DE2015331C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium

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DE2015331C3
DE2015331C3 DE19702015331 DE2015331A DE2015331C3 DE 2015331 C3 DE2015331 C3 DE 2015331C3 DE 19702015331 DE19702015331 DE 19702015331 DE 2015331 A DE2015331 A DE 2015331A DE 2015331 C3 DE2015331 C3 DE 2015331C3
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Kouji Toyonaka Osaka Seto
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren so Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff sowie Biotin und ein Gemisch aus Methionin und Threonin oder Vorstufen der beiden letztgenannten Stoffe oder aber Homoserin enthält, bis eine wesentliche Menge L-Lysin erzeugt worden ist η
Bei den bekannten mikrobiologischen Verfahren zur Herstellung von L-Lysin werden als Kohlenstoffquelle Kohlehydrate, Glucose und Melasse verwendet. Bei diesen Substanzen handelt es sich hauptsächlich um landwirtschaftliche Produkte, wobei Preis- und Qualitätsschwankungen unvermeidlich sind. Durch die in diesen Produkten enthaltenen Verunreinigungen treten bei der Herstellung und Abtrennung von L-Lysin beträchtliche Schwierigkeiten auf.
Ein Verfahren der eingangs genannten Art ist aus der 4> BE-PS 7 20 100 bekannt Bei diesem Verfahren werden zur Herstellung von L-Lysin Stämme Corynebacterium glutanicum gezüchtet. Nachteilig an diesem Verfahren ist insbesondere, daß bei Verwendung von Essigsäure oder Acetat als Kohlenstoffquelle keine befriedigenden >o Ausbeutungen an L-Lysin erhalten werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin zu schaffen, bei dem L-Lysin in großur Reinheit und auf einfache Weise erhalten wird.
Diese Aufgabe ist bei einem Verfahren der eingangs >> genannten Art dadurch gelöst, daß man Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 einsetzt.
Der erfindungsgemäß eingesetzte, Homoserin-auxotrophe Stamm wurde aus Corynebacterium acetophilum durch Behandeln mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosogu- bo anidin erhalten. Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm !st unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-3671 bei der »Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, 6-> V.S.P-A.« hinterlegt und von dieser Hinterlegungsstelle erhältlich.
Die bakteriologischen Eigenschaften von Corynebac^ terium acetophilum NRRL B-3671 sind in der nachstehenden Tabelle I aufgeführt
Tabelle I
Naturwissenschaftliche, systematische Beschreibung von Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671;
1. Form
10
2. Größe
3. Sporen
4. Beweglichkeit
5. Flagellen
6. Gram-Färbung
7. Säureverschiebung
8. Agamährbouillon
in 9. Wachstum auf
Nährbouillonagar
Stäbchen mit runden Enden, gewöhnlich einzeln oder paarweise, pleomorph; 0,3-0,7x0,5-3,0 Mikron
keine
keine
keine
positiv
negativ
geringes Wachstum
die Kolonien sind kreisförmig, glatt, glänzend, etwas erhoben, opak und gelblichweiß
trübe, geringes Sediment, ohne Pellikel
geringes Wachstum bestes Wachstum an der Oberfläche; leichte Verflüssigung geringes Wachstum gutes Wachstum, aber kein Umschlag
geringes Wachstum
negativ
nein
ja
ja
positiv
ja
ja
ja
nein
nein
ja
pH 5-10,
Optimum 7,0-8,0;
Temperatur
15-370C,
Optimum
25-300C;
aerob bis
fakultativ anaerob.
Die vorstehend aufgeführten bakteriologischen Eigenschaften von Corynebacterium acetophilum NrRL B-3671 stimmen im wesentlichen mit denjenigen des Ürstamms, Corynebacterium acetophilum NRRL B-3421 überein, wobei es lediglich bezüglich der Nährstoffe einige Unterschiede gibt« die aus der nachstehenden Tabelle It zu ersehen sind.
