DE1947038A1

DE1947038A1 - Verfahren zur Herstellung von Monohydroxycarbonsaeuren

Info

Publication number: DE1947038A1
Application number: DE19691947038
Authority: DE
Inventors: Osami Yagi; Kouichi Yamada
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1969-07-09
Filing date: 1969-09-12
Publication date: 1971-01-21
Also published as: US3720584A; JPS4814074B1; DE1947038B2; DE1947038C3; GB1248833A

Description

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^ί^Αί 979/13196 DE 12. September 1969

Patentanmeldung

der Firma

Nippon Oil Company, Limited, 3-12 Fishi-Shinbashi 1-chome Minato-Ku, Tokyo/Japan

"Verfahren zur Herstellung- von Monohydroxycarbonsäuren"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Monohydroxyöarbonsäuren mittels gewisser Mikroorganismen und insbesondere ein technisches Verfahren zur Herstellung solcher brauchbarer Produkte wie Milchsäure und dergleichen durch bakterielle Gärung unter aeroben Bedingungen*

Zusammenfassend gesagt, beruht

das Verfahren dieser

Erfindung auf dem Impfen eines,Kultursubstrates, das Glykole als assimilierbare Kohlenstoff-Quelle enthält, mit einem aus Erde isolierten, und zu den Gattungen Arthrobaeter, Alcaligenes oder Fusarium gehörendem Stamm, aerobem Bebrüten des Stammes in dem Substrat und Abtrennen von Monohydroxycörbonsätiren in hohen

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Ausbeuten aus dem bebrüteten Substrat.

■ "._--■ & Beispielsweise basierte die Herstellung von Milchsäure nach Gärungsverfahren bis Jetzt auf der Verwendung von relativ teuren, natürlich vorkommenden Materialien mit hohem Gehalt an Zuckern wie Glucose, Sulfitablaugen, erschöpfte Melassen und dergleichen. Bei Verwendung derartiger Kohlenstoff-Quellen sind die Kulturbedingungen für Milchsäure-Bakterien anaerobisch, was zu einem erhöhten Zeitbedarf für die Herstellung von Milchsäure aus dem Gärmedium führt.

Die modernste Tendenz der Gärungsindustrie ist in einer Hinsieht durch die wachsende Verwendung von Erdöl oder Erdölprodukten als weitgehender Ersatz von Gärungsmaterialien anstelle der herkömmlichen Kohlehydrate gekennzeichnet. Die Herstellung von Glutamin— säure z.B. wird alsbald unter Verwendung von Essigsäure oder inormalen Paraffinen, welche die herkömmlichen

Kohlenstoffj-Quellen verdrängen, durchgeführt werden.

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Das Ziel d4r vorliegenden Erfindung besteht darin, ein neues und verbessertes Verfahren zur Herstellung von Monohydroxyearbonsäuren zu schaffen, durch welches diese gewünschten Produkte in höhen Ausbeuten und mit

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einem Minimum an Herstellzeit durch Gärung einer Bouillonkultur erhältlich sind, welche leicht verfügbare , billige Glykole als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff für die darin stattfindende aerobische Bebrütung von Stämmen, welche zu der Gattung Arthrobaeter, Alcaligenes oder Fusarium gehören, enthält.

Diese und andere Ziele und Merkmale dieser Erfindung werden aus der nachstehenden Beschreibung, unterstützt durch gewisse, spezifische Ausführungsformen dieser Erfindung, näher dargelegt werden.

Der Ausdruck "Glykole", auf den bier als Kohlenetoff-Quelle gemäß der Erfindung Bezug genommen wird, umfaßt 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol und 1', 3-Butandiol, welche für die Kultur der vorerwähnten Mikroorganismen als. besonders wirksam befunden wurden.

Bei dem Gärungsverfahren der Erfindung werden die aus dem Boden isolierten Arthrobaeter», Alealigenes- oder Fusarium-Mikroorganismen in ein Kultursubstrat, welches hauptsächlich Glykole der oben beschriebenen Art, anorganische Salze und organische Nährstoffe, wie sie gewöhnlich für das Wachstum von Bakterien erforderlich sind, enthält, eingeimpft. Das so beimpfte Kultur-

