen Ausbeuten erhalten werden kann, wenn man DL-5-(2-Methylthioäthyl)hydantoin unter milden alkalischen Bedingungen hydrolysiert. Optisch aktives L-Methionin kann auf wirksame Weise synthetisiert werden durch Anwendung der optisch spezifischen, biochemischen Reaktion der Erfindung auf das so hergestellte DL-N-Carbamoylmethionin.

Erfindungsgemäß wird DL- oder L-N-Carbamoylmethionin als Ausgangsmaterial verwendet· Im allgemeinen ist es bevorzugt, DL-N-Carbamoylmethionin zu verwenden, das nach einem bekannten Verfahren hergestellt werden kann durch Umsetzung von DL-Methionin mit Ealiumcyanat oder das von DL-5-(2-Methylthioäthyl)hydantoin abgeleitet werden kann, das als Zwischenprodukt im Verlaufe der Synthese von DL-Methionin erhalten wird·

DL- und L-N -Carbamoylmethionin können auch in Form ihrer anorganischen Salze, beispielsweise in Form ihrer Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze, oder in Form ihrer organischen Salze, beispielsweise in Form ihrer Pyridinium- und quaternären Ammoniumsalze angewendet werden, wenn die Reaktion dadurch nicht gehemmt wird. Bei dem N-Carbamoylmethionin und den Salzen davon kann es sich auch um solche handeln, die Verunreinigungen enthalten, wie z.B. ein Reaktionsgemisch, das DL-N-Carbamoylmethionin enthält, das synthetisch hergestellt worden ist, und sie können erfindungsgemäß verwendet werden, wenn die Reaktion dadurch nicht gehemmt (gestört) wird.

Bei den erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen handelt es sich um solche, welche die Fähigkeit haben, die Carbamoylgruppe von N-Carbamoylmethionin asymmetrisch zu hydrolysieren unter Bildung von L-Methionin, und diese Mikroorganismen werden unter den in der Natur vorkommenden wilden Stämmen,

709832/0977

unter den bei öffentlichen Organisationen hinterlegten Stämmen und unter den Mikroorganismen, die durch künstliche Mutation aus diesen Stämmen erhalten worden sind, in der Weise ausgewählt, daß man untersucht, ob sie die oben genannte Fähigkeit haben. Als ein Verfahren zur Untersuchung, ob diese Fähigkeit vorliegt, kann beispielsweise das nachfolgend beschriebene Verfahren angewendet werden:

Zuerst werden alle Zellen durch Zentrifugieren von 10 ml einer Kulturbrühe eines Mikroorganismus gesammelt und dann mit 10 ml eines 0,9 gew.-%igen Salzwassers gewaschen. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugieren gesammelt« Die dabei erhaltenen intakten Zellen (Naßgewicht 200 bis 2000 mg) werden zu 10 ml einer 0,5 bis 1,ü gew.-%igen wäßrigen Lösung von DL-N-Carbamoylmethionin zugegeben. Dann wird die R_eaktion bei einer Temperatur von 30 bis 37°C und bei einem pH-Wert von 7 bis 10 ^O Stunden lang durchgeführt. Erfindungsgemäß wird ein Mikroorganismus verwendet, der L-Methionin mit einem Umwandlungsgrad von nicht weniger als 1 Mo 1-% bildet· Die oben genannten Reaktionsbedingungen stellen jedoch nur ein Beispiel dar und die Erfindung ist keineswegs darauf beschränkt .

