DE2321334C3

DE2321334C3 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von alpha-Amylase

Info

Publication number: DE2321334C3
Application number: DE19732321334
Authority: DE
Inventors: John D. Littleton; Warder jun. Ira T. Lakewood; Jansen Grant E. Boulder; Richards Carol M. Denver; CoL Douros jun: (V.StA.)
Original assignee: The Gates Rubber Co., Denver, CoI. (V-StA.)
Priority date: 1972-05-05
Filing date: 1973-04-27
Publication date: 1977-03-10

Description

Verfahren /ur Herstellung von alpha-Amylase durch Fermentation mit Mikroorganismen sind bekannt. Bei diesen Verfahren werden im allgemeinen Nährmedien, die verschiedene Quellen von Stärke, Proteinen und essentiellen Nährstoffen enthalten, hergestellt, sterilisiert, gekühlt und mit Kulturen verschiedener Bakterien, Hefen oder Schimmelpilzen geimpft, die alpha-Amylase durch Verstoffwechseln des beim jeweiligen Verfahren verwendeten Nährmediums zu bilden vermögen. Bei den Entwicklungen auf diesem Gebiet handelt es sich beispielsweise um das Auffinden verbesserter Nährmedien und Züchtungsbedingungen für die jeweiligen Mikroorganismen, die alpha-Amylase bilden. Nach diesen Verfahren hergestellte alpha-Amylasen sind für ihre Fähigkeit, Stärke zu Zuckerprodukten wie Dextrin, Glucose, Maltose usw zu hydrolysieren, bekannt und werden für zahlreiche kommerzielle, technische, pharmazeutische und wissenschaftliche Zwecke verwendet. Von diesen Anwendungen seien erwähnt: Herstellung von Nahrungsmitteln, Genußmitteln und Getränken, Herstellung von Klebstoffen, Bekämpfung der Verunreinigung der Umwelt, Herstellung von Verdauungsmitteln, Verwendung für die Behandlung von Krankheiten und als HilfsstofTe in der Grundlagenforschung, z. B. bei der Forschung zur Aufklärung der Strukturen verschiedener komplexer Kohlenhydrate. Nährmedien, Mikroorganismen, Fermentationsverfahren und Anwendungen Tür alpha-Amylase werden in den US-Patentschriften 26 95 863, 30 12 944 und 34 14479 beschrieben.

Die DT-OS 20 25 748 betrifft die Herstellung eines alpha-Amylase enthaltenden Enzyinproduktes, das eine gute Aktivität und Stabilität bei hohen pH-Werten, niedrigen Konzentrationen an Ca ^{+ +}-Ionen und hoher Temperatur besitzt, durch Züchtung von Bacillus licheniformis in einem geeigneten Nährmittel und Isolierung eines alpha-Amylse enthaltenden Enzymproduktes aus der Fermentationsbrühe.

Die DT-OS 2044984 beschreibt eine mikrobiologische Amylase mit optimalem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 11,5 und ein Verfahren zu deren Herstellung mit einem Bakterium von Bacillus subtilis.

Die Erfindung offenbart erstmals den Einsatz von Geflügelexkrementen als alleinige C- und N-Quelle

zur Herstellung von alpha-Amylase mittels fünf bestimmter Bacillus cereus-Stämme.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von alpha-Amylase durch Vergärung von Nährmedien, die eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff und essentielle Nährstoffe enthalten, unter aeroben Bedingungen mit Hilfe eines Mikroorganismus, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man Geflügelexkrement wenigstens als Teil des Nährmediums und als Mikroorganismus Bacillus cereus ATCC 21 768, Bacillus cereus ATCC 21 769, Bacillus cereus ATCC 21 770, Bacülus cereus ATCC 21 77' oder Bacillus cereus ATCC 21 772 verwendet.

eine vollständige Beschreibung der Morphologie

jedes dieser fünf Mikroorganismen wird später in dieser Beschreibung gegeben. Beschrieben wird ferner, wie alpha-Amylase nach diesem Verfahren unter Verwendung von Geflügelexkrement als einzige Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff erzeugt werden kann. Es wurde auch gefunden, daß bei dem oben definierten erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren Glycin die Produktion von alpha-Amylase durch die fünf neuen erfindungsgemäß verwendeten Stämme in einem Nährmedium, das gleichzeitig Weizenkaff enthält, steigert.

Bei den vorstehend genannten Fermentationsverfahren werden Kulturmedien erhalten, die sich zur Gewinnung der alpha-Amylase leicht nach üblichen Fällungs-, Filtrations- und Austauschverfahren verarbeiten lassen. Die Fällung wird gewöhnlich durch Zusatz eines Salzes eines zweiwertigen Kations erreicht, das die alpha-Amylase koaguliert. Nach der Ausfällung kann die nach den Verfahren gemäß der Erfindung hergestellte alpha-Amylase äußerst einfach durch Anwendung der Ionenaustauschchromatographie an Diäthylaminoäthylcellulose (DÄAÄ-Celluiose) unter Verwendung von KCl oder anderen EIutionslösungsmitteln isoliert werden.

Bei Verwendung von Geflügelexkrement als Ergänzung für übliche wäßrige Nährmedien wird vorzugsweise ein Nährmedium hergestellt, das 0,01 bis 15% Protein material und 0,01 bis 15% Stärke enthält. Als proteinhaltige Materialien eignen sich Maisquellflüssigkeit, Casein, Trockenhefe, Fischmehl, Baumwollsaatmehl, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl sowie Gemische dieser Materialien. Vorzugsweise werden etwa 0,8% proteinhaltiges Material in den Nährmedien verwendet, da diese Menge dazu beiträgt, gute Ausbeuten an alpha-Amylase zu gewährleisten.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen eignen sich beim erfindungsgemäßen Verfahren Glucose, Arabinose. Xylose, Lactose, Maltose, Saccharose und verschiedene organische Verbindungen,, z. B. orga-

nische Ammoniumsalze, organische Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren, MaisquellSüssigkeit, Pepton, Casein, Fleischextrakte und Sojabohnenprodukte. Diese Materialien können natürlich nicht nur als Kohlenstoffquellen, sondern gleichzeitig auch als verwertbare S Stickstoffquellen verwendet weiJen. Natürlich wird die Harnsäure in Hühner- oder Putenexkrement auch als Stickstoffquelle verwendet. Als weitere Stickstoffquellen eignen sich für die Zwecke der Erfindung aiie organischen oder anorganischen stickstoffhaltigen Verbindungen, die Stickstoff in einer ^porm, die sich Für die Verstoffwechselung durch die verwendeten Mikroorganismen eignen, freizugeben vermögen. Aus der organischen Gruppe können die folgenden Verbindungen als Beispiele geeigneter stickstoffhaltiger Verbindungen genannt werden: Proteine, säurehydrolysierte Proteine, durch Enzyme aufgeschlossene Proteine. Aminosäuren, Hefeextrakt, Asparagin, Harnstoff und Harnsäure. Natürlich können diese Materialien gleichzeitig als Kohlenstoffquellen verwendet werden. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit ist es gewöhnlich vorzuziehen, anorganische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniak und Ammoniumhydroxyd oder ihre Salze, z. B Ammoniumeitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und saures Ammoniumphosphat, zu verwenden. Wie bereits erwähnt, kann Puten- und Hühnerexkrement als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwendet werden. Ein weiterer sehr zweckmäßiger und zufriedenstellender Weg zur Zufuhr von Stickstoff ist die Verwendung von Ammoniumphosphat oder saurem Ammoniumphosphat, die als Salz zugesetzt oder im wäßrigen Nährmedium in situ gebildet werden können, indem man NH₃ durch das Nährmedium perlen läßt, dem vorher Phosphorsäure zugesetzt worden ist. wodurch saures Ammoniumphosphat gebildet wird.

Als Stärken können beim erfindungsgemäßen Verfahren in den Nährmedien lösliche Stärken oder beliebige übliche unlösliche Stärken, z. B. Reisstärke, Maisstärke, Kartoffelstärke und Pfeiwurzelstärke, verwendet werden. Die Herkunft der Stärke ist nicht wesentlich, so daß unter dem Ausdruck »Stärke« alle verschiedenen bekannten Formen ohne Rücksicht auf ihre Herkunft zu verstehen sind. Die Aufgabe der Stärke ist die eines Aktivators oder Stimulans, und die vei wendete Menge liegt im Eereich von etwa 0,01 bis 15%. Besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung von 0,5% Stärke erhalten, so daß diese Menge bevorzugt wird.

Außer den Kohlenstoff- und Stickstoffquellen müssen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mineralische Nährstoffe in dem Nährmedium zugegen sein, um gutes Wachstum des Mikroorganismus sicherzustellen und maximale Selektivität, d. h. Umwandlung von Geflügelexkrement und anderen Nährstoffen in Mikroorganismuszellen zu erzielen. Beispielsweise können Kalium, Natrium, Eisen, Magnesium, Calcium, Mangan, Phosphor und andere Nährstoffe dem wäßrigen Nährmedium zugegeben werden. In den meisten Fällen enthalten jedoch Hühnerexkrement und Putenexkrement genügend Mineralstoffe Für das Wachstum und die Bildung von alpha-Amylase. In jedem Fall können diese Materialien in Form ihrer Salze, vorzugsweise ihrer wasserlöslichen Salze, zugeführt werden. Beispielsweise kann das Kalium als Kaliumchlorid, -phosphat, -sulfat, -citrat, -acetat und -nitrat zugesetzt werden. Eisen und Phosphor können in Form von Sulfaten und Phosphaten, z. B. als Eisensu'fat und Eisenphosphat eingeführt werden. Im allgemeinen wird der größte Teil des Phosphors als Ammoniumphosphat zugeführt. Bei Verwendung von Ammoniumphosphat oder saurem Ammoniumphosphat kann das Phosphat als kombinierte Quelle von Stickstoff und Phosphor (Phosphation) für das Wachstum der Zellen des Mikroorganismus dienen.

