DE2321334B2 - Biotechnisches verfahren zur herstellung von alpha-amylase - Google Patents

Biotechnisches verfahren zur herstellung von alpha-amylase

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DE2321334B2
DE2321334B2 DE19732321334 DE2321334A DE2321334B2 DE 2321334 B2 DE2321334 B2 DE 2321334B2 DE 19732321334 DE19732321334 DE 19732321334 DE 2321334 A DE2321334 A DE 2321334A DE 2321334 B2 DE2321334 B2 DE 2321334B2
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The Gates Rubber Co., Denver, CoI. (V.St.A.)
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Description

Verfahren zur Herstellung von alpha-Amylase durch Fermentation mit Mikroorganismen sind bekannt. Bei diesen Verfahren werden im allgemeinen Nährmedien, die verschiedene Quellen von Stärke, Proteinen und essentiellen Nährstoffen enthalten, hergestellt, sterilisiert, gekühlt und mit Kulturen verschiedener Bakterien, Hefen oder Schimmelpilzen geimpft, die alpha-Amylase durch Verstoffwechseln des beim jeweiligen Verfahren verwendeten Nährmediums zu bilden vermögen. Bei den Entwicklungen auf diesem Gebiet handelt es sich beispielsweise um das Auffinden verbesserter Nährmedien und Züchtungsbedingungen für die jeweiligen Mikroorganismen, die alpha-Amylase bilden. Nach diesen Verfahren hergestellte alpha-Amylasen sind für ihre Fähigkeit, Stärke zu Zuckerprodukten wie Dextrin, Glucose, Maltose usw. zu hydrolysieren, bekannt und werden für zahlreiche kommerzielle, technische, pharmazeutische und wissenschaftliche Zwecke verwendet. Von diesen Anwendungen seien erwähnt: Herstellung von Nahrungsmitteln, Genußmitteln und Getränken, Herstellung von Klebstoffen, Bekämpfung der Verunreinigung der Umwelt, Herstellung von Verdauungsmitteln, Verwendung für die Behandlung von Krankheiten und als Hilfsstoffe in der Grundlagenforschung, z. B. bei der Forschung zur Aufklärung der Strukturen verschiedener komplexer Kohlenhydrate. Nährmedien, Mikroorganismen, Fermentationsverfahren und Anwendungen für alpha-Amylase werden in den US-Patentschriften 2695 863, 30 12 944 und 34 14479 beschrieben.
Die DT-OS 20 25 748 betrifft die Herstellung eines alpha-Amylase enthaltenden Enzymproduktes, das eine gute Aktivität und Stabilität bei hohen pH-Werten, niedrigen Konzentrationen an Ca+ +-lonen und hoher Temperatur besitzt, durch Züchtung von Bacillus licheniformis in einem geeigneten Nährmittel und Isolierung eines alpha-Amylse enthaltenden Enzymproduktes aus der Fermentationsbrühe.
Die DT-OS 20 44 984 beschreibt eine mikrobiologische Amylase mit optimalem pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 11,5 und ein Verfahren zu deren Herstellung mit einem Bakterium von Bacillus subtilis.
Die Erfindung offenbart erstmals den Einsatz von Geflügelexkrementen als alleinige C- und N-Quelle zur Herstellung von alpha-Amylase mittels fünf bestimmter Bacillus cereus-Stämme.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von alpha-Amylase durch Vergärung von Nährmedien, die eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff und essentielle Nährstoffe enthalten, unter aeroben Bedingungen mit Hilfe eines Mikroorganismus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Geflügelexkremenl wenigstens als Teil des Nährmediums und als Mikroorganismus Bacillus cereus ATCC 21 768, Bacillus cereus ATCC 21 769, Bacillus cereus ATCC 21 770, Bacillus cereus ATCC 21 771 oder Bacillus cereus ATCC 21 772 verwendet.
Eine vollständige Beschreibung der Morphologie
jedes dieser fünf Mikroorganismen wird später in dieser Beschreibung gegeben. Beschrieben wird ferner, wie alpha-Amylase nach diesem Verfahren unter Verwendung von Geflügelexkrement als einzige Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff erzeugt werden kann. Es wurde auch gefunden, daß bei dem oben definierten erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren Glycin die Produktion von alpha-Amylase durch die fünf neuen erfindungsgemäß verwendeten Stämme in einem Nährmedium, das gleichzeitig Weizenkaff enthält, steigert.
Bei den vorstehend genannten Fermentationsverfahren werden Kulturmedien erhalten, die sich zur Gewinnung der alpha-Amylase leicht nach üblichen Fällungs-, Filtrations- und Austauschverfahren verarbeiten lassen. Die Fällung wird gewöhnlich durch Zusatz eines Salzes eines zweiwertigen Kations erreicht, das die alpha-Amylase koaguliert. Nach der Ausfällung kann die nach den Verfahren gemäß der Erfindung hergestellte alpha-Amylase äußerst einfach durch Anwendung der lonenaustauschchromatogra-
so phie an Diäthylaminoäthylcellulose (DÄAÄ-Celluiose) unter Verwendung von KCl oder anderen EIutionslösungsmitteln isoliert werden.
Bei Verwendung von Geflügelexkrement als Ergänzung für übliche wäßrige Nährmedien wird vorzugsweise ein Nährmedium hergestellt, das 0,01 bis 15% Proteinmaterial und 0,01 bis 15% Stärke enthält. Als proteinhaltige Materialien eignen sich Maisquellflüssigkeit, Casein, Trockenhefe, Fischmehl, Baumwollsaatmehl, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl sowie Gemische dieser Materialien. Vorzugsweise werden etwa 0,8% proteinhaltiges Material in den Nährmedien verwendet, da diese Menge dazu beiträgt, gute Ausbeuten an alpha-Amylase zu gewährleisten.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen eignen sich beim erfindungsgemäßen Verfahren Glucose, Arabinose, Xylose, Lactose, Maltose, Saccharose und verschiedene organische Verbindungen, z. B. orga-
nische Ammoniumsalze, organische Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren, Maisquellflüssigkeit, Pepton, Casein, Fleischextrakte und Sojabohnenprodukte. Diese Materialien können natürlich nicht nur als Kohlenstoffquellen, sondern gleichzeitig auch als verwertbare Stickstoffquellen verwendet werden. Natürlich wird die Harnsäure in Hühner- oder Putenexkrement auch als Stickstoffquelle verwendet. Als weitere Stickstoffquellen eignen sich Tür die Zwecke der Erfindung alle organischen oder anorganischen stickstoffhaltigen Verbindungen, die Stickstoff in einer Form, die sich Tür die Verstoffwechselung durch die verwendeten Mikroorganismen eignen, freizugeben vermögen. Aus der organischen Gruppe können die folgenden Verbindungen als Beispiele geeigneter stickstoffhaltiger Verbindungen genannt werden: Proteine, säurehydrolysierte Proteine, durch Enzyme aufgeschlossene Proteine, Aminosäuren, Hefeextrakt, Asparagin, Harnstoff und Harnsäure. Natürlich können diese Materialien gleichzeitig als Kohlenstoffquellen verwendet werden. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit ist es gewöhnlich vorzuziehen, anorganische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniak und Ammoniumhydroxyd oder ihre Salze, z. B. Ammoniumeitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und saures Ammoniumphosphat, zu verwenden. Wie bereits erwähnt, kann Puten· und Hühnerexkrement als einzige Kohlenstoff· und Stickstoffquelle verwendet werden. Ein weiterer sehr zweckmäßiger und zufriedenstellender Weg zur Zufuhr von Stickstoff ist die Verwendung von Ammoniumphosphat oder saurem Ammoniumphosphat, die als Salz zugesetzt oder im wäßrigen Nährmedium in situ gebildet werden können, indem man NH3 durch das Nährmedium perlen läßt, dem vorher Phosphorsäure zugesetzt worden ist, wodurch saures Ammoniumphosphal gebildet wird.
Als Stärken können beim erfindungsgemäßen Verfahren in den Nährmedien lösliche Stärken oder beliebige übliche unlösliche Stärken, z. B. Reisstärke, Maisstärke, Kartoffelstärke und Pfeiwurzelstärke, verwendet werden. Die Herkunft der Stärke ist nicht wesentlich, so daß unter dem Ausdruck »Stärke« alle verschiedenen bekannten Formen ohne Rücksicht auf ihre Herkunft zu verstehen sind. Die Aufgabe der Stärke ist die eines Aktivators oder Stimulans, und die verwendete Menge liegt im Bereich von etwa 0,01 bis 15%. Besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung von 0,5% Stärke erhalten, so daß diese Menge bevorzugt wird.
Außer den Kohlenstoff- und Slickstoffquellen müssen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mineralische Nährstoffe in dem Nährmedium zugegen sein, um gutes Wachstum des Mikroorganismus sicherzustellen und maximale Selektivität, d. h. Umwandlung von Geflügelexkrement und anderen Nährstoffen in Mikroorganismuszellen zu erzielen. Beispielsweise können Kalium, Natrium, Eisen, Magnesium, Calcium, Mangan, Phosphor und andere Nährstoffe dem wäßrigen Nährmedium zugegeben werden. In den meisten Fällen enthalten jedoch Hühnerexkrement und Putenexkrement genügend Mineralstoffe für das Wachstum und die Bildung von alpha-Amylase. In jedem Fall können diese Materialien in Form ihrer Salze, vorzugsweise ihrer wasserlöslichen Salze, zugeführt werden. Beispielsweise kann das Kalium als Kaliumchlorid, -phosphat, -sulfat, -citrat, -acetat und -nitrat zugesetzt werden. Eisen und Phosphor können in Form von Sulfaten und Phosphaten, z. B. als Eisensulfat und Eisenphosphat, eingeführt werden. Im allgemeinen wird der größte Teil des Phosphors als Ammoniumphosphat zugeführt. Bei Verwendung von Ammoniumphosphat oder saurem Ammoniumphos-S phat kann das Phosphat als kombinierte Quelle von Stickstoff und Phosphor (Phosphation) für das Wachstum der Zellen des Mikroorganismus dienen.
