DE1293776B

DE1293776B - Verfahren zur Herstellung von L-Methionin

Info

Publication number: DE1293776B
Application number: DE1962S0081084
Authority: DE
Inventors: Takesue Shigeshi; Yokouchi Toshio
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1961-08-25
Filing date: 1962-08-24
Publication date: 1969-04-30
Also published as: DK105152C; GB970203A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Methionin.

L-Methionin oder L-y-Methylmercapto-a-aminon-buttersäure ist eine der essentiellen Aminosäuren und hat nicht nur als Medikament, sondern auch als Nährsubstanz für den Menschen große Bedeutung.

Chemische Synthesen von DL-Methionin sind bekannt. Es ist jedoch notwendig, eine Trennung des DL-Methionins auf chemischem oder biochemischem Wege durchzuführen, um das technisch wichtige L-Methionin zu erhalten.

Bei der bekannten Methode wird also nur die Hälfte des chemisch synthetisierten DL-Methionins nutzbar gemacht. Außerdem benötigt man ein umständliches Verfahren, um die wertvolle Verbindung aus dem Isomerengemisch abzutrennen.

Es ist deshalb Ziel der Erfindung, ein billiges, einfaches und industriell vorteilhaftes Verfahren zu entwickeln, das L-Methionin in hoher Ausbeute liefert

Das Verfahren der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Pseudomonas denitrificans IAM-1923, Pseudomonas xanthe IAM-1310, Serratia marcescens IAM-1135, Streptomyces erythreus IAM-1652, Penicillium islandicum IAM-7040 oder Torula lactis IAM-1352 in einem Nährmedium bei einem pH-Wert von 6,5 bis 9,0 und einer Temperatur von 25 bis 4O⁰C züchtet, welches y-Methylmercapto-«-hydroxybuttersäure oder ein Salz davon enthält, und das in der Gärbrühe angereicherte L-Methionin isoliert.

Besonders brauchbar ist ein neuer Stamm, der im nachstehenden als Pseudomonas Nr. G-132-13 bezeichnet wird. Er zeichnet sich durch besondere Fähigkeit aus, y-Methylmercapto-a-hydroxybuttersäure in L-Methionin umzuwandeln, und zeigt dabei nicht die Neigung, das erzeugte L-Methionin abzubauen. Das gewünschte Produkt wird daher in der Gärbrühe in höherer Ausbeute angereichert.

Der Stamm Pseudomonas G-132-13 gehört nach Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (7. Auflage) zu Pseudomonas denitrificans. Dieser Stamm ist bei der öffentlichen Sammelstelle am Institute for Applied Microbiology, Tokyo University, Tokyo, als Pseudomonas denitrificans IAM-1923 hinterlegt und

4. Stichgelatine

(1) Wachstum Oberfläche

(2) Verflüssigung keine

5. Flüssige Kultur

(1) Oberflächenwachstum ringförmig

(2) Sediment wenig

(3) Trübung ja

(C) Physiologische Kennzeichen

1. Temperatur

(1) Optimum 25 bis 3O⁰C

(2) Wärmetod 70⁰C, 10 Minuten

2. pH-Optimum 6 bis 8

3. Abhängigkeit von freiem
Sauerstoff aerob

4. Wirkung von Nitraten ... reduzierbar

5. H₂S-Erzeugung positiv

6. Indolerzeugung negativ

7. Einwirkung auf Stärke ... keine Hydrolyse

8. Voges-Proskauer-Reaktion negativ

9. Methylrot-Reaktion negativ

10. Lakmosmilch

(1) Reaktion leicht alkalisch

(2) Koagulation keine

11. Urease positiv

12. Einwirkung auf Kohlenhydrate

Glucose +

Xylose +

Sucrose

Lactose

Raffinose

Dextrin

Mannose

Glycerin

Mannit

Vitaminbedarf Thiamin

Säureproduktion

Gasproduktion

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vorzugsweise der obenkann unter dieser Bezeichnung von dort erworben 45 genannte Mikroorganismus in einem Kulturmedium werden. gezüchtet.