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substrat wird unter aeroben Bedingungen in einer derartigen Weise bebrütet, daß es darin eine große Menge an Monohydroxyöarbonsäuren bildet und anhäuft. Die Zellen werden aus der Bouillonkultür durch Zentrifugieren entfernt, gefolgt von einem Durchleiten der überstehenden Bouillon durch Ionen-Austauscher-Harze zur Adsorption der resultierenden Monohydroxyearbonsäuren an denselben, welche anschließend unter Verwendung eines geeigneten organischen Lösungsmittels elulert werden. Dae Eluat kann durch Verdampfen isoliert werden. Oder es kann die Kulturbouillon nach Entfernung der · Zellen mit einem Alkali oder Salz wie Galciumhydoxyd, Oalciumcarbonat und dergleichen versetzt und hierdurch Honohydröxycarboxylat für eine Trennung gebildet werden. Dieses Salz kann zur Bildung der gewünschten Monohydroxyc arboneäure einer Hydrolyse unterworfen werden.

Stämae

Die KikroOrganismen, di£ gemäß der Erfindung fähig sind, Monohydroxycarbonsäuren in ihrer Bouillonkultur herzustellen und anzureichern, sind mutierte Stämme der Gattung Arthrobacter, AIcaligenes oder Pusarium,

und diese Stämme sind vorzugsweise Arthrobacterjoxydans PG-21-1 (Fiederlegungsnummer 359, Fermentation Research

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Institute Agenoy of Industrial Science and Technology, Tokyo/Japan), Alealigenes faeealis (Niedeflegungsnuinaer 360, F.H.I.A.I.S.T,, Tokyo/Japan)und Fusarium solani (Niederlegunganummer 361, F,R.I.A.I*S.T.,- Tokyo/Japan). Insbesondere wurde gefunden, daß Arthrobaeter oxydane PG-21-1 und Aloaligenes faeealis die besonderen, nachstehend angeführten bakteriologischen Eigenschaften besitzen.

Arthrobaoter Oxydans P6~21«-1 . , Mikroskopische Beobachtungtn Baaillusstamm, im allgemeinen 0,6 bis 0,8 mal .

1,4 bis 2,0 Mikron* Wicht-beweglich* Pleoaorph· Gram-positiv in jungen Kulturen. ffram-negaHiT

in alten Kulturen. Wachstum in den Substraten Hährstoff-Agar-Kalonie»

ι Rund, konvex,

f glänzend, peripher blaß gelb oder grau weiß. Schräg angelegter Nähretoff-Agar»

öemäßigtee Wachstum,

fadenförmig, glänzend.

Nährmittelbouilloni Oberfläohenring, "Irüli·,

klebrigfs 3tdiment.

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Nährstoff-Gelatin-Stichkulturi verflüssigt, BiophysikaliBohe Eigenaohaften ."; \ . B.O.P. Milch: Alkalisoh, peptonisiert. Hitrat-Respiration» Negativ, Keine Indol-Produktion.
ifethylrot-Testt Negativ.
Toges-Proekauer-üJeeti Negjati-w Stärke hydrolisiert.
Keine Sohwefelwaeeerstoff-Pröduk.tion. Katalaae-Froduktion.
Saueretoff-BedariSf» Aerobieeh* Optimale Waohetumetemperaturg 29° bis 3O⁰O. Säure« jedoch kein das aue Glycerin und Rohrzucker* Weder Säure noch 3a» au« Holzzucker, Traubenzucker, Milchzucker und Eftärlce. Tra^benssucker, Grlucon-

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»^«φβ^ CitronenBäure, p-Hyd^oaigrbenzoe säure und

I^o|oeateohU8Bäure wurden a3^B alleinige Quelle aiBiBimilierbaren Kohlenstoff verwendet.

faecalls

Alcaligenee

Beobachtungen ? s

Ba0|^5^ee|aBm, litt allgemeinen 0*5 mal T bis 2 '\

ittkjebn. Beweglich, Gramr-negltiv. Wachstum in djen Substraten \ - '

Agar-Koloniem glänsend,

zusammenhängend.

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Kährmittelseimmi Trüb, klebriges Sediment, Häutig« Kartoffelaubstrati Gejblätch- braun« Gelatinsubstratι Oberflächenwaohstum, keine

Biophysikalisehe Eigenschaften Lackmus Milchι Alkalisch. Keine Indol-Produktion, Saueretoff-Bedarft Aerobisch.