Nach dem Impfen werden die Fermentationen gemäß der Erfindung bei einer Temperatur im Bereich
■ο von etwa 20 bis 500C durchgeführt. Innerhalb dieser Grenzen ist das Wachstum optimal. Vorzugsweise wird jedoch die Temperatur im Bereich von 26 bis 37"C, insbesondere im Bereich von 32 bis 3513C, gehalten.
■5 Bei diesen Temperaturen wurden die besten Ergebnisse erhalten. Der pH-Wert des Mediums wird während der Fermentation zwischen etwa 3,5 und 9,5 gehalten. In diesem Bereich wächst der Mikroorganismus zufriedenstellend. Vorzugsweise wird jedoch der pH-Wert bei etwa 7,2 gehalten. Bei diesem Wert wurden die besten Ergebnisse erhalten.
Die obengenannten 5 Mikroorganismenstämme sind aerob und müssen daher in Gegenwart von Luft gezüchtet werden, wenn das Wachstum gut sein soll.
Die Mikroorganismen können demzufolge auf der Oberfläche flacher Schichten des Mediums oder in belüfteten Submerskulturen gezüchtet werden. Im letzteren Fall werden tiefe Tanks verwendet, denen Luft zugeführt wird. Beide Verfahren werden von der Anmelderin angewandt. Sie erwiesen sich als gut geeignet Tür die Herstellung von alpha-Amylase. Für die Großherstellung ist natürlich das in tiefen Tanks durchgeführte Submersverfahren am geeignetsten.
Die Fermentation wird fortgesetzt, bis die Ausbeute an alpha-Amylase maximal ist. Im allgemeinen liegt die Fermentationszeit zwischen 12 und 72 Stunden, jedoch konnte nachgewiesen werden, daß alpha-Amylase-Aktivität bereits nach 4 Stunden vom Beginn der Fermentation im Nährmedium vorhanden ist. Im allgemeinen erreicht die Ausbeute nach etwa 12 bis 16 Stunden ein Maximum, das jedoch erheblich geringer ist als nach der längeren Zeitgrenze von 72 Stunden, so daß die Fermentation vorzugsweise für eine Zeit von etwa 30 Stunden durchgeführt wird.
Sauerstoff kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dem Kulturmedium in beliebiger Form zugeführt werden, die leicht vom Mikroorganismus assimiliert werden kann. Sauerstoffhaltige Verbindungen
so können verwendet werden, solange sie das Wachstum der Zellen des Mikroorganismus nicht beeinträchtigen. Der Sauerstoff wird jedoch zweckmäßig in Form von sauerstoflhaltigen Gasen, z.B. Luft, die 19 bis 22Gew.-% Sauerstoff enthalten, zugeführt.
Zwar wird die Verwendung von Luft bevorzugt,
jedoch kann auch mit Sauerstoff angereicherte Luft, die mehr als 22 Gcw.-% Sauerstoff enthält, verwendet werden.
Nach der Isolierung der ausgefällten alpha-Amylase
aus dem Nährmedium wird das Material getrocknet, wobei das endgültige Präparat erhalten wird, das außergewöhnlich hohe alpha-Amylase-Aktivität aufweist. Die Trocknung kann unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur über Calciumchlorid oder bei Temperaturen bis etwa 65° C ohne Verminderung der Aktivität des alpha-Amylase-Präparats erfolgen. Nach der Bildung der alpha-Amylase im Kulturmedium wird sie wie folgt isoliert: Zuerst werden die
5 6
Feststoffe aus dem Medium entfernt, worauf die entwickelt, bevor die Produktionsmedien mit ihr
alpha-Amylasc durch Zusatz eines Fällmittels, das beimpft werden.
nachstehend beschrieben wird, aus dem zellfreien Besonders hohe Ausbeuten an alpha-Amylase wer-Medium ausgefällt wird. Die Feststoffe können nach den erhalten, wenn die Teilchengröße des Geflügelbeliebigen üblichen Methoden, z. B. durch Filtration 5 exkremente über 42 μ liegt. Von der Anmelderin und Zentrifugieren, aus dem Kulturmedium entfernt erhaltene Versuchsergebnisse zeigen, daß es noch werden. In vielen Fällen ist es vorteilhaft, die alpha- vorteilhafter ist, Geflügelexkrement einer Teilchen-Amylase in Lösung zu verwenden, so daß eine Aus- größe von 125 μ zu verwenden, wobei ein möglichst fällung hierbei nicht notwendig ist und die Lösung, großer Anteil von Teilchen einer Größe von mehr als die nach der Entfernung der Zellen vom Kultur- io 177 μ besonders bevorzugt wird,
medium zurückbleibt, ohne weiteres für diesen Zweck
verwendet werden kann. Durch Konzentrierung der
zellfreien Medien wird jedoch ihre Wirksamkeit vcr- . . . . o .
bessert, so daß diese Arbeitsweise bevorzugt wird. alpha-Amylase-Besümmung
Nach der Abtrennung der Feststoffe vom Nährmedium 15
und Gewinnung der zellfreien Lösung der alpha-Amy- Die alpha-Amylasenbestimmung erfolgt vorzugslase wird diese vorzugsweise ausgefällt, indem Fäll- weise nach den allgemeinen Methoden von Fischer mittel, z. B. organische Lösungsmittel, die mit Wasser und Stein (Biochemical Preparation, 7, 1960), bei mischbar sind, dem Medium zugesetzt werden. Als denen die Aktivität von alpha-Amylase unter VerFällmittel eignen sich beispielsweise Ammoniumsulfat, 20 wendung von Dinitrosalicylsäure (DNS) gemessen Methyläthylketon, Aceton, Dioxan und niedere ali- wird.
phatische Alkohole, z.B. Methanol, Äthanol, Iso- Als Substrat wird bei dieser Methode eine l%ige propanol, n-Propylalkohol und tert.-Butylalkohol, Lösung von löslicher Stärke in siedendem Wasser sowie Polyäthylenglykol oder Gemische dieser Fäll- mit 0,02molarem Natriumglycerophosphat-HCI-Pufmittel. Das Lösungsmittel wird in einer solchen 25 fer, auf pH 6,9 eingestellt, verwendet. Als Abbruch-Menge zugesetzt, daß die gesamte alpha-Amylase mittel dient eine alkalische Lösung von Dinitrosalicylausgefällt wird. Hierbei wurde festgestellt, daß etwa säure, hergestellt durch Suspendieren von 20 g 3,5-Di-0,5 bis 2,0 Raumteile Fällmittel pro Raumteil des nitrosalicylsäure in 400 ml Wasser. Eine Lösung von zellfreien Mediums genügen, um die gesamte alpha- 32 g NaOH in 800 ml Wasser wird unter kräftigem Amylase auszufällen. Im allgemeinen wird Ammo- 30 Rühren zugetropft. Falls erforderlich, wird in einem niumsulfat als Fällmittel verwendet, da mit ihm gleich Wasserbad leicht erwärmt, bis sich eine klare Lösung gute Ergebnisse ohne Rücksicht auf die Konzen- gebildet hat. Der Rest der NaOH-Lösung wird dann tration der alpha-Amylase im zellfreien Kulturmedium zugesetzt, worauf 600 g Kaliumnatriumtartrat in kleierhalten werden. Es können zwei Raumteile Poly- nen Portionen zugegeben werden. Dann wird mit äthylenglykoi pro Raumteil des die alpha-Amylase 35 Wasser auf ein endgültiges Volumen von 21 aufenthaltenden zellfreien Kulturmediums verwendet gefüllt. Die Lösung wird dann durch eine große grobe werden, da bei Verwendung dieser Menge eine voll- Glasfritte filtriert und bei Raumtemperatur im Dunständige Ausfällung im allgemeinen gewährleistet kein aufbewahrt,
ist. Die eigentlichen alpha-Amylasebestimmungen wer-
Bei der Ausfällung der alpha-Amylase erwies es 40 den wie folgt vorgenommen: 1 ml Substratlösung wird sich als zweckmäßig, das zellfreie Kulturmedium vor zu je 1 ml der alpha-Amylase-Testlösungen gegeben, der Ausfällung zu konzentrieren. Die Lösung kann die mit 0,002molarem Natriumglycerophosphat-HClauf ungefähr 1I10 ihres ursprünglichen Volumens Puffer auf den gleichen pH-Wert wie die Substrateingeengt werden. Ferner erwies es sich als zweck- lösung eingestellt sind. Nach einer Inkubationszeit mäßig, das Nährmedium vor der Einengung zu dialy- 45 von genau 3 Minuten bei 25° C werden 2,0 ml des sieren, da hierdurch die Reinheit des Endprodukts Abbruchreagenz zugesetzt. Das Reagenzglas wird erhöht wird. Die Lösung kann in Zellglasbeuteln 5 Minuten in siedendem Wasser gehalten und dann (Cellophan) gegen fließendes Leitungswasser etwa gekühlt, worauf das Reaktionsgemisch mit 20 ml 24 Stunden dialysiert werden, wenn diese Maßnahme Wasser verdünnt wird. Die Farbe wird in einem nicht unpraktisch ist. so lichtelektrischen Klett-Summerson-Kolorimeter ab-
Zu Beginn der Fermentation wird das sterile Nähr- gelesen, der mit einem Grünfilter Nr. 54 (Spektralmedium mit dem zu züchtenden Mikroorganismus bereich 500 bis 570 π»μ) versehen ist. Der Extinktionsgeimpft, z. B. unter Verwendung eines vorher gezüch- wert wird aus einer Standardkurve, die mit teten Inoculums in einem Wachstummedium oder im D(+)-Maltosehydrat festgelegt worden ist, in mg gleichen Nährmedium, in dem es für die Produktion ss Maltose umgerechnet. Dieser Maltoselösung wird gezüchtet werden soll, z. B. in den oben beschriebenen keine Stärke und kein Puffer zugesetzt. Es wurde Nährmedien. Die Anfangskonzentration des Inocu- gefunden, daß die besten Ergebnisse erhalten werden, lums, das den Mikroorganismus enthält, zu Beginn wenn 1,0 ± 0,5 mg Maltose während der Reaktion der Fermentation kann in weiten Grenzen liegen und gebildet wird. Dies entspricht der Verwendung von beispielsweise 0,0005 bis 50,0 g pro Liter des gesamten 60 0,3 bis 1,0 n^g alpha-Amylase im Bestimmungs-Fermentationsmediums betragen. Auch andere Impf- system. Von der Anmelderin wurde eine alphamethoden können angewandt werden. Beispielsweise Amylaseaktivitätseinheit (DNS-Einheit) als die Enzymkann eine Impfkultur verwendet werden, die durch menge definiert, die 1 mg Maltose unter den obenvorherige Züchtung des Mikroorganismus auf einem genannten Bedingungen bildet.