Die morphologischen Kennzeichen des Stammes Pseudomonas Nr. G-132-13 sind wie folgt:

(A) Vegetative Zelle

1. Form Stäbchen

2. Größe 0,8 bis 1 · 2,3 μ

3. Beweglichkeit beweglich _ . ._;

4. Geissei Monotricha

5. Sporen keine Sporenbildung

6. Gram negativ

(B) Kultureigenschaften

1. Oberflächenkulturen

(1) Form kreisförmig

(2) Rand ganz

(3) Erhöhung konvex

(4) Farbe grauweiß

2. Schrägagar

(1) Wachstumsform fadenförmig

(2) Farbe grauweiß

3. Stichagar

Wachstum nur Oberfläche

Das Medium muß y-Methylmercapto-a-hydroxybuttersäure oder ein Salz davon enthalten. Die Säure kann in der L-Form, der D-Form oder der dl-Form vorliegen. In diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß das erfindungsgemäße Verfahren den wesentlichen Vorteil hat, sogar D-y-Methylmercapto-. Ä-hydroxy-buttersäure in das gewünschte L-Methionin umwandeln zu können. Die y-Methylmercapto-ahydroxybuttersäure kann dem Nährmedium als freie Säure oder als wasserlösliches Salz, z. B. als Calcium-, Ammonium- oder Natriumsalz zugesetzt werden. Die Menge an Säure bzw. Salz kann in weitem Bereich variieren, beispielsweise von 1 bis 10 °/₀ (als freie Säure),

und beträgt vorzugsweise etwa 2 bis 5 °/₀, bezogen auf das Gesamtgewicht des Kulturmediums (Gewichtsprozent).

Abgesehen von y-Methylmercapto-a-hydroxybuttersäure oder eines ihrer Salze kann das Medium aus beliebigen Bestandteilen zusammengesetzt werden, die üblicherweise für die Fermentation von Mikroorganismen verwendet werden. Das Medium wird also Kohlenstoff- und Stickstoffh'eferanten enthalten.

Die Nährstoffe können natürlichen oder künstlichen tion-Elutionsvorgang bei Verwendung eines der-

Ursprunges sein und sind vorzugsweise flüssig. artigen Ionenaustauscherharzes ist dem Fachmann für

Wenn nötig, können Mineralien (anorganische Salze) die Gewinnung von Aminosäuren bekannt, so daß

zugesetzt werden. Beispiele anorganischer Salze sind sich eine ins einzelne gehende Erläuterung hier er-

Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, 5 übrigt.

Ferrosulfat, Zinksulfat, Mangansulfat usw. Als Die Erfindung ist im nachstehenden beispielsweise

Kohlenstofflieferanten können übliche organische beschrieben.

Quellen verwendet werden, wie Glucose, Xylose, B e i s d i e 1 1

Rohrzucker, Glycerin, Stärke usw. Als Stickstoff-

quellen kommen in Betracht: Pepton, Hefeextrakt, io Aus den folgenden Bestandteilen wurde ein Gär-

Fleischextrakt, Getreidemaischwasser usw. medium angesetzt:

Es hat sich gezeigt, daß der Stickstoff zweck- Calciumsalz der DL-y-Methylmercapto-

maßigerweise als Ammoniak im Nahrmedium vor- «-hydroxybuttersäure 20 g

liegen soll. Dieses sollte also Ammoniak, seine Glucose 20 ε

Salze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, 15 Getreidemaischwasser"'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 40 g

Ammoniumphosphate usw. und/oder organische Ammoniumchlorid 10 g

Ammoniumderivate (in weitem Sinne) wie Harnstoff, Monokaliumphosphat 0,5 g

Aminosäuren, Proteine usw. enthalten, weil dadurch Magnesiumsulfat 0,1 g

die Bildung von L-Methiomn begünstigt wird. Der Wasser bis 11
Ammoniaklieferant wird vorzugsweise in einer Menge ao

von 1,2 bis 3 Mol (berechnet als Ammoniak) pro Mol Das Medium wurde auf pH 7,8 eingestellt und

der ursprünglich in dem Nährmedium anwesenden mit einer Impfung PseudomonasdenitrificansIAM-1923

y-Methylmercapto-a-hydroxybuttersäure bzw. ihres (Nr. G-132-13) versetzt. Dann wurde die Kultur