Bei den erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen handelt es sich um solche, welche die oben genannte Prüfung bestehen und sie werden ausgewählt aus Bakterien, Actinomyceten, Schimmeln, Hefen und Deuteromyceten. Solche Mikroorganismen sind vom Standpunkt der Taxonomie aus betrachtet bei den verschiedensten Genus zu finden. Beispiele für geeignete Bakterien sind Acromobacter, Aerobacter, Aeromonas, Acrobacterium, Alkaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Previbacterium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Mikrobacterium, Mikrococcus, Protaminobacter, Proteus, Pseudomonas, Sarcina, Staphylococcus und Xanthomonas. Beispiele für geeignte Actinomyceten sind Actinomyces,

709832/0977

Mycobacterium, Nocardia und Streptomyces. Beispiele für geeignete Schimmel sind Arten, die zu Aspergillus gehören· Beispiele für geeignete Hefen sind Candida, Saccharomyces und Torulopsis·

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein intrazelluläres Enzym der Mikroorganismen verwendet und ein solches Enzym kann hergestellt werden durch Kultivierung eines Mikroorganismus auf konventionelle Weise. Obgleich die Kultivierung in der Regel in einem flüssigen Kulturmedium durchgeführt wird, kann auch eine feste Oberflächenkultur angewendet werden. !Da allgemeinen enthält ein Kulturmedium Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Salze und organische Nährstoffe, die von den Mikroorganismen assimiliert werden können. Dem Kulturmedium wird vorzugsweise eine geringe Menge DL- oder L-N-Carbamoylmethionin, bei dem es sich um das Reaktionssubstrat handelt, oder DL-5-(2-Methylthioäthyl)hydantoin zugesetzt, um die Aktivität des gewünschten Enzyms adaptiv zu erhöhen. Die Kultivierungsbedingungen werden ausgewählt aus dem Temperaturbereich von 20 bis 85⁰C und dem pH-Wertbereich von 4- bis 11 entsprechend den optimalen Wachstumsbedingungen des verwendeten Stammes,und in der Regel werden die Mikroorganismen bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C bei einem pH-Wert von 5 Ms 9, 10 bis 75 Stunden lang kultiviert. Während der Kultivierung kann das Wachstum des Mikroorganismus durch' Belüftung und Rühren (Schütteln) beschleunigt werden.

Der auf diese Weise kultivierte Mikroorganismus wird in Form der Kulturbrühe, in Form von Zellen oder behandelten Zellen bei der Hydrolysereaktion von N-Carbamoylmethionin verwendet. Die starke Reaktion wird in der Regel eingeleitet durch Verwendung der Kulturbrühe als solche, welche die Mikroorganismenzellen enthält. In den Fällen, in denen die Komponenten in der Kulturbrühe ein Hindernis für die Reaktion darstellen oder in denen es erwünscht ist, die Menge der

709832/0977

Zellen zu erhöhen, werden von der Kulturbrühe abgetrennte Zellen verwendet· Obgleich die Ziele der Erfindung in zufriedenstellender Weise durch Verwendung von intakten Zellen erreicht werden können, können die Zellen auch in Form von getrockneten Zellen, z.B. in Form von lyophilisierten Zellen und in Form von Acetonpulver, zur Erleichterung der Lagerung oder Handhabung, verwendet werden. Auch können die Zellen in Form von behandelten Zellen, beispielsweise in Form von zerkleinerten Zellen und in Form des Zellextrakts, verwendet werden. Außerdem können diese Zellen und die behandelten Zellen auf übliche Weise unbeweglich gemacht (immobilisiert) werden.

Das Reaktionssubstrat wird in der Regel mit der Kulturbrühe, den Zellen oder den behandelten Zellen in einem wäßrigen Medium gemischt, um die Enzyme der Mikroorganismen katalytisch auf das Substrat einwirken zu lassen. Die Reaktion kann auch in der Weise durchgeführt werden, daß man das Reaktionssubstrat zu einem flüssigen Kulturmedium während der Kultivierung der Mikroorganismen zusetzt.