Nach dem Impfen werden die Fermentationen gemäß der Erfindung bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 50 C durchgeführt. Innerhalb dieser Grenzen ist das Wachstum optimal. Vorzugsweise wird jedoch die Temperatur im Bereich von 26 bis 37 C, insbesondere im Bereich von 32 bis 35" C, gehalten

Bei diesen Temperaturen wurden die besten Ergebnisse erhalten. Der pH-Wert des Mediums wird während der Fermentation zwischen etwa 3,5 und 9.5 gehalten. In diesem Bereich wächst der Mikroorganismus zufriedenstellend- Vorzugsweise wird jedoch der pH-Wert bei etwa 7,2 gehalten. Bei diesem Wert wurden die besten Ergebnisse erhalten

Die obengenannten 5 Mikroorganismenstämme sind aerob und müssen daher in Gegenwart von Luft gezüchtet werden, wenn das Wachstum gut sein soll. Die Mikroorganismen können demzufolge auf der Oberfläche flacher Schichten des Mediums oder in belüfteten Submerskulturen gezüchtet werden. Im letzteren Fall werden tiefe Tanks verwendet, denen Luft zugeführt wird. Beide Verfahren werden von der Anmelderin angewandt. Sie erwiesen sich als gut geeignet fur die Herstellung von alpha-Amylase. Für die Großherstellung ist natürlich das U. tiefen Tanks durchgeführte Submersverfahren am geeignetsten.

Die Fermentation wird fortgesetzt, bis die Ausbeute an alpha-Amylase maximal ist. Im allgemeinen liegt die Fermentationszeit zwischen 12 und 72 Stunden, jedoch konnte nachgewiesen werden, daß alpha-Amylase-Aktivität bereits nach 4 Stunden vom Beginn der Fermentation im Nährmedium vorhanden ist. Im allgemeinen erreicht die Ausbeute nach etwa 12 bis 16 Stunden ein Maximum, das jedoch erheblich geringer ist als nach der längeren Zeitgrenze von 72 Stunden, so daß die Fermentation vorzugsweise für eine Zeit von etwa 30 Stunden durchgeführt wird.

Sauerstoff kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dein Kulturmedium in beliebiger Form zugeführt werden, die leicht vom Mikroorganismus assimiliert werden kann. Sauerstoffhaltige Verbindungen können verwendet werden, solange sie das Wachs'um der Zellen des Mikroorganismus nicht beeinträchtigen. Der Sauerstoff wird jedoch zweckmäßig in Form von sauerstoffhaltigen Gasen, z. B. Luft, die 19 bis 22 Gew.-% Sauerstoff enthalten, zugeführt. Zwar wird die Verwendung von Luft bevorzugt, jedoch kann auch mit Sauerstoff angereicherte Luft, die mehr als 22 Gew.-% Sauerstoff enthält, verwendet werden.

Nach der Isolierung der ausgefällten alpha-Amylase aus dem Nährmedium wird das Material getrocknet wobei das endgültige Präparat erhalten wird, da; außergewöhnlich hohe alpha-Amylase-Aktivität auf weist. Die Trocknung kann unter vermindertem Drucl bei Raumtemperatur über Calciumchlorid oder be Temperaturen bis etwa 65 C ohne Verminderuni der Aktivität des alpha-Amylase-Präparats erfolgen

Nach der Bildung der alpha-Amylase im Kultur medium wird sie wie folgt isolier«: Zuerst werden ah

Feststoffe aus dem Medium entfernt, worauf die alpha-Amylase durch Zusatz eines Fällmittels, das nachstehend beschrieben wird, aus dem zellfreien Medium ausgefällt wird. Die Feststoffe können nach beliebigen üblichen Methoden, z. B. durch Filtration und Zentrifugieren, aus dem Kulturmedium entfernt werden. In vielen Fällen ist es vorteilhaft, die alpha-Amylase in Lösung zu verwenden, so daß eine Ausfällung hierbei nicht notwendig ist und die Lösung, die nach der Entfernung der Zellen vom Kulturmedium zurückbleibt, ohne weiteres Tür diesen Zweck verwendet werden kann. Durch Konzentrierung der zellfreien Medien wird jedoch ihre Wirksamkeit verbessert, so daß diese Arbeitsweise bevorzugt wird. Nach der Abtrennung der Feststoffe vom Nährmedium und Gewinnung der zellfreien Lösung der alpha-Am)-läse wird diese vorzugsweise ausgefällt, indem Fällmittel, z. B. organische Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind, dem Medium zugesetzt werden. Als Fällmittel eignen sich beispielsweise Ammoniumsulfat, Methyläthylketon, Aceton, Dioxan und niedere aliphatische Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol. Isopropanol. n-Propylalkohol und tert.-Butylalkohol. sowie Polyäthylenglykol oder Gemische dieser Fällmittel. Das Lösungsmittel wird in einer solchen Menge zugesetzt, daß die gesamte alpha-Amylase ausgefällt wird. Hierbei wurde festgestellt, daß etwa 0.5 bis 2,0 Raumteile Fällmittel pro Raumteil des zellfreien Mediums genügen, um die gesamte alpha-Amylase auszufällen. Im allgemeinen wird Ammoniumsulfat als Fällmittel verwendet, da mit ihm gleich gute Ergebnisse ohne Rücksicht auf die Konzentration der alpha-Amylase im zellfreien Kulturmedium erhalten werden. Es können zwei Raumteile Polyäthylenglykol pro Raumteil des die aipha-Amylase enthaltenden zellfreien Kulturmediums verwendet werden, da bei Verwendung dieser Menge eine vollständige Ausfällung im allgemeinen gewährleistet ist.

Bei der Ausfällung der alpha-Amylase erwies es sich als zweckmäßig, das zellfreie Kulturmedium vor der Ausfällung zu konzentrieren. Die Lösung kann auf ungefähr ¹Z₁₀ ihres ursprünglichen Volumens eingeengt werden. Ferner erwies es sich als zweckmäßig, das Nährmedium vor der Einengung zu dialysieren. da hierdurch die Reinheit des Endprodukts erhöht wird. Die Lösung kann in Zellglasbeuteln (Cellophan) gegen fließendes Leitungswasser etwa 24 Stunden dialysiert werden, wenn diese Maßnahme nicht unpraktisch ist.

Zu Beginn der Fermentation wird das sterile Nährmedium mit dem zu züchtenden Mikroorganismus geimpft, ζ. B. unter Verwendung eines vorher gezüchteten Inoculums in einem Wachsrummedium oder im gleichen Nährmedium, in dem es für die Produktion gezüchtet werden solL z. B. in den oben beschriebenen Nährmedien. Die Anfangskonzentration des Inoculums, das den Mikroorganismus enthält, zu Beginn der Fermentation kann in weiten Grenzen Hegen und beispielsweise 0,0005 bis 50,0 g pro Liter des gesamten Fermentationsmediums betragen. Auch andere Impfmethoden können angewandt werden. Beispielsweise käse eine impfkultar verwendet werden, die durch vorherige Züchtung des Mikroorganismus auf einem Medium, das von dem Nährmedium für die Großhersteüong verschieden ist, hergestellt worden ist and dann in die Fermentationsbehälter überfuhrt wird. Normalerweise wird die Kultur 3 4 bis 18 Stunden entwickelt, bevor die Produktionsmedien mit ihi beimpft werden.

Besonders hohe Ausbeuten an alpha-Amylase wer den erhalten, wenn die Teilchengröße des Geflügelexkrements über 42 μ liegt. Von der Anmelderir erhaltene Versuchsergebnisse zeigen, daß es noch vorteilhafter ist, Geflügelexkrement einer Teilchengröße von 125 μ zu verwenden, wobei ein möglichsl großer Anteil von Teilchen einer Größe von mehr als

ίο 177 μ besonders bevorzugt wird.

alpha-Amylase-Bestimmung

Die alpha-Amylasenbestimmung erfolgt vorzugsweise nach den allgemeinen Methoden von Fischer und Stein (Biochemical Preparation, 7, I960), bei denen die Aktivität von alpha-Amylase unter Verwendung von Dinitrosalicylsäure (DNS) gemessen wird.

Als Substrat wird bei dieser Methode eine 1 %ige Lösung von löslicher Stärke in siedendem Wasser mit 0,02molarem Natriumglycerophosphat-HCl-Puffer, auf pH 6,9 eingestellt, verwendet. Als Abbruchmittel dient eine alkalische Lösung von Dinitrosalicylsäure, hergestellt durch Suspendieren von 20 g 3,5-Dinitrosalicylsäure in 400 ml Wasser. Eine Lösung von 32 g NaOH in 800 ml Wasser wird unter kräftigem

Rühren zugetropft. Falls erforderlich, wird in einem Wasserbad leicht erwärmt, bis sich eine klare Lösung gebildet hat. Der Rest der NaOH-Lösung wird dann zugesetzt, worauf 600 g Kaliumnatriumtartrat in kleinen Portionen zugegeben werden. Dann wird mit Wasser auf ein endgültiges Volumen von 21 aufgefüllt. Die Lösung wird dann durch eine große grobe Glasfritte filtriert und bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt.