Optimale Wachstumstemperaturt 25° bis 37°C. Substrat und Kulturverfahren _M>

Die Gärungseubstrate gemäß der Erfindung umfaesen eine Kohlenstoff-Quelle, enthaltend die vorerwähnten verschiedenen Glykole vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 1O)C und eine Stickstoff-Quelle, umfassend Harnstoff, Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Ammoniakwasser, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat. Das Substrat kann ferner Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und ähnliche anorganische Salze ale auoh Hefeauszug und dergleichen für die Begünstigung des Wachstums der Mikroorganismen erforderliche Stoffe enthalten« Geeigne-te KuI tür substrate enthalten 10 bis 100g an Glykolsn der einzeln angegebenen Arten, 3g Harnstoff, IgK₂HPO₄, 0,5g MgSO₄.7H₂O, 0,5g KCl, 0,01g PeSO₄.

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Q*5g Hefeauszug und Leitungswasser zur Auffüllung auf 1 Liter.

Das Substrat mit dieser Zusammensetzung wird auf 115⁰C erhitzt und so 10 Minuten sterilisiert, und anschließender Impfung mit den vorgesehenen Stämmen. Das geimpfte Substrat wird durch Schütteln und/oder durch Lüftung und In-Eewegung-halten bei 25° bis 37⁰C während 40 bis 96 Stunden kultiviert.

Abtrennung und Reinigung der MonohydroxycarbonsBuren

Nach beendigter Gärung werden die Zellen und der Feststoffgehalt der Nährmittelbouillon durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Lösung der "Bouillon anschließend mit einem Anion-Austauscher-Harz zur Adsorption einer durch die Gärung gebildeten Monohydroxycarbonsäure daran behandelt. Die adsorbierte Säure wird mit einem organischen Lösungemittel eluiert und daraus beispielsweise durch Verdampfen des Sluates im Vakuum abgetrennt. Wahlweise kann nach Entfernung der Zellen die KulturbouilloT) mit Calciumhydroxyd, Calciumcarbonat oder anderem geeigneten Alkali oder Salzen zur hierdurch bedingten Bildung von Monohydrczycerboxylat ver-

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setzt werden. Das so gebildete Salz wird abgetrennt und zur Gewinnung der erwünschten Monohydroxyoarbdnsäure hydrolisiert.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden die nachstehenden nicht beschränkenden, erläuternden Beispiele der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform gegeben, jedooh ist es selbstverständlich, daß gewisse Modifikationen und Veränderungen darin durchgeführt werden können, ohne daß man den Bereich der Erfindung und der beigefügten Ansprüche verläßt.

Beispiel 1

Ein flüssiges KuItürsubstrat der folgenden Zusammensetzung in Gramm wurde hergestelltι

1,2-Propandiol 30

Harnstoff 4

K₂KPO₄ ............. i

MgSO₄.7E₂O 0,5

KCl 0,5

Wasser zur Auffüllung auf 1 liter. Das Substrat wurde auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt

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-. 10—

und bei 115⁰G 10 Minuten lang sterilisiert, Die Temperatur wurde dann auf 30⁰O herabgesetzt und das Substrat mit 0,2g Arthrobacter oxydans M-21-1 ge- * impft und durch Schütteln bei 3O°C "gebrütet. Die Assimilation und Dissimilation des Harnstoffes wurden in optimalem Gleichgewicht und der pH-Wert im Bereich ▼on 7_t0 bis 9,0 ohne Einstellung gehalten» Fach 72 stündiger Kultivierung wurde die Kulturbpulllon (1 Liter.) der Zentrifugatioh zur Entfernung der Zellen unterworfen und die überstehende Bouillon durch ein Anion-Austauscher-Harz zur Adsorption der Milchsäure, welche bei der Gärung entstand, geführt· Die adsorbierte Milchsäure wurde mit Ameisensäure eluiert, und das Eluat im Valcuum zur Entfernung der Ameisensäure verdampft, wobei 9_rOg Milchsäure pro Liter Kulturbouillon erhalten wurden.

/ Beispiel 2

Das Substrat und die Art der Kultivierung erfolgte nach Beispijel 1, mit der Ausnahme, daß 10g 1,3-Propandiol als assimilierbare Kohlenstoff-Quelie verwendet wurden, der anfängliche pH-Wert auf 7,0 eingestellt und Luft mit 1 Litei? pro Minute in das Substrat unter Durchlüftung und Bewegung eingeführt wurde. Das Substrat

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BAO ORIGINAL

wurde geimpft und bebrütet mit Arthrobaoter oxydane PG-21-1 bei 3O⁰O. Each 96 stündiger Bebrütung wurde die Kulturbouillon in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt und 1,5g ß-Hydroxypropionsäure pro Liter Kulturbouillon erhalten.

