DE2112073C3 - Verfahren zur Herstellung von Coenzym-A durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus - Google Patents

Description

Elemente in dem Medium jeweils etwa 0,5 bis 5 Gewichtsprozent/Volumprozent und etwa 0,001 bis 3 Ge-

wichtsprozent/Volumprozent betragen. Beispielsweise

35 werden als Stickstoffquellen bevorzugt 1,1 bis 4,4 Gewichtsprozent/Volumprozent Mais-Quellflüssigkeit, 0,5

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bis 2,0 Gewichtsprozent/Volumprozent Fleischextrakt, von Coenzym A durch aerobes Züchten eines Mikro- 0,5 bis 1,5 Gewichtsprozent/Volumprozent Pepton, Organismus in einem Nährmedium bei hierfür üb- Hefeextrakt oder Casein-Hydrolysat und 0,5 bis liehen Temperaturen und pH-Werten. 30 2,0 Gewichtsprozent/Volumprozent Ammoniumsulfat,

Coenzym A ist bekanntlich eine wichtige Verbindung Ammoniumnitrat oder Kaliumnitrat verwendet. Beifür die Stoffwechselprozesse lebender Zellen, wie etwa spiele für anorganische Elemente sind 0,5 bis 3,0 Gefür den Stoffwechsel der Kohlehydrate, Fette und wichtsprozent/Volumprozent Kaliumphosphat, 0,02 Aminosäuren oder die Biosynthese von Ferroproto- bis 0,5 Gewichtsprozent/Volumprozent Magnesiumporphyrin. Es sind bereits einige Syntheseverfahren 35 Sulfat, 0,001 bis 0,1 Gewichtsprozent/Volumprozent zur Herstellung dieses Coenzyme bekannt. Unter den Mangansulfat und 0,01 bis 0,05 Gewichtsprozent/ vorbekannten Verfahren verwendet man Pantothen- Volumprozent Calciumchlorid,
säure und Adenylsäure als Ausgangsmaterial [J. Am. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Ver-

Chem. Soc, 83, S. 663 (1961); Biochim. Biophys. fahrens können jeweils 0,05 bis 0,5 Gewichtsprozent/ Acta, 50, S. 605 (1961); Chem. Pharm. Bull., 15, 40 Volumprozent Pantothensäure, Adenin und Cystein, S. 655 (1967)]. Andere Verfahren bestehen darin, insbesondere 0,1 bis 0,3 Gewichtsprozent/Volumprodas Coenzym aus natürlichen Quellen wie Schweine- zent Pantothensäure, 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent/ leber und Hefe zu isolieren [J. Biol. Chem., 186, S. 253 Volumprozent Adenin und 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent/ (1950), und Ann., 574, S. 1 (1951)]. Diese Verfahren Volumprozent Cystein dem Fermentationsmedium zubefriedigen jedoch auf Gi und der komplizierten Me- 45 gesetzt werden. Diese Verbindungen können entweder thoden bei der Synthese bzw. dem Gehalt von Co- in freier Form oder in Form eines Salzes angewandt enzym A in den Zellgeweben von Schweinen und werden. Beispielsweise sind das Alkalimetallsalz (z. B. Hefe nicht. das Natriumsalz) oder das Erdalkalimetallsalz (z. B.

Ferner sind auch bereits fermentative Herstellung- das Calciumsalz) von Pantothensäure, die sauren Salze verfahren für Coenzym A bekannt, bei welchen ein 50 (z. B. Hydrochloride) von Adenin und Cystein für Mikroorganismus, z. B. Candida tropicalis, Candida diesen Zweck geeignet. Die vorgenannten Verbinlipolytica, Brettanomyceü rambius, Arthrobacter sim- düngen können dem Medium auf einer Stufe zwischen plex, Pseudomonas aeruginosa, unter Verwendung der letzten Hälfte der logarithmischen Wachstumsvon Kohlenwasserstoffverbindungen als Kohlenstoff- phase und der frühen stationären Phase der Fermenquellen kultiviert worden ist (s. japanische Patent- 55 tation zugesetzt werden, weil die Erzeugungsrate von anmeldung 6625/1969, veröffentlicht am 22. 3.1969, Coenzym A mit dem Stamm Sarcina lutea IAM 1099 und britische Patentschrift 1183 873). Die in der Fer- während der genannten Stufen eine maximale Höhe mentationsiösung angesammelte Menge an Coenzym A erreicht. Als Alternative hierzu kann ein Teil dieser beträgt aber nur etwa 120 bis 150 μg/ml. Vorstufen des Coenzyms A während der vorgenannten

Aufgabe der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren 60 Stufen zugesetzt werden, die übrigen Teile der Vorzur fermentativen Herstellung von Coenzym A, wobei stufen können später zugesetzt werden. Die Fermen-Coenzym A in höherer Ausbeute gewonnen werden tation des Mediums kann in 2 bis 5 Tagen abgeschloskann. sen werden. Während des Reaktionsverlaufs erreicht