Salzes zugesetzt. 48 Stunden bei 30°C geschüttelt. Nach der Inku-

Zur Durchführung der Gärung ist der Submers- as bation wurde die Gärbrühe, die 13,2 g L-Methionin prozeß mit Belüftung geeignet, wenn auch Schüttel- enthielt, mit Salzsäure auf pH 3,6 gebracht und auf oder Stationärkulturen angewandt werden können; 100°C erhitzt. Die heiße Brühe wurde mit Aktivauf jeden Fall arbeitet man bei einer Temperatur von kohle versetzt, und die Mischung wurde filtriert. 25 bis 40⁰C, vorzugsweise bei etwa 30° C. Der pH-Wert Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Das des Mediums wird während der Fermentation durch 30 Konzentrat wurde mit Ätznatron auf pH 5,6 geZugabe von Säure oder Base zwischen 6,5 und 9,0, bracht, und beim Abkühlen fiel kristallisiertes L-Mevorzugsweise etwa 7,8 bis 8,5 gehalten werden. Die thionin aus. Die Kristalle wurden gesammelt und Gärung wird fortgesetzt, bis die Umwandlung der aus Wasser umkristallisiert. Die Ausbeute an L-Mey-Methylmercapto-Ä-hydroxybuttersäure in L-Me- thionin betrug 10,6 g. Die spezifische optische Drehung thionin den gewünschten Grad erreicht hat. Im all- 35 war [oc] ²S = +23,40 (0,2n-HCl).
gemeinen wird die Fermentation 1 bis 3 Tage fortgesetzt. Auf diesem Wege erhält man eine Gärbrühe, Beispiel 2
die L-Methionin enthält, welches aus y-Methylmer-

capto-a-hydroxybuttersäure gebildet und während der Pseudomonasdenitrificans IAM-1923 (Nr. G-132-13)

Fermentation angereichert wurde. Nach diesem Ver- 40 wurde in 11 des Gärmediums (pH 7,8) folgender

fahren wird L-Methionin in einer Ausbeute bis zu Zusammensetzung eingeimpft:

⁸⁰x Λ ?⁵°^{/o erhalte}«> ^bezofⁿ ^au! ^die eingesetzte Ammoniumsalz der DL-y-Methyl-

7-Methylmercapto-«-hydroxybutter_Saure mercapto-^-hydroxybuttersäure 2,64%

Die Isolierung des L-Methionms aus der Garbruhe Glucose 5°/

läßt sich leicht auf jede Weise durchführen, die dem 45 Getreidemaischwasser''.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 2%

Fachmann für die Isolierung einer Aminosäure aus Ammoniumchlorid 0,25 »/„

einer Garbruhe bekannt ist. So wird beispielsweise Wasser bis 11
Aktivkohle zwecks Entfärbung zu der Gärbrühe zugesetzt, deren pH-Wert mit einer anorganischen Säure Nach 48stündiger Schüttelkultur bei 3O⁰C wurde wie Salzsäure, Schwefelsäure usw. oder einer orga- 50 eine Gärbrühe erhalten, die 20,9 g L-Methionin nischen Säure wie Oxalsäure, Essigsäure usw. auf enthielt.

einen sauren Wert (z. B. pH 2 bis 5) gebracht wird, um Die Brühe wurde in der gleichen Weise wie im

Verunreinigungen, wie Protein, auszufällen, und Beispiel 1 behandelt. Es wurden 17,8 g reine L-Me-

dann wird die Brühe durch Zentrifugieren oder ein- thioninkristalle erhalten,

fache Filtrierung mit oder ohne Filterhilfe filtriert. 55 . . . _

Das Filtrat wird auf einen pH-Wert gebracht, der B e 1 s ρ 1 e l J

etwa dem isoelektrischen Punkt von L-Methionin Pseudomonas denitrificans IAM-1923 (G-132-13)

entspricht bzw. auf einen pH-Wert von 5,6 bis 6,0, wurde in 1,51 des gleichen Mediums wie im Beispiel 2

vor oder nach der Konzentration (beispielsweise im gebracht und einer 24stündigen Schüttelkultur bei

Vakuum), worauf das L-Methionin ausfällt. Der 60 30⁰C unterworfen. Die Impfkultur wurde dann in

Niederschlag wird gesammelt und kann auf übliche einen Fermenter gebracht, der 1501 des gleichen