Medium, das von dem Nährmedium für die Groß- 65 Falls nicht anders angegeben, sind die Ergebnisse, herstellung verschieden ist, hergestellt worden ist die bei den im folgenden beschriebenen Tests auf und dann in die Fermentationsbehälter überführt alpha-Amylase erhalten wurden, in DNS-Einheiten wird. Normalerweise wird die Kultur 14 bis 18 Stunden ausgedrückt.
Eigenschaften der erfindungsgemäß einzusetzenden fünf Stämme
Die fünf von der Anmelderin isolierten Stämme sind bei der American Type Culture Collection, Washington D. C, hinterlegt und erhielten die Bezeichnungen
Bacillus cereus A. T.CC. 21 768, Bacillus cereus A.T.C.C. 21 769, Bacillus cereus A.T.C.C 21 770, Bacillus cereus A.T.C.C. 21 771 und Bacillus cereus A.T.C.C. 21 772. Diese Stämme haben die nachstehend genannten Kultureigenschaften und mikroskopischen Eigenschaften.
A.T.C.C. Nr. 21769 21770 21771 — 21772 Wachs- Gas
21768 Hühnermist Hühnermist Hühnermist + HUhnermist tum
Quelle Putenmist Putenmist Putenmist Putenmist — — Putenmist —
Hühnermist Dextrose- Dextrose- Dextrose- — — Dextrose- + -
Nährmedium Dextrose- Stärke-Agar Stärke-Agar Stärke-Agar — — Stärke-Agar —
Stärke-Agar 37 37 37 — 37 —
Züchtungs 37 + —
temperatur, "C 6,8* 6,8 6,8 6,8 + —
pH-Wert der
Kultur 		6,8 grampositiv grampositiv grampositiv grampositiv
IVUlVUl
Gramfärbung 		grampositiv X-1I2- 2U 1,3 U Ketten 1 - V2 u 3U
3 μ »vakultiert« .
exzentrisch exzentrisch exzentrisch + + exzentrisch + _
Sporen exzentrisch + ,2U +,1,5U +, 0,75 U — +, 1,5 U + +
+,1,5U — - — —
Pepton-Eisen — + + + +
Hydrolyse von + -j. +
Stärke - ITag - ITag - ITag - ITag
Lackmusmilch - J Tag alkalisch Hydrolyse Hydrolyse Hydrolyse
Reduktion 5 Tage 5 Tage 5 Tage 5 Tage
5 Tage grau weiß weiß weiß
Morphologie weiß weiß schleimig schleimig schleimig
der Kolonie schleimig schleimig ausbreitend glänzend sich ausbreitend
glänzend dunkel mit
Alterung
— — — —
Indol — — - - -
Voges- Proskauer — + + + +
Nitratreduktion — kein Gas — — — -
Methylrot — — — — —
Koser-Citrat — + — -f +
Motilität + + + + +
Katalase — + + +
Gelatine-Stat - Bacillus cereus A.T.C.C. Nr. 21· 769
Bacillus cereus A. T.C.C Nr. 21 768 Wachs- Gas 50 Kohlenhydral-Daten Sauer
Kohlenhydrat-Daten Sauer turn
— Inosit
Inosit -I- - Cellobiose
Cellobiose + — 55 Adonit
Adonit + — Sorbit
Sorbit - + — Dulcit
Dulcit - + -1- - Inulin
Inulin + — ^0 Glycerin
Glycerin - — - Salicin
Rhamnose leicht — - Mannit
Salicin — — Maltose
Mannit _ _ + - 6 Saccharose
Maltose 4- -I- - Dextrose
Saccharose + — Lactose
Dextrose -f + -I- _ Mannose
Lactose
609 528/388
Bacillus cereus A. T. C. C. 21 770
Vergleichsbeispiel 1
Kohlenhydrat-Daten Sauer Wachs
tum
Inosit - +
Cellobiose + +
Adonit — — —
Sorbit - + —
Dulcit - + —
Inulin — +
Glycerin — - -
Salicin — +
Mannit — + —
Maltose + +
Saccharose + +
Dextrose 4- + —
Mannose + +
Bacillus cereus A. T. C. C. Nr. 21 771
Kohlenhydrat- Daten Sauer Wachs
tum
Inosit — —
Cellobiose + +
Adonit — — —
Sorbit - — —
Dulcit - — —
Inulin — +
Glycerin — + —
Salicin — —
Mannit — + —
Maltose + -f-
Saccharose + +
Dextrose + + +
Bacillus cereus A. T. C. C. Nr. 21 772
Kohlenhydrat-Daten Sauer Wachs
turn
Inosit — + —
Cellobiose + +
Adonit — + —
Sorbit + + -
Dulcit - + +
Inulin — +
Glycerin + + -
Salicin — +
Mannit — + -
Maltose + +
Saccharose + +
Dextrose + -
Lactose - _
alpha-Amylase-Aktivitäl der fünf neuen Stämme im Vergleich zu bekannten Stämmen, die alpha-Aniylasc
bilden
Sporen jedes der Mikroorganismen Bacillus cereus
A. T. C. C. 21 768 bis 21 772 werden im Vergleich zu den bekannten alpha-Amylase bildenden Mikroorga-
~ nismen Aspergillus niger A.T.C.C. 15 475 und Bacillus
ίο amyloliquefaciens A.T.C.C. 23 843 auf ihre Fähigkeil zur Bildung von alpha-Amylasc untersucht.
Je eine Impfnadelmenge der Sporen wird von den
_ Dextrose-Stärke-Agar-Schrägkulturen der neuen
Mikroorganismen und der beiden bekannten alpha-
is Amylase bilden Mikroorganismen in einzelne Erlen-
— meyerkolben überführt, die 150 ml einer Spizzenbrühc oder einer Weizenkleie oder einer Bacillus-Amylase
_ enthalten. Etwa 1 bis 5 ml eines vegetativen 16-Stun-
__ den-Inoculums, dessen pH-Wert auf 6,8 eingestellt
ist, werden verwendet. Die Kolben werden dann 15 Minuten in Wasser von 500C gestellt und gekühlt, und
— der Inhalt wird quantitativ in einen 150-ml-Kolben überfuhrt. Die Lösung wird mit 2,0 N-Natriumhydroxydlösung auf pH 4,8 eingestellt, in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben überführt und auf etwa 200 ml verdünnt. Der Inhalt wird dann in einen 250-ml-Meß-
kolben überführt und auf das gewünschte Volumen Gas verdünnt. 200 ml werden dann 15 Minuten bei
2000 UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird in einen trockenen Kolben dekantiert. 50 ml dieser Flüssigkeit wird in ein 70-mI-Reagenzglas pipet-
— tiert. Nach Zugabe von 5 ml 5,0 N-Salzsäure wird das Reagenzglas lose verschlossen, in einem siedenden Wasserbad 3 Stunden erhitzt und dann in einem Eisbad gekühlt. Der Inhalt des Glases wird in einen 100-ml-Meßkolben überführt und mit 2,0 N-Natrium-
— hydroxyd bis zum Umschlagspunkt von Phenolphthalein eingestellt. Nach Verdünnung auf das
_ gewünschte Volumen wird der Wert für reduzierenden
Zucker, gerechnet als Dextrose, an einem aliquoten Teil der endgültigen Lösung bestimmt. Unter diesen ~~ Bedingungen erreichte der alpha-Amylase-Gehalt der
+ Kulturen von Bacillus cereus A. T. C. C. 21 768 bis
21 772 ein Maximum in etwa 20 Stunden, während der Amylase-Gehalt der beiden bekannten Kulturen ihr maximales Wachstum erst nach etwa 40 Stunden erreichten. Die alpha-Amylase-Erzeugung bei diesen Versuchen, ausgedrückt in DNS-Einheiten, ist in der
folgenden Tabelle genannt:
Gas 50
55
60
Nährrnedium Weizen-
kleic 		Bacillus-
Amylase
Ansätze
Spizzen-
brühe
A.T.C.C.-Stamm: 3,5 0,7
21768 2,93 9,0 0,7
21769 2,37 35,2 0,7
21770 8,25 4,62 0,7
21 771 3,50 9,0 0,7
21772 2,97 3,25 0
Aspergillus niger
15475		 2,0 2,8 7,0
Bacillus amylolique
faciens 23 843		 2,0
Spizzenbrühe: Vergleichsbeispiel 2 Es werden weitere Versuche durchgeführt, bei
wasser. Man filtriert durch Watte, gibt 5,0 mg , jf A6J «»ftf^»*!»« T «'η^ bekannten han-
MnSO4 zu, stellt auf pH 6,8 ein und füllt mit 5 ^üblichen (Novo) alpha-Amylase-Enzym-Präparat Leitungswasser auf I I auf. verglichen wird. Tabelle 1 Weizenkleie-Filtrat: Vergleich von Novo-alpha-Amylase und alpha-Amy-
100g Weizenkleie, 300 ml Leitungswasser. Man ,o «ase die durch Bacillus cercus A. T. C. C. 21 768 gebildet
autoklaviert, filtriert durch Baumwollgaze, gibt _ur
200 ml Leitungswasser zu und autoklaviert. Novo- Roh Gereinigt
Amy läse 21 768 21 768
Bacillus-Amylase-Ansätze
., 15 Spezifische Aktivität, 20 14 100
Γ DNS-Einheiten/mg
g Pn»vm
Natriiimcitratdihydrat Ig ^1 Ammoniumsulfat 2 g Optimaler pH-Wert 5,5 4,5 5,5 Magnesiumsulfatheptahydrat 0,2 g Optimale Aktivität
in 1 1 Wasser, pH 7 20 bei pH 2,5 0% 70% 42%
5 g Glucose getrennt autoklaviert bei pH 8,5 51% 72% 49%
c λ η j ii,., r j· Ai · · λ . L bei pH 9,5 5% 40% 36%
Einfluß des pH-Wertes auf die Aktivität der alpha- . . u ' . c0/ no/ ... Amylase von Bacillus cereus A.T.C.C 21768 bis öei pH lü,5 2,5 /„ 9/„ 5/o
21772 2S Einfluß der Temperatur
auf die Aktivität
Jedes Enzym wird 3 Minuten bei 25" C, jedoch bei , ODtimale TcmDe 45 ^ ft,
verschiedenen pH-Werten getestet. Sowohl die Enzym- '' °E^? lösung als auch die l%igen Stärkelösungen werden „ . .' ' A, . .
