DE2015331B2 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von CorynebacteriumInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von
Corynebacterium unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren
Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff sowie Biotin und ein Gemisch aus Methionin und Threonin oder
Vorstufen der beiden letztgenannten Stoffe oder aber Homoserin enthält, bis eine wesentliche Menge L-Lysin
erzeugt worden ist.
Bei den bekannten mikrobiologischen Verfahren zur Herstellung von L-Lysin werden als Kohlenstoffquelle
Kohlehydrate, Glucose und Melasse verwendet. Bei diesen Substanzen handelt es sich hauptsächlich um
landwirtschaftliche Produkte, wobei Preis- und Qualitätsschwankungen unvermeidlich sind. Durch die in
diesen Produkten enthaltenen Verunreinigungen treten bei der Herstellung und Abtrennung von L-Lysin
beträchtliche Schwierigkeiten auf.
Ein Verfahren der eingangs genannten Art ist aus der BE-PS 7 20 100 bekannt. Bei diesem Verfahren werden
zur Herstellung von L-Lysin Stämme Corynebacterium glutanicum gezüchtet. Nachteilig an diesem Verfahren
ist insbesondere, daß bei Verwendung von Essigsäure oder Acetat als Kohlenstoffquelle keine befriedigenden
Ausbeutungen an L-Lysin erhalten werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin zu schaffen, bei dem L-Lysin in
großer Reinheit und auf einfache Weise erhalten wird.
Diese Aufgabe ist bei einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß man Corynebacterium
acetophilum NRRL B-3671 einsetzt.
Der erfindungsgemäß eingesetzte, Homoserin-auxotrophe
Stamm wurde aus Corynebacterium acetophilum durch Behandeln mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
erhalten. Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm ist unter der Hinterlegungsnummer NRRL
B-3671 bei der »Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service,
U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.S.p.A.« hinterlegt und von dieser Hinterlegungsstelle
erhältlich.
Die bakteriologischen Eigenschaften von Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 sind in der
nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Naturwissenschaftliche, systematische Beschreibung von Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671:
| 1. Form | Stäbchen mit runden |
| Enden, gewöhnlich | |
| einzeln oder paarwei | |
| se, pleomorph; | |
| 2. Größe | 0,3-0,7x0,5-3,0 |
| Mikron | |
| 3. Sporen | keine |
| 4. Beweglichkeit | keine |
| 5. Flagellen | keine |
| 6. Gram-Färbung | positiv |
| 7. Säureverschiebung | negativ |
| 8. Agarnährbouillon | geringes Wachstum |
| 9. Wachstum auf | |
| Nährbouillonagar | die Kolonien sind |
| kreisförmig, glatt, | |
| glänzend, etwas erho | |
| ben, opak und gel | |
| blichweiß | |
| 10. Nährbouillon | trübe, geringes Sedi |
| ment, ohne Pellikel | |
| 11. Glukose-Fleisch- | |
| extrakt-Agar | geringes Wachstum |
| 12. Gelatineanstich | bestes Wachstum an |
| der Oberfläche; leich | |
| te Verflüssigung | |
| 13. Peptonbouillon | geringes Wachstum |
| 14. Lackmusmilch | gutes Wachstum, |
| aber kein Umschlag | |
| 15. Wachstum auf | |
| Kartoffeln | geringes Wachstum |
| 16. Voges-Proskauer- | |
| Reaktion | negativ |
| 17. Indolbildung | nein |
| 18. Schwefelwasser | |
| stoffbildung | ja |
| 19. Reduktion von Nitrat | ja |
| 20. Katalasetest | positiv |
| 21. Kraterförmige Verflüs | |
| sigung | ja |
| 22. Stärkehydrolyse | ja |
| 23. Zitronensäureverwertung | ja |
| 24. Koagulation von Milch | nein |
| 25. Reduktion von Chromogen | nein |
| 26. Verwertung von Ammoniak | |
| oder Harnstoff | ja |
| 27. Wachstumsbedingungen | pH 5-10, |
| Optimum 7,0-8,0; | |
| Temperatur | |
| 15~37°C, | |
| Optimum | |
| 25-30" C; | |
| aerob bis | |
| fakultativ anaerob. |
Die vorstehend aufgeführten bakteriologischen Eigenschaften von Corynebacterium acetophilum
NRRL B-3671 stimmen i>r> wesentlichen mit denjenigen
des Urstamms, Corynebacterium acetophilum NRRL B-3421 überein, wobei es lediglich bezüglich der
Nährstoffe einige Unterschiede gibt, die aus der nachstehenden Tabelle Il zu ersehen sind.