Die eigentlichen alpha-Amylasebestimmungen wer-

den wie folgt vorgenommen: 1 ml Substratlösung wird zu je 1 ml der alpha-Amylase-Testlösungen gegeben, die mit 0,002molarem Natriumglycerophosphat-HCl-Puffer auf den gleichen pH-Wert wie die Substratlösung eingestellt sind. Nach einer Inkubationszeit von genau 3 Minuten bei 25^CC werden 2,OmI des Abbruchreagenz zugesetzt. Das Reagenzglas wird 5 Minuten in siedendem Wasser gehalten und dann gekühlt, worauf das Reaktionsgemisch mit 20 ml Wasser verdünnt wird. Die Farbe wird in einem lichtelektrischen Klett-Summerson-Kolorimeter abgelesen, der mit einem Grünfilter Nr. 54 (Spektralbereich 500 bis 570 ΓΠμ) versehen ist. Der Extinktionswert wird aus einer Standardkurve, die mit D( + )-Maltosehydrat festgelegt worden ist, in mg

ss Maltose umgerechnet. Dieser Maltoselösung wird keine Stärke und kein Puffer zugesetzt. Es wurde gefunden, daß die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn 1.0 ± 0,5 mg Maltose während der Reaktion gebildet wird. Dies entspricht der Verwendimg von 0,3 bis 1,0 m|ig alpha-Amylase im Bestimmungssystem. Von der Anmelderin wurde eine alpha-Amylaseaktivitätseinheit (DNS-Einheit) als die Enzymmenge definiert, die 1 mg Maltose unter den obengenannten Bedingungen bildet.

6s Falls nicht anders angegeben, sind die Ergebnisse, die bei den ha folgenden beschriebenen Teste auf alpha-Amylase erhalten wurden, in DNS-Einheiten ausgedrückt.

Eigenschaften der erfind ungsgemäß einzusetzenden
fünf Stämme

Die fünf von der Anmelderin isolierten Stämme sind bei der American Type Culture Collection. Washington D. C. hinterlegt und erhielten die Bezeichnungen

Bacillus ccrcus A.T.C.C. 21 768, Bacillus α A.T.C.C. 21 769, Bacillus cereus A.T.C.C. 21 Bacillus cereus A.T.C.C. 21 771 und Bacillus c< A.T.C.C. 21 772. Diese Stämme haben die r 5 stehend genannten Kultureigenschaften und m skopischen Eigenschaften.

	A.T.C.C. Nr.	21 769	21 770	21 771	— —	21 772	Wachs- Gas
	21 768	Hühnermist	Hühnermist	Hühnermist	+	Hühnermist	tum
Quelle	Putenmist	Putenmist	Putenmist	Putenmist	- -	Putenmist	—
	Hühnermist	Dextrose-	Dextrose-	Dextrose-	- -	Dextrose-	+ -
Nährmedium	Dextrose-	Stärke-Agar	Stärke-Agar	Stärke-Agar	— -	Stärke-Agar	-
	Stärke-Agar	37	37	37	-	37	-
Züchtungs	37				+		-
temperatur, ' C		6,8*	6.8	6,8	-	6,8	+ -
pH-Wert der	6,8				— —		—
Kultur		grampositiv	grampositiv	grampositiv	+	grampositiv	- -
Gramfärbung	grampositiv	1 — ' / — ^ U	1,3 U Ketten	1 - V₂ u	+	3U	—
	3μ		»vakultiert«		+ +		+ -
		exzentrisch	exzentrisch	exzentrisch	—	exzentrisch	+ +
Sporen	exzentrisch	+ ,2U	+ . 1.5 U	+ ,0,75U	+	+ , 1,5 U	—
	+ . 1.5 U	—	-	-		-	+ —
Pepton-Eisen	—	+	+	+	+	+ +
Hydrolyse von
Stärke		- ITag	- 1 Tag	- 1 Tag	- 1 Tag
Lackmusmilch	- ITag	alkalisch	Hydrolyse	Hydrolyse	Hydrolyse
	Reduktion	5 Tage	5 Tage	5 Tage	5 Tage
	5 Tage	grau	weiß	weiß	weiß
Morphologie	weiß	weiß	schleimig	schleimig	schleimig
der Kolonie	schleimig	schleimig	ausbreitend	glänzend	sich ausbreiten
	glänzend		dunkel mit
			Alterung
		—	—	-	-
Indol	_	—	-	-	-
Voges-Proskauer	_	+	+	+	+
Nitratreduktion	— kein Gas	—	-	-	-
Methylrot	—	—	-	—	-
Koser-Citrat	—		-	+	+
Motilität	-\|_	+	+	+	+
Katalase	_\|_	-	+	+	+
Gelatine-Stat	-			Bacillus cereus A.T.C.C. Nr. 21	769
Bacillus cereus A.	T.C.C. Nr. 21 768	Wachs- Gas	50 Kohlenhydrat-Daten Sauer
Kohlenhydrat-Daten	Sauer	tum
		_	Inosit
Inosit	₊	+	Cellobiose
Cellobiose		-	55 Adonit
Adonit	_ +	-	Sorbit
Sorbit	_ +	—	Dulcit
Dulcit	_ +	+ -	Inulin
Inulin	+	-	to Glycerin
Glycerin	- -	-	Salicin
Rhamnose	- leicht	— —	Mannit
Salicin	—	—	Maltose
Mannit	_ —	+ -	₆ Saccharose
Maltose	+	+ -	Dextrose
Saccharose		—	Lactose
Dextrose		+ -	Mannose
Lactose	_

Bacillus cereus A.T.C.C. 21

Kohlcnhydral-Daten

Sauer Wachs- Gas turn

Inosit Cellobiose Adonit Sorbit Dulcit Inulin Glycerin Salicin Mannit Maltose Saccharose Dextrose Mannose

Bacillus cereus A.T.C.C. Nr. 21

_i_

Kohlenhydral-Daten

Saue

Wachs- Gas tum

Inosit Cellobiose Adonit Sorbit Dulcit Inulin Glycerin Salicin Mannit Maltose Saccharose Dextrose

Bacillus cereus A.T.C.C. Nr. 21

fCohlenhydrat-Daten Sauer Wachs- Gas

turn Vergleichsbeispiel 1

alpha-Amylase-Aktivität der fünf neuen Stämme irr Vergleich zu bekannten Stämmen, die alpha-Amylase bilden

Sporen jedes der Mikroorganismen Bacillus cereus A.T.C.C. 21 768 bis 21 772 werden im Vergleich zu den bekannten alpha-Amylase bildenden Mikroorganismen Aspergillus niger A.T.C.C. 15 475 und Bacillus

■ ο amyloliquefaciens A.T.C.C. 23 843 auf ihre Fähigkeit zur Bildung von alpha-Amylase untersucht.

.Ic eine Impfnadelmenge der Sporen wird von den Dextrose-Stärke-Agar-Schrägkulturen der neuen Mikroorganismen und der beiden bekannten alpha-

Amylase bilden Mikroorganismen in einzelne Erlenmeyerkolben überfuhrt, die 150 ml einer Spizzenbrühe oder einer Weizenkleie oder einer Bacillus-Amylase enthalten. Etwa 1 bis 5 ml eines vegetativen 16-Stunden-Inoculums, dessen pH-Wert auf 6,8 eingestellt

ist, werden verwendet. Die Kolben werden dann 15 Minuten in Wasser von 5OC gestellt und gekühlt, und der Inhalt wird quantitativ in einen 150-ml-Kolben überfuhrt. Die Lösung wird mit 2,0 N-Natriumhydroxydlösung auf pH 4,8 eingestellt, in einen 500-ml-

brlenmeyerkolben überführt und auf etwa 200 ml verdünnt. Der Inhalt wird dann in einen 250-ml-Meßkolben überfuhrt und auf das gewünschte Volumen

->nm^Uiⁿi^nt" ^{20Oml werden dann} 15 Minuten bei 2WO UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird m einen trockenen Kolben dekantiert. 50 ml dieser Flüssigkeit wird in ein 70-ml-Reagenzglas pipettiert Nach Zugabe von 5 ml 5.0 N-Salzsäure wird das Reagenzglas lose verschlossen, in einem siedenden Wasserbad 3 Stunden erhitzt und dann in einem Γ™ , p^kühlt· ^Der Inhalt des Glases wird in einen 100-ml-Meßkolben überführt und mit 2,0 N-Natriumhydroxyd bis zum Umschlagspunkt von Phenolphthalein eingestellt. Nach Verdünnung auf das gewünschte Volumen wird der Wert für reduzierenden

Zucker, gerechnet als Dextrose, an einem aliquoten l eil der endgültigen Lösung bestimmt. Unter diesen bedingungen erreichte der alpha-Amylase-Gehalt der Kulturen von Bacillus cereus A.T.C.C. 21 768 bis 21 772 ein Maximum in etwa 20 Stunden, während

der Amylase-Gehalt der beiden bekannten Kulturen inr maximales Wachstum erst nach etwa 40 Stunden erreichten. Die alpha-Amylase-Erzeugung bei diesen Versuchen ausgedrückt in DNS-Einheiten, ist in der folgenden Tabelle genannt·

Inosit

Cellobiose

Adonit Sorbit Dulcit Inulin Glycerin Salicin Mannit Maltose

Saccharose

Dextrose Lactose

Nährmedium

Spizzen- Weizen- Bacfflusbrühe kleie Amylase-

Ansätze

A.T.C.C.-Stamm:
21768
to 21769
21770
21 771
21772

_6s Aspergillus niger 15475

Bacillus amyloliquefaciens 23 843

2,93	3,5	0,7
237	9,0	0,7
8^5	35,2	0,7
3,50	4,62	0,7
2,97	9,0	0,7
2,0	3,25	0

2,0

7,0

Spizzenbrühe:

Man kocht 200 g geschälte und zu Scheiben geschnittene Kartoffeln 30 Minuten in 1 1 Leitungswasser. Man filtriert durch Watte, gibt 5,0 mg MnSO₄ zu, stellt auf pH 6,8 ein und füllt mit Leitungswasser auf 1 I auf.