10. Nährbouillon
11. Glukose-FIeischextrakt-Agar
12. Gelatineanstich
13. Peptonbouillon
14. Lackmusmilch
15. Wachstum auf
Kartoffeln
16. Voges-Proskauer-Reaktion
17. Indolbildung
18. Schwefelwasserstoffbildung
19. Reduktion von Nitrat
20. Katalasetest
21. Kraterförmige Verflüssigung
22. Stärkehydrolyse
23. Zitronensäureverwertung
24. Koagulation von Milch
25. Reduktion von Chromogen
26. Verwertung von Ammoniak
oder Harnstoff
27. Wachstumsbsdingungen
Tabelle II
Corynebacterium
acetophilum hom-73
(NRRL B-3671)
Corynebacterium acetophüum NRRL B-3421 (Urstamm)
Homoserin Notwendig für
Methionin
Threonin
Biotin
das Wachstum
Im wesentlichen
notwendig für das Wachstum
Nicht erforderlich für das Wachstum
Die Verzögerungsperiode des Wachstums wird verkürzt
Als Kohlenstoffquellen können im erfindungsgemäßen Verfahren Zucker, wie Glucose, Arabinose, Mannose, Fruktose, Saccharose, Maltose, Xylose, Salizin, Trehalose, Stärke und Dextrin oder organische Säuren, wie Propion-, Milch- und Bernsteinsäure, und Salze von organischen Säuren sowie Alkohole, wie Äthanol verwendet werden. Die besten Ergebnisse werden mit Essigsäure und/oder Acetaten erhalten (siehe die Beispiele).
Als Stickstoffquellen werden Ammoniak, Ammoniumchlorid, -sulfat, -nitrat und -karbonat, Harnstoff, Ammoniumsalze organischer Säuren, wie Ammoniumacetat, oder Hydrolysate oder Extrakte von protein- oder nukleinsäurehaltigen Materialien verwendet.
Als Mineralstoffe verwendet man Dikaliumphosphat, Monokaliumphosp!: it, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Manganchlorid, Eisen(III)-chlorid ·]. dgl.
Beim Verfahren der Erfindung ist für die Fermentierung der Zusatz von Homoserin r-ier Homoserin enthaltenden Stoffen erforderlich, da Corynebacterium acetophüum zum Wachstum Homoserin benötigt Es liegt jedoch angesichts bekannter Biosynthesen auf der Hand, daß Stämme, die Homoserin benötigen, im Grunde nicht anderes als Stämme sind, die zum Wachstum Threonin und Methionin brauchen. Folglich kann man Homoserin durch ein Gemisch von Threonin und Methionin ersetzen. Überdies kann man anstelle von Methionin Aminosäuren verwenden, die Stationen auf einem biosynthetischen Weg von Homoserin zu Methionin bilden, z. B. O-AIkylhomoserin, Cystathionin oder Homocystein. Anstelle der vorgenannten Wuchsstoffe kann auch Hefeextrakt verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird ein Kulturmedium, das geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und andere notwendige Wachstumsfak'oren enthält, mit Corynebacterium acetophüum NRRL B-3671 beimpft Hierauf wird die Züchtung unter Belüftung oder mechanischem Schütteln 1 bis 5 Tage bei 25 —300C fortgesetzt wobei der pH-Wert des Mediums etwa neutral (pH 6,0—9,0) eingestellt wird. Dabei reichert sich L-Lysin im Nährmedium an. Die Regelung und Einstellung des pH-Werts des Kulturmediums ist bezüglich der Steigerung der L-Lysinausbeute außerordentlich wirksam. Essigsäure kann dabei nicht nur wirksam als Kohlenstoffquelle, sondern auch als Mittel zum Einstellen des pH-Werts verwendet werden.
Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 erzeugt unter den Vorstehend erwähnten Bedingungen außer L-Lysin kaum andere Aminosäuren. Demzufolge kann man aus dem Kulturmedium das L-Lysin leicht erhalten, indem man das Von Zellen befreite Kulturmedium einengt und L-Lysin nach herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern od. dgl. isoliert
Die Beispiele erläutern die Erfindung,
ι
Beispiel 1
100 ml eines Nährmediums, das 5,0 g CH3COONa · 3 H3O, 1,9 g Ammoniumacetat, 0,1 g KH3PO4, f\05 g MgSO4 · 7 H2O, 0,001 g FeCI3 · 6 H3O, 0,001 g MnCI3 · 4 H3O, 0,02 g Homoserin, 2 g Biotin und als Rest entionisiertes bzw. entmineralisiertes Wasser enthält,
werden mit 5 ml einer Impfkultur von Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 geimpft Das Kulturmedium der Impfkultur besitzt die gleiche Zusammensetzung wie das vorstehend beschriebene Nährmedium, das mit der Impfkultur geimpft wird.