Die Konzentration des ReaktionsSubstrats, DL- oder L-N-Carbamoylmethionin, wird innerhalb des Bereiches von 0,1 bis 50 Gew.-% ausgewählt· Das Substrat, das in der Regel in gelöster Form vorliegt, kann auch in Form einer Suspension vorliegen. Der pH-Wert des wäßrigen Mediums für die Hydrolysereaktion wird innerhalb des Bereiches von 6 bis 11 ausgewählt und die Reaktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 10 durchgeführt. Wenn der pH-Wert unterhalb 6 liegt, ist die Reaktionsgeschwindigkeit sehr geriig. Wenn der pH-Wert oberhalb 11 liegt, können unerwünschte Nebenreaktionen auftreten. Da der pH-Wert des wäßrigen Mediums mit fortschreitender Hydrolysereaktion ansteigt, ist es zweckmäßig, den optimalen pH-Wert dadurch aufrechtzuerhalten, daß man zu einem geeigneten Zeitpunkt während der Reaktion dem Medium ein Neutralisations-

709832/0977

mittel zusetzt. Als Neutralisationsmittel können Säuren, wie Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure, ▼erwendet werden. Die Hydrolysereaktion wird bei einer Temperatur durchgeführt, die für das Enzym des verwendeten Mikroorganismus geeignet ist, in der Regel bei einer Temperatur von 20 bis 85°C. Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit von der Aktivität des verwendeten Mikroorganismus und der angewendeten Reaktionstemperatur und sie liegt in der Regel innerhalb des Bereiches von 10 bis 100 Stunden.

Das gebildete L-Methionin wird auf konventionelle Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert. So wird beispielsweise nach der Entfernung der unlöslichen Materialien, wie z.B. der Zellen, aus dem Reaktionsgemisch, das L-Methionin durch Durchlaufenlassen des Reaktionsgemisches durch eine Kolonne eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, beispielsweise vom Η-Typ, adsorbiert und dann mit verdünntem wäßrigem Ammoniak aus dem Harz eluiert« Durch Einengen des Eluats erhält man Ir-Methionin-Kristalle ·

Erfindungsgemäß wird nur die L-Porm von H-Carbamoylmethionin in L-Methionin umgewandelt und die D-Form verbleibt in dem Reaktionsgemisch, ohne umgewandelt zu werden. Es wurde nun erfindungsgemäß gefunden, daß optisch aktives N-Carbamoylmethionin in einer stark alkalischen wäßrigen Lösung racemisiert. Deshalb kann das zurückbleibende D-N-Carbamoylmethionin als Reaktionssubstrat wiederverwendet werden, indem man es in die DL-Form umwandelt· Auf diese Weise kann durch Kombinieren des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Racemisierungsstufe L-Methionin auf wirksame Weise aus DL-N-Carbamoylmethionin hergestellt werden, so daß der industrielle Wert der Erfindung sehr hoch ist·

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Die darin angegebenen

709832/0977

Prozentsätze "beziehen sich, wenn nichts anderes angegeben ist, auf das Gewicht·

Beispiel 1

Es wurde ein flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7»O hergestellt, welches die nachfolgend angegebenen Komponenten enthielt, und es wurden 9 ml-Portionen desselben in 70 ml-Teströhrchen gegossen und 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 120⁰C mit Wasserdampf sterilisiert.

.Komponenten des Mediums	0,5 %
Glukose	0,1 %
Hefeextrakt	0,5 %
Pepton	0,5 %
KH₂PO₄	0,02 %
MgSO₄.7H₂O	10 ppm
PeSO₄.7H₂O	10 ppm
MnSO₄

In jedes Teströhrchen wurde 1 ml einer unter sterilen Bedingungen sterilisierten 3*3 %igen wäßrigen Lösung von DL-N-Carbamoylmethionin (pH 7»0) gegeben. Jeder in der weiter unten fo'lgenden Tabelle I angegebenen Mikroorganismus wurde mit einer Platinöse in das Medium eingeimpft (inokuliert) und dann unter Schütteln bei einer Temperatur von 33°C 22 Stunden lang kultiviert. Aus jeder Kulturbrühe wurden durch Zentrifugieren Zellen abgetrennt und mit 5 ml einer 0,9 %igen Kochsalzlösung gewaschen. Die aus Jeder Kulturbrühe erhaltenen Zellen wurden in einem Gemisch der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung suspendiert.

709832/0977

270Α2Ί2

"3

Zusammensetzung der Mischung

1.) 5»0 ml einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 7»6, die 2,0 % DL-N-Carbamoylmethionin enthielt (Substratgehalt: 100 mg)

2.) 5,0 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,6

In der Mischung der oben angegebenen Lösungen (1) und (2) wurden die Zellen suspendiert und die Reaktion wurde 40 Stunden lang beim Stehenlassen bei 33⁰O durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert und die Methioninmenge in der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde durch ein biologisches Nachweisverfahren (Bioassay) unter Verwendung eines L-Methionin benötigenden Stammes bestimmt. Außerdem wurde das Produkt einer Silicagel-Dünnschichtchromatographie (Lösungsmittel: n-Butanol/Essigsäure/Wasser » 4/1/1) unterworfen, um den Methioninfleck abzutrennen, und die Methioninmenge wurde durch Entwicklung der Farbe mit Ninhydrin kolorimetrisch bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben.

709832/0977

Tabelle I

Stamm

Menge an
gebildetem Ir-Methionin

C mg./ml.)

Umwandlung

(Mo1-%)

Achromobacter polymorph 0.35

Achromobacter superficialis 0.30

Aerobacter cloacae IAM 1221 0.70

Aeromonas punctata IAM 1646 0.35

Agrobacterium rhizogenes IFO 13259 1.45 Alcaligenes faecalis IAM 1015 0.30

Arthrobacter ureafaciens IFO 12140 0.10 Bacillus circulans IFO 3329 0.25

Bacillus licheniformis IFO 12195 0.10 Bacillus megaterium IFO 3003 0.40

Bacillus purailus IFO 3028 0.40

Brevibacterium flavum ATCC 21129 0.10

Corynebacterium sepedonicum IFO 3306 3.70

Enterobacter cloacae IFO 13535 0.05

Erwinia aroideae IFO 12380 0.10

Escherichia coli ATCC 8739 0.45

Klebsiella pneumoniae IFO 3319 0.20

Microbacterium flavum ATCC 10340 0.17

Micrococcus roseus IFO 3764 0.28

Mycobacterium smegmatis ATCC 607 2.60

Nocardia corallina IFO 3338 0.20

Protaminobacter ruber IFO 3708 0.40

Proteus mirabilis IFO 3849 0.10

Pseudomonas aeruginosa IFO 3445 0.55

Pseudomonas solanacearum IFO 12510 0.10

4.5 3.9 9.0

4.5 18.7 3.9 1.3 3.2 1.3 5.2 5.2 1.3 47.7 0.6 1.3 5.8 2.6 2.2 3.6 33.5 2.6 5.2 1.3 7.1 1.3

709832/0977

Portsetzung von Tabelle I

Stamm

Menge an gebildetem L-Methionin

mg. /ml.

Umwandlung

(MoI-?

Sarcina lutea IPO 3232" Sarcina variabilis IFO 3067 Staphylococcus aureus IFO 12732 Xanthomonas campestris IAM 1671

0.55 0.40 0.10 0.45

7.1 5.2 1.3 5.8

Fußnoten;

Die in der vorstehenden Tabelle I angegebenen Katalognummern der Stämme geben die Stämme an, die bei der folgenden Organisation hinterlegt wurden (dies gilt auch für die weiter unten folgende Beschreibung): IAM: Institute of Applied Microbiology, Universität von

Tokyo (Japan)

IFO: Institute for Fermentation, Osaka (Japan) ATCC'.American Type Culture Collection (USA)