Zur Lösung dieser Aufgabe dient ein Verfahren zur die Menge an angesammelten Coenzym , A in dem Herstellung von Coenzym A durch aerobes Züchten 65 Medium eine Höhe von annähernd 500 bis 700 μg/ml. eines Mikroorganismus in einem Nährmedium bei Nach dem Ende der Fermentation werden Mycele

hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten, das und andere feste Kulturbestandteile von der Fermendadurch gekennzeichnet ist, daß man Sarcina lutea tationsbriihe durch herkömmliche Verfahren wie hei-

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spielsweise Erwärmen, nachfolgendes Filtrieren und/ oder Zentrifugieren entfernt. Vielerlei bekannte Verfahren können zur Gewinnung und/oder Reinigung von Coenzym A aus dem Fütrat oder der überstehenden Lösung angewandt werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können bevorzugt beispielsweise das Adsorptionsverfahren mit aktivem Kohlenstoff, ein Adsorptionsverfahren mit schwach sauren Ionenaustauschern, DÄAÄ-Zellulose-Adsorptionsverfahren, DÄAÄ-Dextran-Gel-Adsorptionsverfahren oder die Kombination dieser Verfahren angewandt werden. Nach diesen Verfahren wird Coenzym A mit einer Reinheit von 200 bis 150 Einheiten/mg erhalten. Der technische Fortschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem aus der britischen Patentschrift 1183 873 vorbekannten Verfahren ergibt sich aus folgenden Vergleichsversuchen:

Stämme, die nach den in dieser Patentschrift angegebenen Zahlenwerten die höchsten Apsbeuten an Coenzym A ergaben.

Tabelle

Sarcina lutea IAM 1099

Corynebacterium fascians ATCC
12974 (britische Patentschrift
1183 873)

Brevibacterium alkanophilum
nov. sp. ATCC 21071
(britische Patentschrift 1183 873)

Coeizyia-

A-Menge

in der Fennen-

talionsbrühe

(μβ/ml)

718

66

132

Vergleichsversuche
Die Züchtung des bei dem erfindungsgemäßen Ver- jo Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der

fahrens verwendeten Stammes Sarcina lutea IAM 1099 erfolgte unter den in dem folgenden Beispiel 3 genannten Bedingungen. Die in der Fermentationsbrühe angesammelte Coenzym-A-Menge wurde nach der Phosphortransacylase-methode [Methods in mology, 1, S. 596 (1955)] bstimmt.

Die Züchtung von in der britischen Patentschrift 1183 873 vorbeschriebenen Stämmen wurde wie folgt durchgeführt:

Corynebacterium fascians ATCC 12974 und Brevibacterium alkanophilum nov. sp. ATCC 21071 wurden in 700 ml eines Kulturmediums eingeimpft, welches folgende Zusammensetzung besaß:

Gemisch von η-Paraffinen 700 ml

NH₄Cl 42 g

KH₁PO₄ 105 g

Na₂HPO₄ 1,4 g

MgSO₄ · 7 H₂O 17,5 g

CaCl₂-IH₂0 3,5 g

FeSO₄ · 7 H₂O 0,7 g

Hefeextrakt 14 g

Wasser auf 7 1

pH-Wert 7,0

folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Es wurde ein wäßriges Nährmedium hergestellt mit Enzy- 25 folgenden Bestandteilen:

Glucose 5%

Mais-Quellflüssigkeit 2J1%

Pepton 1,35%

Primäres Kaliumphosphat 0,25 %

Das Medium wurde unter Schütteln bei 28⁰C während 26 Stunden im Falle des Corynebacterium fascian-Stammes bzw. 28 Stunden im Falle des Brevibacterium alkanophilum-Stammcs kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde in 71 eines Kulturmediums mit derselben Zusammensetzung wie zuvor eingeimpft und dieses Medium bei 30⁰C 30 Stunden im Falle des Corynebacterium fascians-Stammes bzw. 26 Stunden im Falle des Brevibacterium alkanophiium-Stammes unter Belüften und Inbewegunghalten kultivierte Während der Kultivierung wurde das Medium mit wäßrigem Ammoniak auf einem pH-Wert von 7,0 gehalten. Die erhaltenen Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und dann 10 Minuten bei 100⁰C mittels Wasser extrahiert. Nach dem Abkühlen

Sekundäres Kaliumphosphat 0,25 %

Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,1 %

Das obige Medium wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. 20 ml des Mediums werden in einen 500-

inl-Schüttelkolben eingebracht, der Kolben und sein Inhalt sterilisiert. Sarcina lutea IAM 1099 wird für für 20 Stunden in dem Medium mit den obigen Bestandteilen kultiviert. 0,5 ml des so erhaltenen Impfstoffs wird in das Medium eingeführt. Die Kultivie-

rung wird 48 Stunden lang bei 30⁰C unter Schütteln mit 140 Umdrehungen pro Minute durchgeführt. Dem Medium werden 25 mg Calciumpantothenat, 25 mg Adenin und 25 mg Cystein-Hydrochlorid zugesetzt. Das Medium wird mit 25 ml sterilem Wasser

verdünnt und weitere 16 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie oben geschüttelt. Das so erhaltene Medium enthält 650 μg/πll Coenzym A.