Das Kulturmedium wird in einen 500 ml fassenden
2t) konischen Kolben gegeben und vier Tage bei 300C mechanisch geschüttelt (130 Schwingungen pro Minute). Mit fortschreitendem Wachstum steigt der pH-Wert des Kuturmediums. Der pH-Wert des Kulturmediums wird auf etwa 7,4 eingestellt indem man in Abständen von 12 Stunden eine wäßrige Lösung zusetzt die 40% Essigsäure und 10% Ammoniumacetat (Konzentrationsangaben auf der Basis von Essigsäure) enthält
Auf diese Weise bildet sich L-Lysin in einer Menge von 2,2 g (als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium,
in wobei die L-Lysinausbeute, bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetzter Essigsäure, 253% beträgt
Nach beendetem Wachstum werden die Zellen vom Kulturmedium durch Zentrifugieren abgetrennt, worauf das Kulturmedium auf etwa 35 ml eingeengt und auf
r> einen ph-Wert von 2,5 angesäuert wird. Aus dem auf diese Weise erhaltenen Konzentrat des Kulturmediums werden 2,0 g L-Lysin mit einer Reinheit von 98% durch folgende Reihe von Verfahrensschritten gewonnen: Das konzentrierte Kulturmedium wird durch eine Säule
4n geschickt die mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz in der Η-Form gefüllt ist (Körnung 0,149— 0,074 mm, 300 ml), worauf die Säule, nachdem man sie mit Wasser gewaschen hat, mit 2-n-wäßriger Ammoniaklösung eluiert und das Eluat auf etwa 40 ml
4Ί eingeengt wird. Hierauf wird der pH-Wert des konzentrierten Eluats durch Zugabe von Ammoniak auf 10,5 eingestellt und die auf diese Weise erhaltene Lösung durch eine mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz in der OH-Form gefüllte Säule
ίο (Körnung 0,149 bis 0,074 mm, 300 ml) geschickt, die dann mit Wasser gewaschen und hierauf mit 2-n-wäßriger Essigsäurelösung eluiert wird, worauf man das Eluat zur Trockene eindampft.
r· B e i s ρ i e I 2
Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle des Homoserins 0,01 g L-Threonin und 0,01 g !.-Methionin verwendet. Dabei bildet sich L-Lysin in einer Menge bo von 2,0 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium, entsprechend einer L-Lysinausbeute von 22,5%, bezogen auf die gesamte zugesetzte Essigsäuremenge.
Beispiel 3
Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle des Homoserins und Biötins 0,4 g Hefeextfäkt verweil' det.
Es bildet sich L-Lysin in einer Menge von 2,4 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 10OmI, Kulturmedium entsprechend einer L-Lysinausbeute von 24,0%, bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetzter Essigsäure.
Beispiel 4
Es wird eine Impfkuluir hergestellt, indem man Corynebacterium acecophilum NRRL B-3671 in 5 ml eines Imnfkulturmediums kultiviert das 2% Essigsäure in Form von Natriumacetat 1% Pepton und 0,5% Hefeextrakt enthält Mit dieser Impfkultur werden iiierauf 100 ml eines Kulturmediums mit der in Beispiel 3 angegebenen Zusammensetzung geimpft worauf analog Beispiel 1 weitergearbeitet wird.
Pro 100 ml Kulturmedium bilden sich 2,6 g L-Lysin (Mengenangabe als HQ-SaIz), entsprechend einer L-Lysinausbeute von 24,0%, bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetzter Essigsäure.