in einer Pufferlösung bei dem pH-Wert hergestellt, 30 Z Anstieg der Aktivität 43% 160% 116% bei dem die alpha-Amylasebestimmung durchgeführt ™m. Opumum über
werden soll. Die Ergebnisse für Bacillus cereus die Aktivität bei
A. T. C. C. 21 768 sind in F i g. 1 dargestellt. Auch hier 25 c
sind die Kurven für die anderen vier Stämme fast 3. optimale Aktivität 60% 78% 58% identisch. Die Untersuchung der pH-Kurven zeigt 35 bei 8O0C maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 7,5. Einfluß der Temperatur Im allgemeinen sind noch etwa 30 bis 40% der maxi- auf die Stabilität malen Aktivität bei pH 10,5 vorhanden. Aktivitätsverlust
Einfluß einer längeren Wärmebehandlung auf die 1. nach 15 Minuten 7% 0% 0% Stabilität der Aktivität der alpha-Amylase ** bei 700C Jede alpha-Amylase-Lösung wird für die Zeit 0, 2 nach *° Minuten 80% 0% 78%
1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden usw. bei 7O0C gehal- 1^1 70°c
ten. Die alpha-Amylase-Proben werden dann gekühlt 3. nach einer Stunde 94% 0% 95%
und bei 250C der Bestimmung unterworfen. Die 45 bei 700C
Ergebnisse dieser Tests sind für jeden Stamm sehr 4. nach 2 Stunden 2,6%
ähnlich und in Fig. 2 dargestellt. Nach 1 Stunde bei 700C
bei 70°C ist kein Verlust an Aktivität-eingetreten. Nach Einfluß von hoher ·) **)
2 Stunden ist die Aktivität der alpha-Amylase um Temperatur und hohem etwa 20% geringer, und nach 3stündiger Inkubation 50 pH-Wertaufdie
ist die Enzymaktivität um etwa 30% gesunken. Stabilität der Amylase
Einfluß der Temperatur auf die Aktivität 1. Verlust nach 15 Min. 0% Die von jedem der fünf neuen Stämme gebildete 1^' pH 8'5
alpha-Amylase wird der vorstehend beschriebenen 55 2· Verlust nach 30 Min. 0%
Bestimmung bei verschiedenen Temperaturen unter- bei PH 8>5
worfen. Die alpha-Amylase-Lösungen und Stärke- 3. Verlust nach 15 Min. 16%
substratlösungen werden vor Beginn der Reaktion bei pH 9,5
5 Minuten auf die Bestimmungstemperatur vorge- 4. Verlust nach 30 Min. 27%
wärmt. Die Ergebnisse dieser Tests sind für die 60 bei pH 9,5
5 Stämme fast identisch Die Untersuchung dieser 5 Verlust nach 15 Min. 33%
Temperaturkurven zeigt, daß ein fast linearer Anstieg bei oH IO 5
der Aktivität der alpha-Amylase von 25 auf 450C , ., , . -Aw.
vorhanden ist. Im allgemeinen ist der Anstieg der 6> Verlust nach 30 Mm. 60%
Aktivität der Amylase von 45 bis 700C nur gering, 65 °*1 pH ιυ'5 Und bei 8O0C ist die Aktivität der alpha-Amylase *) Da das Enzym bei hoher Temperatur (70° C) sehr instabil war,
im allgemeinen um 10 bis 30% geringer geworden Zt ίΑΑ,ΑΓ *** Jamt ""*
(F I g. 3). ♦*) Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Amylase nicht unter
sucht.
13 Novo- Roh 232 1 334 14 Novo- AT alpha-Am
Amylasc 21769 Amylasc C Γ. 21 T
Tabelle 2 20 5 Tabelle 3 20 Roh
alpha-Amy- 21770 Gereinigt
769 gebildet 10 21 770
Vergleich von Novo-alpha-Amylase und 5,5 5,0 5 Vergleich von Novo-alpha-Amylase und 5,5 72
läse, die durch Bacillus cereus A. T. C. C. 21 Gereinigt läse, die durch Bacillus cereus
wurde 0% 45% 21 769 IO gebildet wurde 0% 4,5
51% 60% 50 51% 4,5
5% 33% 5% 40%
Spezifische Aktivität, 2,5% 8% Spezifische Aktivität, 2,5% 45% 26%
DNS-Einheiten/mg 5,5 •5 DNS-Einheiten/mg 35% 30%
Enzym Enzym 10% 20%
Optimaler pH-Wert 45 60 33% Optimaler pH-Wert 45 5%
Optimale Aktivität 55% Optimale Aktivität
bei pH 2,5 43% 150% 24% 2O bei pH 2,5 43% 50
bei pH 8,5 0% bei pH 8,5 50
bei pH 9,5 bei pH 9,5 85%
bei pH 10,5 bei pH 10,5 90%
Einfluß der Temperatur 60% 70% 60 2< Einfluß der Temperatur 60%
auf die Aktivität auf die Aktivität
1. optimale Tempe 135% 1. optimale Tempe 70%
ratur, 0C ratur, 0C 72%
2. Anstieg der Aktivität 2. Anstieg der Aktivität
beim Optimum über 7% 10% 30 beim Optimum über 7%
die Aktivität bei 52% die Aktivität bei
• 250C 80% 22% 25° C 80% 0%
3. optimale Aktivität 3. Optimale Aktivität 0%
bei 800C 94% 36% bei 8O0C 94% 0%
Einfluß der Temperatur 35 Einfluß der Temperatur 75%
auf die Stabilität 70% 8% auf die Stabilität 5%
Aktivitätsverlust Aktivitätsverlust 95%
1. nach 15 Minuten *) 40% 1. nach 15 Minuten *) 10%
bei 700C 40 bei 700C
2. nach 30 Minuten 70% 2. nach 30 Minuten
bei 7O0C bei 700C **)
3. nach einer Stunde 0% 95% 3. nach einer Stunde
bei 700C bei 700C
4. nach 2 Stunden 5% ·*) 45 4. nach 2 Stunden 0%
bei 700C bei 700C
Einfluß von hoher 20% Einfluß von hoher 0%
Temperatur und hohem Temperatur und hohem
pH-Wert auf die 42% SO pH-Wert auf die 10%
Stabilität der Amylase Stabilität der Amylase
1. Verlust nach 15 Min. 40% 1. Verlust nach 15 Min. 15%
bei pH 8,5 bei pH 8,5
2. Verlust nach 30 Min. 60% 2. Verlust nach 30 Min. 32%
bei pH 8,5 55 bei pH 8,5
3. Verlust nach 15 Min. 3. Verlust nach 15 Min. 48%
bei pH 9,5 bei pH 9,5
4. Verlust nach 30 Min. 4. Verlust nach 30 Min.
bei pH 9,5 6o bei pH 9,5
5. Verlust nach 15 Min. 5. Verlust nach 15 Min.
bei pH 10,5 bei pH 10,5
6. Verlust nach 30 Min. 6. Verlust nach 30 Min.
bei pH 10,5 bei pH 10,5
·) Da das Enzym bei hober Temperatur (70° C) sehr instabil war, wurde der kombinierte Effekt von hoher Temperatur und hohem pH-Wert nicht untersucht.
**) Aus dem gleichen Grunde wie lür Novo-Amylase nicht untersucht.
, *) Da das Enzym bei hoher Temperatur (70° C) sehr instabil war, ' wurde der kombinierte Effekt von hoher Temperatur und hohem pH-Wert nicht untersucht.
**) Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Amylase nicht untersucht
Tabelle 4
Novo-A my läse
l:oh
1771
Gereinigt
21771
Tabelle 5
Vergleich von Novo-alpha-Amylase und alpha-Amylase, die durch Bacillus cereus lA.T.C.C. 21771 gebildet wurde
Vergleich von Novo-alpha-Amylase und alpha-Amylase, die durch Bacillus cereus A. T. C. C. 21 gebildet wurde
Novo- Roh Amylase 21772
Gereinigt
21772
Spezifische Aktivität, 20 2!θ 85
DNS-Einheiten/mg
Enzym
Optimaler pH-Wert 5,5 |5,5 5,5
Optimale Aktivität
bei pH 2,5 0% 5b% 42%
bei pH 8,5 51% 43% 33%
bei pH 9,5 5% 3)% 20%
bei pH 10,5 2,5% ψ/ο 3%
Einfluß der Temperatur
auf die Aktivität
1. optimale Tempe- 45 5|5 60 ratur, °C
2. Anstieg der Aktivität 43% ίκ|)% 90% beim Optimum über
die Aktivität bei
25°C
3. optimale Aktivität 60% 70% 68% bei 800C
Einfluß der Temperatur
auf die Stabilität
Aktivitätsverlust
1. nach 15 Minuten 7% ol% 5% , bei 700C
2. nach 30 Minuten 80% io|% 82% bei 700C I
3. nach einer Stunde 94% 25% 98% bei 700C
4. nach 2 Stunden 39 t bei 700C
Einfluß von hoher ♦) I **»
Temperatur und hohem
pH-Wert auf die
Stabilität der Amylase
1. Verlust nach 15 Min.
bei pH 8,5
2. Verlust nach 30 Min. 20« bei pH 8,5
3. Verlust nach 15 Min. 25' bei pH 9,5
4. Verlust nach 30 Min. 48°/ bei pH 9,5
5. Verlust nach 15 Min. 35«! bei pH 10,5
6. Verlust nach 30 Min. 60*; bei pH 10,5
*) Da das Enzym bei hoher Temperatur (70' C)I sehr instabil war, wurde der kombinierte Effekt von hoher | Temperatur und hohem pH-Wert nicht untersucht.
**) Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Am|ylase nicht untersucht.
75% 70%
60% 48%
42% 30%
12% 0%
Spezifische Aktivität, 20 12 120
DNS-Einheiten/mg
Enzym
'5 Optimaler pH-Wert 5,5 4,5 4,5
Optimale Aktivität
bei pH 2,5 0%
bei pH 8,5 51%
bei pH 9,5 5%
bei pH 10,5 2,5%
Einfluß der Temperatur
auf die Aktivität
1. optimale Tempe- 45 60 60 ratur, 0C
2. Anstieg der Aktivität 43% 120% 100% beim Optimum über
die Aktivität bei
25°C
3. optimale Aktivität 60% 69% 62% bei 80" C
Einfluß der Temperatur
auf die Stabilität
Aktivitätsverlust
1. nach 15 Minuten 7% 5% 8% bei 7O0C
2. nach 30 Minuten 80% 8% 16% bei 70° C
3. nach einer Stunde 94% 22% 40% bei 700C
4. nach 2 Stunden — 30% 88% bei 700C
Einfluß von hoher *) **)
Temperatur und hohem
pH-Wert auf die
Stabilität der Amylase
1. Verlust nach 15 Min. 10% bei pH 8,5
2. Verlust nach 30 Min. 25% bei pH 8,5
3. Verlust nach 15 Min. 22% bei pH 9,5
4. Verlust nach 30 Min.
bei pH 9,5
5. Verlust nach 15 Min.
bei pH 10,5
6. Verlust nach 30 Min.
bei pH 10,5
36%
28%
62%
·) Da das Enzym bei hoher Temperatur (700C) sehr instabil war, wurde der kombinierte Effekt von hoher Temperatur und
hohem pH-Wert nicht untersucht.
**) Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Amylase nicht unterh
sucht.
609528/388
Bei spiel 1
Etwa 500 ml Nährmedium auf Basis von Hühnermist mit folgender Zusammensetzung wurden hergestellt:
Hühnerexkrement, Teilchengröße
177 μ 5%
(NHJ2HPO4 0,5%
CaCO3 2,0%
K2HPO4 0,1%
CaCl2 1%
MgCl2 0,01%
Das Medium wurde sterilisiert, mit Bacillus cereus ATCC 21 770 geimpft und 60 Stunden unter Schütteln bei 37°C bebrütet. Das hierbei erhaltene Kulturmedium (10 Vol.-%) wurde in ein Hauptkulturmedium überführt, das die obengenannte Zusammensetzung hatte und unter Schütteln bei 37° C bebrütet wurde. Eine 50%ige Harnstofflösung wurde während der Fermentation nach Bedarf zugesetzt, um den pH-Wert zwischen 6 und 8 zu halten. Hühnerexkrement wurde zur Ergänzung des Verbrauchs zweimal in einer Menge von 2% zugesetzt. Nach einer Fermentationszeit von 60 Stunden betrug die Konzentration der alpha-Amylase im Kulturmedium 45 DNS-Einheiten. Der gleiche Versuch wird unter Verwendung von Maisquellflüssigkeit anstelle von Hühnerexkrement wiederholt, wobei nur 26—3) DNS-Einheiten gebildet werden.
Beispiel 2
Etwa 500 ml Nährmedium auf Basis von Hühnermist mit der folgenden Zusammensetzung wurden in einem 500-tnl-Erlenmeyerkolben sterilisiert :
Hühnerexkrement, Teilchengröße
177 μ 3%
Harnstoff 0,1 %
K,HPO4 0,5%
CaCl2 0,5%
MgCl2 0,05%
FeCl2 0,05%
Bacillus cereus ATCC 21 768 wurde in das Medium geimpft und 18 Stunden bei 300C unter Schütteln bebrütet. Während der Fermentation wurde der pH-Wert mit einer 50%igen HarnstofHösung bei 6 bis 9 gehalten. Nach Beendigung der Kultivierungszeit betrug die Menge der im Kulturmedium angehäuften alpha-Amylase 1000 Einheiten/ml oder etwa 3,5 beim Dinitrosalicylsäuretest. Gleiche Versuche unter Verwendung von Maisquellflüssigkeit anstelle von Hühnerexkrement ergaben 1,0 DNS-Einheiten.
Beispiel 3
Ein Kulturmedium wurde hergestellt, indem Bacillus cereus ATCC 21 772 in einem Nährmedium auf Basis von Putenexkrement 18 Stunden bei 300C gezüchtet wurde. Das Kulturmedium wurde in ein Hauptkulturmedium der folgenden Zusammensetzung geimpft:
Endmelasse 1,0%
(NHJ2SO4 1,0%
KH2PO4 0,2%
MgSO4 · 7H2O 0,05%
Fe++ 2 ppm
Mn ++ 2 ppm
CaCO3 1.5%
Das Medium wurde bei 30' C gehalten. Nach 10, 24 und 48 Stunden wurden 2% Putenexkrement zugesetzt. Nach einer Kultivierungszeit von 72 Stunden betrug die im Kulturmedium angehäufte Menge der alpha-Amylase 80 DNS-Einheiten. Bei einer Wiederholung des gleichen Versuchs unter Verwendung von Maisquellflüssigkeit anstelle des Putenexkrements wurden 1,3 D NS-Einheiten erhalten.
Beispiel 4
500 ml Impfkulturmedium von Bacillus cereus ATCC 21 771 in einem Medium, das 0,5%
'5 (NHJ2HPO4, 0,2% KH2PO4, 0,05% MgSO4 · 7H2O und 0,05% Hefeextrakt enthält, werden 20 Stunden bei 30"C geschüttelt und dann in 200 ml eines Hauptkulturmediums in einem lOOO-ml-Kolben geimpft. Das Gemisch wird bei 30°C unter Schütteln bebrütet.
Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:
(NHJ2SO4 0.5%
(NHJ2HPO4 0,5%
KH2PO4 0,2%
K2HPO4 0.7%
MgSO4 · 7H2O 0,05%
MnCl2 0—2%
FeCl2 0—2%
Hefeextrakt 0,02%
pH 7,4
v
Nach einer Fermentationszeit von 24 Stunden werden 3% Hühnerexkrement zugesetzt. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden beträgt der Gehalt an alpha-Amylase im Kulturmedium 1 DNS-Einheit/ Ml. Ein gleicher Versuch unter Verwendung von Maisquellflüssigkeit anstelle von Hühnerexkrement ergab die Bildung von O DNS-Einheiten alpha-Amylase. Mit Sojabohnenöl und Weizenkaff anstelle des Hühnerexkrements werden ähnliche Ergebnisse erhalten.
Vergleichsbeispiel 3
Bacillus cereus 21 769 wurde auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise in einem Medium, das 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Malzextrakt und 1% Sojabohnenöl enthielt und einen pH-Wert von 6 hatte, gezüchtet und im gleichen Nährmedium weiter gezüchtet. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden betrug der alpha-Amylasegehalt im Kulturmedium 2 DNS-Einheiten/ml.
Beispiel 5
Ein Nährmedium auf Stärkebasis wurde hergestellt und mit Bacillus cereus 21 770 beimpft und 20 Stunden unter Schütteln bei 37° C bebrütet. 300 ml des hierbei erhaltenen Kulturmediums wurden in 51 eines Hauptkulturmediums der folgenden Zusammensetzung ge impft:
Kartoffelstärke 0,2%
(NHJ2SO4 0,5%
(NHJ2HPO4 0,5%
K2HPO4 0,1%
KH2PO4 0,2%
MgSO4 ■ 7H2O 0,05%
Hefeextrakt 0,02%
pH 6,5
Das Medium wurde in einen 10-1-Fermenter gegeben, in dem die Fermentation bei WC unter Zuführung von Luft in einer Menge von 10 l/Minute und unter Rühren bei 300 UpM durchgeführt wurde. Nach einer Fermentationszeit von 20 Stunden wurde das Hühnerexkrement dem Medium aseptisch zugesetzt. Getrennt wurden 0,5% (NHJ2HPO4 zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit 15%iger wäßriger Ammoniaklösung aufrechterhalten. Nach 42 Stunden wurden 2 g/ml = 21 Einheiten alpha-Amylase im Kulturmedium erhalten.
Beispiel 6
Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wurde mit Bacillus cereus 21 771 wiederholt. Nach 8 Stunden wurden 0,03% Glucose zugesetzt. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden erreichte die Konzentration der alpha-Amylase im Kulturmedium 81 DNS-Einheiten.