Beispiel 2

20 ml des Nährmediums mit den gleichen Bestandteilen wie im Beispiel 1 (mit der Ausnahme, daß 10 % Saccharose an Stelle von Glucose verwendet werden) werden hergestellt. Sarcina lutea IAM 1099 wird für 20 Ctunden in dem Medium kultiviert, das die gleichen Bestandteile wie oben angegeben enthält. 0,5 ml des so erzeugten Impfstoffes werden in das Medium eingebracht. Die Kultivierung wird für 48 Stunden bei 3O⁰C unter Schütteln mit 140 Umdrehungen pro Minute durchgeführt. 25 mg Calciumpantothenat, 25 mg

wurde der Extrakt zur Abtrennung der überstehenden 60 Adenin und 25 mg Cystein-Hydrochlorid werden dem » ._. ■*..-·_.» t^·- ». ,.__ Medium zugesetzt. Das Medium wird mit 25 ml

Lösung zentrifugiert. Die Menge an angesammelten Coenzym A wurde nach der bereits zuvor genannten Analysenmethode bestimmt.

Aus den in der folgenden Tabelle zusammengestellten Ergebnissen ergibt sich, daß die in der Fermentationsbrühe angesammelte Coenzym-A-Menge 5- bzw. lOfach höher lag als im Fall des Einsatzes der aus der britischen Patentschrift 1183 873 bekannten sterilem Wasser verdünnt und weitere 16 Stunden bei den gleichen Bedingungen wie oben geschüttelt. Das so erhaltene Medium enthält 690μg/ml Coenzym A.

Beispiel 3

20 ml des Nährmediums mit den gleichen Bestandteilen wie im Beispiel 2 werden hergestellt. Sarcina

lutea IAM 1099 wird nach dem Verfahren des Beispiels 2 kultiviert. 0,5 ml des so erzeugten Impfstoffs werden in das Medium eingebracht. Die Kultivierung wird für 48 Stunden bei 30° C unter Schütteln mit 140 Umdrehungen pro Minute durchgeführt. 25 mg Calciumpantothenat, 25 mg Adenin und 25 mg Cystein-Hydrochlorid werden dem Medium zugesetzt.

Das Medium wird mit 25 ml sterilem Wasser verdünnt und 20 Stunden bei den gleichen Bedingungen wie oben geschüttelt. Jeweils 25 mg Calciumpantothenat, Adenin und Cystein-Hydrochlorid werden dem Medium zugesetzt, und das Medium wird weitere 16 Stunden geschüttelt. Das so erhaltene Medium enthält 718 μg/ml an Coenzym A.

Claims (3)

IAM 1099 in einem Nähnnedium in Gegenwart von Patentansprüche: Pantothensäure, Adenin und Cystein züchtet. Die Fermentation des obengenannten Mikroorga-

1. Verfahren zur Herstellung von CoenzymA nismus kann entweder durch Schüttelkultivierung durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in 5 oder durch Fermentation nach dem Submersverfahren einem Nährmedium bei hierfür üblichen Tempe- unier Luftzufuhr durchgeführt werden. Bevorzugt raturen und pH-Werten, dadurch gekenn- wird die Fermentation bei 30 bis 37°C bei pH 5,0 bis zeichnet, daß man Sarcina lutea IAM 1099 7,0 durchgeführt. Das Nähnnedium enthält Kohlenin dem Nährmedium in Gegenwart von Pantothen- stoffquellen, Stickstoffquellen und eine kleine Menge säure, Adenin und Cystein züchtet io anorganischer Elemente.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Geeignete Kohlenstoffquelilen für den Fermenzeichnet, daß man pro Liter des Nährmediums tationsprozeß büden Glucose, Maltose, Saccharose, Pantothensäure, Adenin und Cystein in einer Stärke und Melassen. Die in dem Nährmedium entMenge von jeweils etwa 0,05 bis etwa 0,5Ge- haltene Menge dieser Quellen hegt bei etwa 5 bis wichtsprozent/Volumprozent einsetzt. 15 10 Gewichtsprozent/Volumprozent, Die Menge an

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Stickstoff quellen und/oder den anorganischen EIezeichnet, daß man pro Liter des Nährmediums menten im Nähnnedium kann mit den Fermentations-0,1 bis 0,3 Gewichtsprozent/Volumprozent Pan- bedingungen und den verwendeten Nährquellen vatothensäure, 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent/Volum- riiert werden. Doch kann die erfindungsgemäße Ferprozent Adenin und 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent/ ao mentation gut durchgeführt werden, wenn die VerVolumprozent Cystein einsetzt. hältnisse der Stickstoffquellen und der anorganischen