Weizenkleie-Filtral:

100 g Weizenkleie. 300 ml Leitungswasser. Man autoklaviert, filtriert durch Baumwollgaze, gibt 200 ml Leitungswasser zu und autoklaviert.

Bacill us-A iny lase-Ansätze

L-Leucin 10 mg/1 ^I;

K₂HPO₄ 14g

Natriumcitratdihydrat Ig

Ammoniumsulfat 2 g

Magnesiumsulfatheptahydrat 0.2 g

in 1 1 Wasser, pH 7 5 g Glucose getrennt autoklaviert

Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität der alpha-Amylase von Bacillus cereus A.T.C.C. 21 768 bis

21 772

Jedes Enzym wird 3 Minuten bei 25"C, jedoch bei verschiedenen pH-Werten getestet. Sowohl die Enzymlösung als auch die l%igen Stärkelösungen werden in einer Pufferlösung bei dem pH-Wert hergestellt, bei dem die alpha-Amylasebestimmung durchgeführt werden soll. Die Ergebnisse für Bacillus cereus A.T.C.C. 21 768 sind in F i g. 1 dargestellt. Auch hier sind die Kurven für die anderen vier Stämme fast identisch. Die Untersuchung der pH-Kurven zeigt maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 7,5. Im allgemeinen sind noch etwa 30 bis 40% der maximalen Aktivität bei pH 10,5 vorhanden.

Einfluß einer längeren Wärmebehandlung auf die
Stabilität der Aktivität der alpha-Amylase

Jede alpha-Amylase-Lösung wird für die Zeit 0,

1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden usw. bei 70° C gehalten. Die alpha-Amylase-Proben werden dann gekühlt und bei 25° C der Bestimmung unterworfen. Die Ergebnisse dieser Tests sind für jeden Stamm sehr ähnlich und in Fig. 2 dargestellt. Nach 1 Stunde bei 70° C ist kein Verlust an Aktivität eingetreten. Nach

2 Stunden ist die Aktivität der alpha-Amylase um etwa 20% geringer, und nach 3stündiger Inkubation ist die Enzymaktivität um etwa 30% gesunken.

Einfluß der Temperatur auf die Aktivität

Die von jedem der fünf neuen Stämme gebildete alpha-Amylase wird der vorstehend beschriebenen Bestimmung bei verschiedenen Temperaturen unterworfen. Die alpha-Amylase-Lösungen und Stärkesubstratlösungen werden vor Beginn der Reaktion S Minuten auf die Bestünmungstemperatur vorgewärmt Die Ergebnisse dieser Tests sind für die 5 Stämme fest identisch. Die Untersuchung dieser Temperaturkurven zeigt, daß ein fast linearer Anstieg der Aktivität der alpha-Amylase von 25 auf 45° C vorhanden ist Im allgemeinen ist der Anstieg der Aktivität der Amylase von 45 bis 70⁰C nur gering, und bei 8O⁰C ist die Aktivität der alpha-Amylase im allgemeinen um 10 bis 30% geringer geworden (Fig. 3).

Vcrgleichsbeispiel 2

Ls werden weitere Versuche durchgerührt, bei denen die Aktivität der durch die fünf neuen Stämme gebildeten alpha-Amylase mit einem bekannten handelsüblichen (Novo) alpha-Amylase-Enzym-Präparat verglichen wird.

Tabelle

Vergleich von Novo-alpha-Amylase und alpha-Amylase, die durch Bacillus cereus A. T. C. C. 21 768 gebildet wurde

	Novo-	Roh	Gereinigt
	Amylase	21 768	21 7Λ5
Spezifische Aktivität,	20	14	100
DNS-Einheiten/mg
Enzym
Optimaler pH-Wert	5,5	4,5	5,5
Optimale Aktivität
bei pH 2,5	0%	70%	42%
bei pH 8,5	51%	72%	49%
bei pH 9,5	5%	40%	36%
bei pH 10,5	2,5%	9%	5%
Einfluß der Temperatur
auf die Aktivität
1. optimale Tempe	45	60	60
ratur. C
2. Anstieg der Aktivität	43%	160%	116%
beim Optimum über
die Aktivität bei
25 C
3. optimale Aktivität	60%	78%	58%
bei 80 C
Einfluß der Temperatur
auf die Stabilität
Aktivitätsverlust

7%

0%

80%

94%

0%

78%

0% 95%

2,6%

1. nach 15 Minuten
bei 70'C

2. nach 30 Minuten
bei 70^c C

3. nach einer Stunde
bei 70" C

4. nach 2 Stunden
bei 7CC

Einfluß von hoher
Temperatur und hohem
pH-Wert auf die
Stabilität der Amylase

1. Verlust nach 15 Min.
bei pH 8,5

2. Verlust nach 30 Mk
bei pH 8,5

3. Verlust nach 15 Min. bei pH 9,5

4. Verlust nach 30 Min.
bei pH 9,5

5. Verlust nach 15 Min. bei pH 10,5

6. Verlust nach 30 Min. bei pH 10,5

*) Da das Enzym bei hoher Temperatur {70° C) sehr instabil ¹WaT, wurde der kombinierte Effekt von hoher Temperatur und hohem pH-Wert nicht untersucht

**) Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Amylase nicht untersucht.

0%

16%

27%

33%

60%

.Λ ■»*■>

Tabelle 2 Tabelle 3

Vergleich von Novo-alpha-Amylase und alpha-Amylase, die durch Bacillus uereusA.T.C.C.21 769 gebildet wurde

Vergleich von Novo-alpha-Amylase und alpha-Am) läse, die durch Bacillus cereus A. T. C. C. 21 77 gebildet wurde

	Novo-	Roh	Gereinigt	_ IO	Spezifische Aktivität,	Novo-	Roh	Gereinigt
	Amylase	21 769	21769		DNS-Einheiten/mg	Amylase	21 770	21770
Spezifische Aktivität,	20	5	50		Enzym	20	10	72
DNS-Einheiten/mg					Optimaler pH-Wert
Enzym				15	Optimale Aktivität
Optimaler pH-Wert	5,5	5,0	5,5		bei pH 2,5	5.5	4,5	4,5
Optimale Aktivität					bei pH 8,5
bei pH 2,5	0%	45%	33%		bei pH 9,5	0%	40%	26%
bei pH 8,5	51%	60%	55%	20	bei pH 10,5	51%	45%	30%
bei pH 9,5	5%	33%	24%		Einfluß der Temperatur	5%	35%	20%
bei pH 10.5	2,5%	8%	0%		auf die Aktivität	2,5%	10%	5%
Einfluß der Temperatur					1. optimale Tempe
auf die Aktivität					ratur. C
1. optimale Tempe	45	60	60		2. Anstieg der Aktivität	45	50	50
ratur. C					beim Optimum über
2. Anstieg der Aktivität	43%	150%	135%		die Aktivität bei	43%	85%	90%
beim Optimum über					25 C
die Aktivität bei				3°	3. Optimale Aktivität
25 C					bei 80 C
3. optimale Aktivität	60%	70%	52%		Einfluß der Temperatur	60%	70%	72%
bei 80 C					auf die Stabilität
Einfluß der Temperatur					Aktivitätsverlust
auf die Stabilität				35	1. nach 15 Minuten
Aktivitätsverlust					bei 70 C
1. nach 15 Minuten	7%	10%	8%		2. nach 30 Minuten	7%	0%	0%
bei 70 C					bei 70 C
2. nach 30 Minuten	80%	22%	40%	4°	3. nach einer Stunde	80%	0%	75%
bei 70 C					bei 70 C
3. nach einer Stunde	94%	36%	70%		4. nach 2 Stunden	94%	5%	95%
bei 70 C					bei 70 C
4. nach 2 Stunden		70%	95%		Einfluß von hoher		10%
bei 70 C				45	Temperatur und hohem
Einfluß von hoher	*)		**)		pH-Wert auf die	*)		**)
Temperatur und hohem					Stabilität der Amylase
pH-Wert auf die					1. Verlust nach 15 Min.
Stabilität der Amylase				so	bei pH 8.5
1. Verlust nach 15 Min.		0%		j^w	2. Verlust nach 30 Min.		0%
bei pH 8.5					bei pH 8,5
2. Verlust nach 30 Min.		5%			3. Verlust nach 15 Min.		0%
bei pH 8.5					bei pH 9,5
3. Verlust nach 15 Min.		?.0%		55	4. Verlust nach 30 Min.		10%
bei pH 9,5					bei pH 9,5
4. Verlust nach 30 Min.		42%			5. Verlust nach 15 Min.		15%
bei pH 9.5					bei pH 10.5
5. Verlust nach 15 Min.		40%		6o	6. Verlust nach 30 Min.		32%
bei pH 10.5					bei pH 10.5
6. Verlust nach 30 Min.		60%				48%
bei pH 10,5

*l Da das Hn/ym bei hoher Temperatur (70 C) sehr instabil war. wurde der kombinierte liffekt von hoher Temperatur und hohem pH-Wert nicht untersucht.
**) Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Amylasc nicht unter*l Da das Hn/.ym bei hoher Temperatur (70¹C) sehr instabil w; wurde der kombinierte Effekt von hoher Temperatur ui hohem pH-Wert nicht untersucht.

'*) Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Amyliisc nicht unli sucht.