Bei spiel 7
Bacillus cereus ATCC Nr. 21 770 wurde in einem Medium, das 1% Bouillon, 0,5% NaCl und 0,1% Hefeextrakt enthielt, 18 Stunden bei 30" C und weiter in einem Hauptkulturmedium auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise 72 Stunden bei 3O0C gezüchtet. Nach 12 Stunden wurden 0,01% Kaliumeitrat zugesetzt. Nach 12, 20, 30 und 40 Stunden wurde 1,0% Hühnerexkrement zugesetzt. Nach 72 Stunden erreichte die Konzentration der alpha-Amylase im Kulturmedium 36 DNS-Einheiten.
Beispiel 8
Bacillus cereus ATCC 21 768 wurde in ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung geimpft:
NaNO3 (als Stickstoßquelle) 0,6% Hühnerexkrement, Teilchengröße
125 μ 5,0%
CaCO3 2%
Acetatpuffer, pH 6,8
CaCI2 0,1%
Das nach 24 Stunden bei 37° C erhaltene Kulturmedium wurde mit einem Hauptkulturmedium der folgenden Zusammensetzung gemischt:
•5
Hühnerexkrement, Teilchengröße
125 μ
Essigsäure
(NHJ2SO4 Hf
2,0% 1,0% 0,5%
Vergleichsbeispiel 4
Aspergillus niger ATCC Nr. 15 475 wurde in ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung geimpft:
KH2PO4 0,1%
MgSO4 · 7H2O 0,05%
(NHJ2SO4 0,1%
Harnstoff 0,25%
MnCl2 0,2 ppm
FeC]2 0,2 ppm
Hühnerexkrement, Teilchengröße
125 μ 2,0%
Das nach 20 Stunden bei 300C erhaltene Kulturmedium wurde mit einem Hauptkulturmedium der folgenden Zusammensetzung gemischt:
Hühnerexkrement, Teilchengröße
125 μ 2,0%
Propylenglykol 1,5%
Harnstoff 0,25%
KH2PO4 0,2%
MgSO4 · 7H2O 0,05%
Maisquellflüssigkeit 0,3%
Nach einer Kultivierungszeit von 18 Stunden bei 28° C unter Schütteln wurde das Kulturmedium mit einer Hamstofflösung auf pH 7 bis 8 eingestellt. Nach 6$ 12, 18, 24, 36 und 48 Stunden wurden 2% Äthanol zugesetzt. Nach 62 Stunden erreichte die Menge der alpha-Amylase im Kulturmedium 1,3 DNS-Einheiten.
Harnstoff 0,5%
w KH2PO4 0,2%
K2HPO4 0,2%
MgSO4 ■ 7H2O 0,05%
Hydrolysiert Pflanzenprotein der Ajinomoto Company, Japan 1,5%
Nach 72 Stunden betrug die Konzentration der alpha-Amylase 29 Einheiten.
In Tabelle 6 sind die fünf neuen Stämme zusammen mit vielen bereits bekannten Mikroorganismen sowie ihre Fähigkeit, auf Nährmedien auf Basis von Geflügelexkrement zu wachsen, genannt. Dieses Wachstum wurde wie folgt bestätigt: Plattenkulturen der Mikroorganismen wurden 5 Tage bei 300C bebrütet, und ein Teil des flüssigen Inhalts wurde nach einer Diffu sionsmethode auf Filterpapier übertragen. Der alpha- Amylasegehalt jedes Kulturmediums wurde nach der Dinitrosalicylsäuremethode sowie nach anderen Methoden der Enzymologie berechnet. Ergebnisse der chromatographischen Analyse wurden verwendet, um zu ermitteln, welche Zucker gebildet wurden. Das Wachstum der Mikroorganismen wird durch Plattenzählungen und Verwertung von Zucker, DNA und RNA bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 auf einer willkürlichen, jedoch reproduzierbaren Skala angegeben. Die verwendeten Zeichen haben die folgende Bedeutung:
+ 4- + + = ausgezeichnet, verwendeten So A. Hühnerexkrement Teilchen Konzen
+ + + = gut, SS Nährmedien hatten die folgende Zusammensetzung: B. Hühnerexkrement größe tration im
50 + + = ziemlich gut, Nährmedium C. Putenexkrement Nährmedium,
+ = signifikant, D. Hühnerexkrement Gewichts
- = Spur. E. Hühnerexkrement prozent
Die bei den Versuchen zu 42 μ 1,0
125 μ 2,0
125 μ 2,0
177 μ 2,0
177 μ 5,0
1 Tabelle 6
Fortsetzung Teilchen Konzen Nährmedium 5 J. Hühnerexkrement Teilchen Konzen
größe tration im Cellobiose größe tration im
Nährmedium Nährmedium, ίο MgSO4 7H2O Nährmedium,
Gewichts KCl Gewichts
prozent CaCl2 5H2O prozent
Hefeextrakt
■5 Maisquellflüssigkeit 125 μ 5,0
177 μ 10,0 destilliertes Wasser 0,1
177 μ 2,0% K. Putenexkrement IO g/l
F. Hühnerexkrement 0,1 Cellobiose 5 g/1
G. Hühnerexkrement 2,0 2O MgSO4 7H2O
KCI		 0,2 g/l
CaCl2 0,1 CaCl2-5H2O
Hefeexlrakt		 1,0 g
CaCO3 0,1 destilliertes Wasser 7,0
MgCl2 6 L. Putenexkrement 1000 ml
FeCl2 Cellobiose 42 μ 5,0
pH 177 μ 5,0 MgSO4 7H2O 0,1
2,0
0,1 		KCl 10 g/l
5 g/l
H. Hühnerexkrement 0,1
0,1 		30 CaCl2 5H2O 0,2 g/l
1.0 g
CaCO3
CaCl2 		6 Hefeextrakt 1000 ml
MgCl2
FeCl2
„TI		 177 μ 3,0 destilliertes Wasser 42 μ 5,0
pH 3,0 0,1
I. Hühnerexkrement 10 g/l FG H I 10 g/l
Cellobiose 5 g/l + +++ ++ 5 g/l
MgSO4 7H2O 0,2 g/l 0,2 g/l
KCl 1,0 g — ++ +++ ++ 1,0 g
CaCl2 5H2O 1000 ml 1000 ml
Hefeextrakt — + + + ++
desliUiertes Wasser C D E J K L
Nährmedium + + + + - + ++ ++ + +- + +
A B
Aspergillus awamori + + + + + + + - + +++ ++ + + + + +
ATCC 11358
Aspergillus + + + + + + — + ++ ++ + +
diastaticus
Aspergillus flavus + + + + — + ++ ++ + - —
ATCC 11 495
Aspergillus foetidus — — + + + + _ _ _ _ + + + + +
ATCC 14916
Aspergillus niger — — + + + _ _ _ _ + + + + + + + +
ATCC 15475
Aspergillus oryzae — + + + + + ++ — + ++ + + — _
ATCC 7561
Aspergillus oryzae + + + — — — _ _ _ _ — — —
ATCC 9102
Aspergillus phoenicis — — — _ — — + ++ ++ — — —
ATCC 15 556
Aspergillus ruber — — - + + + +++ ++ ++ + + + —
ATCC 9481
Aspergillus saitol — — — — _ — + +++ ++ — — —
ATCC 11 362
Aspergillus terreus — — — + + + - + +++ ++ + + + +' +
ATCC 11 877
Aspergillus usamü — — + + + + + - ++ ++ ++ + + +
ATCC 11364
Bacillus amylolique- + + + + + + + + +
faciens ATCC 23 843
Bacillus brevis 4- + - + + + + + + +
ATCC 10068
Bacillus cereus -I- + + + + + - —
ATCC 944
Bacillus cereus — —
ATCC 7004
23 24
Fortsetzung Nährmedium B C D E + F G H 1 J + K L
A + + + + + + + +
+ + + +
Bacillus cereus + + + + + + + + + + — + + + + + + + + + + + + + + + +
ATCC 12480 + + + + + +
Bacillus cereus + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
ATCC 21 768 + + + + + +
Bacillus cereus + + + + + + + + + _ + + + + + + + + + + + + + + + + + +
ATCC 21 769 -t- + + + + +
Bacillus cereus + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
ATCC 21 770 + + + + +
Bacillus cereus + + + + + + + + + + + _ + + +· + + + + + + + + + + + + +
ATCC 21 771 + +
Bacillus cereus + + + + + + + + +
ATCC 21 772
Candida solami - - - - - - - - - - -
ATCC 14440 - + + + — + + + + + + + _ —
Candida parapsolosis
Cellumonas biazotea + - - - - - - -
ATCC 486 —
Cellumonas fimi — - - - - - - - - - -
ATCC IS 724 —
Corynebacteria — — - - - - - - - -
liliumATCC 15990 _
Corynebacteria
hydrocarboclastus _ _ _ _ — _ — _
19 556
Pseudomonas aeru- _ — _ _ - _ — — —
ginosa ATCC 7706 _
Pseudomonas
amyloderamosa _ _ _ + _ + + + _ — — _
ATCC 21 262
Pseudomonas atro-'
faciens ATCC 9004
Vergleichsbeispiel 6
Weitere Fermentationen werden unter Verwendung Weise verändert werden. Das Geflügelexkrement hat der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen und der eine Teilchengröße von 42 μ. Das verwendete Nährin Vergleichsbeispiels beschriebenen Nährmedien 40 medium enthält als Kohlenstoflquelle 7,0% Maisunter den in Vergleichsbeispiel 5 genannten Bedin- quellflüssigkeit. Die durch die verschiedenen Mikrogungen durchgeführt, wobei jedoch die Anteile des Organismen gebildete Menge an alpha-Amylase ist in Geflügelexkrements in der in Tabelle 7 angegebenen DNS-Einheiten in Tabelle 7 genannt.