Beispiel 2

Es wurde ein flüssiges Kulturmedium mit einem pH-Wert von 7,0 hergestellt, welches die folgenden Komponenten enthielt, und es wurden 9 ml-Portionen desselben in 70 ml Test-Röhrchen gegossen und 10 Minuten lang bei 120°C mit Wasserdampf sterilisiert·

Komponenten des Mediums

Glukose

Sojabohnenmehl

Hefeextrakt

Fleischextrakt

KCl

2,0 % 1,0 % 0,25 % 0,1 % 0,4 % 0,5 % 0,02 %

709832/0977

Zu Jedem Teströhrchen wurde 1 ml einer 2 %igen wäßrigen Lösung von DL-N-Carbamoylmethionin zugegeben, die unter sterilen Bedingungen sterilisiert worden war (pH 7»O). Jeder in der folgenden Tabelle II angegebene Mikroorganismus wurde mit einer Platinöse in das Medium eingeimpft (inokuliert) und dann unter Schütteln 40 Stunden lang bei 30°C kultiviert. Von jeder Kulturbrühe wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 5 ml einer 0,9 %igen Kochsalzlösung gewaschen. Die aus Jeder Kulturbrühe erhaltenen Zellen wurden in einer Mischung der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung suspendiert:

Zusammensetzung der Mischung

1.) 5,0 ml einer wäßrigen Substrat lösung mit einem pH-Wert von 7,6, die 2,0 % DL-N-Carbamoylmethionin enthielt (Substrat geh alt 100 mg)

2.) 5,0 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7»6

In der Mischung der oben angegebenen Lösungen (1) und (2) wurden die Zellen suspendiert und die Reaktion wurde Stunden lang bei 33⁰C durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Menge des gebildeten L-Methionins auf die gleicherweise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

gebildetem Umwandlung L-Methionin

fing./ml.) (Mol-%)

Streptomyces almquisti ATCC 618 0.13 1.7

Streptomyces aureus IFO 3175 0.42 5.4

Streptomyces flaveolus IFO 3408 0.50 6.4

Actinomyces griseoruber IFO 12872 0.37 4.8

709832/0977

270A212

Beispiel 3

In einen 2 1-Schüttelkolben wurden 300 ml eines flüssigen Kulturmediums mit einem pH-Wert von 7*0 eingeführt, welches die nachfolgend angegebenen Komponenten enthielt, und die Wasserdampfsterilisation wurde 15 Hinuten lang bei 120⁰C durchgeführt·

Komponenten des Mediums

Glukose 1,0 %

Pepton 0,5 %

Fleischextrakt 0,2 % Hefeextrakt 0,5 %

KH₂PO₄ 0,1 %

MgSO₄-TH₂O 0,04 %

PeSO₄.7H₂O 3 ppm

MnSO₄ 3 ppm

Nach der Zugabe von sterilisiertemDL-N-Carbamoylmethionin zu dem flüssigen Kulturmedium in einer Menge von 0,3 % wurden 10 ml einer Zellsuspension von Corynebacterium sepedonicum IPO 3306, die vorher in dem gleichen Kulturmedium wie oben kultiviert worden war, in das Kulturmedium eingeimpft (inokuliert) und dann wurde die Kultivierung 22 Stunden lang unter Schütteln bei 33°C durchgeführt. Aus der dabei erhaltenen Kulturbrühe wurden durch Zentrifugieren Zellen abgetrennt und diese wurden mit 100 ml einer 0,9 #igen Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurden 50 ml einer 0,9 #igen Kochsalzlosung zu den Zellen zugegeben unter Bildung einer Zellsuspension.

Ein sterilisierter 500 ml-Glasschliff-Erlenmeyer-Kolben wurde mit einer Mischung der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung beschickt und die Reaktion wurde beim Stehenlassen 2 Tage lang bei 33°C durchgeführt.