Weise umkristallisiert werden. Die Arbeitsvorschriften Gärmediums enthielt. Die Submersgärung wurde

für die Gewinnung des besagten Filtrates sind nicht unter Rühren bei 30⁰C durchgeführt. Dabei wurde

kritisch. So kann die Gärbrühe nach der Filtration mit eine Belüftung mit 150 l/Min, und einem inneren

entfärbender Holzkohle bei pH 2 bis 5 versetzt und 65 Überdruck von 0,3 bis 0,5 kg/cm² durchgeführt;

dann filtriert werden. der pH-Wert des Mediums wurde während der Gärung

Die Isolierung kann auch mit Hilfe eines Ionen- auf 7,8 bis 8,0 gehalten, indem eine alkalische Lösung

austauscherharzes durchgeführt werden. Der Adsorp- zugegeben wurde. Nach 44stündiger Inkubation

Claims

5 6

wurden 1501 Gärbrühe erhalten, die 3,07 kg L-Me- wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 1,61 g reine

thionin enthielten. Die Gärbrühe wurde in der gleichen L-Methioninkristalle erhalten wurden.

Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 2,30 kg _R . · ι ο

reine L-Methioninkristalle erhalten wurden. Beispiel 8

-....,. 5 Ein Gärmedium wurde aus den folgenden Bestand-

B ei spiel 4 teilen bereitet:

Pseudomonas xanthe IAM-1310 wurde in 11 des Calciumsalz der DL-y-Methyl-

gleichen Mediums wie im Beispiel 1 geimpft und mercapto-a-hydroxybuttersäure 10 g

einer 48stundigen Schuttelkultur bei 30 C unter- Glucose 20 g

worfen. Nach der Inkubation wurde die Gärbrühe, io Penton 5 ε

die 11,4 g L-Methionin enthielt, in der gleichen Weise Fleischextrakt 5 ε

wie im Beispiel 1 aufgearbeitet, wobei 8,6 g reine Hefeextrakt 3 g

L-Methioninkristalle erhalten wurden. Ammoniumchiorid '.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 5 g

Beispiel 5 Monokaliumphosphat 0,5 g

., , , ,., ^.. ,. . . η · · , ^ ¹⁵ Magnesiumsulfat 0,1g

11 des gleichen Garmediums wie im Beispiel 1 Wasser bis 11
wurde mit Serratia marcescens IAM-1135 beimpft

und einer 72stündigen Schüttelkultur bei 30⁰C unter- Das Medium wurde auf pH 6,8 eingestellt, mit worfen. Nach der Inkubation enthielt die Gärbrühe Torula lactis IAM-1352 beimpft und einer 96stündi-10,8 g L-Methionin. Sie wurde in der gleichen Weise so gen Schüttelkultur bei 27° C unterworfen. Nach wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 8,1 g reine L-Me- der Inkubation enthielt die Gärbrühe 1,02 g L-Methioninkristalle erhalten wurden. thionin. Sie wurde in der gleichen Weise wie im . if- Beispiel 1 behandelt, wobei 0,71 g reine L-Methionin-Beispiel 6 kristalle erhalten wurden.

11 des gleichen Mediums wie im Beispiel 1 wurde 25

mit Streptomyces erythreus IAM-1652 beimpft und Fatentansprucn:

einer 72stündigen Schüttelkultur bei 30° C unter- Verfahren zur Herstellung von L-Methionin,

worfen. Nach der Inkubation enthielt die Gärbrühe dadurch gekennzeichnet, daß man

2,1 g L-Methionin. Sie wurde in der gleichen Weise den Mikroorganismus Pseudomonas denitrificans

wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 1,47 g reine 30 IAM-1923, Pseudomonas xanthe IAM-1310, Ser-

L-Methioninkristalle erhalten wurden. ratia marcescens IAM-1135, Streptomyces ery-

. . threus IAM-1652, Penicillium islandicum IAM-7040

Beispiel 7 _{oder Torula lactis IAM}.₁₃₅₂ j_{n emem} Nähr-

11 des gleichen Kulturmediums wie im Beispiel 1 medium bei einem pH-Wert von 6,5 bis 9,0 und

wurde mit Penicillum islandium IAM-7040 beimpft 35 einer Temperatur von 25 bis 40° C züchtet, welches

und einer 72stündigen Schüttelkultur bei 30°C unter- y-Methylmercapto-a-hydroxybuttersäure oder ein

worfen. Nach der Inkubation enthielt die Gärbrühe Salz davon enthält, und das in der Gärbrühe

2,3 g L-Methionin. Sie wurde in der gleichen Weise angereicherte L-Methionin isoliert.