Tabelle 7
Verwendete Mikroorganismen Hühnerexkrement 0,1% 2% 4% 6% 8% 10% 20% Putenexkremenl 5% t 8%
0,0% ' 1 1.1 2,0 2,1 1,6 0 0 4% 3,1 2,1
Aspergillus diataticus 0 1,3 1,6 2,4 1,5 0 0 0 2,7 1,9 1,3
Aspergillus flavus ATCC 11 495 0 3,0 1,8 2,4 1,9 0 0 0 1,7 1,9 1,0
Aspergillus foetidus 0 1,7
ATCC 14916 0 0,5 1,3 1,1 0 0 0 1,8 1,1
Aspergillus niger ATCC 15475 0 0 0 0 1,0 0 0 0 1,1 4,1 3,6
Aspergillus oryzae ATCC 7561 0 0 1,4 1,9 1,0 0 0 0 3,9 3,8 3,0
Aspergillus oryzae ATCC 9102 0 0 0 0 0 0 0 0 3,0 1,3 1,1
Aspergillus phoenicis 0 1,1
ATCC 15 556 0 0 0 0 0 0 0 3,1 3,0
Aspergillus usamii ATCC 11 364 0 1,4 1,8 2,1 1,5 1,0 0 0 2,9 1,9 1.4
Bacillus amyloliquefaciens 0,5 1,5
ATCC 23 843 1,1 1,4 2,0 1,0 0 0 0 1,0 1,0
Bacillus brevis ATCC 10068 0,5 0 0 0 0 0 0 0 1,0 1,6 1,1
Bacillus cereus ATCC 12480 0,5 3 7 28 36 12 0 0 1,1 36 29
Bacillus cereus ATCC 21 768 0,5 7 14 32 38 24 17 0 29 36 21
Bacillus cereus ATCC 21 769 0,1 30 609528/388
Fortsetzung
Verwendete Mikroorganismen Hiihncruxkrcmcm 0.1% 2% 4% 6% 8% 10% 20% Putenexkrement 5% 8%
0,0% 9 15 32 30 0 0 0 4% 39 25
Bacillus cereus ATCC 21 770 0 9 11 40 46 0 21 0 33 37 29
Bacillus cereus ATCC 21 771 0 Il 18 43 48 0 0 0 30 0 0
Bacillus cereus ATCC 21 772 0,1 0 0 1,0 0 0 0 0 0 0 0
Candida solami ATCC 14440 0 0 0 1,1 0 0 0 0 0 0 0
Candida parapsolosis ATCC 0 0 0 1,1 0 0 0 0 0 0 0
Candida guilliermondii
ATCC 9390		 0 0 1,1 1,0 0 0 0 0 0 0 0
Cellumonas biazotea
ATCC 486		 0 0 1,3 2,0 0 0 0 0 0 0 0
Cellumonas fimi ATCC 15 724 0 0 0 U 0 0 0 0 0 0 0
Corynebacteria hydro-
carboclastus ATCC 19 556		 0 0 0 1,1 0 0 0 0 0 0 0
Pseudomonas amyloderamosa
ATCC 21 262		 0 0 0 1,1 0 0 0 0 0 0 0
Pseudomonas Atrofaciens
ATCC 9004		 0 0
Ähnliche Versuche werden unter Verwendung der in Vergleichsbeispiel 5 genannten Nährmedien A, C, G und K durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten werden.
Vergleichsbeispiel 7
Fermentationen werden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen und des in
Tabelle 8
Vergleichsbeispiel 5 genannten Nährmediums J und den in Vergleichsbeispiel 5 angegebenen Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch das Geflügelexkrement, das eine Teilchengröße von 125 μ hatte, dem Nähr-30 medium in den nachstehend in Tabelle 8 angegebenen Mengen zugesetzt wird. Dieser Vergleich zeigt deutlich die vorteilhaften Ergebnisse, die durch Verwendung größerer Anteile Geflügelexkrement beim erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.
Verwendete Mikroorganismen Hergestellte alpha-Amylase 0,1% 2% 1,7 ,1 > 4% 6% 8% 10% 20% Putenexkrement 5% 8%
Hühnerexkrement 0 1,5 2,3 2,8 1,9 2,1 0 0 0 4% 1,9 0
0,0% 0 ,0 ,3 2,5 : 1,6 2,0 1,1 0 0 1,7 1,0 0
Aspergillus diastaticus 0 0 2,3 : 1,0 0 0 0 0 1,5 0 0
Aspergillus flavus ATCC 11 495 0 L,3 2,7 : 0
Aspergillus foetidus 0 0 ,0 0,5 : 1,0 0 0 0 0 1,3 0
ATCC 14916 0 1,1 1,1 1,1 7 0 0 1,1 0 0
Aspergillus niger ATCC 15 475 0 0 0 0 1,5 1,0 0 0 0 0 0 0
Aspergillus oryzae ATCC 7561 0 1,0 1,1 0 0 0 0 0 0
Aspergillus oryzae ATCC 9102 0 0
Aspergillus phoenicis 0 0 0 1,1 4 0 0 0 0 0 2,1 3,0
ATCC 15 556 0 0 0 0 0 0 0 1,7 0 0
Aspergillus ruber ATCC 9481 0 0 0 0 0 0 0 0 1,0 1,9 2,3
Aspergillus saitol ATCC 11 362 0 0,5 1 1,3 1,3 0 0 0 1,5 1,4 1,4
Aspergillus usamii ATCC 11 364 0 1,1
Bacillus amyloliquefaciens 0,5 0,1 1 1,5 1,5 0 0 0 1,4 1,4
ATCC 23 843 2,3 S 38 69 78 0 0 1,2 80 96
Bacillus brevis ATCC 10068 0,1 46 71 76 0 0 78 80 93
Bacillus cereus ATCC 21 768 0,2 42 63 61 0 0 78 86 91
Bacillus cereus ATCC 21 769 0,2 46 71 60 0 0 83 75 0
Bacillus cereus ATCC 21 770 0,3 49 71 63 0 0 71 75 0
Bacillus cereus ATCC 21 771 0,2 9 0 0 0 0 71 0 0
Bacillus cereus ATCC 21 772 0,2 3 0 0 0 0 0 0 0
Cellumonas biazotea ATCC 486 6,0 0
Cellumonas fimi ATCC 15 724 0,900
27
Fortsetzung
Verwendete Mikroorganismen Hergestellte alpha-Amylase
Hühnerexkremenl 0,1% 2% 4% 6% 8% 10·/. 20% Putenexkrement s% 8%
0,0% 1,0 6 5 0 0 0 0 4% 0 0
Cellumonas vibrioides
ATCC 11 764 		0 0.5 1 1 0 0 0 0 0 0 0
Cellumonas Cartalyticum
ATCC 21 681 		0 0,5 5 1 0 0 0 0 0 0 0
Cellumonas Flavigena
ATCC 482 		0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 9
Pseudomonas aerginosa
ATCC 7706 		0 1,5
Ähnliche Versuche werden unter Verwendung der Nährmedien A, C, D, G, K und L des Vergleichsbeispiels 5 durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten werden.
Vergleichsbeispiel 8 Fermentationen werden unter den in Vergleichs- Die Ergebnisse zeigen, daß bei den größeren Frak-
beispiel 7 genannten Bedingungen im Nährmedium J tionen die Bildung von alpha-Amylase beim erfin-
durchgeführt, wobei jedoch Gefliigelexkrement einer dungsgemäßen Verfahren verstärkt ist.
Teilchengröße von 177 μ und größer verwendet wird. Tabelle 9 Verwendete Mikroorganismen Hergestellte alpha-Amylase Hühnerexkrement Putenexkrement
0,0% 0,1% 2% 4% 6% 8% 10% 20% 4% 5% 8%
Aspergillus diastaticus ATCC Aspergillus flavus ATCC 11 Aspergillus foetidus ATCC 14916
Aspergillus niger ATCC 15475 Aspergillus oryzae ATCC 7561 Aspergillus phoenicis ATCC 15 556
Aspergillus ruber ATCC 9481 Aspergillus saitol ATCC 11 Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23 843
Bacillus brevis ATCC 10068 Bacillus cereus ATCC 21 768 Bacillus cereus ATCC 21 769 Bacillus cereus ATCC 21 770 Bacillus cereus ATCC 21 771 Bacillus cereus ATCC 21 772 Cellumonas biazotea ATCC Cellumonas firni ATCC 15 Cellumonas vibrioides ATCC 11764
Cellumonas cartalyticum ATCC 21 681 Cellumonas flavigena ATCC 482
Pseudomonas aerginosa 0 0 0 0 0 0 0 0 3,0 6 2,0
ATCC 7706
Ähnliche Ergebnisse werden unter Verwendung der in Vergleichsbeispiel 5 genannten Nährmedien A, C, G und K erhalten.
0 0 2,9 1,0 2,3 0 0 0 17 24 0
0 0 2,4 11 19 0 0 0 0 20 0
0 0 2,0 Π 19 0 0 0 0 0 0
0 0 2,3 10 18 10 0 0 12 19 0
0 0 2,3 10 17 0 0 0 0 0 0
0 0 2,7 10 19 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 17 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 21 28 20
0 1,3 8 9 10 0 0 0 10 11 3
0 1,1 6 7 6 0 0 0 5 5 5
0 4,7 35 45 88 100 0 0 87 91 90
0 4,3 30 40 81 89 0 0 86 90 88
0 4,7 31 41 82 90 0 0 88 93 90
0 4,6 29 40 81 90 0 0 80 90 0
0 4,3 31 42 83 93 0 0 80 91 0
0 1,1 6 18 0 0 0 0 0 0 0
0 2,0 12 26 0 0 0 0 0 0 0
0 2,0 14 34 0 0 0 0 0 0 0
0 1,0 6 20 0 0 0 0 0 0 0
6 1,3 8 23 0 0 0 0 0 0 0
29
30
Vergleichsbeispiel 9
Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen unter den gleichen Bedingungen wie in Vergleichsbeispiel 5 im Nährmedium J durchgeführt, wobei jedoch als Kohlcnstoffquelle 7% Weizenkleie anstelle von 7% Maisquellflüssigkeit verwendet wurden.