709832/0977

270Λ2Ί2

Zusammensetzung der Mischung;

1.) 50 ml einer wäßrigen Substrat lösung mit einem pH-Wert von 7,6, die 3,0 % DL-N-Carbamoylmethionin enthielt, 2.) 50 ml einer 0,2 H Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,6 (die außerdem 6 ppm FeSO^.7H₂O und 6 ppm Mn³O^. enthielt) , '
3.) 50 ml der oben angegebenen Zellsuspension.

Nach Beendigung der Reaktion wurde festgestellt, daß in der Reaktionsmischung Methionin in einer Menge von 3 »85 mg/ml gebildet worden war. Die Umwandlung betrug 49,6 Mol_%.

Nach der Abtrennung der Zellen aus der Reaktionsmischung durch Zentrifugieren wurde das Methionin durch Hindurchleiten der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit durch eine Kolonne mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz vom Η-Typ adsorbiert und dann mit verdünntem wäßrigem Ammoniak aus dem Harz eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 480 mg kristallines Methionin erhielt. Das spezifische Drehvermögen des auf diese Weise isolierten Methionine betrug Ca]Jp - +22,0° (c = 1, 5 η HCl) und dasjenige von authentischem L-Methionin betrug CotJip = +22,5°, Auch der papierchromatographische Rf-Wert, erhalten unter Verwendung einer Mischung aus zwei Lösungsmitteln als Entwicklungslösungsmittel, der Wert der Elementaranalyse und das Infrarotspektrum des isolierten Methionins stimmten mit denjenigen des authentischen L-Methionins überein. Das Reaktionsprodukt wurde als optisch aktives L-Methionin identifiziert.

Durch Verwendung anderer Mikroorganismen, wie sie in der Tabelle I oder II aufgezählt worden sind, beispielsweise durch Verwendung von Aerobacter cloacae IAM 1221, Agrobacterium rhizogenes IPO 13259, Xanthomonas campestris IAM 1671, Feeudomonas aeruginosa IPO 344-5, Sarcina lutea IPO 3232, Escherichia coli ATCC 8739 _f Bacillus pumilus IPO 3028 und

709832/0977

Streptomyces flaveolus IFO 3^08₁ wurden außerdem Reaktionsprodukte erhalten, die auf die oben angegebene Weise ebenfalls als L-Methionin identifiziert wurden.

Beispiel 4-

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 wurden 50 ml einer wäßrigen Zellsuspension von Corynebacterium sepedonicum IPO 3306 hergestellt. Dann wurden zwei Arten von Mischungen mit den nachfolgend angegebenen Zusammensetzungen hergestellt und die Hydrolysereaktion wurde jeweils auf die gleiche Weise wie .in Beispiel 3 durchgeführt.

Zusammensetzung der Mischung A

1.) 25 ml einer wäßrigen Substratlösung mit einem pH-Wert

von 7»6, die 3»0 % L-N-Carbamoylmethionin enthielt ,, 2.) 25 ml einer 0,2 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7f6 (die außerdem 6 ppm FeSO^.7BUO und 6 ppm MnSo^

enthielt)_Λ
3«) 25 ml der oben angegebenen Zellsuspension.

Zusammensetzung der Mischung B

Die Zusammensetzung der Mischung B war die gleiche wie diejenige der Mischung A, jedoch mit der Ausnahme, daß die Komponente (1) der Mischung A durch 25 ml einer wäßrigen Substratlösung mit einem pH-Wert von 7,6, die 3,0 % D-N-Oarbamoylmethionin enthielt, ersetzt wurde.

Diese Mischungen wurden jeweils in einen sterilisierten 200 ml-Erlenmeyer-Schliffkolben eingeführt zur Durchführung der Hydrolysereaktion. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Menge an gebildetem L-Methionin bestimmt. Es wurde festgestellt, daß das L-Methionin in der Reaktionsmischung A in einer Menge von 3,30 mg/ml gebildet wurde, daß jedoch in der Reaktionsmischung B weder D- noch L-Methionin gebildet wurde.