Tabelle 4 Tabelle 5

Vergleich von Novo-alpha-Amylase und alpha-Amylase, die durch Bacillus cereus A.T.C.C. 21 771 gebildet wurde

Vergleich von Novo-alpha-Amylase und alpha-Amy läse, die durch Bacillus cereus A.T.C.C. 21 IT. gebildet wurde

	Novo-	Roh	Gereinigt	IO	Spezifische Aktivität,	Novo-	Roh	Gereinigt
	Amylasc	21 7-T	21 771		DNS-Einheiten/mg	Amylase	21772	21772
Spezifische Aktivität,	20	20	85		Enzym	20	12	120
DNS-Einheiten/mg					Optimaler pH-Wert
Enzym				15	Optimale Aktivität
Optimaler pH-Wert	5,5	5,5	5,5		bei pH 2,5	5,5	4,5	4,5
Optimale Aktivität					bei pH 8,5
bei pH 2,5	0%	52%	42%		bei pH 9,5	0%	75%	70%
bei pH 8,5	51%	48%	33%	20	bei pH 10,5	51%	60%	48%
bei pH 9,5	5%	30%	20%		Einfluß der Temperatur	5%	42%	30%
bei pH 10.5	2,5%	15%	3%		auf die Aktivität	2,5%	12%	0%
Einfluß der Temperatur					1. optimale Tempe ratur, C 2. Anstieg der Aktivität beim Optimum über die Aktivität bei 25 C
auf die Aktivität				25 30	3. optimale Aktivität bei 80 C
1. optimale Tempe ratur, C 2. Anstieg der Aktivität beim Optimum über die Aktivität bei 25 C	45 43%	55 90%	60 90%		Einfluß der Temperatur auf die Stabilität	45 43%	60 120%	60 100%
3. optimale Aktivität bei 80 C	60%	70%	68%		Aktivitätsverlust	60%	69%	62%
Einfluß der Temperatur auf die Stabilität				35	1. nach 15 Minuten bei 70 C
Aktivitätsverlust					2. nach 30 Minuten bei 70 C
1. nach 15 Minuten bei 70 C	7%	0%	5%	40	3. nach einer Stunde bei 70 C	7%	5%	8%
2. nach 30 Minuten bei 70 C	80%	10%	82%		4. nach 2 Stunden bei 70 C	80%	8%	16%
3. nach einer Stunde bei 70 C	94%	25%	98%		Einfluß von hoher Temperatur und hohem pH-Wert auf die Stabilität der Amylase 1. Verlust nach 15 Min. bei pH 8.5	94%	22%	40%
4. nach 2 Stunden bei 70 C		39%		45 50	2. Verlust nach 30 Min.		30%	88%
Einfluß von hoher Temperatur und hohem pH-Wert auf die Stabilität der Amylase 1. Verlust nach 15 Min. bei pH 8,5	*)	5%	**)		bei pH 8.5	*)	10%	**)
2. Verlust nach 30 Min.		20%			3. Verlust nach 15 Min.		25%
bei pH 8,5					bei pH 9.5
3. Verlust nach 15 Min.		25%		55	4. Verlust nach 30 Min.		22%
bei pH 9,5					bei pH 9,5
4. Verlust nach 30 Min.		48%			5. Verlust nach 15 Min.		36%
bei pH 9,5				60	bei pH !0.5
5. Verlust nach 15 Min.		35%			6. Verlust nach 30 Min.		28%
bei pH 10,5					bei pH 10,5
6. Verlust nach 30 Min.		60%				62%
bei pH 10.5

*) Oa das Enzym bei hoher Temperatur (7()^r C) sehr instabil war. wurde der kombinierte Effekt von hoher Temperatur und hohem pH-Wert nicht untersucht.

**) Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Amylasc nicht untersucht.

*l Da das Enzym bei hoher Temperatur (70°Cl sehr instabil wai wurde der kombinierte Effekt von hoher Temperatur um hohem pH-Wert nicht untersucht.

*) Aus dem gleichen Grunde wie TOr Novo-Amylasc nicht unter sucht.

Beispiel I

Etwa 500 ml Nährmedium auf Basis von Hühnermist mit folgender Zusammensetzung wurden hergestellt: _s

Hühnerexkrement, Teilchengröße

177 _μ T 5%

(NH₄J₇HPO₄ 0,5%

CaCCf₃ 2,0%

K₂HPO₄ 0,1% ,ο

CaCl₂ Γ/ο

MgCl₂ 0,01%

Das Medium wurde sterilisiert, mit Bacillus cereus ATCC 21 770 geimpft und 60 Stunden unter Schütteln bei 37 C bebrütet. Das hierbei erhaltene Kultur- '⁵ medium (10 Vol.-%) wurde in ein Hauptkulturmedium überführt, das die obengenannte Zusammensetzung hatte und unter Schütteln bei 37° C bebrütet wurde. Eine 50%ige Harnstofflösung wurde während der Fermentation nach Bedarf zugesetzt, um den pH-Wert zwischen 6 und 8 zu halten. Hühnerexkrement wurde zur Ergänzung des Verbrauchs zweimal in einer Menge von 2% zugesetzt. Nach einer Fermentationszeit von 60 Stunden betrug die Konzentration der alpha-Amylase im Kulturmedium 45 DNS-Einheiten. Der gleiche Versuch wird unter Verwendung von Maisquellflüssigkeit anstelle von Hühnerexkrement wiederholt, wobei nur 26 31 DNS-Einheiten gebildet werden.

30 Beispiel 2

Etwa 500 ml Nährmedium auf Basis von Hühnermist mit der folgenden Zusammensetzung wurden in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben sterilisiert:

Hühnerexkrement. Teilchengröße

177 u ~ 3%

Harnstoff 0,1%

K₂HPO₄ 0,5%

CaCl₂ 0,5%

MgCl₂ 0,05%

FeCl₂ 0,05%

35

Bacillus cereus ATCC 21 768 wurde in das Medium geimpft und 18 Stunden bei 30 C unter Schütteln bebrütet. Während der Fermentation wurde der pH-Wert mit einer 50%igen Harnstofflösung bei 6 bis 9 gehalten. Nach Beendigung der Kultivierungszeit betrug die Menge der im Kulturmedium angehäuften alpha-Amylase 1000 Einheiten/ml oder etwa 3,5 beim Dinitrosalicylsäuretest. Gleiche Versuche unter Verwendung von Maisquellflüssigkeit anstelle von Hühnerexkrement ergaben 1,0 DNS-Einheiten.

Beispiel 3

Ein Kulturmedium wurde hergestellt, indem Bacillus cereus ATCC 21 772 in einem Nährmedium auf Basis von Putenexkrement 18Stunden bei 30'C gezüchtet wurde. Das Kulturmedium wurde in ein Hauptkulturmedium der folgenden Zusammensetzung geimpft:

Endmelasse 1,0%

(NH₄J₂SO₄ 1,0%

KH₂PO₄ 0,2%

MgSO₄ · 7H₂O 0,05%

Fe⁺⁺ 2 ppm

6o

Das Medium wurde bei 30'C gehalten. Nach 10,24 und 48 Stunden wurden 2% Putenexkrement zugesetzt. Nach einer Kultivierungszeit von 72 Stunden betrug die im Kulturmedium angehäufte Menge der alpha-Amylase 80 DNS-Einheiten. Bei einer Wiederholung des gleichen Versuchs unter Verwendung von Maisq'iiellflüssigkei! anstelle des Putenexkrements wurden 1,3 DNS-Einheiten erhalten.

Beispiel 4

500 ml Impfkulturmedium von Bacillus cereus ATCC 21 771 in einem Medium, das 0,5% (NH₄J₇HPO₄, 0,2% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O und O7O5% Hefeextrakt enthält, werden 20 Stunden bei 30" C geschüttelt und dann in 200 ml eines Hauptkulturmediums in einem 1000-ml-Kolben geimpft. Das Gemisch wird bei 30°C unter Schütteln bebrütet. Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:

(NH₄J₂SO₄ 0,5%

(NH₄J₂HPO₄ 0,5%

KH₂PO₄ 0,2%

K₂HPO₄ 0.7%

MgSO₄ · 7H₁O 0,05%

MnCl₂ 0 2%

FcCI₂ 0 2%

Hefeextrakt 0,02%

pH 7,4

Nach einer Fermentationszeit von 24 Stunden werden 3% Hühnerexkrement zugesetzt. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden beträgt der Gehalt an alpha-Amylase im Kulturmedium 1 DNS-Einheit/ Ml. Ein gleicher Versuch unter Verwendung von Maisquellflüssigkeit anstelle von Hühnerexkrement ergab die Bildung von 0 DNS-Einheiten alpha-Amylase. Mit Sojabohnenöl und Weizenkaff anstelle des Hühnerexkrements werden ähnliche Ergebnisse erhalten.

Vergleichsbeispiel 3

Mn"

2 ppm

CaCO₃ 1.5%

Bacillus cereus 21 769 wurde auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise in einem Medium, das 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt und 1 % Sojabohnenöl enthielt und einen pH-Wert von 6 hatte, gezüchtet und im gleichen Nährmedium weiter gezüchtet. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden betrug der alpha-Amylasegehalt im Kulturmedium 2 DNS-Einheiten/ml.

Beispiel 5

Ein Nährmedium auf Stärkebasis wurde hergestellt und mit Bacillus cereus 21 770 beimpft und 20 Stunden unter Schütteln bei 37°C bebrütet. 300 ml des hierbei erhaltenen Kulturmediums wurden in 51 eines Hauptkultunnediums der folgenden Zusammensetzung geimpft :

Kartoffelstärke 0.2%

(NH₄J₂SO₄ 0,5%

(NH₄J₂HPO₄ 0,5%

K₂HPO₄ 0,1%

KH₂PO₄ 0,2%

MgSO₄ · 7H₂O 0,05%

Hefeextrakt 0.02%

pH 6.5

Das Medium wurde in einen 10-1-Fermenter gegeben, in dem dk Fermentation bei 30" C unter Zuführung von Luft in einer Menge von 10 l/Minute und unter Rühren bei 300 UpM durchgeführt wurde. Nach einer Fermentationszeit von 20 Stunden wurde das Hühnerexkrement dem Medium aseptisch zugesetzt. Getrennt wurden 0,5% (NRJ₂HPO₄ zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit 15%iger wäßriger Ammoniaklösung aufrechterhalten. Nach 42 Stunden wurden 2 g/ml = 21 Einheiten alpha-Amylase im Kulturmedium erhalten.