Beispie! 5
Beispiel 2 wird wiederholt wobei ma.·, jedoch anstelle von CHjCOONa · 3 FIiO und Ammoninmacetat 4,0 g Glucose und 1,5 g(NH4).HPO4 sowie 0,1 g Natriumchlorid verwendet und den pH-Wert des Kulturmediums während der Inkubationsperiode nicht einstellt. Es bildet sich L-Lysin in einer Menge von 0,7 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 6
Beispiel 5 wird wiederholt wobei jedoch anstelle der Glucose 0,4 g Mannose verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,1 g (Mengenangabe als HCl-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 7
Beispiel 5 wird wiederholt wobei jedoch anstelle der Glucc.e 4,0 g Galaktose verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,2 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 8
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Glucose 4,0 g Saccarose (Rohrzucker) verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,5 g (Mengenangabe als HCl-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 9
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Clucose 4,0 g Fructose verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,7 g (Mengenangabe als HCl-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 10
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Glucose 4,0 g Dextrin verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,1 g (Mengenangabe als HCI^SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 11
Beispiel 5 wird wiederholt wobei man jedoch anstelle der Glucose 4,0 g Äthanol verwendet L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,4 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 12
Beispiel 2 wird wiederholt wobei man jedoch ein lu Kulturmedium verwendet das anstelle von 5,0 g CH3COONa · 3 H2O und 1,9 g Ammoniumacetat 9,1 g CH3COONa · 3 H2O und 0,7 g Harnstoff, sowie außerdem 0,1 g Natriumchlorid enthält und den pH-Wert statt mit einer Essigsäure-Ammoniumacetat-Lösung Ii unter Verwendung einer wäßrigen Lösung einstellt die 40% Essigsäure und 5% Harnstoff enthält L-Lysin bildet sich in einer Menge von 2,0 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 13
Beispiel 2 wird wiederh 'ι, wobei jedoch ein Kulturmedium verwendet wirci, das 5,7 anstatt 5,0 g CH)COONa · 3 Η,Ο sowie außerdem 0,1 g vitaminfreies Kaseinhydrolysat und 0,1 g Kochsalz enthält L-Lysin r> bildet sich in einer Menge von 2,1 g (a.s HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 14
Beispiel 12 wird wiederholt, wobei jedoch ein »ι Kulturmedium, das anstelle von 9.1 g CHjCOONa · 3 H2O und 0,7 g Harnstoff 3.2 g Natrium-propionat und 1,8 g Ammonium-propionat enthält verwendet und der pH-Wert des Kulturmediums während des Wachstums mit Hilfe einer wäßrigen Lösung eingestellt wird, die j-> 40% Propionsäure und 10% Ammonium-propionat (Konzentrationsangaben auf der Basis von Propionsäure) enthält L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,1 g (als HCl-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
4|i Beispiel 15
Beispiel 12 wird wiederholt wobei jedoch ein Kulturmedium, das anstelle des Natriumacetats und des Harnstoffs die Natriumsuccinat (C4H4O4Na2) und Diammoniumsuccinat (C4H4O4(NH4J2) enthält verwen-
4i det und während des Wachstums der pH-Wert des Kulturmediums mit einet wäßrigen Lösung eingestellt wird, die 20% Bernsteinsäure und 5% Diammoniumsuccinat (Konzentrationsangaben auf der Basis von Bernsteinsäure) enthält L-Lysin bildet sich in einer
-,ο Menge von 0.2 g (als HCl-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 16
Beispiel 12 wird wiederholt, wobei jedoch ein )-> Kulturmedium, das anstelle des Natriumacetats und des Harnstoffs \\ g Natriumlactat (C1ICHOHCOONa) und 1,8 g Ammoniurn-Lactat (CHjCHOHCOONHi) enthält verwendet und während des Wachstums der pH-Wert des Kulturmediums mit einer wäßrigen μ Lösung einstellt wird, die 40% Milchsäure und 10% Diammonium-Lactat (Konzentrationsangaben auf der Basis von Milchsäure) enthält. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,6 g (als HCl-Sülz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff sowie Biotin und ein Gemisch aus Methionin und Threonin oder Vorstufen der beiden letztgenannten Stoffe oder aber Homoserin enthält, bis eine wesentliche Menge L-Lysin erzeugt worden ist, und durch Isolieren des L-Lysin aus dem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 einsetzt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle Essigsäure einsetzt
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