DE1926178C3 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von D-Arablt - Google Patents

Description

a) YM-Fiüssigkeitsmedium:

Nach 3 Tagen bei 25 C stellten die Zellen ovale. !änelich-oväle oder zylindrische Formen mit rf°n Abmessungen (t,5 ~ 5) - (1,5 ~ 12) μ dar. Es war ein Sediment und eine Membrane gebildet worden.

b)

Die Erfindung im ein niiktubiüiugisches Verfahren zur Herstellung von D-Arabit, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Pichia ohmeri ATCC 20 209 in ein Nährmedium inoculiert, welches als wesentliche Kohlenstoffquelle ein fermentierbares Saccharid enthält, den Mikroorganismus in dem Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und aus der Fermentationsflüssigkeit das angesammelte D-Arabit in herkömmlicher Weise gewinnt.

D-Arabit dient als wichtiges Ausgangsmaterial zur Heiitellung von D-Xy!öse auf dem Wege über D-X\ lulose.

Über die Herstellung verschiedener mehrwertiger Alkonoie aus Sacchariden, beispielsweise aus D-CIucose unter Verwendung von Hefen, liegen bereits viele Berichte vor. So wird z. B. D-Arabit biologisch durch Züchten eines Stammes von Pichia miso in einem D-GIucose enthaltenden Nährmedium hergestellt (vgl. japanische Patentschrift Nr. 3545/62). Ein hinterlegter Stamm ist in dieser Literaturstelle nicht angegeben.

Dieses Verfahren besitzt jedoch den Nachteil einer schlechten Ausbeute an D-Arabit, da gleichzeitig die Bildung nicht unerheblicher Mengen anderer mehrwertiger Alkohole als D-Arabit, z. B. von Glycerin, Erythrit u. dgl., erfolgt. Zur Isolierung und Reinigung des gewünschten D-Arabits aus den daneben mit ähnlichen Eigenschaften vorliegenden Nebenprodukten sind daher aufwendige Maßnahmen notwendig.

Es ist gezeigt worden, daß eine Anzahl von Hefen, die zur Gattung Debaryomyces, Hansenula und Saccharomyces gehören, zur Herstellung von D-Arabit aus Sacchariden wirksam ist. Diese Methoden sind jedoch mit dem ähnlichen Nachteil wie im Falle der

VpiTA/pnHiinrj von Pir-hia mi«n vprhunrfpn

So liegt im Beispiel der USA.-Patentschrift 2 934 474 die Ausbeute an D-Arabit, auf die eingesetzte Glukose bezogen, nur bei etwa 30°,,. Daneben liegen noch beträchtliche Mengen Glycerin im fermentierten Medium vor. Ein hinterlegter Stamm ist auch in dieser USA.-Patentschrift nichi angegeben.

Es ist gefunden worden, daß D-Arabit mit hoher Anbeute ohne nennenswer'e Bildung anderer mchr-Wl.liger Alkohole erhalten werden kann, wenn man den Stamm Pichia ohmeri ATCC 20 209 in einem Nährmedium aerob kultiviert, welches die üblichen fermentierbaren Saccharide, wie Glukose, Saccharose, Mannose, Fructose u. dgl. enthält. Dieser Stamm erhielt auch die Hinterlegungsnummer 158 des Fermentation Research Institute. Agciu <if Industrial Sciene and Technology, Japan.

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YM-Agar:

Nach zwei Wochen erschien die Schräg-Kuhur arau-selb. In der ersten Stufe des Wachstums war fhre Oberfläche glatt und wurde dann run/lig. Der Umfang war nii. Wimpern versehen.

Pseudomycelium:

Die Züchtung auf Kartoffel-Dextrose-Medium, entsprechend der Dalmau-Agar-Methode, ergab Pseudomycelien.

Sporen:

Auf dem herkömmlichen sporenbildenden Medium fand beim alleinigen Inoculieren des Mikroorganismus keine Sporenbildung statt (Da Pichia ohmeri zur heterothallischen Art gehört, bildet er keine Ascosporen, wenn er nicht mit anderen Arten gekreuzt ist).

Fermentation vor: Sacchariuen:

1. Glucose:
II. Galactose:
HI. Saccharose:
IV. Maltose:
V. Lactose:
Vl. Rafiinose:

positiv

positiv (langsam)

positiv

negativ

negativ

positiv

Assimillierung von Kohlenstoffquellen.·

Es wurden assimiliert: Glucose, Galactose, Saccharose. Mallose, Sorbose. Cellobiose, Trehalo^e, Raffinose, Äthanol, Glycerin, Adonit, Mannit, Sorbit, u-Methylglucoside und Salycin. Dagegen wurden dte folgenden Stoffe nicht assimiliert: Lactose, Mellbiose, Melecitose, Xylose, Arab^:- nose, Erythrit, Dulcit, Gluconsäure, Inosit und C .t I-

Nitrate: Nicht assimiliert.

Vitaminbedarf: Fs war Biotin erforderlich.

Urease-Aktivität: Keine Aktivität in Christensens-Medium.

Keine Gelatine-Verflüssigung trat ein.