Beispiel 6

Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wurde mit Bacillus cereus 21771 wiederholt. Nach 8 Stunden wurden 0,03% Glucose zugesetzt. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden erreichte die Konzentration der alpha-Amylase im Kulturmedium 81 DNS-Einheiten.

Beispiel 7

Bacillus cereus ATCC Nr. 21 770 wurde in einem Medium, das 1% Bouillon, 0,5% NaCl und 0,1% Hefeextrakt enthielt, 18 Stunden bei 30"C und weiter in einem Hauptkulturmedium auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise 72 Stunden bei 30 C gezüchtet. Nach 12 Stunden wurden 0,01% Kaliumeitrat zugesetzt. Nach 12, 20, 30 und 40 Stunden wurde 1,0% Hühnerexkrement zugesetzt. Nach 72 Stunden erreichte die Konzentration der alpha-Amylase im Kulturmedium 36 DNS-Einheiten.

Beispiel 8

Bacillus cereus ATCC 21 768 wurde in ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung geimpft:

NaNO₃ (als Stickstoffquelle) 0,6%

Hühnerexkrement, Teilchengröße

125 u 5.0%

CaCO₃ 2%

Acetatpuffer, pH 6,8

CaCt, 0,1%

Das nach 24 Stunden bei 37" C erhaltene Kulturmedium wurde mit einem Hauptkulturmedium der folgenden Zusammensetzung gemischt:

Hühnerexkrement. Teilchengröße

12.5 μ 2.0%

20

Vergleichsbeispiel 4

Aspergillus niger ATCC Nr. 15 475 wurde in ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung geimpft :

KH₂PO₄ 0,1%

MgSO₄ · 7H,O 0,05%

(NHJ₂SO₄ 0,1%

Harnstoff 0,25%

MnCl₂ 0,2 ppm

FeCl₂ 0,2 ppm

Hühnerexkrement, Teilchengröße

125 μ 2,0%

Das nach 20Stunden bei 3O⁰C erhaltene Kulturmedium wurde mit einem Hauptkultumedium der folgenden Zusammensetzung gemischt:

Hühnerexkrement, Teilchengröße

125 μ 2,0%

Propylenglykol 1,5%

Harnstoff 0,25%

KH₂PO₄ 0,2%

MgSO₄ · 7H₂O 0,05%

Maisquellflüssigkeit 0,3%

Nach einer Kullivierungszeit von 18 Stunden bei 28°C unter Schütteln wurde das Kulturmedium mit einer Harnstofflösung auf pH 7 bis 8 eingestellt. Nach 12, 18, 24, 36 und 48 Stunden wurden 2% Äthanol zugesetzt. Nach 62 Stunden erreichte die Menge der alnha-Amvlase im Kulturmedium 1,3 DNS-Einheiten.

Essigsäure 1,0%

(NH₄KSO₄ : 0,5%

Harnstoff 0,5%

KH₁PO₄ 0,2%

K₁HPO₄ 0,2%

MgSO₄ · 7H₂O 0,05%

Hydrolysiertes Pflanzenprotein der

Ajinomoto Company, Japan 1.5%

Nach 72 Stunden betrug die Konzentration der alpha-Amylase 29 Einheiten.

In Tabelle 6 sind die fünf neuen Stämme zusammen mit vielen bereits bekannten Mikroorganismen sowie ihre Fähigkeit, auf Nährmedien auf Basis von Geflügelexkrement zu wachsen, genannt. Dieses Wachstum wurde wie folgt bestätigt: Plattenkulturen der Mikroorganismen wurden 5Tage bei 30^cC bebrüt?', und ein Teil des flüssigen Inhalts wurde nach einer Diffusionsmethode auf Filterpapier übertragen. Der alpha-Amylasegehalt jedes Kulturmediums wurde nach der Dinitrosalicylsäuremethode sowie nach anderen Methoden der Enzymologie berechnet. Ergebnisse der chromatographischen Analyse wurden verwendet, um zu ermitteln, welche Zucker gebildet wurden. Das Wachstum der Miki oorganismen wird durch Plattenzählungen und Verwertung von Zucker, DNA und RNA bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 auf einer willkürlichen, jedoch reproduzierbaren Skala angegeben. Die verwendeten Zeichen haben die folgende Bedeutung:

-f = ausgezeichnet,

+ = gut,

+ = ziemlich gut,

+ = signifikant,

-- = Spur.

Die bei den Versuchen zu Tabelle 6 verwendeten Nährmedien hatten die folgende Zusammensetzung:

Nährmedium	Teilchen	Konzen
	größe	tration im
		Nährmedium
		Gewichts
		prozent
A. Hühnerexkrement	42 μ	1,0
B. Hühnerexkrement	125 μ	2,0
C. Putenexkrement	125 μ	2,0
D. Hühnerexkrement	177 μ	2,0
E. Hühnerexkrement	177 a	5,0

21

Fortsetzung	Teilchen größe	Konzen tration im Nährmedium,	5	Nährmedium	Teilchen	Konzen
		Gewichts			größe	tration im Nährmedium, Gewichts
Nährmedium		prozent				prozent

	177 μ	10,0		J. Hühnerexkrement	125 μ	5,0
	177 μ	2,0%	IO	Cellobiose		0,1
F. Hühnerexkrement		0,1		MgSO₄-7H₂O		10 g/l
G. Hühnerexkrement		2,0		KCl		5 g/l
CaCl₂		0,1		CaCI₂-5H₂O		0,2 g/l
CaCO₃		0,1	15	Hefeextrakt		1,0 g
MgCl₂		6		Maisquellflüssigkeit		7,0
FeCl₂				destilliertes Wasser		1000 ml
pH	177 μ	5,0		K. Putenexkrement	42 μ	5,0
		2,0 0,1 0,1 0,1	20	Cellobiose		0,1
H. Hühnerexkrement		O		MgSO₄-7H₂O KCl CaCI₂-5H₂O Hefeextrakt		10 g/l 5 g/l 0,? g/l 1,0 g
CaCO₃ CaCl₂ MgCl₂ FeCl₂	177 μ	3,0		destilliertes Wasser		1000 ml
pH		3,0		L. Putenexkrement	42 μ	5,0
1. Hühnerexkrement		10 g/l		Cellobiose		0,1
Cellobiose		5 g/l		MgSO₄-7H₂O		10 g/l
MgSO₄-7H₂O		0,2 g/l	3°	KCl		5 g/l
KCl		1,0 g		CaCl₂-5H₂O		0,2 g/l
CaCl₂-5H₂O		1000 ml		Hefeextrakt		1,0 g
Hefeextrakt				destilliertes Wasser		1000 ml
destilliertes Wasser	C	D E
Nährmedium			FG H I	J	K L
A B

Aspergillus awamori + ATCC 11 358
Aspergillus +

diastaticus

Aspergillus flavus + ATCC 11 495
Aspergillus foetidus — ATCC 14916
Aspergillus niger -

ATCC 15 475
Aspergillus oryzae ATCC 7561

Aspergillus oryzae + ATCC 9102

Aspergillus phoenicis — ATCC 15 556
Aspergillus ruber —

ATCC 9481

Aspergillus sailol — ATCC 11 362
Aspergfflus terreus — ATCC 11 877
AspergiBus nsamii — ATCC 1! 364

Bacillus amylolique- + fariensATCC23843 Badflus brevis +

ATCC JO 068 Bacütecerens +

ATCC 944

Bacülus cereos -

ATCC 7004

23

Fortsetzung

Nährmedium AB C

F G

J K

Bacillus cereus -- - + ++ -+ ++ + +

ATCC 12 480

Bacillus cereus -t- + + + + + + + + ++ + + + + - ++ + + + + ϊ+-

ATCC 21 768 Bacillus cereus ATCC 21 769 Bacillus cereus ATCC 21 770 Bacillus cereus ATCC 21 771

ATCC 21 772

Candida solami -- + + + - + ++ ++ ++- -

ATCC 14440

Candida parapsolosis — - - — - — - - - ___

CHlumonas biazotea — + — + + — + ++ ++ ++— —

ATCC 486

Cellumonas fimi — + - -- -— — - ___

ATCC 15 724

Coryiiebacteria ___ _ _ __ _ _ ___

liliumATCC 15 990

Corynebacteria --— — — -- — - ___

hydrocarboclastus

Pseudomonas aeru- ___ _ — _ _ _ _ ___

ginosa ATCC 7706

Pseudomonas _.__ — — - _ - — ___

amyloderamosa ATCC 21 262

Pseudomonas atro-' — — — — + — + ++- ___

faciens. ATCC 9004

Vergleichsbeispiel 6

Weitere Fermentationen werden unter Verwendung Weise verändert werden. Das Geflügelexkrement hat der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen und der eine Teilchengröße von 42 μ. Das verwendete Nährin Vergleichsbeispiel 5 beschriebenen Nährmedien 40 medium enthält als Kohlenstoffquelle 7.0% Maisunter den in Vergleichsbeispiel 5 genannten Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch die Anteile des

gg g j

Geflügelexkrements in der in Tabelle 7 angegebenen

Tabelle 7

quellflüssigkeit. Die durch die verschiedenen Mikro-Organismen gebildete Menge an alpha-Amylase ist ir DNS-Einheiten in Tabelle 7 genannt.