Beispiel 3

Arthrobacter oxydans PG-21-1 wurde in einem Kulturmedium enthaltend eine Kohlenstoff-Quelle von 1Og^- 1,3-Butandiol in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise bebrütet. !Tach 96 stündiger Bebrütung bei 30⁰C wurde clie ICulturbouillon gleichfalls in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt und man erhielt 2_f0g ß-Oxybuttersäure pro Liter Bouillonl

Beispiel^

Alcaligones faecalis wurde ir dem Substrat gemäß der ir. Beispiel 1 beschriebenen Weise kultiviert. Fach 9~ stllndirer Kultivierung bei 30⁰C wurde das Substrat ir d?r in "«-ispiel 1 beschriebenen Weiße behandelt und r-ar. erhiplt 3_f0g Milchsäure pro Liter Eulturtculllon.

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Beispiel 5

Ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung in Gramm wurde hergestellt»

1,2-Propandiol. ,... 30

NO, 3

K₂HPO₄."... ..T

KCl 0,5

'Wasser zur Auffüllung auf 1 Liter.

Dieses KuItursubstrat wurde mit 0,3g Fusarium solani geimpft und bei 3O⁰C nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise bebrütet. Nach Verlauf von 48 Stunden wurde 1 Liter der Kulturbouillon der Zentrifugatiρη zur Entfernung der Zellen unterworfen· Die überstehende Bouillon wurde mit 7g pulverförmigem Calciumcarbonat zur Abtrennung des Sedimente für die Hydrolyse versetzt. In dieser Weise wurden 3g Milchsäure pro Liter Bouillon erhalten.

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Claims

Patentansprüche

1. Terfahren zur Herstellung von Monohydroxycarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der zu einer Gattung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arthrobaeter, Aloaligenes und Pusarium gehört, aerobisch in einem flüssigen Kultursubstrat, enthaltend Glykole als Kohlenstoff-Quelle, 'bebrütet und die erwähnten, in der Kulturbouillon angereicherten Monohydraxycarbonsäuren abtrennt,'

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnetj daß man einen Stamm, ausgewählt;aus der Gruppe bestehend aus Arthrobaeter oxydans (Niederlegungsnummer 359_t fermentation Eesearoh Institute Agency of Industrial Science and Technology, Tokyo/Japan), Aloaligenes faecalis (Hiederlegungsnummer 360, F.R.I.A.I.S.T., Tokyo/ Japan) und Fusarium solani (Me^erlegungsnummer 361, P.E.I.A.I.S.T., Tokyo/Japan) in-ein flüssiges Kultursubstrat, enthaltend ein Glykol, ausgewählt aus der-Gruppe bestehend aus 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol und 1,3-Butandiol als Kohlenstoff-Quelle einimpft, den Stamm in dem erwähnten Substrat aerobisoh bebrütet und die in der Kulturbouillon angereicherten erwähnten Monohydroxycarbonsäuren abtrennt.

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1 .

5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arthrobacter oxydans, Alcaligenes faeoalis und Fusarium solani in ein flüssiges Kultursubstrat, .enthaltend als Kohleiiet off-Quelle ein Glykol, ausgewählt aus der Gruppe bestehendaus 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol undt,5-Butandiol, eine Stickstoff-Quelle, anorganische Salze und ein wachB-tumsforderndes Mittel, einimpft, den Stamm in dem erwähnten Substrat bei einer Semperatur Ton im wesentlichen «wischen 25° und 37°C und bei einem pH-Wert von zwischen 7»0und 9,0 aerobisch bebrütet und die in der Kulturbouillon angereicherten erwähnten Monohydroxyearbonsäuren abtrennt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte Kohlenstoff-Quelle in Konzentrationen im Bereich von 1 bis; 10j( angewandt wird.

ί i

j -;

ι ;

5. Verfahreit nach Anspruch 3» dadureh gekennzeichnet, daß die erwjimte Stickstoff-Quelle ausgewählt ist aus der Gruppe gestehend aus Harnstoff, Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Ammoniakwasser, Ammoniumeulfat und Ammoniumnityat.

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6. Verfahren zur Herstellung von Monohydroxycarbonsäuren im wesentlichen wie vorstehend beschrieben unter besonderer Berücksichtigung der Beispiele,

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