7 09832/0977

ZO

Beispiel 5

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 wurden 50 ml einer wäßrigen Zellsuspension von Corynebacterium sepedonicum IPO 3306 hergestellt. Es wurden auch 0,2 M Phosphatpufferlösungen mit einem pH-Wert von 5,0, 5»5» 5,8, 6,1, 6,6, 7,2, 7,8 und 8,4 sowie Na₂CO,-NaHCO,-Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 9,0, 9,5| 10,0 und 10,7 hergestellt. Dann wurden Mischungen der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung hergestellt und jeweils in Teströhrchen eingeführt. Die Hydrolysereaktion wurde 44 Stunden lang bei 33°C durchgeführt.

Zusammensetzung der Mischung

1.) 2,0 ml der oben angegebenen Pufferlösung, 2.) 2,0 ml einer wäßrigen Substratlösung, die 3,0 % L-N-Carbamoylmethionin enthielt, die auf den gleichen pH-Wert

wie die Pufferlösung eingestellt wurde ^ 3·) 2,0 ml der oben angegebenen Zellsuspension.

Nach Beendigung der Reaktion wurde die Menge an gebildetem Methionin mit einem biologischen Nachweisverfahren (Bioassay) und kolorimetrische Messungen wie in Beispiel 1 bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III angegeben. Dabei wurde gefunden, daß der optimale pH-Wert der Hydrolysereaktioni des L-N-Carbamoylmethionins bei Verwendung von Corynebacterium sepedonicum IFO 3306 innerhalb des Bereiches von 7 bis 8,5 lag.

709832/0977

Tabelle III

pH-Wert L-Methionin

zu Beginn nach Beendi- Menge an gebilder Reaktion gung der Re- detem L-Methio- Umwandlung "■ .. aktion nin

(mg. /ml.) (Mol-SO

5.0 5.4 '+ <1

5.5 5.9 + <1 5.8 6.0 + <1

6.1 6.4 + <1

6.6 6.9 1.0 13

7.2 7.5 3.2 41 7.8 8.1 3.5 . 45

8.4 8.7 3.8 49 9.0 9.6 2.3 30

9.5 9.7 2.2 28 10.0 9.8 1.8 23 10.7 9.9 1.1 14

Beispiel 6

Es wurde ein flüssiges Kulturmedium mit einem. pH-Wert von 7_t6» welches die nachfolgend angegebenen Komponenten enthielt, hergestellt und es wurden 9 ml-Portionen desselben in Teströhrchen gegossen und 10 Minuten lang bei 120⁰C mit Wasserdampf sterilisiert.

709832/0977

XX

Komponenten des Mediums

Saccharose

Hefeextrakt

KH₂PO₄
MgSO₄.TH₂O
CaCO_x

10,0 %
0,2 %
0,2 %
0,1 %
0,1 %
0,2 %

Zu jedem Teströhrchen wurde 1 ml einer 3,0 %igen wäßrigen Lösung von sterilisiertem DL-N-Carbamoylmethionin (pH 7,0) unter sterilen Bedingungen zugegeben. Jeder Mikroorganismus, wie er in der folgenden Tabelle IV angegeben ist, wurde aus einer Vorratsschrägkulfcur mit einer Platinöse überimpft (inokuliert) und unter Schütteln 40 Stunden lang bei 30⁰C kultiviert. Dann wurden unter Verwendung von Zellen, die aus jeder Kulturbrühe auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 abgetrennt worden waren, die Hydrolysereaktionen von DL-NHJarbamoylnethionin unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Nach Beendigung der E_eaktion wurde die Menge an gebildetem L-Methionin auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Stamm