Verwendete Mikroorganismen	Hühnerexkrement	0,1%	2%	4%	6%	8%	10%	20%	Putenexkrement	5%	8%
	0,0%	-1	1,1	2,0	Zi	1,6	0	0	4%	3,1	Zl
Aspergillus diataticus	0	1,3	1,6	2,4	1,5	0	0	0	2,7	1,9	1,3
Aspergillus flavus ATCC 11 495	0	3,0	1,8	2,4	1,9	0	0	0	1,7	1,9	1,0
Aspergillus foetidus	0								1,7
ATCC 14916		0	0,5	U	1,1	0	0	0		1,8	1,1
Aspergillus niger ATCC 15475	0	0	0	0	1,0	0	0	θ	14	4,1	3,6
Aspergillus oryzae ATCC 7561	0	0	1,4	1,9	1,0	0	0	0	3,9	3,8	3,0
Aspergillus oryzae ATCC 9102	0	0	0	0	0	0	0	0	3,0	1,3	U
Aspergillus phoenicis	0								1,1
ATCC 15 556		0	0	0	0	0	0	0		3,1	3,0
Aspergillus usanrii ATCC ί 1 364	0	1,4	1,8	Zl	1,5	1,0	0	0	Z9	1,9	1,4
Bacillus amyloliquefaciens	0,5								1,5
ATCC 23 843		1,1	1,4	ZO	1,0	0	0	0		1,0	1,0
Bacillus brews ATCC 10068	0,5	0	0	0	0	0	0	0	1,0	1,6	1,1
Bacfflus cereus ATCC 12480	0,5	3	7	28	36	12	0	0	1,1	36	29
BaciDus cereus ATCC 21 768	0,5	7	14	32	38	24	17	0	29	36	21
Bacillus cereus ATCC 21 769	0,1								30		709 BIO/2

Fortsetzung

Verwendete Mikroorganismen

Bacillus cereus ATCC 21 770
Bacillus cereus ATCC 21 771
Bacillus cereus ATCC 21 772
Candida solami ATCC 14440
Candida parapsolosis ATCC
Candida guilliermondii
ATCC 9390
Cellumonas biazotea
ATCC 486

Cellumonas fimi ATCC 15 724
Corynebacteria hydrocarboclastus ATCC 19 556
Pseudomonas amyloderamosa
ATCC 21 262
Pseudomonas Atrofaciens
ATCC 9004

	0.1%	2%	1 334	6%	IN	J	10%	26	Putenexkrement	5%	8%
	9	15		30			0	O	4°/..	39	25
	9	11		46			21		33	37	29
	11	18		48		0	20%	30	0	0
	0	0	4%	0	8%	0	0	0	0	0
	0	0	32	0	0	0	0	0	0	0
23 2	0	0	40	0	0	0	0	0	0	0
	0	1,1	43	0	0	0	0	0	0	0
	0	1,3	1,0	0	0	0	0	0	0	0
Hühnerexkremenl	0	0	1,1	0	0	0	0	0	0	0
0.0%	0	0	1,1	0	0	0	0	0	0	0
0	0	0	1,0	0	0	0	0	0	0	0
0	2,0	0		0	0
0,1	1,1	0	0
0	1,1	0	0
0	1,1	0
0
0
0
0
0
0

Ähnliche Versuche werden unter Verwendung der in Vergleichsbeispiel 5 genannten Nährmedien A, C, G und K durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten werden.

Vergleichsbeispiel 7

Fermentationen werden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen und des in

Tabelle 8

Vergleichsbeispiel 5 genannten Nährmediums J und den in Vergleichsbeispiel 5 angegebenen Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch das Geflügelexkrement, das eine Teilchengröße von 125 μ hatte, dem Nährmedium in den nachstehend in Tabelle 8 angegebenen Mengen zugesetzt wird. Dieser Vergleich zeigt deutlich die vorteilhaften Ergebnisse, die durch Verwendung größerer Anteile Geflügelexkrement beim erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.

Verwendete Mikroorganismen

Hergestellte alpha-Amylase

Hühnerexkrement

0,0% 0,1% 2% 4% 6%

8%

10% 20%

Putenexkrement 4% 5% 8%

Aspergillus diastaticus O O 1,7

Aspergillus flavus ATCC 11 495 O O 1,5

Aspergillus foetidus 0 0 1,0

ATCC 14916

Aspergillus niger ATCC 15475 0 0 1,3

Aspergillus oryzae ATCC 7561 0 0 1,0

Aspergillus oryzae ATCC 9102 0 0 1,1

Aspergillus phoenicis 0 0 0

ATCC 15 556

Aspergillus rüber ATCC 9481

Aspergillus saitol ATCC I1 362 Aspergilhis usamii ATCC 11 364 Bacillus amyloliquefaciens

ATCC 23 843

Bacillus brevis ATCC10 068 0,1 0,1 13 Bacillus cereus ATCC 21768 0,2 23 9 Bacillus cereus ATCC 21769 0,2 2,3 2,8 Bacillus cereus ATCC 21770 03 2,5 2,7 Bacfllus cereus ATCC 21771 0,2 23 2,7 Bacfflus cereus ATCC 21772 0,2 2,7 2,8 Ceilumonas biazotea ATCC 486 6,0 0,5 3 Ceflumonas fimi ATCC 15724 0,900 1,1 4

0 0 0

0 0 0

0,5 O^ 1,1

2,1 2,0 0

1,1
0

0

1,1 7

1.0 0

1.1 0

0 0 0 13

0 0 0 0

1,5 1,5 0

69 78

71 76

63 61

71 60

71 63

0 0

0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

1,7 1,5 0

1,1 0 0 0

1,7 1,0

U 78 78 83 71 71

1,9 1,0 0

1,3

0

2,1 0 1,9 1,4

1,4 1,4 80 80

86

75

91 0 0 0 0

27	Fortsetzung	Ab	23	21 334	2%	4% 6%	8%	10%	28	Putenexkrement	5%	8%
Verwendete Mikroorganismen				6	5 0	0	0		4%	0	0
	Hergestellte alpha-Amylase	1	1 0	0	0		0	0	0
	Hühnerexkrement	5	1 0	0	0		0	0	0
Cellumonas vibrioides ATCC 11 764	0,0% 0,1%	0	0 0	0	0	20%	0	2	9
Cellumonas Cartalyticum ATCC 21 681	0 1,0				0	1,5
Cellumonas Flavigena ATCC 482	0 0,5			0
Pseudomonas aerginosa ATCC 7706	0 0,5			0
0 0			0

Ähnliche Versuche werden unter Verwendung der Nährmedien A, C, D, G, K und L des Vergleichsbeispiels 5 durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten werden.

Vergleichsbeispiel 8

Fermentationen werden unter den in Vergleichs- Die Ergebnisse zeigen, daß bei den größeren Frak

beispiel 7 genannten Bedingungen im Nährmedium J tionen die Bildung von alpha-Amylase beim erfin

durchgeführt, wobei jedoch Geflügelexkrement einer dungsgemäßen Verfahren verstärkt ist.

Teilchengröße von 177 μ und größer verwendet wird. 25

Tabelle 9	Hergestellte alpha-Amylase	0,1%	2%	4%	6%	8%	10%	20%	Putenexkrement	5%	8%
Verwendete Mikroorganismen	Hühnerexk rement	0	2,9	1,0	2,3	0	0	0	4%	24	0
	0,0%	0	2,4	11	19	0	0	0	17	20	0
	0	0	2,0	11	19	0	0	0	0	0	0
Aspergillus diastaticus ATCC	0								0
Aspergillus flavus ATCC 11 495	0	0	2,3	10	18	10	0	0		19	0
Aspergillus foetidus		0	2,3	10	17	0	0	0	12	0	0
ATCC 14916	0	0	2,7	10	19	0	0	0	0	0	0
Aspergillus niger ATCC 15 475	0								0
Aspergillus oryzae ATCC 7561	0	0	0	0	17	0	0	0		0	0
Aspergillus phoenicis		0	0	0	0	0	0	0	0	28	20
ATCC 15 556	0	1,3	8	9	10	0	0	0	21	11	3
Aspergillus mber ATCC 9481	0								10
Aspergillus saitol ATCC 11 362	0	1,1	6	7	6	0	0	0		5	5
Bacillus amyloliquefaciens		4,7	35	45	88	100	0	0	5	91	90
ATCC 23 843	0	4,3	30	40	81	89	0	0	87	90	88
Bacillus brevis ATCC 10068	0	4,7	31	41	82	90	0	0	86	93	90
Bacillus cereus ATCC 21 768	0	4,6	29	40	81	90	0	0	88	90	0
Bacillus cereus ATCC 21 769	0	4,3	31	42	83	93	0	0	80	91	0
Bacillus cereus ATCC 21 770	0	1,1	6	18	0	0	0	0	80	0	0
Bacillus cereus ATCC 21 771	0	2,0	12	26	0	0	0	0	O	0	0
Bacillus cereus ATCC 21 772	0	2,0	14	34	0	0	0	0	0	O	0
Cellumonas biazotea ATCC 486	0								0
Cellumonas fern ATCC Ϊ 5 724	0	1,0	6	20	0	0	0	0		0	0
Cellumonas vibriokies									0
ATCC H 764	0	1,3	8	23	0	0	0	O		Q	0
Cellumonas cartalyticum									0
ATCC 21 681	6	0	0	0	0	0	0	Θ		6	2,0
Cellumonas flavigena									3,0
ATCC 482	0
Pseudomonas acrgmosa
ATCC 7706

Ähnliche Ergebnisse werden unter Verwendung der in Vergleichsbeispiel 5 genannten Nährmedien A₁C₁G und R erhalten.

