DE2015331B2 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium

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DE2015331B2
DE2015331B2 DE19702015331 DE2015331A DE2015331B2 DE 2015331 B2 DE2015331 B2 DE 2015331B2 DE 19702015331 DE19702015331 DE 19702015331 DE 2015331 A DE2015331 A DE 2015331A DE 2015331 B2 DE2015331 B2 DE 2015331B2
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    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04Alpha- or beta- amino acids
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff sowie Biotin und ein Gemisch aus Methionin und Threonin oder Vorstufen der beiden letztgenannten Stoffe oder aber Homoserin enthält, bis eine wesentliche Menge L-Lysin erzeugt worden ist.
Bei den bekannten mikrobiologischen Verfahren zur Herstellung von L-Lysin werden als Kohlenstoffquelle Kohlehydrate, Glucose und Melasse verwendet. Bei diesen Substanzen handelt es sich hauptsächlich um landwirtschaftliche Produkte, wobei Preis- und Qualitätsschwankungen unvermeidlich sind. Durch die in diesen Produkten enthaltenen Verunreinigungen treten bei der Herstellung und Abtrennung von L-Lysin beträchtliche Schwierigkeiten auf.
Ein Verfahren der eingangs genannten Art ist aus der BE-PS 7 20 100 bekannt. Bei diesem Verfahren werden zur Herstellung von L-Lysin Stämme Corynebacterium glutanicum gezüchtet. Nachteilig an diesem Verfahren ist insbesondere, daß bei Verwendung von Essigsäure oder Acetat als Kohlenstoffquelle keine befriedigenden Ausbeutungen an L-Lysin erhalten werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin zu schaffen, bei dem L-Lysin in großer Reinheit und auf einfache Weise erhalten wird.
Diese Aufgabe ist bei einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß man Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 einsetzt.
Der erfindungsgemäß eingesetzte, Homoserin-auxotrophe Stamm wurde aus Corynebacterium acetophilum durch Behandeln mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erhalten. Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm ist unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-3671 bei der »Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.S.p.A.« hinterlegt und von dieser Hinterlegungsstelle erhältlich.
Die bakteriologischen Eigenschaften von Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle I
Naturwissenschaftliche, systematische Beschreibung von Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671:
1. Form Stäbchen mit runden
Enden, gewöhnlich
einzeln oder paarwei
se, pleomorph;
2. Größe 0,3-0,7x0,5-3,0
Mikron
3. Sporen keine
4. Beweglichkeit keine
5. Flagellen keine
6. Gram-Färbung positiv
7. Säureverschiebung negativ
8. Agarnährbouillon geringes Wachstum
9. Wachstum auf
Nährbouillonagar die Kolonien sind
kreisförmig, glatt,
glänzend, etwas erho
ben, opak und gel
blichweiß
10. Nährbouillon trübe, geringes Sedi
ment, ohne Pellikel
11. Glukose-Fleisch-
extrakt-Agar geringes Wachstum
12. Gelatineanstich bestes Wachstum an
der Oberfläche; leich
te Verflüssigung
13. Peptonbouillon geringes Wachstum
14. Lackmusmilch gutes Wachstum,
aber kein Umschlag
15. Wachstum auf
Kartoffeln geringes Wachstum
16. Voges-Proskauer-
Reaktion negativ
17. Indolbildung nein
18. Schwefelwasser
stoffbildung ja
19. Reduktion von Nitrat ja
20. Katalasetest positiv
21. Kraterförmige Verflüs
sigung ja
22. Stärkehydrolyse ja
23. Zitronensäureverwertung ja
24. Koagulation von Milch nein
25. Reduktion von Chromogen nein
26. Verwertung von Ammoniak
oder Harnstoff ja
27. Wachstumsbedingungen pH 5-10,
Optimum 7,0-8,0;
Temperatur
15~37°C,
Optimum
25-30" C;
aerob bis
fakultativ anaerob.
Die vorstehend aufgeführten bakteriologischen Eigenschaften von Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 stimmen i>r> wesentlichen mit denjenigen des Urstamms, Corynebacterium acetophilum NRRL B-3421 überein, wobei es lediglich bezüglich der Nährstoffe einige Unterschiede gibt, die aus der nachstehenden Tabelle Il zu ersehen sind.
Tabelle II
Corynebacterium acetophilum hom-73
(NRRL B-3671)
Corynebacterium acetophilum NRRL B-3421 (Urstamm)
Homoserin
oder
Methionin
und
Threonin
Biotin
Notwendig für
das Wachstum
Im wesentlichen
notwendig für das Wachstum
Nicht erforderlich für das Wachstum
Die Verzögerungsperiode des Wachstums wird verkürzt
Als KoWenstoffquellen können im erfindungsgemäßen Verfahren Zucker, wie Glucose, Arabinose, Mannose, Fruktose, Saccharose, Maltose, Xylose, Salizin, Trehalose, Stärke und Dextrin oder organische Säuren, wie Propion-, Milch- und Bernsteinsäure, und Salze von organischen Säuren sowie Alkohole, wie Äthanol verwendet werden. Die besten Ergebnisse werden mit Essigsäure und/oder Acetaten erhalten (siehe die Beispiele).
Als Stickstoffquellen werden Ammoniak, Ammoniumchlorid, -sulfat, -nitrat und -karbonat, Harnstoff, Ammoniumsalze organischer Säuren, wie Ammoniumacetat, oder Hydrolysate oder Extrakte von protein- oder nukleinsäurehaltigen Materialien verwendet.
Als Mineralstoffe verwendet man Dikaliumphosphat, Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Manganchlorid, Eisen(IH)-chlorid u. dgl.
Beim Verfahren der Erfindung ist für die Fermentierung der Zusatz von Homoserin oder Homoserin enthaltenden Stoffen erforderlich, da Corynebacterium acetophilum zum Wachstum Homoserin benötigt. Es liegt jedoch angesichts bekannter Biosynthesen auf der Hand, daß Stämme, die Homoserin benötigen, im Grunde nicht anderes als Stämme sind, die zum Wachstum Threonin und Methionin brauchen. Folglich kann man Homoserin durch ein Gemisch von Threonin und Methionin ersetzen. Überdies kann man anstelle von Methionin Aminosäuren verwenden, die Stationen auf einem biosynthetischen Weg von Homoserin zu Methionin bilden, z. B. O-Alkylhomoserin, Cystathionin oder Homocystein. Anstelle der vorgenannten Wuchsstoffe kann auch Hefeextrakt verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird ein Kulturmedium, das geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und andere notwendige Wachstumsfaktoren enthält, mit Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 beimpft. Hierauf wird die Züchtung unter Belüftung oder mechanischem Schütteln 1 bis 5 Tage bei 25-300C fortgesetzt, wobei der pH-Wert des Mediums etwa neutral (pH 6,0—9,0) eingestellt wird. Dabei reichert sich L-Lysin im Nährmedium an. Die Regelung und Einstellung des pH-Werts des Kulturmediums ist bezüglich der Steigerung der L-Lysinausbeute außerordentlich wirksam. Essigsäure kann dabei nicht nur wirksam als Kohlenstoffquelle, sondern auch als Mittel zum Einstellen des pH-Werts verwendet werden.
Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 erzeugt unter den vorstehend erwähnten Bedingungen außer L-Lysin kaum andere Aminosäuren. Demzufolge kann man aus dem Kulturmedium das L-Lysin leicht erhalten, indem man das von Zellen befreite Kulturmedium einengt und L-Lysin nach herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern od. dgl. isoliert.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
100 ml eines Nährmediums, das 5,0 g CH3COONa · 3 H2O, 1,9 g Ammoniumacetat, 0,1g KH2PO4, 0,05 g MgSO4 · 7 H2O, 0,001 g FeCl3 · 6 H2O, 0,001 g MnCI2 · 4 H2O, 0,02 g Homoserin, 2 g Biotin und als Rest entionisiertes bzw. entmineralisiertes Wasser enthält,
werden mit 5 ml einer Impfkultur von Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 geimpft. Das Kulturmedium der Impfkultur besitzt die gleiche Zusammensetzung wie das vorstehend beschriebene Nährmedium, das mit der Impfkultur geimpft wird.
Das Kulturmedium wird in einen 500 ml fassenden konischen Kolben gegeben und vier Tage bei 30° C mechanisch geschüttelt (130 Schwingungen pro Minute). Mit fortschreitendem Wachstum steigt der pH-Wert des Kuturmediums. Der pH-Wert des Kulturmediums wird auf etwa 7,4 eingestellt, indem man in Abständen von 12 Stunden eine wäßrige Lösung zusetzt, die 40% Essigsäure und 10% Ammoniumacetat (Konzentrationsangabe.i au/ der Basis von Essigsäure) enthält.
Auf diese Weise bildet sich L-Lysin in einer Menge von 2,2 g (als HCl-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium, wobei die L-Lysinausbeute, bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetzter Essigsäure, 25,3% beträgt.
Nach beendetem Wachstum werden die Zellen vom Kulturmedium durch Zentrifugieren abgetrennt, worauf das Kulturmedium auf etwa 35 ml eingeengt und auf einen ph-Wert von 2,5 angesäuert wird. Aus dem auf diese Weise erhaltenen Konzentrat des Kulturmediums werden 2,0 g L-Lysin mit einer Reinheit von 98% durch folgende Reihe von Verfahrensschritten gewonnen: Das konzentrierte Kulturmedium wird durch eine Säule geschickt, die mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz in der Η-Form gefüllt ist (Körnung 0,149— 0,074 mm, 300 ml), worauf die Säule, nachdem man sie mit Wasser gewaschen hat, mit 2-n-wäßriger Ammoniaklösung eluiert und das Eluat auf etwa 40 ml eingeengt wird. Hierauf wird der pH-Wert des konzentrierten Eluats durch Zugabe von Ammoniak auf 10,5 eingestellt und die auf diese Weise erhaltene Lösung durch eine mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz in der OH-Form gefüllte Säule (Körnung 0,149 bis 0,074 mm, 300 ml) geschickt, die dann mit Wasser gewaschen und hierauf mit 2-n-wäßriger Essigsäurelösung eluiert wird, worauf man das Eluat zur Trockene eindampft.
Beispiel 2
Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle des Homoserins 0,01 g L-Threonin und 0,01 g L-Methionin verwendet. Dabei bildet sich L-Lysin in einer Menge von 2,0 g (Mengenangabe als HCl-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium, entsprechend einer L-Lysinausbeute von 22,5%, bezogen auf die gesamte zugesetzte Essigsäuremenge.
Beispiel 3
Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle des Homoserins und Biotins 0,4 g Hefeextrakt verwendet.
Es bildet sich L-Lysin in einer Menge von 2,4 g (Mengenangabe als HCl-SaIz) pro 100 ml, Kulturmedium entsprechend einer L-Lysinausbeute von 24,0%, bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetzter Essigsäure.
Beispiel 4
Es wird eine Impfkultur hergestellt, indem man Corynebacterium acetophilum NRRL B-367I m 5ml eines Impfkulturmediums kultiviert, das 2% Essigsäure in Form von Natriumacetat, 1% Pepton und 0,5% Hefeextrakt enthält. Mit dieser Impfkultur werden hierauf 100 ml eines Kulturmediums mit der in Beispiel 3 angegebenen Zusammensetzung geimpft, worauf analog Beispiel 1 weitergearbeitet wird.
Pro 100 ml Kulturmedium bilden sich 2,6 g L-Lysin (Mengenangabe als HCI-SaIz), entsprechend einer L-Lysinausbeute von 24,0%, bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetzter Essigsäure.
Beispiel 5
Beispiel 2 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle von CH3COONa · 3 H2O und Ammoniumacetat 4,0g Glucose und 1,5 g (N H4J2H PO4 sowie 0,1 g Natriumchlorid verwendet und den pH-Wert des Kulturmediums während der Inkubationsperiode nicht einstellt. Es bildet sich L-Lysin in einer Menge von 0,7 g (Mengenangabe als HCl-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 6
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Glucose 0,4 g Mannose verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,1 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 7
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Glucose 4,0 g Galaktose verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,2 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 8
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Glucose 4,0 g Saccarose (Rohrzucker) verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,5 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 9
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoen anstelle der Clucose 4,0 g Fructose verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,7 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 10
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Glucose 4,0 g Dextrin verwendet v/erden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,1 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 11
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle der Glucose 4,0 g Äthanol verwendet. L-Lysin bildet ι sbh in einer Menge von 0,4 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 12
Beispiel 2 wird wiederholt, wobei man jedoch ein in Kulturmedium verwendet, das anstelle von 5,0 g CH3COONa · 3H2O und 1,9 g Ammoniumacelat 9,1 g CH3COONa · 3 H2O und 0,7 g Harnstoff, sowie außerdem 0,1 g Natriumchlorid enthält, und den pH-Wert statt mit einer Essigsäure-Ammoniumacetat-Lösung -, unter Verwendung einer wäbrigen Lösung einstellt, die 40% Essigsäure und 5% Harnstoff enthält L-Lysin bildet sich in einer Menge von 2,0 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 13
Beispiel 2 wird wiederholt, wobei jedoch ein Kulturmedium verwendet wird, das 5,7 anstatt 5,0 g CH3COONa · 3 H2O sowie außerdem 0,1 g vitaminfreies Kaseinhydrolysat und 0,1 g Kochsalz enthält L-Lysin >-> bildet sich in einer Menge vonr 2,1 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 14
Beispiel 12 wird wiederholt, wobei jedoch ein in Kulturmedium, das anstelle von 9,1 g CH3COONa · 3 H2O und 0,7 g Harnstoff 3,2 g Natrium-propionat und 1,8 g Ammonium-pnopionat enthält, verwendet, und der pH-Wert des Kulturmediums während des Wachstums mit Hilfe einer wäßrigen Lösung eingestellt wird, die c. 40% Propionsäure und t0% Ammonium-propional (Konzentrationsangaben auf der Basis von Propionsäure) enthält. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,1 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel· 15
■tu r
Beispiel 12 wird wiederholt wobei jedoch ein Kulturmedium, das anstelle des Natriumacetats und des Harnstoffs die Natriumsuccinat (C4^O4Na2) und Diammoniumsuccinat (C4H4O4(NH4^) enthält verwen-
4-, det und während des Wachstums der pH-Wert des Kulturmediums mit einer wäßrigen Lösung eingestellt wird, die 20% Bernsteinsäure und 5% Diammoniumsuccinat (Konzentrationsangaben auf der Basis von Bernsteinsäure) enthält. L-Lysin bildet sich in einer
,Ii Menge von 0,2 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 16
Beispiel 12 wird wiederholt, wobei jedoch ein Kulturmedium, das anstelle des Natriumacetats und des Harnstoffs 3,1 g Natriumlactat (CH3CHOHCOONa) und 1,8 g Ammonium-Lactat (CH3CHOHCOONh4) enthält verwendet und- während des Wachstums der pH-Wert des Kulturmediums mit einer wäßrigen Lösung eingestellt wird, die 40% Milchsäure und 10% Diammonium-Lactat (Konzenlrationsangaben auf der Basis von Milchsäure) enthält. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,6 g (als HCl-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff sowie Biotin und ein Gemisch aus Methionin und Threonin oder Vorstufen der beiden letztgenannten Stoffe oder aber Homoserin enthält, bis eine wesentliche Menge L-Lysin erzeugt worden ist, und durch Isolieren des L-Lysin aus dem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium acetophilum NRRLB-3671 einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle Essigsäure einsetzt.
DE19702015331 1969-03-31 1970-03-31 Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium Expired DE2015331C3 (de)

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