Tabelle 10 Verwendete Mikroorganismen
Hergestellte alpha-Amylasc 0.1% ,6 2% 4% 6% 8% 10% 20% Putenexkrement 5% 8%
Hühnerexkrement 2,0 13,0 35 16 0 0 4% 29 0
0,0% 3,5 14 36 32 0 0 21 23 0
0 3,0 15 35 20 0 0 18 0 0
0 3,3 14 35 18 0 0 3 23 0
0 3,7 15 36 15 0 0 19 0 0
0 3,6 14 35 16 0 0 0 0 0
0 1,1 14 35 12 0 0 0 0 0
0 1,3 6 35 0 0 0 0 34 0
0 1,3 0 0 0 0 0 0 27 Q 24
0 Ul 1,4 3 8 0 0 0 0 20 5
0 1,0 10 12 8 0 0 0 15 19 8
0 1,6 9 12 8 0 0 0 15 7 5
0,1 ,5 23 63 Ul 147 16 0 5 103 102
0,1 1,0 30 60 UO 132 11 0 96 105 102
0,6 ,0 30 58 108 138 0 0 96 111 101
0,6 i,o 29 60 110 131 16 0 99 101 0
0,5 0 31 63 108 131 0 0 91 100 0
0 1,0 10 24 24 0 0 0 90 0 0
0 2,0 14 26 24 0 0 0 0 0 0
0 1,8 10 23 19 0 0 0 0 0 0
0 11 0
0 11
19
11
16
2,0
2,5
1
Aspergillus diastaticus Aspergillus flavus ATCC 11 Aspergillus foetidus ATCC 14916
Aspergillus niger ATCC 15 Aspergillus oryzae ATCC 9102 Aspergillus phoenicis ATCC 15 556
Aspergillus saitol ATCC 11 Aspergillus terreus ATCC 11877
Aspergillus awamori ATCC Aspergillus usamii ATCC 11 Bacillus amyloliqucfaciens ATCC 23 843
Bacillus brevis ATCC 10068 Bacillus cereus ATCC 21 768 Bacillus cereus ATCC 21 769 Bacillus cereus ATCC 21 770 Bacillus cereus ATCC 21 771 Bacillus cereus ATCC 21 772 Cellumonas biazotea ATCC Cellumonas fimi ATCC 15 Cellumonas vibrioides ATCC 11 764
Cellumonas cartalyticum ATCC 21 681
Cellumonas flavigena ATCC 482
Pseudomonas aerginosa ATCC 7706
Vergleichsbeispiel
Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen unter den in Vergleichsbeispiel 5 genannten Bedingungen durchgeführt. Das in Vergleichsbeispiel 5 genannte Nährmedium J wurde verwendet, jedoch enthielt dieses Nähr medi um als Kohlenstoffquelle 7% Sojabohnenöl anstelle von 7% Maisquellflüssigkeit. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 genannt.
Tabellen
1,5
1,3
23
24
25
24
0 0
0 0 0 0 0
11
Verwendete Mikroorganismen Hergestellte alpha-Amylasc Hühnerexkrement
0,0% 0,1% 2% 4%
6%
Putenexkrement 10% 20% 4% 5% 8%
Aspergillus diastaticus 0 0 0 0 0 0 0 0 .5 1,0 0
Aspergillus flavus ATCC ί 1495 0 0 0 0 0 0 0 0 1,0 1,0 0
Aspergillus niger ATCC 15475 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0
Bacillus cereus ATCC 21 768 0 1,6 3,6 9 12 0 0 0 12 14 0
Bacillus cereus ATCC 21 769 0 1,6 3,6 8 14 0 0 0 12 14 0
Bacillus cereus ATCC 21 770 0 1,3 3,1 9 12 0 0 0 14 12 0
Bacillus cereus ATCC 21 771 0 1,6 3,6 11 12 0 0 0 12 14 0
Bacillus cereus ATCC 21 772 0 1,3 3,1 11 12 0 0 0 14 14 0
31
Vergleichsbeispiel
Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen unter den in Vergleichsbeispiel 5 angegebenen Bedingungen im Nährmedium L durchgeführt, das jedoch 10% Weizenkaff als Kohlenstoffquelle enthielt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 12 genannt.
Tabelle 12
Verwendete Mikroorganismen
Aspergillus diastaticus Aspergillus flavus ATCC 11 Aspergillus foetidus
ATCC 14916
Aspergillus niger ATCC 15 Aspergillus oryzae ATCC 7561 Aspergillus oryzae ATCC 9102 Aspergillus phoenicis
ATCC 15 556
Aspergillus ruber ATCC 9481 Aspergillus saitol ATCC 11 Aspergillus usamii ATCC 11 Bacillus amyloliquifaciens
ATCC 23 843
Bacillus brevis ATCC 10068 Bacillus subtilis Bacillus cereus ATCC 21 768 Bacillus cereus ATCC 21 769 Bacillus cereus ATCC 21 770 Bacillus cereus ATCC 21 771 Bacillus cereus ATCC 21 772 Cellumonas biazotea ATCC Cellumonas fimi ATCC 15 Cellumonas vibrioides
ATCC 11 764
Cellumonas cartalyticum
ATCC 21 681
Cellumonas flavigena
ATCC 482
Beispiel 9
Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 6 genannten Mikroorganismen unter den gleichen Bedingungen wie in Vergleichsbeispiel 11 im Nährmedium J durchgeführt, dem jedoch Weizenkaff und 200 μ$ Glycin zugesetzt wurden. Die von den fünf neuen Mikroorganismen gebildeten Mengen an
Hergestellte alpha-Amylasc 0,1% 2% 4% 21 6% QO/. IO1M. 20% Putenexkrement 5% 8%
Hühncrexkrement 1,5 3,7 21 43 28 0 0 4% 34 8
0.0% 1,2 4,4 21 43 30 0 0 31 31 11
0 1,3 4,0 20 46 28 0 0 28 18 3
0 1,9 4,3 0 45 30 0 0 15 34 6
0 1,7 4,6 21 0 0 0 0 31 0 0
0 1,3 4,2 21 43 31 0 0 0 0 0
0 K3 4,1 22 45 28 0 0 0 0 0
0 1,4 4,1 21 43 31 0 0 0 0 0
0 1,3 4,0 9 45 28 0 0 0 39 31
0 1,3 3,6 20 19 0 0 0 35 0 0
0 3,1 11 21 17 0 0 0 0 28 16
0 2,6 12 0 17 0 0 0 26 31 11
0 0 0 10 0 0 0 0 28 11 9
0 3,0 9,0 1 7,4 89 96 21 0 9 101 108
0 8,1 7,2 92 99 30 0 93 100 106
0 6,3 7,1 96 103 50 0 96 102 107
0 7,0 23 92 140 32 0 96 101 0
0 7,3 28 100 142 32 0 93 101 0
0 3,0 14 30 36 16 0 0 95 0 0
0 3,5 15 33 38 10 0 0 0 0 0
0 3,0 17 31 36 11 0 0 0 0 0
0 3,0 14 30 34 16 0 0 0 0 0
0 3,0 11 38 10 0 0 0 0 0
0 0
0
Beispiel 10
Der in Beispiel 9 beschriebene Versuch wurde unter Verwendung von Nährmedien wiederholt, die 5% bzw. 2% Hühnerexkrement enthielten. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 14 genannt.
Tabelle 14
nannt.
Tabelle 13		 10%
Weizenkaff
+ Glycin 		5%
Weizenkaff
+ Glycin 		& Bacillus cereus 5%
Hühner
exkrement
+ 200 μβ
Glycin 		3%
Hühner
exkrement
+ 200 (ig
Glycin
Bacillus cereus 330 130 ATCC 21 768 135 119
ATCC 21 768 203 17 ATCC 21 769 33,50 23,35
ATCC 21 769 85 89 ATCC 21 770 94 94
ATCC 21 770 5 31 6 ATCC 21 771
ATCC 21 772 		42 44
ATCC 21 771 30 39 Aspergillus niger
ATCC 15475		 29 47
ATCC 21 772 1,0 U Hierzu 2 Blatt Zeichnungen 2,85 2,80
Aspergillus niger
ATCC 15475		 609528/388

Claims (5)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von alpha-Amylase durch Vergärung von Nährmedien, die eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff und essentielle Nährstoffe enthalten, unter aeroben Bedingungen mit Hilfe eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß man Geflügelexkrement wenigstens als Teil des Nährmediwns und als Mikroorganismus Bacillus cereus ATCC 21 768, Bacillus cereus ATCC 21 769, Bacillus cereus ATCC 21 770, Bacillus cereus ATCC 21 771 oder Bacillus cereus ATCC 21 772 verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Geflügelexkrement im Nährmedium in einer Menge von 0,01 bis 10% verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Geflügelexkrement in getrockneter Form und in Form von Teilchen einer Größe von 42 μ bis 2 mm, vorzugsweise 125 bis 297 μ, insbesondere 149 bis J 77 μ, verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das Wasser, Geflügelexkrement, 0,01 bis 15% Stärke und 0,01 bis 15% Proteinmaterial enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung 1 bis 72 Stunden, vorzugsweise 25 bis 35 Stunden, durchgeführt wird.
DE19732321334 1972-05-05 1973-04-27 Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von alpha-Amylase Expired DE2321334C3 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US00250506A US3808102A (en) 1972-05-05 1972-05-05 Process for preparing alpha amylase
US25050672 1972-05-05

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2321334A1 DE2321334A1 (de) 1973-11-15
DE2321334B2 true DE2321334B2 (de) 1976-07-08
DE2321334C3 DE2321334C3 (de) 1977-03-10

Family

ID=

Also Published As

Publication number Publication date
JPS4941585A (de) 1974-04-18
CA1006837A (en) 1977-03-15
FR2183756B3 (de) 1976-04-16
DE2321334A1 (de) 1973-11-15
FR2183756A1 (de) 1973-12-21
NL7306142A (de) 1973-11-07
US3808102A (en) 1974-04-30
IT981952B (it) 1974-10-10
GB1421448A (en) 1976-01-21

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