Vergleichsbeispiel 9

Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen unter den gleichen Bedingungen wie in Vergleichsbeispiel 5 im Nährmedium J durchgeführt, wobei jedoch als Kohlenstoffquelle 7% Weizenkleie anstelle von 7% Maisquellflüssigkeit verwendet wurden. Tabelle 10

Verwendete Mikroorganismen	Hergestellte alpha-Amylase	0,1%	2%	4%	6%	8%	10%	20%	Pulenexkrement	5%	8%
	Hühnerexkrement	;	2,0	13,0	35	16	0	0	4%	29	0
	0,0%	1	3,5	14	36	32	0	0	21	23	0
Aspergillus diastaticus	0	1	3,0	15	35	20	0	0	18	0	0
Aspergillus flavus ATCC 11 495	0								3
Aspergillus foetidus	0	]	3,3	14	35	18	0	0		23	0
ATCC 14916		1	3,7	15	36	15	0	0	19	0	0
Aspergillus niger ATCC 15 475	0	1,3	3,6	14	35	16	0	0	0	0	0
Aspergillus oryzae ATCC 9102	0	1,1							0
Aspergillus phoenicis	0	1,0	U	14	35	12	0	0		0	0
ATCC 15 556			3,3	6	35	Ü	0	0	0	34	0
Aspergillus saitol ATCC 11 362	0	1,6							27
Aspergillus terreus	0	1,5	0	0	0	0	0	0		0	24
ATCC 11 877		UO	1,4	3	8	0	0	0	0	20	5
Aspergillus awamori ATCC	0		10	12	8	' 0	0	0	15	19	8
Aspergillus usamii ATCC 11 364	0	1,0							15
Bacillus amyloliquefaciens	0,1	1,0	9	12	8	0	0	0		7	5
ATCC 23 843			23	63	111	147	16	0	5	103	102
Bacillus brevis ATCC 10068	0,1	0	30	60	110	132	11	0	96	105	102
Bacillus cereus ATCC 21 768	0,6	1,0	30	58	108	138	0	0	96	Hl	101
Bacillus cereus ATCC 21 769	0,6	2,0	29	60	110	131	16	0	99	101	0
Bacillus cereus ATCC 21 770	0,5		31	63	108	131	0	0	91	100	0
BacilluG cereus ATCC 21 771	0	1,8	10	24	24	0	0	0	90	0	0
Bacillus cereus ATCC 21 772	0	Π	14	26	24	0	0	0	C	0	0
Cellumonas biazotea ATCC 486	0	11	10	23	19	0	0	0	0	0	0
Cellumonas fimi ATCC 15 724	0	19							0
Cellumonas vibrioides	0	11	11	23	25	20	0	0		0	0
ATCC 11 764		16							0
Cellumonas cartalyticum	0	2,0	11	24	24	0	0	0		0	0
ATCC 21 681		2,5							0
Cellumonas flavigena	0	1,6	0	0	0	0	0	0		11	20
ATCC 482									5
Pseudomonas aerginosa	0	1,5
ATCC 7706
1,3

0

Vergleichsbeispiel

Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen unter den in Vergleichsbeispiel 5 genannten Bedingungen durchgeführt. Das in Vergleichsbeispiel 5 genannte Nährmedium J wurde verwendet, jedoch enthielt dieses Nährmedium als KohlenstofTquelle 7% Sojabohnenöl anstelle von 7% Maisquellflüssigkeit. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 genannt. Tabelle 11

Verwendete Mikroorganismen

Aspergillus diastaticus Aspergillus flavus ATCC 11 Aspergillus niger ATCC 15 Bacillus cereus ATCC 21 768 Bacillus cereus ATCC 21 769 Bacillus cereus ATCC 21 770 Bacillus cereus ATCC 21 771 Bacillus cereus ATCC 21 772

Hergestellte alpha-Amylase	0,1%	2%	4%	6%	8%	10%	20%	Putenexkrement	5%	8%
Hühnerexkrement	0	0	0	0	0	0	0	4%	1,0	0
0,0%	0	0	0	0	0	0	0	.5	1,0	0
0	0	0	0	0	0	0	0	1,0	5	0
15 0	1,6	3,6	9	12	0	0	0	0	14	0
5 0	1,6	3,6	8	14	0	0	0	12	14	0
0	1,3	3,1	9	12	0	0	0	12	12	0
0	1,6	3,6	11	12	0	0	0	14	14	0
0	1,3	3,1	11	12	0	0	0	12	14	0
0							14
0

31

Vergleichsbeispiel 51

Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen unter den in Vergleichsbeispiel 5 angegebenen Bedingungen im Nährmedium L durchgeführt, das jedoch 10% Weizenkaff als Kohlenstoffquelle enthielt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 12 genannt.

Tabelle 12

Verwendete Mikroorganismen

Aspergillus diastaticus Aspergillus Oavus ATCC 11 Aspergillus foetidus ATCC 14916

Aspergillus niger ATCC 15 Aspergillus oryzae ATCC 7561 Aspergillus oryzae ATCC 9102 Aspergillus phoenicis ATCC 15 556

Aspergillus ruber ATCC 9481 Aspergillus saitol ATCC 11 Aspergillus usamii ATCC 11 Bacillus amyloliquifaciens ATCC 23 843

Bacillus brevis ATCC 10 068 Bacillus subtilis

Bacillus cereus ATCC 21 768 Bacillus cereus ATCC 21 769 Bacillus cereus ATCC 21 770 Bacillus cereus ATCC 21 771 Bacillus cereus ATCC 21 772 Cellumonas biazotea ATCC Cellumonas fimi ATCC 15 Cellumonas vibrioides ATCC 11 764

Cellumonas cartalyticum ATCC 21 681

Cellumonas flavigena ATCC 482

Beispiel 9

Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen unter den gleichen Bedingungen wie in Vergleichsbeispiel 11 im Nährmedium J durchgeführt, dem jedoch Weizenkaff und 200 μg Glycin zugesetzt wurden. Die von den fünf neuen Mikroorganismen gebildeten Mengen an

Hergestellte alpha-Amylase	0.1%	2%	4%	6%	8%	10%	20%	Putenexkrement	5%	8%
Huhnerexkrement	1,5	3,7	21	43	28	0	0	4%	34	8
0,0%	1,2	4,4	21	43	30	0	0	31	31	11
0	1,3	4,0	21	46	28	0	0	28	18	3
0	1,9	4,3	20	45	30	0	0	15	34	6
0	1,7	4,6	0	0	0	0	0	31	0	0
0	1.3	4,2	21	43	31	0	0	0	0	0
0	1,3	4,1	21	45	28	0	0	0	0	0
0	1,4	4,1	22	43	31	0	0	0	0	0
0	1,3	4,0	21	45	28	0	0	0	39	31
0	1.3	3,6	9	19	0	0	0	35	0	0
0	3,1	11	20	17	0	0	0	0	28	16
0	2,6	12	21	17	0	0	0	26	31	11
0	0	0	0	0	0	0	0	28	11	9
0	3,0	9,0	110	89	96	21	0	9	101	108
0		8,1	7,4	92	99	30	0	93	100	106
0		6,3	7.2	96	103	50	0	96	102	107
0		7,0	7,1	92	140	32	0	96	JOl	0
0		7,3	23	100	142	32	0	93	101	0
0	3,0	14	28	36	16	0	0	95	0	0
0	3,5	15	30	38	10	0	0	0	0	0
0	3,0	17	33	36	11	0	0	0	0	0
0	3,0	14	31	34	16	0	0	0	0	0
0	3,0	11	30	38	10	0	0	0	0	0
0							0
0

Beispiel 10

Der in Beispiel 9 beschriebene Versuch wurde unter Verwendung von Nährmedien wiederholt, die 5% bzw. 2% Hiihnerexkrement enthielten. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 14 genannt.

Tabelle 14

aipna-rtinyiasc suiu iia nannt.	luiisicnciiu in ι	ti UClIC 1 J gC	55 Bacillus cereus	ATCC 21 768	5%	3%
Tabelle 13				ATCC 21 769	Hühner-	Hühner-
Bacillus cereus	10%	5%		ATCC 21 770	+ 200 μg	+ 200 μg
	Weizenkaff	WeizenkafT		₆ ATCC 21 771	Glycin	Glycin
	+ Glycin	+ Glycin		⁵ ATCC 21 772
			- bo	Aspergillus niger
ATCC 21 768	330	130	ATCC 15 475	Ϊ35	119
ATCC 21 769	203	17	Hierzu 2 Blatt Zeichnungen	33,50	23,35
ATCC 21 770	85	89	94	94
ATCC 21 771	5	31	42	44
ATCC 21 772	30	39	29	47
Aspergillus niger	1,0	1,1	2,85	2,80
ATCC 15 475
			709 BIO/261

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von alpha-Amylase durch Vergärung von Nährmedien, die eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff und essentielle Nährstoffe enthalten, unter aeroben Bedingungen mit Hilfe eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß man Geflügelexkrement wenigstens als Teil des Nährmediums und als Mikroorganismus Bacillus cereus ATCC 21 768, Bacillus cereus ATCC 21769, Bacillus cereus ATCC 21770, Bacillus cereus ATCC 21 771 oder Bacillus cereus ATCC 21 772 verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Geflügalexkrement im Nährmedium in einer Menge von 0,Gl bis 10% verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Geflügelexkrement in getrockneter Form und in Form von Teilchen einer Größe von 42 u bis 2 mm, vorzugsweise 125 bis 297 μ, insbesondere 149 bis 177 μ, verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährrnedium verwendet, das Wasser, Geflügelexkrement, 0.01 bis 15% Stärke und 0,01 bis 15% Proteinmaterial enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung 1 bis 72 Stunden, vorzugsweise 25 bis: 35 Stunden, durchgeführt wird.