Corynebacterium
acetophilum hom-73
(NRRL B-3671)
Corynebacterium acetophilum NRRL B-3421 (Urstamm)
Homoserin
oder
Methionin
und
Threonin
Biotin
Notwendig für
das Wachstum
das Wachstum
Im wesentlichen
notwendig für das Wachstum
notwendig für das Wachstum
Nicht erforderlich für das Wachstum
Die Verzögerungsperiode des Wachstums wird verkürzt
Als KoWenstoffquellen können im erfindungsgemäßen Verfahren Zucker, wie Glucose, Arabinose,
Mannose, Fruktose, Saccharose, Maltose, Xylose, Salizin, Trehalose, Stärke und Dextrin oder organische
Säuren, wie Propion-, Milch- und Bernsteinsäure, und Salze von organischen Säuren sowie Alkohole, wie
Äthanol verwendet werden. Die besten Ergebnisse werden mit Essigsäure und/oder Acetaten erhalten
(siehe die Beispiele).
Als Stickstoffquellen werden Ammoniak, Ammoniumchlorid, -sulfat, -nitrat und -karbonat, Harnstoff,
Ammoniumsalze organischer Säuren, wie Ammoniumacetat, oder Hydrolysate oder Extrakte von protein-
oder nukleinsäurehaltigen Materialien verwendet.
Als Mineralstoffe verwendet man Dikaliumphosphat, Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid,
Manganchlorid, Eisen(IH)-chlorid u. dgl.
Beim Verfahren der Erfindung ist für die Fermentierung der Zusatz von Homoserin oder Homoserin
enthaltenden Stoffen erforderlich, da Corynebacterium acetophilum zum Wachstum Homoserin benötigt. Es
liegt jedoch angesichts bekannter Biosynthesen auf der Hand, daß Stämme, die Homoserin benötigen, im
Grunde nicht anderes als Stämme sind, die zum Wachstum Threonin und Methionin brauchen. Folglich
kann man Homoserin durch ein Gemisch von Threonin und Methionin ersetzen. Überdies kann man anstelle
von Methionin Aminosäuren verwenden, die Stationen auf einem biosynthetischen Weg von Homoserin zu
Methionin bilden, z. B. O-Alkylhomoserin, Cystathionin
oder Homocystein. Anstelle der vorgenannten Wuchsstoffe kann auch Hefeextrakt verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird ein Kulturmedium, das geeignete
Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und andere notwendige Wachstumsfaktoren enthält, mit Corynebacterium
acetophilum NRRL B-3671 beimpft. Hierauf wird die Züchtung unter Belüftung oder mechanischem
Schütteln 1 bis 5 Tage bei 25-300C fortgesetzt, wobei der pH-Wert des Mediums etwa neutral (pH 6,0—9,0)
eingestellt wird. Dabei reichert sich L-Lysin im Nährmedium an. Die Regelung und Einstellung des
pH-Werts des Kulturmediums ist bezüglich der Steigerung der L-Lysinausbeute außerordentlich wirksam.
Essigsäure kann dabei nicht nur wirksam als Kohlenstoffquelle, sondern auch als Mittel zum
Einstellen des pH-Werts verwendet werden.
Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 erzeugt unter den vorstehend erwähnten Bedingungen außer
L-Lysin kaum andere Aminosäuren. Demzufolge kann man aus dem Kulturmedium das L-Lysin leicht erhalten,
indem man das von Zellen befreite Kulturmedium einengt und L-Lysin nach herkömmlichen Verfahren
unter Verwendung von Ionenaustauschern od. dgl. isoliert.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
100 ml eines Nährmediums, das 5,0 g CH3COONa ·
3 H2O, 1,9 g Ammoniumacetat, 0,1g KH2PO4, 0,05 g
MgSO4 · 7 H2O, 0,001 g FeCl3 · 6 H2O, 0,001 g
MnCI2 · 4 H2O, 0,02 g Homoserin, 2 g Biotin und als
Rest entionisiertes bzw. entmineralisiertes Wasser enthält,
werden mit 5 ml einer Impfkultur von Corynebacterium acetophilum NRRL B-3671 geimpft. Das Kulturmedium
der Impfkultur besitzt die gleiche Zusammensetzung wie das vorstehend beschriebene Nährmedium, das mit
der Impfkultur geimpft wird.
Das Kulturmedium wird in einen 500 ml fassenden konischen Kolben gegeben und vier Tage bei 30° C
mechanisch geschüttelt (130 Schwingungen pro Minute). Mit fortschreitendem Wachstum steigt der pH-Wert des
Kuturmediums. Der pH-Wert des Kulturmediums wird auf etwa 7,4 eingestellt, indem man in Abständen von 12
Stunden eine wäßrige Lösung zusetzt, die 40% Essigsäure und 10% Ammoniumacetat (Konzentrationsangabe.i
au/ der Basis von Essigsäure) enthält.
Auf diese Weise bildet sich L-Lysin in einer Menge von 2,2 g (als HCl-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium,
wobei die L-Lysinausbeute, bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetzter Essigsäure, 25,3% beträgt.
Nach beendetem Wachstum werden die Zellen vom Kulturmedium durch Zentrifugieren abgetrennt, worauf
das Kulturmedium auf etwa 35 ml eingeengt und auf einen ph-Wert von 2,5 angesäuert wird. Aus dem auf
diese Weise erhaltenen Konzentrat des Kulturmediums werden 2,0 g L-Lysin mit einer Reinheit von 98% durch
folgende Reihe von Verfahrensschritten gewonnen: Das konzentrierte Kulturmedium wird durch eine Säule
geschickt, die mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz in der Η-Form gefüllt ist (Körnung 0,149—
0,074 mm, 300 ml), worauf die Säule, nachdem man sie mit Wasser gewaschen hat, mit 2-n-wäßriger
Ammoniaklösung eluiert und das Eluat auf etwa 40 ml eingeengt wird. Hierauf wird der pH-Wert des
konzentrierten Eluats durch Zugabe von Ammoniak auf 10,5 eingestellt und die auf diese Weise erhaltene
Lösung durch eine mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz in der OH-Form gefüllte Säule
(Körnung 0,149 bis 0,074 mm, 300 ml) geschickt, die dann mit Wasser gewaschen und hierauf mit 2-n-wäßriger
Essigsäurelösung eluiert wird, worauf man das Eluat zur Trockene eindampft.
Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle des Homoserins 0,01 g L-Threonin und 0,01 g L-Methionin
verwendet. Dabei bildet sich L-Lysin in einer Menge von 2,0 g (Mengenangabe als HCl-SaIz) pro 100 ml
Kulturmedium, entsprechend einer L-Lysinausbeute von 22,5%, bezogen auf die gesamte zugesetzte
Essigsäuremenge.
Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle des Homoserins und Biotins 0,4 g Hefeextrakt verwendet.
Es bildet sich L-Lysin in einer Menge von 2,4 g (Mengenangabe als HCl-SaIz) pro 100 ml, Kulturmedium
entsprechend einer L-Lysinausbeute von 24,0%, bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetzter Essigsäure.
Es wird eine Impfkultur hergestellt, indem man Corynebacterium acetophilum NRRL B-367I m 5ml
eines Impfkulturmediums kultiviert, das 2% Essigsäure in Form von Natriumacetat, 1% Pepton und 0,5%
Hefeextrakt enthält. Mit dieser Impfkultur werden hierauf 100 ml eines Kulturmediums mit der in Beispiel 3
angegebenen Zusammensetzung geimpft, worauf analog Beispiel 1 weitergearbeitet wird.
Pro 100 ml Kulturmedium bilden sich 2,6 g L-Lysin (Mengenangabe als HCI-SaIz), entsprechend einer
L-Lysinausbeute von 24,0%, bezogen auf die Gesamtmenge an zugesetzter Essigsäure.
Beispiel 2 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle von CH3COONa · 3 H2O und Ammoniumacetat 4,0g
Glucose und 1,5 g (N H4J2H PO4 sowie 0,1 g Natriumchlorid
verwendet und den pH-Wert des Kulturmediums während der Inkubationsperiode nicht einstellt. Es
bildet sich L-Lysin in einer Menge von 0,7 g (Mengenangabe als HCl-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Glucose 0,4 g Mannose verwendet werden. L-Lysin
bildet sich in einer Menge von 0,1 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der
Glucose 4,0 g Galaktose verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,2 g (Mengenangabe als
HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der
Glucose 4,0 g Saccarose (Rohrzucker) verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,5 g
(Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoen anstelle der
Clucose 4,0 g Fructose verwendet werden. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,7 g (Mengenangabe als
HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 10
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei jedoch anstelle der Glucose 4,0 g Dextrin verwendet v/erden. L-Lysin bildet
sich in einer Menge von 0,1 g (Mengenangabe als HCI-SaIz) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 11
Beispiel 5 wird wiederholt, wobei man jedoch anstelle der Glucose 4,0 g Äthanol verwendet. L-Lysin bildet
ι sbh in einer Menge von 0,4 g (als HCI-SaIz angegeben)
pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 12
Beispiel 2 wird wiederholt, wobei man jedoch ein in Kulturmedium verwendet, das anstelle von 5,0 g
CH3COONa · 3H2O und 1,9 g Ammoniumacelat 9,1 g
CH3COONa · 3 H2O und 0,7 g Harnstoff, sowie außerdem
0,1 g Natriumchlorid enthält, und den pH-Wert statt mit einer Essigsäure-Ammoniumacetat-Lösung
-, unter Verwendung einer wäbrigen Lösung einstellt, die 40% Essigsäure und 5% Harnstoff enthält L-Lysin
bildet sich in einer Menge von 2,0 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 13
Beispiel 2 wird wiederholt, wobei jedoch ein Kulturmedium verwendet wird, das 5,7 anstatt 5,0 g
CH3COONa · 3 H2O sowie außerdem 0,1 g vitaminfreies
Kaseinhydrolysat und 0,1 g Kochsalz enthält L-Lysin >-> bildet sich in einer Menge vonr 2,1 g (als HCI-SaIz
angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Beispiel 14
Beispiel 12 wird wiederholt, wobei jedoch ein in Kulturmedium, das anstelle von 9,1 g CH3COONa ·
3 H2O und 0,7 g Harnstoff 3,2 g Natrium-propionat und
1,8 g Ammonium-pnopionat enthält, verwendet, und der
pH-Wert des Kulturmediums während des Wachstums mit Hilfe einer wäßrigen Lösung eingestellt wird, die
c. 40% Propionsäure und t0% Ammonium-propional (Konzentrationsangaben auf der Basis von Propionsäure)
enthält. L-Lysin bildet sich in einer Menge von 0,1 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
■tu r
Beispiel 12 wird wiederholt wobei jedoch ein Kulturmedium, das anstelle des Natriumacetats und des
Harnstoffs die Natriumsuccinat (C4^O4Na2) und
Diammoniumsuccinat (C4H4O4(NH4^) enthält verwen-
4-, det und während des Wachstums der pH-Wert des Kulturmediums mit einer wäßrigen Lösung eingestellt
wird, die 20% Bernsteinsäure und 5% Diammoniumsuccinat (Konzentrationsangaben auf der Basis von
Bernsteinsäure) enthält. L-Lysin bildet sich in einer
,Ii Menge von 0,2 g (als HCI-SaIz angegeben) pro 100 ml
Kulturmedium.
Beispiel 12 wird wiederholt, wobei jedoch ein Kulturmedium, das anstelle des Natriumacetats und des
Harnstoffs 3,1 g Natriumlactat (CH3CHOHCOONa)
und 1,8 g Ammonium-Lactat (CH3CHOHCOONh4)
enthält verwendet und- während des Wachstums der
pH-Wert des Kulturmediums mit einer wäßrigen Lösung eingestellt wird, die 40% Milchsäure und 10%
Diammonium-Lactat (Konzenlrationsangaben auf der Basis von Milchsäure) enthält. L-Lysin bildet sich in
einer Menge von 0,6 g (als HCl-SaIz angegeben) pro 100 ml Kulturmedium.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin durch Züchten eines Stammes von Corynebacterium unter
aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und
assimilierbaren Stickstoff sowie Biotin und ein Gemisch aus Methionin und Threonin oder Vorstufen
der beiden letztgenannten Stoffe oder aber Homoserin enthält, bis eine wesentliche Menge
L-Lysin erzeugt worden ist, und durch Isolieren des L-Lysin aus dem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet,
daß man Corynebacterium acetophilum NRRLB-3671 einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet,
daß man als Kohlenstoffquelle Essigsäure einsetzt.
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1970
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2015331C3 (de) | 1979-01-04 |
| GB1300654A (en) | 1972-12-20 |
| DE2015331A1 (de) | 1971-02-11 |
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