Menge an gebildetem L-Methionin

Umwandlung

(mg./ml.) (Mq1~90

Candida intermedia IFO 0761 0.20

Saccharomyces cerevisiae IFO 0971 0.10 Torulopsis fanata IFO 0728 0.10

2.6

1.3 1.3

Ϊ09832/0977

Beispiel 7

Es wurde ein flüssiges Kulturmedium mit einem pH-Wert von 6,0 hergestellt, welches die nachfolgend angegebenen Komponenten enthielt, und in einer Menge von 9 ml in ein Teströhrchen eingeführt und 10 Minuten lang bei 120°C mit Wasser dampf sterilisiert·

Komponenten des Mediums	10,0 %
Glukose	0,2 %
Pepton	0,2 %
KNO₃	1,0 %
(NH₄)H₂PO₄	0,05 %
\t mQa OTT Λ	0,01 %
CaCl₂

Eine sterilisierte wäßrige Lösung mit einem pH-Wert von 7»0, die 3,0 % DL-N -Carbamoylmethionin enthielt, wurde unter sterilen Bedingungen in das Teströhrchen eingeführt und mit einer Platinöse wurde Aspergillus nigar IAM 300? eingeimpft (inokuliert). Die Kultivierung wurde 40 Stunden lang unter Schütteln bei 26⁰C durchgeführt. Unter Verwendung von Zellen, die aus der dabei erhaltenen Kulturbrühe auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 abgetrennt worden waren, wurde die Hydrolysereaktion von DL-N-Carbamoylmethionin durchgeführt und die Bestimmung des gebildeten L-Methionins erfolgte' auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1. Die Menge an gebildetem L-Methionin betrug 0,10 mg/ml und die Umwandlung betrug 1,3 Mol-%.

709832/0977

ORIGINAL INSPECTED

Claims

50 7^5 - Dr.T

Anmelder: Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha

No. 3, Nakanoshima 3-chome, Kita-ku, Osaka-shi/Japan

Patentansprüche

, 1. / Verfahren zur Herstellting von L-Methionin, dadurch gekennzeichnet, daß man Kulturbrühen, Zellen oder behandelte Zellen bzw. aus diesen gewonnene Enzyme oder Enzymanreicherungen, die bevorzugt die Carbamoylgruppe von Ir-N-Carbamoylmethionin hydrolysieren, auf DL- oder L-N-Carbamoylmethionin einwirken läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zellen intakte Zellen oder getrocknete Zellen verwendet .

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als behandelte Zellen zerkleinerte Zellen oder Zellextrakte verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen unbeweglich macht (immobilisiert).

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die behandelten Zellen unbeweglich macht (immobilisiert).

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man Kulturbrühen, Zellen oder behandelte Zellen eines Mikroorganismus in einem wäßrigen Hedium mit einem pH-Wert von 6 bis 11 auf DL- oder L-N-Carbamoylmethionin einwirken läßt.

709832/0977

ORIGINAL INSPECTED

7· Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen Vertreter aus der Gruppe Achromobacter, Aerobacter, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Microbacterium, Micrococcus, Protaminobacter, Proteus, Pseudomonas, Sarcina, Staphylococcus, Xanthomonas, Actinomyces, Mycobacterium, Nocardia, Streptomyces, Aspergillus, Candida, Saccharomyces und Torulopsis verwendet.

8· Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß man Kulturbrühen, Zellen oder behandelte Zellen eines Mikroorganismus aus der Gruppe Corynebacterium, Mycobacterium und Agrobacterium in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7 bis 10 auf DL-N-Carbamoylmethionin einwirken läßt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen solchen verwendet, der in einem Kulturmedium kultiviert worden ist, das mindestens einen Vertreter aus der Gruppe DL-N-Carbamoylmethionin, L-N-Carbamoylmethionin und DL-5-(2-Methylthioäthyl)hydantoin enthält, um die Fähigkeit des Mikroorganismus, die Carbamoylgruppe von N-Carbamoylmethionin asymmetrisch zu hydrolysieren, zu verbessern.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das L-Methionin aus der Behandlungslösung isoliert.

709832/0977