Herkunft: Erde von Toshima-Ward in Tokyo/ Japan.

Angesichts des oben beschriebenen bakteriologi-6e sehen Verhaltens wurde der Mikroorganismusstamm als zu Pichia ohmeri gehörig identifiziert und intern als Picchia ohmeri Nr. 230 bezeichnet. Die Hinterlegung dieses Stammes ist oben angegeben.

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Das Verfahren gemäß der Erfindung beruht auf der Es Ist erwähnenswert, daß die Isolierung von vorteilhaften Verwendung des oben angegebenen D-Arabit aus der Fermentationsflüssigkeit gemäß der Mikroorganismus Pichia ohmeri ATCC 20 209. Nach vorliegenden Erfindung ohne weiteres vorgenommen dem Verfahren der Erfindung wird D-Arabit mit hoher werden kann, da die Flüssigkeit das gewünschte Ausbeute durch aerobische Kultivierung des genannten 5 D-Arabit mit hoher Konzentration enthält, ohne daß Mikroorganismus in einem Nährmedium erhalten, andere mehrwertige Alkohole mit ähnlichen Eigenweiches als wesentliche Kohlenstoffquelle ein fermen- schäften vorliegenr

uerbares Saccharid enthält. Dies führt zur Ansamm- Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. In

lung von D-Arabit. Letzterer wird auf die herkömm- diesen sind alle Angaben bezüglich der prozentualen

liehe Weise gewonnen. ₁₀ Gehalte auf das Gewicht bezogen.

Als für die Züchtung nach der Erfindung geeignete

Kohlenstoffquellen kommen alle Saccharide in~ Be- Beispiel 1 tracht, soweit sie von dem genannten Stamm verwertet

werden können. Es wurde festgestellt, daß Glucose, 50 ml eines Nährmediums, welches 10% Glucose,

Saccharose, Mannose, Maltose, Fructose u. dgl. be- 15 0,4% Hefeexlrakt, 0,3% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄-

sonders vorzuziehen sind. 7 H,0 enthält und dessen pH-Wert 6,6 betrug, wurden

Es können gleichermaßen natürliche und künstliche In einen 500 ml-KoIben gegossen. Dieser wurde dann

Nährnu\l;en verwendet werden, die dadurch hergestellt 10 Minuten bei 120 C sterilisiert,

werden, daß man eine ausgewählte Kohlenstoffquelle Das Medium wurde mit 1,5% vorher sterilisiertem

nät einer organische.· oder anorganischen Stickstoff- 20 CaCO₃ versetzt und hierauf mit 4 ml einer Vorkultur

quelle, wie Ammoniumchlorid,-sulfat,-nur it,-acetat, von Pichia ohmeri ATCC 20 209 versetzt. Diese

Harnstoff u dgl., und mit einer geringen Menge von wurde durch gesonderte 2tägige Kultivierung dieses

Nährstoffen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Mikroorganismus in einer anderen Fraktion des oben

Casaminosäure, Peptonen und Vitaminen, und schließ- genannten Nähr.wüums hergestellt.

Kch mit anorganischen Substanzen, wie ΚΗ,ΡΟ,, 25 Der Kolben w n<* 4 Tage auf einer Schütteleinrich-

MgSO, -7 H₂O u. dgl., vermischt. " tung mit einem Auss. hlag von 7 cm bei 125 Zyklen

Obwohl die Kontrolle des pH-Wertes des Nähr- pro Minute und 30 C geschüttelt. Danach wurde eine

mediums während der Kultivierung nicht notwendig kultivierte Flüssigkeit erhalten, die 4,3 g pro dl D-Ara-

ist, ist es doch im Interesse der Gewährleistung einer bit enthielt, was einer auf das Gesamtgewicht der

gesteigerten Ausbeute an D-Arabit erwünscht, den 30 Ausgangsglucose bezogenen Ausbeute von 43% ent-

pH-Wert bei 4 ~ 7 zu halten. Die Kontrolle des pH- sprach.

Wertes kann z. B. vorteilhatterweKe durch Zugabe Durch chromatc.graphische Untersuchungen wurde

von Calciunicarbonat durchgeführt wenden. bewiesen, daß die kultivierte Flüssigkeit von anderen

Wenn die ■ ermentation eemäß der Erfindung mit mehrwertigen Alkoholen als D-Arabit und der rest-

einem Nährn. dium, welches ein Saccharid mit einer 35 liehen Glucose fast frei war. Konzentration von etwa IO Gewichtsprozent enthält,

durchgeführt wird, dann wird D-Arabit mit einer, Beispiel 2 bezogen auf das Gesamtgewicht des Saccharids, Ausbeute von 40% erhalten. 18,5 I eines Nährmediums, welches 2% Glucose, Wenn auf der anderen Seite die Fermentation mii 40 0,1 % Hefeextrakt, 0,2% Harnstoff, 0,1% KH₂PO₄ einem Nährmedium durchgeführt wird, weiches, ein und 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O enthielt, wurden in einen Saccharid mi' einer niedrigen Konzentration, wie Tank-Fermentor mit einer Kapazität von 301 gebracht, etwa 3 ~ 5 Gewichtsprozent enlhält, und wenn die Dieser wurde 15 Minuten bei 120 C sterilisiert. In Saccharid-Verarmung durch periodische Zugabe des den Fermentor wurden 100 g vorher durch Hitze Saccharids in der Weise kompensiert wird, daß wäh- 45 sterilisiertes CaCO₃ eingebracht, rend des Prozesses die Konzentration des Saccharids Der Inhalt des Fermentors wurde mit 1 1 einer Vorin dem Nährmedium auf etwa 3 ~ 5",, gehalten wird, kultur Pichia ohmen ATCC 20 209 jnoculiert. Diese dann kann eine gesteigerte Ausbeute an D-Arabit, war gesondert durch 24stündige Kultivierung des beispielsweise eine solche von 50% (8-9 g/dl), S«qmmes bei 30 C in einem Nährmedium, welches bezogen auf das Gesamtgewicht des Saccharids, 50 4% Glukose. 0,1 % KH₂PO₄ und 0,1 % MgSO₁ · 7 H₂O erhalten werden. enthielt, hergestellt worden.

Ferner kann eine gesteigerte Vermehrung der Zellen Das Ganze wurde bei 30 C unter Belüftuni -nit

und eine erhöhte D-Arabit-Ausbeute erhalten werden, 20 l/min und Rühren mit ZW upm (Kd = (S bib 5)

wenn der Sauerstoffabsorptionskoeffizient (Kd) in · 10-/⁶) kultiviert. Pn System wurde kontinuierlich dem aerobischen Kultivierungsi..edium innerhalb des 55 eine genügende Menge 70%,ger wäßriger Glucose-

Bereiches von 7,7 -10 ⁴ bis 4,15 · 10 ⁴, gemessen nach Lösung zugefügt, um die Konzentration der Glucose

der Sulfit-Oxidations-Methode, gehalten wird. Wenn in dem Nährmedium während der Kultivierung inner-

man bei einem Kd-Wert von weniger als 4 · K¹ /^e halb des Bereiches von 4 ~ 5 % zu halten. Die Zugabe

arbeitet, dann verringert sich der Saccharid-Verbrauch der Glucose-Lösung wurde nach 95 Stunden un»er- und man nimmt einen aromatischen Ester-Geruch wahr. 60 brachen und die Kultivierung weitergeführt, bis die

Die D-Arabit-Ausbeute wird beträchtlich verringert. gesamte Kultivierungszeit 120 Stunden betrug.

Nach Vervollständigung der Fermentation wird das Der Gesamtverbrauch an Glucose während der

D-Arabit aus der Nährflüssigkeit nach den üblichen obenangegebenen Fermentationsperiode betrug 17 g/d

Methoden isoliert. Dies geschieht dadurch, daß man Flüssigkeit. Die erhaltene Flüssigkeit enthielt 8,6 g/dl alle gewachsenen Zellen entfernt, die zurückbleibende 6₅ D-Arabit. Dies entspricht einer, bezogen auf die ver-

Fermentationsflüssigkeit mit Aktivkohle behandelt, wendete Giucosemenge, Ausbeute von 50%.

die Flüssigkeit konzentriert und den Rückstand aus 1 1 der kultivierten Flüssigkeit wurde zentrifugiert,

heißem Äthanol u. dgl. umkristallisiert. um die Sedimentierung der Zellen zu bewirken. Diese

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wurden dann durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde rr.it einer bestimmten Menge Ca(OH)₂ versetzt und erhitzt. Das Ganze wurde weiter mit einer kleinen Menge Aktivkohle behandelt. Nach Entfernung der Feststoffe durch die Filtration wurde das Filtrat bei vermindertem Druck bei 60 C zu einem Syrup konzentriert. Nach dem Stehenlassen über Nacht veränderte sich der Syrup zu einer kristallinen Masse, die aus heißem 99%igen Äthanol umkristallisiert wurde. Dabei wurden 70 g prismenförmigen D-Arabits erhalten. Das Produkt war in kaltem Äthanol unlöslich und reduzierte Fehling'sche Lösung nicht. Beim Vermischen mit einem authentischen Muster trat keine Schmelzpunktdepression auf. Die 1 R-Absorptionswerte des Produktes entsprachen denjenigen des authentischen Musters.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von D-Arabit, dadurch gekennzeichnet, daß man Pichia ohmcri ATCC 2G 209 in ein Nährmediüm inocufiert, welches als wesentliche Kohlenstoff queue ein fermentierbares Saccharid enthält, den Mikroorganismus in dem Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und aus der ίο Fermentationsflüssigkeit das angesammelte D-Arabit in herkömm !.her Weise sewinnL

   Die Klassifizierung des bestimmten Mikroorganismus welcher aus der Erde von Toshima-Ward in Tokyo, Japan, isoliert worden ist, wurde nach der von J Lodder in dem Buch »The Yeasts, a Taxonomic Study«, Intersdence Publishers, New York, j952, angegebenen Methode durchgeführt.

   Der auf diese Weise erhaltene Mikroorganismus zeiste die folgenden bakteriologischen Eigenschaften: