DE2321334A1 - Verfahren zur herstellung von alphaamylase - Google Patents
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Description
Verfahren zur Herstellung von α-Amyläse durch Fermentation
mit Mikroorganismen sind bekannt. Bei diesen Verfahren werden im allgemeinen Nährmedien, die verschiedene Quellen von
Stärke, Proteinen und essentiellen Nährstoffen enthalten,
hergestellt, sterilisiert, gekühlt und mit Kulturen verschiedener Bakterien, Hefen oder Schimmelpilzen geimpft, die
a-Amylase durch Verstoffwechsel η des beim jeweiligen Verfahren
verwendeten Nährmediums zu bilden vermögen. Bei den Entwicklungen auf diesem Gebiet handelt es sich gewöhnlich
um das Auffinden verbesserter Nährmedien und Züchtungsbedingungen für die jeweiligen Mikroorganismen, die a-Amylase
bilden. Nach diesen Verfahren hergestellte a-Amylasen sind für ihre Fähigkeit,Stärke zu Zuckerprodukten wie Dextrin,Glucose,
Maltose usw.zu hydrolysieren,bekannt und werden für zahl reiche
kommerzielle, technische, pharmazeutische und wissenschaftliche
Zwecke verwendet. Von diesen Anwendungen seien erwähnt: Herstellung von Nahrungsmitteln, Genußmitteln und
Getränken, Herstellung von Klebstoffen, Bekämpfung der Verunreinigung der Umwelt, Herstellung von Verdauungsmitteln,
Verwendung für die Behandlung von Krankheiten und als HiI fsstoffe
in der Grundlagenforschung, z.B. bei der Forschung zur.Aufklärung der Strukturen verschiedener komplexer Kohlenhydrate.
Repräsentative Nährmedien, Mikroorganismen,
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Fermentationsverfahren und Anwendungen für α-Amy]ase werden in den USA-Patentschriften 2 695 865, 3 0]2 944 und 3 4]A
beschrieben.
Die Erfindung ist auf die Verwendung neu gefundener Bacillus-Stämme
für die Herstellung von oc-Amylase gerichtet. Diese
Stämme können aus Geflügelexkrementen nach den nachstehend
beschriebenen Verfahren gezüchtet werden und erhielten die
Bezeichnungen Bacillus cereus A.T.C.C. Nr. 21768, Bacillus
cereus A.T.C.C. Nr. 21769, Bacillus cereus A.T.C.C.
Nr. 21770, Bacillus cereus A.T.C.C. Nr. 21771 und Bacillus
cereus A.T.C.C. Nr. 21772.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Peststellung,
daß die Bildung von a-Amylase durch Mikroorganismen der Gruppen Pseudomonas, Corynebacterium, Aspergillus,
Cellumonas, Bacillus und Candida auf Nährmedien, die übliche Quellen von Stärke, Protein und essentiellen Nährstoffen
enthalten, die nachstehend beschrieben werden, stark gesteigert werden kann, wenn wenigstens ein Teil, des Nährmediums
aus Geflügelexkrement besteht. Eine besonders gute Produktion von a-Amylase in üblichen Nährmedien, die einen
Anteil an Geflügelexkrement enthalten, wird durch Verwendung
der vorstehend genannten Bacillus-Stamme Bacillus cereus
A.T.C.C. Nr. 21768 bis 21772 erzielb. Eine vollständige Beschreibung der Morphologie jedes diesel1 Mikroorganismen wird
später in dieser Beschreibung gegeben. Beschrieben wird ferner, wie a-Ainylase unter Verwendung von Geflügelexkrement
als einzige Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff
erzeugt werden kann. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist ein verbessertes Nährrnedium für die Züchtung der Mikroorganismen, die Fermentgemioche, die reich an a-Amylaoe
sind, zu bilden vermögen. In diesem Zusammenhang wurde gefunden,
daß Weizenkaff eine außergewöhnlich gute Nährstoff-
98 46/10
-J- 232133A
quelle insbesondere für-den für die Zwecke der Erfindung
verwendeten Stamm Bacillus cereus Nr. 21768 ist. Ferner wurde gefunden, daß Glycin die Produktion von a-Amylase
durch die neuen erfindungsgemäß verwendeten Stämme in einem
Nährmedium, das gleichzeitig Weizenkaff enthält, steigert.
Bei den vorstehend genannten Fermentationsverfahren "werden
Kulturmedien erhalten, die sich zur Gewinnung der a-Amylase
leicht nach üblichen Fällungs-, Filtrations- und Austauschverfahren verarbeiten lassen. Die Fällung wird gewöhnlich
durch Zusatz eines Salzes eines zweiwertigen Kations erreicht, das die a-Amylase koaguliert. Nach der Ausfällung
wird die nach den Verfahren gemäß der Erfindung erzeugte a-Amylase äußerst einfach durch Anwendung der Austauschchromatographie
an DEAE-CeIIuI öse (Diäthylaminoäthylcellulose)
unter Verwendung von KCl oder anderen Elutionslösungsmitteln
isoliert.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nachstehend
ausführlich beschrieben.
Die a-Amylasenbestimmung zum Nachweis der Erfindung erfolgt
vorzugsweise nach den allgemeinen Methoden von Fischer und Stein (Biochemical Preparation, "]_, i960), bei denen die
Aktivität von a-Amylase unter Verwendung von Dinitrosalicylsäure
(DNS) gemessen wird.
Als Substrat wird bei dieser Methode eine l^ige Lösung von
löslicher Stärke (Itoredux Standard, B. Siegfried & Co.,
Zofingen, Schweiz) in siedendem Wasser, mit 0,02-molarem
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Natriumg]ycerophosphat-HC]-Puffer auf pH 6,9 eingestellt/
verwendet. Als Abbruchmittel dient eine alkalische Lösung von Dinitrosalicy]säure, hergestellt durch Suspendieren von
20 g 3,5-Dinitrosalicylsäure in 400 ml Wasser. Eine Lösung
von 52 g NaOH in 800 ml Wasser wird unter kräftigem Rühren
zugetropft. Palis erforderlich, wird in einem Wasserbad
leicht erwärmt, bis sich eine klare Lösung gebildet hat. Der Rest der NaOH-Lösung wird dann zugesetzt, worauf 600 g
Kaliumnatriumtartrat in.kleinen Portionen zugegeben werden.
Dann wird mit Wasser auf ein endgültiges Volumen von 2 Liter aufgefüllt. Die Lösung wird dann durch eine große grobe
Glasfritte filtriert und bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt.
Die eigentlichen a-Amylasebestimmungen werden wie folgt vorgenommen:
] ml Substratlösung wird zu je 1 ml der a-Amylase-Test]
Ösungen gegeben, die mit 0,002-mo.]arem Natriumglycerophosphat-HCl-Puffer
auf den g]eichen pH-Wert wie die Substratlösung eingestellt sind. Nach einer Inkubationszeit von genau
drei Minuten bei 25°C werden 2,0 ml des Abbruchreagenz zugesetzt.
Das Reagenzglas wird 5 Minuten in siedendem Wasser gehalten und dann gekühlt, worauf das Reaktionsgemisch mit
20 ml Wasser verdünnt Wird. Die Farbe wird in einem lichtelektrischen Kl ett-Summerson-Kolorimeter abgelesen, der mit *
einem Grünfilter Nr. 54 (Spektra]bereich 500 bis 570 rau) versehen
ist. Der Extinktionswert wird aus einer Standardkurve/ die mit D (+)-Maltosehydrat festgelegt worden ist, in mg
Maltose umgerechnet. Dieser Maltoselösung wird keine Stärke
und kein Puffer zugesetzt. Es wurde gefunden, daß die besten
Ergebnisse erhalten werden, wenn 1,C + 0,5 mg Maltose während
der Reaktion gebildet wird. Dies entspricht der Verwendung von 0,3 bis 1,0 mug a-Amylase im Bestimmungssystem. Von der
Anmelderin wurde eine a-Amy]aseaktivitatseinheit (DNS-Einheit)
als die Enzymmenge definiert, die 1 mg Maltose unter den oben genannten Bedingungen bildet. Palis nicht anders angegeben,
sind die Ergebnisse, die bei den in den folgenden
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Beispielen beschriebenen Tests auf a-Amylase erhalten wurden,
in DNS-Einheiten ausgedrückt.
Die Isolierung, Auswahl und Identifizierung der neuen Stämme Bacillus cereus A.T.C.C. Nr. 21768 bis 21772 kann
nach bekannten Methoden erfolgen.Bei einer dieser Methoden, die von der Anmelderin angewandt wurden, wird wie folgt gearbeitet:
Homogenisierter Hühnermist, der auf eine Korngröße von 42 /u oder größer gebracht worden ist, wird auf a-Amylase
bildende Stämme auf Platten, die mit Dextrose-Stärke-Agar unter Verwendung von 8 ml pro Platte hergestellt worden sind,
getestet. Nach 24, 48 und 72 Stunden werden die Platten mit einer Jodlösung überflutet, die aus 11g Jod, 22 g Kaliumiodid
und 500 ml destilliertem Wasser besteht. Positive Amy]asebildung wird durch eine klare oder gelbe Zone angezeigt,
die den Abbau von Stärke erkennen läßt. Der Test wird unter Verwendung von Agar, der auf einen pH-Wert im basischen,
neutralen und sauren Bereich eingestellt worden ist,
durchgeführt, jedoch ist zu bemerken, daß die sauren Testplatten zur richtigen Identifizierung eine Erhöhung des
Agargehalts von etwa 2% benötigen. Däeser Test wird dreimal
in dreifach zur Bestätigung der Aktivität durchgeführt (3 positive, 1 positives- 1 negatives-]-positives oder 3 negative
Ergebnisse). Offensichtlich verbesserte Kolonien
werden ausgewählt und erneut auf Dextrose-Stärke-Agar-Platten bei mit Phosphatpuffer eingestellten pH-Werten von 4,5,
6,8 und 8,4 erneut getestet. Diese Stämme werden durch den hohen pH-Wert von 8,4 oder den niedrigen pH-Wert von 4,5
nicht inhibiert. Die fünf isolierten Stämme sind bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C, hinterlegt,
und erhielten die Bezeichnungen Bacillus cereus A.T.C.C.
309846/107A
Nr. 23768, Baci3 3us cereus A.T.CC. Nr. 23769, Baci33us
cereus-A.T.C.C. Nr. 23770, Baci33us cereus A.T.C.G. Nr.23773
und Baci3 3us cereus A.T.C.C. Nr. 23 772. Diese Stämme haben
die nachstehend genannten Ku3tureigenschaften und mikroskopischen
Eigenschaften.
309846/ 1074
CJ
O
(D
OO
Λ.T.CC. Nr.
Quelle
Quelle
Näh medium
23768
Putenmist Hühnermist
Dextrose-Stärke· Agar
23770
Züchtungstemperatur,, 37 0C
pH-Wert der Kultur 6,8 Gramfärbung grampositiv 3 Ai
Sporen
Pepton-Eisen
Hydrolyse von
Stärke
Stärke
Lackmusmilch
Morphologie der
Kolonie
Kolonie
Indol
Voges-Proskauer
Nitratredukt ion
Methyl rot
exzentrisch +, 1,5 U
- 1 Tag Reduktion 5 Tage
weiß
schleimig glänzend
- kein Gas Hühnermist
Putennist
Putennist
23773
Hühnermist
21772
Hühnermist Putenmist
Hühnermist
Putenmist Putennist Putenmist
-Dextrose-Stärke- Dextrose-Star- Dextrose-Stär- Dextrose-Agar
ke-Agar ke-Agar Stärke-Agar
37 37 37
6,8*
grampositiv
- 1/2 - 2 U
- 1/2 - 2 U
exzentrisch
+ , 2 U-
+ , 2 U-
- 1 Tag
alkalisch
Tage
alkalisch
Tage
grau
weiß
schleimig
weiß
schleimig
6,8 . 6,8
grampositiv grampositiv 1,3 U Ketten 1 -" V^ U
"vaculated"
"vaculated"
exzentrisch exzentrisch +, 1,5 U +, 0,75 U
- 1 Tag
Hydrolyse
5 Tage
Hydrolyse
5 Tage
weiß
schleimig
ausbreitend
dunkel mit
Alterung
ausbreitend
dunkel mit
Alterung
- 1 Tag
Hydrolyse
5 Tage
Hydrolyse
5 Tage
weiß
schleimig
glänzend
6,8
grampositiv 3 U
exzentrisch + , 1,5 U
- 1 Tag Hydrolyse
5 Tage
weiß
schleimig sich ausbreitend 1^
O)
A.T.C.C. Nr.
23768
23769
23770
23773
23772
Koser-Citrat
Motilität
Kata3ase
Ge3atine-Stat
Motilität
Kata3ase
Ge3atine-Stat
3acj]]us cereus A.T.C.C. Nr. 23768
Koh3enhydrat-Daten , Sauer
Inosit , - +
Ce]]obiose +
Adonit . . - +
Sorbit - +
DuJcit - +
Inu3 in +
Gjycerin ' - ■ -
Rhamnose - 3 eicht Sa]icin
Mannit
Mannit
Ma] tose +
Saccharose +
Dextrose + + Lactose
Wachstum
Gas
Inosit - ' -
Cellobiose + +
Adonit - "
Sorbit
Dulcit
Inulin - + -
Glycerin +
SaI icin . _ _
Mannit -
Maltose + +
Saccharose + + +
Dextrose + + -
Lactose - +
Mannose + + +
Inosit - + -
Cellobiose + + -
Adonit - -
Sorbit - +
Dulcit - +
Inulin +
Glycerin - -
SaIicin - + ^
Mannit - + -
Maltose + +
Saccharose + +
Dextrose + + -
Mannose + +
309846/1074
- JO -
Inosit
Cellobiose +
Adonit
Sorbit
DuIcit
Inul in
Glycerin - +
Salicin . -
Mannit - +
Maltose +
Saccharose +
Dextrose + +
Wachstum
Gas
Inosit - +
Cellobiose ~ +
Sorbit + + '
Du] c it - +
Inulin -
Glycerin + + Salicin
Mannit - +
Maltose +
Saccharose +
Dextrose + +
Lactose -
Wachstum
Gas
309846/1074
- 33 -
Beispie] 3
Das a]3 gemeine Verfahren zur Reinigung der von den fünf erfindungsgemäß
verwendeten Stämmen von Bacillus cereus gebi3deten a-Amy3ase wird nachstehend beschrieben.
Stufe Aktivität Aktivität/mg Reini- Ausbeute
3yophi3isier- gung . %
tes Materia]
3) 3 Liter 30'Einhei- 0 300$
Amyläse ten/m] T.A.=
WBF 30 000 EinKultur heiten
WBF 30 000 EinKultur heiten
2) Dialyse 34 Einhei- 0,3.JX \\yf>
gegen Ca3eium- ten/m3 Ϊ.Α.=
acetat; NaC3 34 000
3) gefrierge- - 8,3 g 3 - 4 Ein- _ trocknet heiten/mg T.A.
= 33 200
4) erneut - ' 2,2 g - 4 Ein- 5)5X
ge3öst, 60$ heiten/ m| T.A.
(NH,)oS0, = 30 800
Fä3Jung .
5)Hydroxyapatit 45 Einhei- - · - 72%
Vo3.= 480 m3 ten/m3
480 m3 =
Vo3umen T.A.
23 600
6) Dia3yse und 23 0 mg - 3 00 25X
Gefriertrock- Einheiten/ mg
nung . T.A. = 23 000
Dieses Verfahren wird im einze3nen wie fo3gt durchgeführt:
3. Liter des Uberstandes, auf dem jeder Mikroorganismus gezüchtet
wurde, wird auf Amy3ase-Aktivität getestet. Hierbei werden 20 bis 30 Einheiten pro ml gefunden. Jede Lösung
wird einzeln zwei Tage gegen 32 1 eines Puffers aus 0,01-mo3aretn.
Calciumacetat und 0,]$ Natriumchlorid dialysiert.
309846/1074
Während der Dialyse wird dieser Puffer viermal bis fünfmal
gewechselt. Die dia]ysierten Lösungen v/erden der Bestimmung
unterworfen, wobei ] bis 45 Einheiten pro ml gefunden wurden.
Jede dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. Das trockene Materia] (etwa 4 bis 8,3 g) wird in JOO ml destilliertem
Wasser suspendiert. Zu jeder Lösung wird (NH^)2SO2, bis zu 60% Sättigung gegeben. Proteine läßt man
über Nacht in der Kälte ausfällen. Jede Suspension wird
zentrifugiert. Im überstand wird keine nennenswerte Amylase-Aktivität
festgestellt, so daß der überstand verworfen wird.
Das körnige Material wird erneut in 50 ml des Calciumacetat-Natriumchlorid-Puffers
suspendiert. Bei diesen Lösungen werden Amylase-Aktivitäten von 400 bis 600 Einheiten/ml festgestellt.
Sie sind bereit für die weitere Reinigung durch Säulenchromatographie an Hydroxyapatit als Adsorptionsharz.
Von der Anmelderin wird jedoch empfohlen, zunächst eine geringe
Menge jedes Materials (10 ml mit 90 Einheiten/ml) auf
die Säule aufzubringen, um die Funktionsfähigkeit des Systems zu prüfen. Für jeden Test wird die Säule zuerst mit 0,1-molarem
Natriumphosphatpuffer bei pH 7*0 eluiert, wobei sich
im UV-Spektrum im allgemeinen zwei Absorptionsmaxima bei
280 rau ergeben, die in den folgenden Elutionsprofilen als
A und B bezeichnet werden. Diese Maxima haben jedoch, wenn überhaupt, nur eine geringe Amylase-Aktivität. Die Säulen
sollten daher mit 0,5-molarem Natrjumphosphatpuffer bei
pH 7*0 eluiert werden. Hierbei wird ein drittes Eluat mit
einem Proteinmaximum C erhalten, das etwa * 400 bis 600 Einheiten
der insgesamt 950 Amylaseeinheiten enthält, die zu Beginn auf die Säule gegeben worden sind. Das Elutionsprofil
für die Proteinmaxima jedes neuen Stammes ist in Figur 1 bis Figur 5 dargestellt.
309846/1074
Beispie] 4
α-AmyJase-Aktivität der neuen Stämme im Vergleich zu bekannten Stämmen, die α-Amylase bilden
Isolierte Sporen jedes der auf die in Beispiel 2 beschriebene V/eise isolierten Mikroorganismen Bacillus cereus A.T.C.C
Nr. 21768 bis 21772 werden im Vergleich zu den bekannten
Amylase bildenden Mikroorganismen Aspergillus niger A.T.C.C.
Nr. 15^75 und Bacillus amyloliquefaciens A.T.C.C. Nr. 2^843
auf ihre Fähigkeit zur Bildung von α-Amylase untersucht.
Je eine Impfnadelmenge der Sporen wird von den Dextrose-Stärke
-Agar -Schrägkultur en der neuen Mikroorganismen, und
der beiden bekannten a-Amylase bildenden Mikroorganismen in einzelne Erlehmeyerkolben überführt, die 150 ml einer
Spizzenbrühe oder einer Weizenkleie oder einer Bacillus-Amylase enthalten. Etwa 1 bis 5 ml eines vegetativen 16-Stunden-Inoculums,
dessen pH Wert auf 6,.8 eingestellt ist,
werden verwendet. Die Kolben werden dann 15 Minuten in Wasser von 50°C gestellt und gekühlt, und der Inhalt wird
quantitativ in einen I50 ml-KoIben überführt. Die Lösung
wird mit 2,0 N-Natriumhydroxydlösung auf pH 4,8 eingestellt,
in einen 5OO ml-ErIenmeyerkolben überführt und auf etwa
200 ml verdünnt. Der Inhalt wird dann in einen 250 ml-Meßkolben
überführt und auf das gewünschte Volumen verdünnt. 200 ml werden dann 15 Minuten bei 2000 UpM zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird in einen trockenen Kolben dekantiert. 50 ml dieser Flüssigkeit wird in ein JO ml-Reagenzrglas
pipettiert. Nach Zugabe von 5 ml 5*0 N-SaIzsäure
wird das Reagenzglas lose verschlossen, in einem siedenden
Wasserbad drei Stunden erhitzt und dann in einem Eisbad gekühlt.
Der Inhalt des Glases wird in einen 100 ml-Meßkolben
überführt und mit 2,0 N-Natriumhydroxyd bis zum Umschlagspunkt von Phenolphthalein eingestellt. Nach Verdünnung auf
das gewünschte Volumen wird der Wert für reduzierenden Zuk-
309846/1074
ker, gerechnet als Dextrose, an einem aliquoten Teil der
endgültigen Lösung bestimmt. Unter diesen Bedingungen erreichte der a-Amylase-Gehalt der Kulturen von Bacillus
cereus A.T.C.C. 21768 bis 21772 ein Maximum in etwa 20 Stunden,
während der Amylase-Gehalt der beiden bekannten Kulturen
ihr maximales Wachstum erst nach etwa 40 Stunden erreichten. Die Amylase-Erzeugung bei diesen Versuchen, ausgedrückt
in DNS-Einheiten, ist in der folgenden Tabelle genannt .
| Nährmedium | Spizzen- | Weizen | Bacillus- |
| brühe | kleie | Amylase | |
| 21768 | * 2,93 | 3,5 | 0,7 |
| 21769 | 2,37 | 9,0 | 0,7 |
| 21770 | 8,25 | 35,2 | 0,7 |
| 21773 | 3,50 | 4,62 | 0,7 |
| 21772 | 2,97 | 9,0 | 0,7 |
| Aspergillus niger 15475 | 2,0 | 3,25 | 0 |
Bacillus amyloliquefaciens
23843 2,0
2,8
7,0
Spizzenbrühe: Man kocht 200 g geschälte und zu Scheiben geschnittene
Kartoffeln 30 Minuten in 1 Liter Leitungswasser. Man filtriert durch Watte,
gibt 5,0 mg MnSOhZU, stellt auf pH 6,8 ein und füllt mit Leitungswasser auf 1 Liter auf.
Weizenkleie-PiI trat :
100 g Weizenkleie (Hamico, Shorts, Red Dog),
300 ml Leitungswasser. Man autoklaviert.,
filtriert durch Baumwollgaze, gibt 200 ml
Leitungswasser zu und autoklaviert.
309846/107/»
Bacillus-Amylase: L-Leucin 10 mg/]
K2HPCr4 14 g
Natriumcitratdihydrat 1 g
Ammoniumsulfat 2 g
Magnesiumsulfathepta-
hydrat 0,2 g
1 Liter Wasser
pH 7 ·
getrennt autoklaviert - 5g Glucose
Figur 6 zeigt eine Kinetik-Kurve für den erfindungsgemäß verwendeten neuen Samm Bacillus cereus A.T.C.C. Nr. 21768.
Die Kinetik-Kurven für die anderen erfindungsgemäß verwendeten
vier neuen Stämme von Bacillus cereus sind fast identisch mit der Kurve für den Stamm 21768. Eine Analyse
der Kurven zeigt daher, daß die Reaktionen dieser Stämme im allgemeinen linear bis zu dem Punkt verlaufen, an dem
2,0 Amy].ase-Einheiten gebildet worden sind. An diesem Punkt wird die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich geringer. Daher
muß man sicher sein, daß die a-Amylase auf eine Konzentration
verdünnt ist, mit der sie auf dem linearen Teil der Reaktion liegt. Unter den von der Anmelderin angewandten
Bestimmungsbedingungen müßte die Aktivität geringer als 2,0 Einheiten/ml sein.
Jedes Enzym wird drei Minuten bei 25°C, jedoch bei verschiedenen pH-Werten getestet. Sowohl die Enzymlösung als
auch die l^igen Stärkelösungen werden in einer Pufferlösung
bei dem pH-Wert hergestellt, bei dem die a-Amylasebestimmung
durchgeführt werden soll. Die Ergebnisse für
309846/1074
Bacillus cereus A.T.C.C. Nr. 23768 sind in Figur 7 dargesteilt.
Auch hier sind die Kurven für die anderen vier Stämme fast identisch. Die Untersuchung der pH-Kurven
zeigt maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 7*5· Im allgemeinen sind noch etwa 30 bis ko% der maxima3en
Aktivität bei pH 3 0,5 vorhanden.
Beispie3 7
Einf3uß einer Dängeren Wärmebehand]ung auf die Stabilität
der Aktivität der Amylase
Jede Amy3ase-Lösung wird für die Zeit 0, 3 Stunde, 2 Stunden,
3 Stunden usw. bei 70 C gehalten. Die α-Amylase-Proben
werden dann gekühlt und bei 25°C der Bestimmung unterworfen. Die Ergebnisse dieser Tests sind für jeden Stamm sehr ähnlich
und in Figur 8 dargestellt. Nach einer Stunde bei 70°C ist
kein Ver3ust an Aktivität eingetreten. Nach zwei Stunden ist die Aktivität der a-Amy3ase um etwa 20$ geringer, und
nach 3-stündiger Inkubation ist die Enzymaktivität um gesunken.
Beispie3 8
Die von jedem der fünf neuen Stämme gemäß der Erfindung gebildete
α-Amylase wird der vorstehend beschriebenen Bestimmung bei verschiedenen Temperaturen unterworfen. Die
ct-Amylaselösungen und Stärkesubstrat]ösungen werden vor
Beginn der Reaktion 5 Minuten auf die Bestimmungstemperatür
vorgewärmt. Die Ergebnisse dieser Tests sind fast identisch und in Figur 9 graphisch dargeste31t. Die Untersuchung
dieser Temperaturkurven zeigt, daß ein fast linearer Anstieg
der Aktivität der Amylase von 25 auf 45°C vorhanden
ist. Im allgemeinen ist der Anstieg der Aktivität der
309846/1074
- 37 -
Amylase von 45 bis 7O°C nur gering, und bei 80°C ist die
Aktivität der a-Amylase im allgemeinen um 3 0 bis J>0% geringer
geworden.
Es werden weitere Versuche durchgeführt, bei denen die
Aktivität der durch die neuen Stämme gemäß der Erfindung gebildeten a-Amylase mit einem bekannten handelsüblichen (Novo) a-Amylase bildenden Enzym verglichen wird.
Aktivität der durch die neuen Stämme gemäß der Erfindung gebildeten a-Amylase mit einem bekannten handelsüblichen (Novo) a-Amylase bildenden Enzym verglichen wird.
309846/1074
Tab e 1 1 e
Vergleich von Novo-Amylase und Amyläse, die durch Bacillus
cereus A.T.C,C. Nr. 21768 gebildet wurde.
Spezifische Aktivität,
DNS-Einheiten/mg Enzym
DNS-Einheiten/mg Enzym
Optimaler pH-Wert
Optimale Aktivität bei p„ 2,5
P11 8,5 PH9,5
Po 10,5
bei
bei
bei
bei
bei
No vo Amyläse
20 5,5
O*
O*
51* 5% ..
2,5$
Einfluß der Temperatur auf die Aktivität
optimale Temperatur, 0C 45 Anstieg der Aktivität beim
Optimum über die Aktivität bei 25 C 43*
3) Optimale Aktivität bei 80°C 60*
Einfluß der Temperatur auf die Stabilität
Aktivitätsverlust
Aktivitätsverlust
1) nach 15 Minuten bei 70 C 7*
2) nach 30 Minuten bei 700C 8o*
3) nach einer Stunde bei 700C 94*
4) nach 2 Stunden bei 70°C
Einfluß von hoher Temperatur und hohem ppj-Wert auf die Stabilität
der Amylase
1) Verlust nach 15 Min. bei pR 8,5
2) Verlust nach 30 Min. bei pjj 8,5
3) Verlust nach 15 Min. bei PH 9,5
4) Verlust nach 30 Min. bei Pjj 9,5
5) Verlust nach 15 Min. bei pH 10,5
6) Verlust nach 30 Min. bei p« 10,5
κ) roh 21768
14
4,5 10% 12%
4o*
9%
60
I6o* 78*
o%
o%
o%
0% 0%
21%
60*
gereinigt 21768
100
5,5
42*
49*
36*
5%
60
116* 58*
0% 78* 95*
Da das Enzym bei' hoher Temperatur (70°C) sehr instabil
war, wurde der kombinierte Effekt von hoher Temperatur und hohem ppj-Wert nicht untersucht.
Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Amylase nicht
untersucht.
09846/1074
Vergleich von Novo-Amylase und Amy läse, die durch Bacillus
cereus A.T.C.C. Nr. 21?69 gebildet wurde.
Spezifische Aktivität, DNS-Einheiten/mg Enzym
Optimaler pH-Wert
Optimale Aktivität bei p„ 2,5
bei Pn 8,5
■ bei pH 9,5
bei pH 10,5
Einfluß der Temperatur auf die Aktivität
1) optimale Temperatur, 0C
2) Anstieg der Aktivität beim Optimum über die Aktivität bei 25°C
J>) Optimale Aktivität bei 8o°C
Einfluß d'er Temperatur auf die Stabilität
Aktivitätsverlust
Aktivitätsverlust
1) nach 15 Minuten bei 70 C
2) nach JO Minuten bei 700C
5) nach einer Stunde bei 700C
4) nach 2 Stunden bei 700C
| Novo- | roh | gereinigt |
| Amylase | 21769 | 2I769 |
| 20 | 5 | 50 |
| 5,5 | 5,0 | '5,5 |
| Og | 45g | |
| 51g | 60$ | 55g |
| 5g | 25g | 24$ |
| 2,5g | 8g | Og |
43g
60$
7g
80g
94g
80g
94g
150g 70$
log 22g
60
135g 52g
70g
4og 70g
95g
Einfluß von hoher Temperatur und hohem pjj-Wert auf die Stabilität
der Amylase
1) Verlust nach 15 Min. bei pH "8,5
2) Verlust nach JO Min. bei pjj 8,5
5) Verlust nach 15 Min. bei Pn 9,5
4) Verlust nach ^O Min. bei pH 9,5
5) Verlust nach 15 Min. bei pH 10,5
6) Ver3.ust nach JO Min. bei pH 10,5
x)
xx)
0%
5g 20g 42g 40g 60g
Da das Enzym bei hoher Temperatur (70 C) sehr instabil war, wurde der' kombinierte Effekt von hoher Temperatur
und hohem pjj-V/ert nicht untersucht.
'Aus dem gleichen Grunde wie für Novo-Amylase nicht untersucht.
30984 6/AQ7
Vergleich von Novo-Amyläse und Amyläse, die durch Bacillus
cereus A.T.C.C. Nr. 21770 gebildet wurde.
Novo- roh gereinigt
Amylase 21770 21770
Spezifische Aktivität,
DNS-Einheiten/mg Enzym 20 10 72
Optimaler pH-Wert ■ 5,5 4,5 4,5
Optimale Aktivität bei pH 2,5 0% Κθ% 2β%
bei pH 8,5 5V% *5% J>0%
bei PH 9,5 5% 1)5% 20%
bei Pjj 10,5 2,5$ 10# 5%
Einfluß der Temperatur auf
die Aktivität
die Aktivität
optimale Temperatur, 0C 45 50 50
Anstieg der Aktivität beim
-Optimum über die Aktivität ^3% &5% 90%
bei 25°C
3) Optimale Aktivität bei 80°C 60% 10% 12%
3) Optimale Aktivität bei 80°C 60% 10% 12%
Einfluß der Temperatur auf
die Stabilität >
die Stabilität >
Aktivitätsverlust
1) nach 15 Minuten bei 70 C 1% 0% 0%
2) nach 30 Minuten bei 7O0C 80% 0% 15%
3) nach einer Stunde bei 70°C 94$ 5% 95%
4) nach 2 Stunden bei 70°C
Einfluß von hoher Temperatur und hohem pj^-Wert auf die Stabilität
der Amylase κ) xx)
1) Verlust nach I5 Min. bei pH 8,5
2) Verlust nach JO Min. bei pH 8,5
J>) Verlust nach I5 Min. bei P1^ 9,5 10%
4) Verlust nac.i JO Min. bei P11 9,5 15jg
5) Verlust nach I5 Min. bei pH 10,5
6) Verlust nach ^O Min. bei pH 10,5
K^ Da das Enzym bei hoher Temperatur (7O0C) sehr instabil
war, wurde der' kombinierte Effekt von hoher Temperatur und hohem p^-Wert nicht untersucht.
^Aus dem gleichen Gründe wie für Novo-Arnylase nicht
untersucht.
30 9846/1074
. - 21 -
Tabelle 4 ' ■
Vergleich von Novo-Amylase und Araylase, die durch* Bacillus
cereus A.T.C.C. Nr. 21771 gebildet wurde.
Spezifische Aktivität,
DNS-Einheiten/mg Enzym
DNS-Einheiten/mg Enzym
Optimaler pH-Wert
Optimale Aktivität bei
Optimale Aktivität bei
| PH | 2, | 5 | Novo- | roh | gereinigt | |
| 8, | 5 | Arnylase | 21771 | 21771 | ||
| ät, zym |
PH | 9, | 5 | 20 | 20 | 85 |
| % | 10 | *5 | 5*5 | 5*5 | 5*5 | |
| bei | 0% | 52# | 42$ | |||
| bei | 51% | 48# | ||||
| bei | 5% | 30% | 20# | |||
| bei | 2,5% | 15% | y% | |||
Einfluß der Temperatur auf
die Aktivität
die Aktivität
1) optimale Temperatur, °C 45 55 60
2) Anstieg der Aktivität beim Optimum über die Aktivität
bei 25°C · . ft W 90# 90%
3) Optimale Aktivität bei 80°C 60^ 10% 68%
Einfluß!der Temperatur auf
die Stabilität >
die Stabilität >
Aktivitätsverlust
1) nach 15 Minuten bei 70 C 1% 0% 5%
2) nach J50 Minuten bei 700C . 80# 1C$
3) nach einer Stunde bei 700C 9k% 25%
4) nach 2 Stunden bei 700C Jß%
Einfluß von hoher Temperatur und hohem pjj-Wert auf die Stabilität
der Amylase · K)
1) Verlust nach 15 Min. bei pH 8,5 5^
2) Verlust nach 30 Min. bei P11 8,5 20$
3) Verlust nach 15 Min. bei pH 9,5
4) Verlust nach 30 Min. bei pH 9,5
5) Verlust nach 1.5 Min. bei pH 10,5 35$
6) Verlust nach 30 Min. bei pH 10,5 60%
K' Da das Enzym bei hoher Temperatur (70°C) sehr instabil
war, wurde der'kombinierte Effekt von hoher Temperatur
und hohem ptr-Wert nicht untersucht.
^^^Au.s dem gleichen Grunde wie für Novo-Amylase nicht
untersucht.
309846/1074
T a b e 1 1 e
Vergleich von Novo-Amylase und Amylase, die durch Bacillus
cereus A.T.C.C. Nr. 21772 gebildet wurde.
Spezifische Aktivität, DNS-Einheiten/mg- Enzym
Optimaler pH-Wert -
Optimale Aktivität bei pH 2,5
bei Pit 8,5
bei
bei pH 10,5 Novo-Amylase
20
5,5
5,5
PH9,5
Einfluß der Temperatur auf die Aktivität
1) optimale Temperatur, 0C
2) Anstieg der Aktivität beim Optimum über die Aktivität bei 25°C ■ -ft
5) Optimale Aktivität bei 80°C 51g
5g
2,5g
5g
2,5g
60g
roh 21772
4,5
75g
60g
42g
12g
120g
Einfluß von hoher Temperatur und hohem p^-Wert auf die Stabilität
der Amyläse '
1) Verlust nach 15 Min. bei pH 8,5
2) Verlust nach 30 Min. bei P11 8,5
5)' Verlust nach 15 Min. bei Pu 9,5
4) Verlust nach 30 Min. bei pH 9,5
5) Verlust nach 15 Min. bei pH 10,5
6) Verlust nach 50 Min. bei pH 10,5
x)
log
25g 22g ?6g
28g 62g
gereinigt 2I772
120
4,5 70g 48g
Og
60
lOOg 62g
| Einfluß der Temperatur auf die Stabilität Aktivitätsverlust 1) nach I5 Minuten bei 70 C |
7g | 5* | 8g |
| 2) nach 30 Minuten bei 700C | 80g | 8g | 16g |
| 5) nach einer Stunde bei 7O0C | 94g | 22g | 4og |
| 4) nach 2 Stunden bei 700C | - | 30g | 88g |
xx)
Da das Enzym bei hoher Temperatur (7O0C) sehr instabil
war, wurde der'kombinierte Effekt von hoher Temperatur
und hohem Pjj-Wert nicht untersucht.
ν
Aus dem gleichen Grunde wie für Kovo-Amylase nicht
Aus dem gleichen Grunde wie für Kovo-Amylase nicht
untersucht. ·
309846/1074
Um die Fähigkeit der fünf Mikroorganismen zur Bildung von a-Amylase in anderen Medien zu veranschaulichen, wurde ein
Nährmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Kohlenstoffquelle (siehe Tabelle 6) 2 bis
Stickstoff aus Harnstoff 1%
CaCO3 2#
CaCl2 - 0,1%
MgCl2 0,l#
FeCl2 . 0,
2
Wasser 1000 ml.
Wasser 1000 ml.
Je 300 m3 dieses Mediums wurden in 500 mJ-Schütte]koDben
mit Mischb3echen gegeben und 3 5 Minuten mit Wasserdampf in den Ko3ben bei 3230C steri3isiert. Baci3 3us cereus
A.T.C.C. Nr. 23 768 bis 23772 wurden unabhängig in diese
Nährmedien geimpft und. unter aeroben Bedingungen 48 Stunden bei 37°C und einer Geschwindigkeit des Rührers von 250 bis
900 UpM, bei der etwa 40 bis 60 3 Luft/Minute eingerührt
werden, -gezüchtet. Der pH-Wert des Systems variiert von 6,0 bis 9,0.
Die Paste der Mikrobienze33 en wird bei -200C ge3agert. Die
Paste wird dann mit einem Bakterienhomogenisator bei 5°C zerk3einert, worauf 0,03 m3 Tris-Puffer, 30 3 Äthy3endiamintetraessigsäure
(EDTA) (3^ und 8 m3 Mercaptoäthano3 zugesetzt
werden. Der das Protein entha3tende überstand wird dann mit Po3yäthy3eng3yko3 in verschiedenen Konzentrationen
von 50, 5. 30, 3 5 und 20% fraktioniert. Jedes Produkt der
Fraktionierung wird vor dem Zentrifugieren wenigstens eine Stunde stehen ge3assen. Die in jedem Ku3turmedium angehäufte
Menge der oc-Amy3ase ist nachstehend in Tabe3 3e 6 genannt
.
3 09846/1074
T a b e
Koh]enstoffque]le
Weizenkaff WeizenkJeie
zerstoßenes Getreide Maisschrotmeh] Haferschrotmeh] Roggenschrotmeh]
zerstoßener Reis
Maisque]Jwasser Kartoffe]stärke
WeizenkJeie Sojabohnenö] SojaboJanensGhrotmeh]
Zein
Baumwo]]saatmeh] Casein
Weizenkaff WeizenkJeie
zerstoßenes Getreide Maisschrotmeh] Haferschrotmeh] Roggenschrotmeh]
zerstoßener Reis
Maisque]Jwasser Kartof f-eJ stärke Weizenk]eie
Sojabohnenö] Zein
Baumwo]]saatmeh] Kasein
Weizenkaff Weizenk]eie
zerstoßenes Getreide Maisschrotmeh] Haferschrotmeh]
Roggenschrotmeh] zerstoßener Reis
Maisque]3wasser Kartoffe]stärke
WeizenkJeie Sojabohnenö] Sojabohnenmeh]
Weizenkaff WeizenkJeie zerstoßenes Getreide Maisschrotmeh]
Konz. 21768 21770 21771 21772
| 2% | 73 | 4ϋ |
| 2% | 62 | 42 |
| 2% | 51 | 40 |
| 2% | 40 | 30 |
| 2% | 25 | 10 |
| 2% | 18 | 23 |
| 2% | 15 | 31 |
| 2% | 60 | |
| 2% | 39 | 11 |
| 2% | 59 | 28 |
| 2% | 18 | 31 |
| 2% | 18 | 15 |
| 2% | 19 | 15 |
| 2% | 40 | 10 |
| 2% | 16 | 31 |
| 4% | 192 | 93 |
| 4% | 65 | 90 |
| 4% | 64 | 113 |
| 4% | 32 | 20 |
| 4% | 26 | 28 |
| 4% | 6 | 29 |
| 4% | 11 | 30 |
| 4% | 24 | 43 |
| 4% | 44 | 39 |
| 4% | 23 | 44 |
| 4%. | 11 | 26 |
| 4% | 14 | 11 |
| 4% | 41 | 39 |
| 4% | 17 | 15 |
| 6% | 190 | 88 |
| 6% | 73 | 86 |
| 6% | 50 | 100 |
| 6% | 30 | 23 |
| 6% | 30 | 30 |
| 6% | 18 | 34 |
| 6% | 37 | |
| 6% | 36 | |
| 6% | "24 | 40 |
| 6% | 73 | 33 |
| 6% | 26 | |
| 6% | ■ nnii m | |
| 10% | 40 | 85 |
| 10% | 40 | 80 |
| 10% | 40 | 100 |
| 10% | 15 | 10 |
| 60 | 39 |
| 60 | 4.4 |
| 37 | 39 |
| 37 | 38 |
| S | 11 |
| 8 | 19 |
| 5 | 23 |
| 27. | 29 |
| 10 | |
| 19 | 19 |
| 26 | 26 |
| 10 | 11 |
| 10 | 11 |
| 50 | 41 |
| 8 | 19 |
| 40 | 44 |
| 43 | 50 |
| 33 | 39 |
| 31 | 40 |
| 11 | 16 |
| 9 | 26 |
| 11 | 23 |
| 20 | 21 |
| 19 | 30 |
| 11 | 16 |
| 11 | 16 |
| 14 | 50 |
| 50 | 23 |
| 11 | 23 |
| 43 | 60 |
| 43 | 61 |
| 38 | 54 |
| 31 | 30 |
| 12 | 19 |
| 12 | 11 |
| 11 | 19 |
| 29 | 21 |
| 19 | 29 |
| 11 | 30 |
| 10 | |
| 11 | |
| 5 | 30 |
| 3 | 33 |
| 3 | 18 |
| 1 | 21 |
309846/1074
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiterhin die Er findung in Bezug auf Änderungen im liährmedium und in den
Fermentationsbedingungen«
Etwa 500 ml Nährmedium auf Basis von Hühnermist mit folgender Zusammensetzung wurden hergestellt:
Hühnermist, 177 u 50
(NH4)2HP04 0,5 0
CaCO5 2,
E2HP CaCl
E2HPO4 0,10
2 10
MgCl2 0,010
Das Medium wurde sterilisiert, mit Bacillus cereus ATCC 21770 geimpft und 60 Stunden unter Schütteln bei
370C "bebrütet. Das hierbei erhaltene Kulturmedium (10
Vol.-0) wurde in ein Hauptkulturmedium überführt, das die oben genannte Zusammensetzung hatte und- unter Schütteln
bei 37°C bebrütet wurde. Eine 5O0ige Harnstofflösung wurde
während der Fermentation nach Bedarf zugesetzt, um den p„-^vert zwischen 6 und 8 zu halten. Hühnermist wurde zur
Ergänzung des Verbrauchs zweimal in einer Menge von 20 zugesetzt» Nach einer Fermentationszeit von 60 Stunden
betrug die Konzentration der oc-Amyiase im Kulturmedium 45 DNS-Einheiten. Der gleiche Versuch wird unter Verwendung
von Maisquellwasser an Stelle von Hühnermist wiederholt, wobei nur 26-31 DNS-Einheiten gebildet werden.
Etwa 500 ml Nährmedium auf Basis von Hühnermist mit der
folgenden Zusammensetzung wurden in einem 500 ml-Erlen-
meyerkolben sterilisiert:
Hühnermist, 177/1 30
Harnstoff 0,10
K2HPO4 0,50
3098A6/1074
CaCl2 0,50 .
MgCl2 " .0,05^
PeCl2 0,050
Bacillus cereus ATCC 21768 wurde in das Medium geimpft
und 18 Stunden bei 300C unter Schütteln bebrütet. Während
der Fermentation wurde der pH-Wert mit einer 5O0igen Harn
stofflösung bei 6 bis 9 gehalten. Nach Beendigung der Kultivierungszeit betrug die Menge der im Kulturmedium
angehäuften oc-Amylase 1000 Einheiten/ml oder etwa 3,5
beim Dinitrosalicylsäuretest. Gleiche Versuche unter Verwendung
von Maisquellwasser an Stelle von Hühnermist ergaben 1,0 DNS-Einheiteno
Beispiel 13 ■ .
Ein Kulturmedium wurde hergestellt, indem Bacillus cereus
ATCC 21772 in einem Nährmedium auf Basis von Putenmist 18 Stunden bei 300C gezüchtet wurde» Das Kulturmedium
wurde in ein Hauptkulturmedium der folgenden Zusammensetzung geimpft:
Endmelasse 1»O0
1,00
424
KH2PO4 0,20
MgS04o7H20 0,050
Fe++ 2 ppm
Mn+* ' ' . 2 ppm
CaCO, 1,50
Das Medium wurde bei 300C gehalten. Nach 10, 24 und 48
Stunden wurden 20 Putenmist zugesetzt, Nach einer Kultivierungszeit
von 72 Stunden betrug die im Kulturmedium angehäufte Menge der ct-Amylase 80 DNS-Einheiten. Bei einer
Wiederholung des gleichen Versuchs unter Verwendung von
Maisquellwasser an Stelle des Putenexkrements wurden
1,3 DNS--Einheiten erhalten. Ähnliche Ergebnisse wurden
erhalten, wenn andere Kohlenstoffquellen aus den in Tabelle
6 genannten Kohlcnfjtoffquellen ausgewählt wurden«
30 9 8 467 107
500 ml Impf kulturmedium von Bacillus cere'us ATCC 21771
in einem Medium, das 0,5$ (NH4^HPO4, 0,2$ KH2PO4,. 0,05$
MgS04.7H20 und 0,05$ Hefeextrakt enthält, werden 20 Stunden
"bei 300C geschüttelt und dann in 200 ml eines Hauptkulturmediums
in einem 1000 ml-Kolben geimpft» Das Ge
| misch wird bei 30 C | unter Schütteln bebrütet. | O | Das Nähr- |
| medium hat folgende | Zusammensetzung; | O | |
| (NH4)2S04 | 0,5$ | ||
| (NH4J2HPO4 | 0,5$' | ||
| KH2PO4 | 0,2$ | ||
| K2HPO4 | 0,7$ | ||
| MgSO4.7H2O | 0,05$ | ||
| MnCl2 | -2$ | ||
| FeCl2 | -2$ | ||
| Hefeextrakt | 0,02$ | ||
| Ptl | 7,4 |
Nach einer Permentationszeit von 24 Stunden werden 3$
Hühnerexkrement zugesetzt. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden beträgt der Gehalt an ct-Amylase im Kulturmedium
1 DNS-Einheit/mll. Ein gleicher Versuch unter
Verwendung von Maisquellwasser an Stelle von Hühnerexkrement ergab die Bildung von 0 DNS-Einheiten a-Amylase»
Mit Sojabohnenöl und Weizenlcaff ' an Stelle des Hühnerexkrements
werden ähnliche Ergebnisse erhalten.
Bacillus cereus 21769 wurde auf.die in Beispiel 14 beschriebene
V/eise in einem Medium, das 0,3$ Hefeextrakt, 0,3$ Malzextrakt und 1$ Sojabohnenöl enthielt und einen
Pjj-Wert von 6 hatte, gezüchtet und im gleichen Nährmedium
weiter gezüchtete Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden betrug der oc-Amylasegehalt im Kulturmedium.. 2 DNS-Einheiten/ml.
309846/1074
Ein Nährmedium auf Stärkebasis wurde hergestellt und mit
Bacillus cereus 21770 beimpft und 20 Stunden unter
Schütteln bei 370C bebrütet. 300 ml des hierbei erhaltenen
Kulturmediums wurden in 5 1 eines Hauptkulturmediums der folgenden Zusammensetzung geimpft:
Kartoffelstärke 0,2$
(NH4J2SO4 0,5$
(MH4)2HP04 0,5$
K2HPO4 . 0,1$
KH2PO4 . 0,2$
MgSO4ο7H2O 0,05$
Hefeextrakt . 0,02$
PH T . ■ . * ■ 6,5
Das Medium wurde in einen 10 1-Fermenter gegeben, in dem
die Fermentation bei 300C unter Zuführung von Luft in
einer Menge von 10 l/Minute und unter Rühren bei 300 UpM durchgeführt wurde. Nach einer Fermentationszeit von
20 Stunden wurde das Hühnerexkrement dem Medium aseptisch zugesetzt. Getrennt wurden 0,5$ (KH4)2HP04 zugesetzt. Der
Ρττ-Wert wurde mit 15$iger wässriger Ammoniaklösung aufrecht
erhalten. Nach 42 Stunden wurden 2 g/ml-21 Einheiten
cc-rAmylase im Kulturmedium erhalten.
Der in Beispiel 16 beschriebene Versuch wurde rait Bacillus
cereus 21771 wiederholt„ Nach 8 Stunden wurden 0,03$
Glucose zugesetzte Nach einer Feimentationszeit von 48
Stunden erreichte die Konzentration, der a-Amylase im
Kulturmedium 81 DNS-Einheiten.
Beispiel 18 .
Bacillus cereus ATCC Nr.21770 wurde in einem Medium, das
1$ Bouillon, 0,5$ NaCl und 0,1$ Hefeextrakt enthielt,
18 Stunden bei 300C und weiter in einem Hauptkulturmedium
auf die in Beispiel 13 beschriebene Weise 72 Stunden bei
3 0 9 8 4 6/1074
3O0C gezüchtet. Nach 12 Stunden wurden 0,01$ Kaliumeitrat
zugesetzt. Nach 12, 20, 30 und 40 Stunden wurde 1,0$
Hühnerexkrement zugesetzt. Nach 72 Stunden erreichte die Konzentration der a-Amylase im Kulturmedium 36 DNS-Einheiten.
Bei Wiederholungen des Versuchs unter Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen aus den in Tabelle 6
genannten Kohlenstoffquellen wurden etwa 8 Ms 14 DNS-Einheiten erhalten.
Aspergillus niger ATCC Nr.154-75 wurde in ein Nährmedium
der folgenden Zusammensetzung geimpft:
KH2PO4 0,1$
0,05$
424 0,1$
Harnstoff 0,25$
MnCl2 0,2 ppm
PeCl2 0,2'ppm
Hühnerexkrement 125 p. 2,0$
Das nach 20 Stunden bei 300C erhaltene Kulturmedium wurde
mit einem Hauptkulturmedium der folgenden Zusammensetzung gemischt:
Hübnerexkrement 125 /λ 2,0$
Propylenglykol 1»5$
Harnstoff 0,25$
KH2PO4 0,2$
MgSO4.7H2O 0,05$
Maisquellwasser 0,3$
Nach einer Kultivierungszeit von 18 Stunden bei 280C unter
Schütteln wurde das Kulturmedium mit einer Harnstofflösung
auf pH 7 bis 8 eingestellt. Nach 12, 18, 24, 36 und 48
Stunden wurden 2$ Äthanol zugesetzt. Nach 62 Stunden erreichte die Menge der a-Amylase im Kulturmedium 1,3
Einheiter ο
309846/1074
Bacillus cereus ATGC Nr.21768-wurde in ein Kulturmedium
der folgenden Zusammensetzung geimpft:
NaNO3 als Stickstoffquelle 0,6$
Hühnerexkrement 125 At
Acetatpuffer PH 6,8
CaCl2 0,1$
Das nach 24 Stunden bei 37°C erhaltene Kulturmedium wurde
mit einem Hauptkulturmedium der folgenden Zusammensetzung gemischt:
Hühnerexkrement 125 M 2,0$
Essigsäure ' 1,0$
(NH^)2SO4 0,5$
Harnstoff 0,5$ KH2PO4 . -■ 0,2$
K2HPO4 0,2$
MgSO4.7H2O ■■·■■.■■ 0,05$
Aji-eki 1,5$
Nach 72 Stunden betrug die Konzentration der a-Amylase 29 Einheiten.
Im Rahmen der Erfindung kann das Geflügelexkrement für die folgenden Zwecke dienen: 1) als ursprüngliche Quelle für
die Isolierung der neuen a-Amylase bildenden Mikroorganismen gemäß der Erfindung, 2) als einziger Bestandteil in
Nährmedien für die neuen a-Amylase bildenden Mikroorganismen
gemäß der Erfindung sowie als einziger Nährstoff für die bereits bekannten a-Amylase bildenden Mikroorganismen
aus den nachstehend beschriebenen G-ruppen und 3) als Ergänzung für bekannte Nährmedien, die für die Fermentation
sowohl der neuen Mikroorganismen geoiäß der Erfindung als
auch für zahlreiche bereits bekannte Mikroorganismen, die nachstehend beschrieben werden, verwendet werden können»
309846/1074
Die Isolierung und Identifizierung der erfindungsgemäß verwendeten neuen a-Amylase "bildenden Mikroorganismen
aus nassem (nicht-sterilem) Geflügeiexkrement wird in Beispiel 2 dieser Anmeldung beschrieben. Die Verfahren zur
G-ewinnung des im Rahmen der Erfindung als Nährstoff verwendeten getrockneten (sterilen) Geflügelexkrements werden
in der USA-Patentanmeldung Nr080 517 (7.10.1970) der Anmelderin beschrieben. Diese Patentanmeldung beschreibt
geeignete Verfahren zum Sammeln, Sterilisieren, Trocknen, Mahlen und Fraktionieren des Geflügelexkrements insbesondere
von Hühner- und Putengroßfarmen. In dieser Patentanmeldung
wird die folgende typische Analyse von Geflügelexkreme.nt genannt:
Gew.
-jo
Rohe Fette 2,4
Silicate 1,6
Kohlenhydrate 8,9
Phosphor 2,0
Calcium 10,7 Magnesium . 0,4
Harnsäure 0-5»0 Stickstoff 4,6
Rohe Pasern . 11,8
V/asser 5,0
Rest (anorganische Anionen und andere Kohlenstoff-, Wasserstoff- und Sauerstoffverbindungen)
47,6
Diese Analyse zeigt deutlich, daß Geflügelexkrement zu einem hohen Prozentsatz aus Quellen von assimilierbarem
Kohlenstoff, assimilierbarem Stickstoff und essentiellen Nährstoffen besteht. Proteinhaltiges Material ist eindeutig
in Form von rohen Fetten, Kohlenhydraten und rohen Fasern verfügbar. Die vorstehende chemische Analyse läßt
klar erkennen, daß alle Fraktionen des Geflügelexkrements Nährstoffe enthalten, jedoch wurde ferner gefunden, daß
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"besonders hohe Ausbeuten an a-Amylase erhalten werden,
wenn die Teilchengröße des Geflügelexkrements über 42 p.
liegt. Von der Anmelderin erhaltene Versuchsergebnisse zeigen, daß e3 noch vorteilhafter ist, Geflügelexkrement
einer Teilchengröße von 125 Ai zu verwenden, wobei ein
möglichst großer Anteil von Teilchen einer Größe von mehr als 177 P. besonders bevorzugt wird. Es wurde gefunden,
daß diese Wechselbeziehung bis zu Teilchengrößen von 1,7 mm gilt. Eine Festlegung auf eine Theorie, die diese
Unterschiede erklärt, ist nicht beabsichtigt, jedoch wird angenommen·, daß sie dadurch erklärt werden können, daß
die größeren Fraktionen des Geflügelexkrements einen höheren Gehalt an Kohlenhydraten haben.
Bakterien und Hefen aus anderen bekannten und sehr unterschiedlichen
Gattungen vermögen a-Amylase auf Medien zu bilden, die Geflügelexkrement als einzige oder hauptsächliche
Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und assimilierbarem Stickstoff enthalten. Die zur Bildung von
a-Amylse geeigneten Stämme von Mikroorganismen teilen außer ihrer Fähigkeit, auf einem Nährmedium z-u wachsen,
das Geflügelexkrement als hauptsächliche Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff enthält, und
a-Amylase durch Verstoffwechseln dieses Mediums zu bilden, keine leicht erkennbaren Merkmale. Unter Anwendung der
Auswahltests auf der Grundlage dieser Eigenschaften wurden von der Anmelderin zahlreiche geeignete Mikroorganismen
in der Natur und in Kultursammelstellen gefunden, ohne das Gebiet der Nachforschung zu erschöpfen.
In Tabelle 7 sind die neuen Stämme gemäß der Erfindung zusammen mit vielen bereits bekannten Mikroorganismen
sowie ihre Fähigkeit, auf Nährmedien auf Basis von Geflügelexkrement zu wachsen, genannt. Dieses Y/achstum wurde
wie folgt bestätigt: Plattenkulturen der Mikroorganismen wurden 5 Tage bei 300C bebrütet, und ein Teil des flüssigen
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Inhalts wurde nach einer Diffusionsmethode auf Filterpapier
übertragen. Der a-Amylasegehalt jedes Kulturmediums
wurde nach der Dinitrosalicylsäuremethode sowie nach anderen Methoden der Enzymologie berechnet. Ergebnisse der
chromatographischen Analyse wurden verwendet, um zu ermitteln, welche Zucker gebildet wurden. Das Wachstum der
Mikroorganismen wird durch Plattenzählungen und Verwertung von Zucker, DNA und RNA bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 7 auf einer willkürlichen, jedoch reproduzierbaren
Skala angegeben. Die verwendeten Zeichen haben die folgende Bedeutung:
ausgezeichnet
gut
ziemlich gut
+ signifikant
- Spur
+ signifikant
- Spur
Die verwendeten Nährmedien hatten die folgende Zusammensetzung:
Nährmedium Teilchen- Konzentration ) größe im Nährmedium,
Gew. -jo
42 /U 1,0
125 Al 2,0
125 JX 2,0
Ml JX 2,0
177^ 5,0
177/U 10,0 177
| A. | Hühnerexkrement |
| Β» | Hühnerexkrement |
| C. | Putenexkrement |
| D. | Hühnerexkrement |
| E. | Hühnerexkrement |
| F. | Hühnerexkrement |
| G. | Hühnerexkrement |
| CaOl2 | |
| OaGO5 | |
| MgCl2 | |
| FeCl2 |
0,1 2,0 0,1 0,1 PH 6
H. Hühnerexkrement MT ja 5,0
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| 2321334 | Nährmedium | -34 - | ■ | Λ2 jx | Konzentration im |
| Teilchen | Nährmedium, Gew.~?& | ||||
| CaCO5 | größe | 2,0 | |||
| CaCl2 | 0,1 | ||||
| MgCl2 | 0,1 | ||||
| FeCl2 | ■ | 0,1 | |||
| pH | 6 | ||||
| Io Hühnerexkrement | 3,0 | ||||
| Cellobiose | 177 yu | 3,0 | |||
| MgSO4.7H2O | 10 g/l | ||||
| KCl | 5 g/l | ||||
| CaCl0.5Ho0 | 0,2 g/l | ||||
| Hefeextrakt | 1,0 g | ||||
| Destilliertes Wasser | 1000 ml | ||||
| J.Hühnerexkrement | 5,0 | ||||
| Cellobiose | 125 /U | 0,] | |||
| MgSO4o7H2O | 10 g/l | ||||
| KCl | 5 g/l | ||||
| CaCl2.5H2O | 0,2 g/l | ||||
| Hefeextrakt | 1,0 g | ||||
| Maisquellwasser | 7,0 | ||||
| Destilliertes Wasser | 1000ml | ||||
| fCo Putenexkrement | 5.0 | ||||
| Cellobiose | 42 jx | 0,1 | |||
| MgS04o7H20 | 10 g/l | ||||
| KCl | 5 g/l | ||||
| .OaOl2.5H2Q | 0,2 g/l | ||||
| Hefeextrakt | 1,0 g | ||||
| Destilliertes Wasser | 1000 ml | ||||
| Lo Putenexkrement | 5,0 | ||||
| Cellobiose | 0,1 | ||||
| ./MgSO4.7H2O- | 10 g/l | ||||
| KCl | 5 g/l | ||||
| CaCl9.5HQ0 C-C- |
0,2. g /1 | ||||
| Hefeextrakt | 1,0 g | ||||
| Destilliertes V/asser | 1000 ml |
309846/1074
T a b e 3 3 e 7
■rer»
Nährmedium
Aspergillus awamori ATCC 11358 Aspergillus diastaticus
Aspergillus flavus ATCC 11495 Aspergillus foetidus ATCC 14916 Aspergillus niger ATCC 15475
Aspergillus oryzae ATCC 7561 Aspergillus oryzae ATCC 9102 Aspergillus phoenicis ATCC 15556
Aspergillus ruber ATCC 9 Aspergillus saitol ATCC 11362 Aspergillus terreus ATCC 11877
Aspergillus usamii ATCC 11364
Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23843 Bacillus brevis ATCC 1006 8
Bacillus cereus ATCC 944 Bacillus cereus ATCC 7004 Bacillus cereus ATCC 12480 Bacillus cereus ATCC 2176 8
Bacillus cereus ATCC 21769 Bacillus cereus ATCC 21770 Bacillus cereus ATCC 21771
3acillus cereus ATCC 21772
Candida solami ATCC 14440 Candida parapsolosis
Cellumonas biazotea ATCC Cellumonas find ATCC 15724
Corynebacteria lilium ATCC 15990 Corynebacteria hydrocarboclastus 19556
Pseudomonas aeruginosa ATCC 7706 Pseudomonc.s amyloderamosa ATCC 21262
Pseudomonas atrofaciens ATCC 9004
^ B
| C | D | E |
| + | + | ++ |
| + | ++ | ++ |
| + | + | ++ " |
| + | + | + |
| + | + | ++ |
| + | + | ++ |
| + | + | ++ |
-.35 -
F G
| J | K | + |
| + - | + | + |
| ++ | + | + |
| ++ | + | _ |
| + | _ | + |
| ++ | + | ■ ++ |
| ++ | +++ | |
- ttsi
Weitere Fermentationen werden unter Verwendung der in
Tabelle 7 genannten Mikroorganismen und der in Beispiel 21 beschriebenen Nährmedien unter den in Beispiel 21 genannten
Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch die Anteile des Geflügel
exkrement s in der in Tabelle 8 angegebenen Weise verändert werden. Das Geflügelexkrement hat eine Teilchengröße
von 42/U. Das verwendete Nährmedium enthält als Kohlenstoffquelle 7*0$ Maisquellwasser. Die durch die verschiedenen
Mikroorganismen gebildete Menge an Amylase ist in DNS-Einheiten in Tabelle 8 genannt.
309848/1074
. T a b e 3 1 e
CD
CO
OO
CO
OO
verwendete Mikroorganismen
Aspergillus diataticus Aspergi3 3us
f3avus ATCC 3 3
Aspergi3 3us foetidus ATCC 34936
Aspergi3 3us niger ATCC 3 5^75
Aspergi3 3 us oryzae ATCC 7563 Aspergi3Jus
oryzae ATCC 9302 Aspergi3 3us phoenicis ATCC 3 5556
Aspergi3 3us usamii ATCC 13564
Baci3 3us amylo3 iquefaciens
ATCC 2384J
Bacillus brevis ATCC 3 0068 Baci3 3us cereus
ATCC 3 2480 Baci3.1us cereus
ATCC 21768 Bacil3us cereus ATCC 23769
| H ü | h η | ere | χ k r | e m e η | t | 8# | 10$ | j | Puten exkrement |
5% | 8$ |
κ»
<*» |
| 1,6 | O | 20^1 | 4% | 3,1 | 2,1 | ϋί | ||||||
| 0,0 | 0,1% | 2% | 6% | O | O | O | 2,7 | 1,9 | 3,3 | OJ | ||
| 0 | 3 | 1,3 | 2,0 | 2,3 | O | O | O | 1,7 | 1,9 | 1,0 | ||
| 0 | 1,3 | 1,6 | 2,4 | 1,5 | O | O | O | 1,7 | 1,8 | 1,1 | ||
| 0 | 3,0 | 1,8 | 2,4 | 1,9 | O | O | O | 3,3 | 4,1 | 3,6 | ||
| 0 | •0 | 0,5 | 1,3 | ^^ | O | O | O | 3,9 | 3,8 | 3,0 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 1,0 | O | O | O | 3,0 | 1,3 | 1,3 | ||
| 0 | 0 | 1,4 | 1,9 | 1,0 | O | O | O | 1,1 | 3,1 | 3,0 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1,0 | O | O | 2,9 | 1,9 | 1,4 | ||
| 0 | 0 | 0 | 0 | ο' | O | O | O | 1,5 | 1,0 | 1,0 | ||
| 0,5 | 1,4 | 1,8 ' | 2,1 | 1,5 | O | O | O | 1,0 | 1,6 | 1,1 | ||
| 0,5 | 1,1 | 1,4 | 2,0 | 1,0 | 12 | O | O | 1,1 | 36 | -9 | ||
| 0,5 | 0 | 0 | 0 | O | 24 | 17 | O | 29 | 36 | 21 | ||
| 0,5 | 3 | 7 | 28 | 36 | O | 30 ' | ||||||
| ο,ι | 7 | 14 | 32 | 38 | ||||||||
Forts. Tabe3 3e
ω ο co
| 0,0 | 0,3* | 2% | k% | 30 | 8% | 3 0$ | 205g! | 33 | 39 | 8% . | 0 | |
| Baci3 3us cereus | 0 | 9 | 35 | 32 | 0 | 0 | 0 . | 25 | ||||
| ATCC 23770 | 46 | 30 | 37 | 0 | ||||||||
| Baci3 3us cereus | 0 | 9 | 33 | 40 | 0 | 23 | 0 | 29 | ||||
| ATCC 23773 | 48 | 0 | 0 | |||||||||
| Baci3 3us cereus | 0,3 | 3 3 | 38 | 43 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| ATCC 23772 | ||||||||||||
| Candida so3ami | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| ATCC 3 4440 | 0 | 0 | 0 | 3,0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| Candida parapso3osis | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| ATCC | 0 | 0 | 0 | 3,3 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||||
| Can&ida gul3 3ier- | 0 | 0 | 0 | 0 | ||||||||
| mondii ATCC 9390 | 0 | 0 | 0 | 3,3 | 0 | 0 | 0 | 0 VjJ r*r |
||||
| Cellumonas biazotea | 0 | 0 | 0 | I | ||||||||
| ATCC 486 | 0 | 0 | 3,3 | 3,0 | 0 | 0 | 0 | |||||
| Ce3 3umonas fimi | 0 | C | 0 | |||||||||
| ATCC 3 5724 | 0 | 0 | 3,3 | 2,0 | 0 | 0 | 0 | |||||
| Ccrynebacteria | ||||||||||||
| hydrocarboc3astus | 0 | 0 | 0 · | |||||||||
| ATCC 3 9556 | 0 | 0 | Q | 3,3. | 0 | 0 | 0 | |||||
| Pseudomonas | ||||||||||||
| amy3 oderamosa | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| ATCC 21262 | 0 | 0 | 0 | 3,3 | 0 | 0 | 0 | |||||
| Pseudomonas | ||||||||||||
| Atrofaciens | 0 | 0 | 0 | |||||||||
| ATCC 9004 | 0 | 0 | 0 | 3,3 | 0 | 0 | 0 | |||||
232133«
- 59 -
Ahn]iche Versuche werden'unter Verwendung der in Beispie]
genannten Nährmedien A, C, G und K durchgeführt, wobei ahn-]iche
Ergebnisse erhalten werden.
■ Fermentationen werden unter Verwendung der in Tabelle 7 genannten
Mikroorganismen und des in Beispie] 21 genannten Nährmediums J und den in Beispiel 21 angegebenen Bedingungen
durchgeführt, wobei jedoch das Geflüge]exkrement, das eine
Teilchengröße von 125/u hatte, dem Nährmedium in den nachstehend in Tabelle 9 angegebenen Mengen zugesetzt wird.. Dieser
Vergleich zeigt deutlich die vorteilhaften Ergebnisse,
die durch Verwendung größerer Anteile Geflügelexkrement erhalten
werden.
309846/1074
verwendete Mikroorganismen
Aspergillus diastaticus Aspergillus
flavus ATCC 1149 Aspergillus foetidus ATCC 14916 Aspergillus niger
ATCC 15475 Aspergillus oryzae ATCC 7561
Aspergillus oryzae ATCC 9102
Aspergillus phoenicis ATCC 15556 Aspergillus ruber ATCC 9481
Aspergillus saitol ATCC 11362 Aspergillus usamii ATCC 1136 4
Aspergillus oryzae ATCC 9102
Aspergillus phoenicis ATCC 15556 Aspergillus ruber ATCC 9481
Aspergillus saitol ATCC 11362 Aspergillus usamii ATCC 1136 4
Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23843 Bacillus brevis
ATCC 1006 8 Bacillus cereus ATCC 21768
Bacillus cereus ATCC 21769 Bacillus cereus ATCC 21770
Bacillus cereus ATCC 21771 · Bacillus cereus
ATCC 21772 \
Ce 11 um.on.as b i a zöte a
ATCC 486
Cellumonas find. ATCC 15724 Cellumonas vibrioides ATCC 11764 Cellumonas Cartalyticum ATCC 21681 Celluraonas Flavigena ATCC 482
Cellumonas find. ATCC 15724 Cellumonas vibrioides ATCC 11764 Cellumonas Cartalyticum ATCC 21681 Celluraonas Flavigena ATCC 482
Pseudomonas aergrnosa ATCC 7706 .
| T a | 40 b e |
3 3 | e | ν e | 3 te | α-Amy3 ase | 0 | Puten exkrement |
1.90 | |
| 6% | m e | η 1 | 0 | 1.0 0 | ||||||
| H | U h | η e | r e | hergeste3 | 2.1 | 8fo | b | 0 | 1.7 | 0 0 |
| ρ | 0% < | 3,3$ | 2% | χ k | 2.0 | 0 . | 3 0^20^ | 0 | 1.5 | 1.30 |
| 0 | 0 | 1.7 | 0 | 1.1 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | ||
| 0 | 0 | 1.5 | 1.9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.1 | 0 0 | |
| 0 | 0 | 1.0 | 1.6 | 1.1. | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | |
| 0 | 0 | 1.3 | 1.0 | 1.0 | 7 | 0 ] |
0 | 0 | 2.13,0 | |
| 0 | 0 | 1.0 | 1.0 | 1.1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 | |
| 0 | 0 | 1.1 | 1.1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 1.92,3 | |
| 0 | 0 | 0 | 1.5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.0 | 1.4 3,4 | |
| 0 | 0 | 0 | 1.0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1.5 | 1.4 3,4 | |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 1.3 | 0 | 0 | 0 | 1.1 | 80 96 | |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 1.5 | 0 | 0 | 0 | 1.2 | 80 93 | |
| 0 | .5 | 0.5 | 1.1 | 0 | 69 | 0 | 0 | 0 | 78 | 86 93 |
| 0 | .1 | o.i | 1.3. | 1.3 | 71 | 78 | 0 | 0 | 78 | 75 0 |
| 0 | .2 | 2.3 | 9 | 1.5 | 63 | 76 | 0 | 0 | 83 | 75 0 |
| 0 | .2 | 2.3 | 2.8 | 38 | 71 | 61 | 0 | 0 | 71 | 0 0 |
| q | .3 | 2.5 | 2.7 | A6 | 71 | 60 | 0 | 0 | 71 | •0 0 |
| 0 | .2 | 2.3 | 2.7 | 42 | 0 | 63 | 0 | 0 | 0 | 0 0 |
| 0 | .2 | 2.7 | 2.8 | 46- | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 |
| 6 | *o | 0.5 | 3 | 49 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 0 |
| ). | 900 | 1.1 | 4 | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| 0 | 1.0 | 6 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 0 | 0.5 | 1 | 5 | 0 | 0 | |||||
| 0 | 0.5 | 5 | 1 | 0 | ||||||
| 1 | ||||||||||
00
1.5 2
30 98 46/1074
- in -
Ähnliche Versuche werden unter Verwendung der Nährmedien A, C, D, G, K und L durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten
werden.
Fermentationen \<?erden unter den in Beispiel 23 genannten Bedingungen
im Nährmedium J durchgeführt, wobei jedoch Geflügelexkrement einer Teilchengröße von 177/U und größer verwendet
wird. Die Ergebnisse zeigen, daß bei den größeren Fraktionen die Bildung von a-Amylase verstärkt ist.
verwendete Mikroorganismen
hergestellte α-Amy läse
Hühnerexkremen t
Aspargillus diastaticus ATCC
Aspargillus flavus ATCC 1149 5 Aspargillus foetidus ATCC 14916
Aspergillus niger ATCC 15475 Aspergillus oryzae
ATCC 7561 Aspergillus phoenicis ATCC 15556
Aspergillus ruber ATCC 9 481 Aspergillus saitol ATCC 11362
Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23 Bacillus brevis
ATCC 1006 8 Bacillus cereus ATCC 217 6 8 Bacillus cereus ATCC 21769 Bacillus cereus
ATCC 21770 B ac i1lus ce reus
ATCC 21771 Bacillus cereus ATCC 21772
Q,Q% 0,1%
fi\of Qoi Τ C\C' OfV^
Ό/ο OjO j KJ/ο cUü
Putenexkrement
4ji
| 0 | 0 | • | 2.9 | 1.0 | 2.3 | 0 | 0 | 0 | 17 | 24 | U |
| 0 | 0 | 2.4 | 11 | 19 | G. | G | 0 | 0 | 20 | 0 | |
| S 0 |
0 | 2.0 | 11 | 19 | 0 | G | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 0 | 0 | 2.3 | 10 | 18 | 10 | 0 | 0 | 12 | 19 | 0 | |
| 0 | ■0 | 2.3 | 10 | 17 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| is 0 |
0 | 2.7 | 10 | 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 0 | 0 | .3 | 0 | 0 | 17 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 | 0 | .1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 21 | 28 | 20 |
| 0 | 1 | .7 | 8 | 9 | 10 | 0 | 0 | 0 | 10 | 11 | 5 |
| 0 | 1 | .3 | 6 | 7 | 6 | 0 | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 |
| 0 | 4 | .7 | 35 | 45 | 88 | 100 | 0 | 0 | 87 | 91 | 90 |
| 0 | 4 | .6 | 30 | 40 | 81 | 89 | 0 | 0 | 86 | 90 | 83 |
| 0 | 4 | .3 | 31· | 41' | €2 | 90 | 0 | 0 | 88 | ' 93 | 90 |
| 0 | 4 | 6/ | 29 | 40 | ?1 | 90 | 0 | 0 | 80 | 90 | 0 |
| 0 | 4 | 31 | 42 | 83 | 9 3 | 0 | 0 | 80 | 91 | C | |
| 309 | 8 4 | 10 | 74 | ||||||||
Forts. Tabelle 3 0
Hühnerexkrement'
8% 10% 20fo
Cellumonas biazotea ATCC 486
Cellumonas find ATCC .1572 4 "Cellumonas vibrioides ATCC 11764
Cellumonas find ATCC .1572 4 "Cellumonas vibrioides ATCC 11764
Cellumonas cartalyti- η -ι η
cum ATCC 21681
Cellumonas flavigena 6 ι τ
ATCC 482 ^*"5
Putenexkrement
0 0
1.1 6 18 0
2.0 12 26 Q
2.0 14.34 0
20 0
23 0
Pseudomonas aerqinosa λ η ATCC 7706 ' vu
0 0
0 0
0 0 0
0 0
0 0 0
0 0
ο ο. ο ο
0
ο ο ο ο
3.0 6 2,0
Ähnliche Ergebnisse werden unter Verwendung der in Beispie] 21
genannten Nährmedien A, C, G und K erhalten.
Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 7 genannten Mikroorganismen unter den gleichen Bedingungen wie in
Beispiel 21 im Nährmedium J "durchgeführt, wobei jedoch als
Kohlenstoffquel Ie 7$ Weizenkleie anstelle von 7$ Maisquellwasser
verwendet wurden.
309846/1074
TabeJüe 21
verwendete
Mikroorganismen hergestellte oc-AmyJase
Mikroorganismen hergestellte oc-AmyJase
Aspergillus
diastaticus
Aspergillus flavus ATCC 1149 5
diastaticus
Aspergillus flavus ATCC 1149 5
■Aspergillus foetidus ATCC 14916
Aspergillus niger ATCC 15475
Aspergillus oryzae ATCC 910 2
Aspergillus phoenicis ATCC 15556 " 0
Aspergillus niger ATCC 15475
Aspergillus oryzae ATCC 910 2
Aspergillus phoenicis ATCC 15556 " 0
Aspergillus saitol ATCC 11362
Aspergillus terreus ATCC 11877
Aspergillus awaraori ATCC
Aspergillus terreus ATCC 11877
Aspergillus awaraori ATCC
Aspergillus usamii ATCC 11364
Hiihherexkremen
0,0$ 0,1% 2% 4j6 6$ 8$ YÖ% 20%
0,0$ 0,1% 2% 4j6 6$ 8$ YÖ% 20%
Put< meni
0 0 0 0 0
0 0 0 0
1.3 2.0 13.0 35 16
1.1 3.5 14 36 32
1.0 3.0 15 35 20
1.6 3.3Ί4 35 18
1.5 3.7 15 36 15
1.0 3.6 14 35 16
1.0 1.1 14 35 12
1.0 1.3 6 35 0
0 0 0.0
1.0 1.4 3 8 0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Bacillus amylolique-
faciens ATCC 23 843 0,] 2.0 10 12 8 0
Bacillus brevis 8 0
ATCC 10068
Bacillus cereus ATCC 21768
Bacillus cereus ATCC 21769
Bacillus cereus ATCC 21770
Bacillus cereus ATCC 21771
Bacillus cereu3 ATCC 21772
Bacillus cereus ATCC 21769
Bacillus cereus ATCC 21770
Bacillus cereus ATCC 21771
Bacillus cereu3 ATCC 21772
0
0
16
0
16
0,3 1.8
0,6 Il 23 63 111 147
0,6 U 30 60 110 132 11
.0,5 19 30 58 10Ö 138 d
11 29 60 110 131 16
lg 31 63 100 131 0
Cellumonas biazotea ο
ATCC 486
Cellumonas find ο ATCC 15724
Cellumonas vibrio- O ides ATCC 11764 Cellumonas cartalyti- ο
cum ATCC 216 81 Cellumonas flavigena ο 1.3 11 ATCC 482
2,0 10 24 24 0
2.5 14 26 24 0
1.6 10 23 19 0
l.S 11 23 25 0
l.S 11 23 25 0
Pseudomonas aerginosa ο
ATCC 7706
0
0 0 0
0 0 0
309846/1074
ο
ο
0
0
0
0
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0
;nexkre-
21
18
19
27
15
15
96
96
99
91
90
0 0 0 0 0
29
23
O
23
O
O
O
34
O
20
19
7
105302 1111O]
101 300
0 0
0
ο ο
ο ο
11
- "4'4
Beispie] 26
Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 7 genannten Mikroorganismen unter den in Beispiel 21 genannten Bedingungen
durchgeführt» Das in Beispiel 21 genannte Nährmedium
J wurde verwendet, jedoch enthielt dieses Nährmedium aus
Kohlenstoffquelle 7% Sojabohnenöl anstelle von 7$ Maisquellwasser.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 genannt»
'Tabelle 32
verwendete Mikroorganismen
hergestellte a-Amylase
HUhnerexkrement
IAspergillus
!diastäticus
!Aspergillus flavus ATCC 11495
Aspergillus niger ATCC 15475
Bacillus cereus ATCC 2176 8 Bacillus cereus
ATCC21769
Bacillus cereus ATCC. 21770 . Bacillus cereus ATCC 21771
Bacillus cereus ATCC 21772
0,0%
6%
Putenexkrement
10% 20?o
| 0 | 0 | .6 | 0 | .6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | .5 | 1.0 | 0 |
| 0 | 0 | .6 | 0 | .6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0" | 1.0 | 1.0 | 0 |
| 0. | 0 | .3 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | .5 | 0 |
| 0 | 1 | .6 | 3 | 6 | 9 | 12 | 0 | 0 | 0 | 12 | 14 | 0 |
| 0 | 1 | .3 | 3 | 1. | 8 | 14 | 0 | 0 | 0 | 12 | 14 | 0 |
| 0 | 1 | 3~ | 9 | 12 | 0 | 0 | 0 | 14 | 12 | 0 | ||
| 0 | 1 | 3. | 11 | 12 | 0 | 0 | 0 | 12 | 14 | 0 | ||
| 0 | 1 | 3. | 11 | 12 | 0 | 0 | 0 | 14 | 14 | 0 | ||
Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 7 genannten
Mikroorganismen unter den in Beispiel 21 angegebenen
Bedingungen im Nährmedium L durchgeführt, das jedoch
3Q# Weizenkaff als Kohlenstöffque3Ie enthielt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 13 genannt.
309846/107
T a b e 3 3 e 3J5
| verwendete | h | η e | hergeste3 3 | χ k | r e | te a-Amv3ase | ~-£--*J /0 | 0 | • | 0 | Putenex | ' 34 8 |
| Mikroorganismen ,. .. | r e | .ment | 0 | krement | ||||||||
| ο. Η | 0 | 0 | 31 33 | |||||||||
| Aspergillus Q ι | 0 | 1.5 | 2fo | 21 | 43 | 8s* | 0 . | 31 | ||||
| diastaticus | 3.7 | 28 | 0 | 0 | 18 3 | |||||||
| Aspergillus flavus | 0 | 1.2 | 21 | 43. | 0 | 28 | ||||||
| ATCC 11495 | 4.4 | 30 | 0 | 34 6 | ||||||||
| Aspergillus foetidus | 0 | 1.3 | 21 | 46 | 0 | 15 | ||||||
| ATCC 14916 | 4.0 | 28 | G | o o | ||||||||
| Aspergillus niger | 0 | 1.9 | 20 | 45 | 0 | 31 | ||||||
| ATCC 15475 | 4.3 | 30 | 0 | 0 0 | ||||||||
| Aspergillus oryzae | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||||||
| ATCC 7561 | 4.6 | 0 | 0 | o o | ||||||||
| Aspergillus oryzae | 0 | 1.3 | 21 | 43 | 0 | 0 | ||||||
| ATCC 9102 | 4,2 | 31 | 0 | 0 0 | ||||||||
| Aspergillus phoenicis | 0 | 1.3 | 21 | 45 | 0 | 0 | ||||||
| ATCC 15556 | 4.1 | 28 | 0 | 39 53 | ||||||||
| Aspergillus ruber | 0 | 1.4 | 22 | 43 | G | 0 | 0 | |||||
| ATCC 9 481 | 4.1 | 31 | 0 G | |||||||||
| Aspergillus saitol | 0 | 1.3 | 21 | 45 | 0 | 0 | 35 | |||||
| ATCC 11362 | 4.0 | 28 | 28 36 | |||||||||
| Aspergillus usamii | 0 | 1.3· | 9 | 19 | 0 | 0 | 0 | |||||
| ATCC 11364 | 3.6 | 0 | 31 3 3 | |||||||||
| Bacillus amyloliaui- | 0 | 3.1 | 20 | 17 | θ | 0 | 26 | 11 9 | ||||
| faciens ATCC 23843 | 11 | 0 · | 0 | |||||||||
| Bacillus brevis | 0 | 2.6 | 21 | 17 | . 0 | 28 | 1013 08 | |||||
| ATCC 10068 | 0 | 0 | 12 | 0 | 0 | 0 | 21 | 9 | ||||
| Bacillus subtilis | 0 | 0 | 100306 | |||||||||
| Bacillus cereus | 0 | 3.0 | 110 | 89 | 30 | 93 | ||||||
| ATCC 21768 | 9.0 | 96 | 102307 | |||||||||
| Bacillus csreus | 0 | ■ | 7.4 | 92 | 50 | 96 | ||||||
| ATCC 21769 | 8.1 | 99 | 101 0 | |||||||||
| Bacillus cereus | 0 | 7.2 | 96 | 32 | 96 | |||||||
| ATCC 21770 | 6.3 | 103 | ||||||||||
| Bacillus cereus | 0 | 7.1 | 92 | 93 | ||||||||
| ATCC 21771 | 7.0 | 140 | ||||||||||
Bacillus cereus ATCC 21772
Cellumonas biazotea
ATCC 486
CeI !union as firni ATCC 15724 Cellumorias vibrioides ATCC 1176 4 Ccllumonas cartalyti-Q cum ATCC 216 81 Collumonas flavigena q ATCC 482 .
CeI !union as firni ATCC 15724 Cellumorias vibrioides ATCC 1176 4 Ccllumonas cartalyti-Q cum ATCC 216 81 Collumonas flavigena q ATCC 482 .
7.3 23 100 142 32 0
3.0 14 2 L1 36 36 0 0
3.5 15 30 38 10 0 0
3.0 17 33 36 11 0 0
3.0 14 '31. 34 16 0 0
3.0 11 30 38 10 0 0
95 101 G
0 0 0 0 0
3 0 9846/1074
Fermentationen wurden unter Verwendung der in Tabelle 7 genannten
Mikroorganismen unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 27 im Nährmedium J durchgeführt, dem jedoch
Weizenkaff und 200/Ug Glycin zugesetzt wurden. Die von den
fünf neuen Mikroorganismen gebildeten Mengen an a-Amylase
sind nachstehend in Tabelle 14 genannt.
| lus oereus | T a b e 3 J e | 14 | 5$ Weizenkaff | |
| Bacil | 10# Weizenkaff | +Glycin | ||
| 21768 | + Glycin | 130 | ||
| ATCC | 21769 | 17 | ||
| ATCC | 21770 | 205 | 89 | |
| ATCC | 21773 | 85 | 31 | |
| ATCC | 21772 | 5 | 39 | |
| ATCC | 30 | |||
Aspergillus niger
ATCC I5475 3,0 1,1
Der in Beispiel 28 beschriebene Versuch wurde unter Verwendung
von Nährmedien wiederholt, die 5$ bzw. 2$ Hühnerexkrement
enthielten. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabel1e 15 genannt.
| Bacil | lus cereus | 5$ Hühnerexkrement | 3/O Hühnerexkrement |
| + 200 /Ug Glycin | + . 200 /Ug Glycin | ||
| ATCC | 21768 | 335 | 319 |
| ATCC | 21769 | 33,50 | 23,35 |
| ATCC | 21770 | 94 | 94 |
| ATCC | 21771 | 42 | 44 |
| ATCC | 21772 | 29 | 47 |
Aspergillus niger
ATCC I5475 2,85 2,J
309846/1074
Bei einer besonders bevor-zugten Ausführungsform der Erfindung
kann das Geflügelexkrement als Ergänzung für Nährmedien
dienen, die bei üblichen Fermentationsverfahren zur Herstellung
von α-Amylase verwendet werden. Dieser Punkt ist in
den Beispielen dieser Beschreibung gut veranschaulicht. Die
als Ergänzung bei üblichen Nährmedien verwendeten Mengen.des Geflügelexkrements können jedoch in einem verhältnismäßig
weiten Bereich variieren. Konzentrationen von nur 0,01 Gew.-%
bis hinauf zu 15 Gew.-$ der üblichen Nährmedien bewirken
eine Steigerung der Ausbeute an a-Amylase. Ss wurde gefunden,
daß mit Konzentrationen über 15 Gew.-% keine zusätzlichen
Vorteile erzielt werden, und daß in gewissen Fällen das Geflügelexkrement
in Konzentrationen über 5$ als Inhibitor
wirksam ist. Die bevorzugte Konzentration liegt daher im Bereich von 1 bis 5$ und die besonders bevorzugte Konzentration
im Bereich von 2 bis 5 Gew.-% der üblichen Nährmedien.
Bei Verwendung von Geflügelexkrement als Ergänzung für üb-1 iche Nährmedien wird vorzugsweise ein Nährmedium hergestellt,
das 0,01 bis 15# Proteinmaterial und 0,01 bis 15$
Stärke enthält und mit Wasser auf Volumen aufgefüllt ist. Als
proteinhaltige Materialien eignen sich für die Zwecke der
Erfindung Maisquellwasser, Casein, Trockenhefe, Fischmehl,
Baumwollsaatmehl, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl
sowie Gemische dieser Materialien. Vorzugsweise werden' etwa 0,8^ proteinhaltiges Material in den Nährmedien verwendet,
da diese Menge dazu beiträgt, gute Ausbeuten an Amylase zu gewährleisten.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen eignen sich beim Verfahren
gemäß der Erfindung Glucose, Arabinose, Xylose, Lactose, Maltose, Saccharose usw. und verschiedene organische
Verbindungen, z.B. organische Ammoniumsalze, organische Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren, Maisquellwasser, Pepton,
Casein, Fleischextrakte und Sojabohnenprodukte. Diese
309846/107A
Materialien können natürlich nicht nur als Kohlenstoffquellen,
sondern gleichzeitig auch als verwertbare Stickstoffquellen
verwendet werden. Natürlich wird die Harnsäure in Hühneroder Putenexkrement auch als Stickstoffquelle verwendet. Als
weitere Stickstoffquellen eignen sich für die Zwecke der Erfindung
alle organischen oder anorganischen stickstoffhaltigen Verbindungen, die Stickstoff in einer Form, die sich
für die Verstoffwechselung durch die verwendeten Mikroorganismen
eignen, freizugeben vermögen. Aus der organischen Gruppe können die folgenden Verbindungen als Beispiele geeigneter
stickstoffhaltiger Verbindungen genannt werden: Proteine, säurehydrolysierte Proteine, durch Enzyme aufgeschlossene Proteine, Aminosäuren, Hefeextrakt, Asparagin,
Harnstoff und Harnsäure. Natürlich können diese Materialien gleichzeitig als Kohlenstoffquell en verwendet werden. Aus
Gründen der Wirtschaftlichkeit ist es gewöhnlich vorzuziehen,
anorganische Stickstoffverbindungen, z.B. Ammoniak und Ammoniumhydroxyd
oder ihre Salze, z.B. Ammoniumeitrat, Ammohiumsulfat,
Ammoniumphosphat und saures Ammoniumphosphat, zu verwenden. Wie bereits erväint, kann Puten- und Hühnerexkrement
als einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwendet
werden. Ein weiterer sehr zweckmäßiger und zufriedenstellender
Weg zur Zufuhr von Stickstoff ist die Verwendung von
Ammoniumphosphat oder saurem Ammoniumphosphat, die als Salz
zugesetzt oder im wässrigen Nährmedium in situ gebildet werden können, indem man naszierenden Stickstoff durch das Nährmedium
perlen .läßt, dem vorher Phosphorsäure zugesetzt worden
ist, wodurch saures Ammoniumphosphat gebildet wird.
Als Stärken können in den Nährmedien gemäß der Erfindung lösliche Stärken oder beliebige übliche unlösl iche-Stärken,
z.B. Reisstärke, Maisstärke, Kartoffelstärke und Pfeilwurzelstärke,
verwendet werden. Die Quelle der Stärke ist nicht wesentlich, so daß unter dem Ausdruck "Stärke" alle verschiedenen
bekannten Formen ohne Rücksicht auf ihre Herkunft
309846/1074
.- 49 - ■
zu verstehen sind. Die Aufgabe der Stärke ist die eines Aktivators
oder Stimmulans, und die verwendete.Menge liegt im Bereich von etwa 0,01 bis 15/»· Besonders gute Ergebnisse
wurden unter Verwendung von 0,5$ Stärke erhalten, so daß diese
Menge bevorzugt wird.
Außer den Kohlenstoff- und Stickstoffquell en kann es bei
einigen Mikroorganismen notwendig sein, gewisse Mengen ausgewählter mineralischer Nährstoffe dem Nährmedium zuzusetzen,
um gutes Wachstum des Mikroorganismus sicher zu stellen und maximale Selektivität, d.h. Umwandlung von Geflügelexkrement
und anderen Nährstoffen in Mikroorganismuszellen zu erzielen. Beispielsweise können Kalium, Natrium, Eisen, Magnesium,
Calcium, Mangan, Phosphor und andere Nährstoffe dem wässrigen Nährmedium zugegeben werden» In den meisten Fällen enthalten
jedoch Hühnerexkrernent und Putenexkrement genügend Mineralstoffe für das Wachstum und die Bildung von a-Amylase. In
jedem Fall können diese Materialien in Form ihrer Salze, vorzugsweise ihrer wasserlöslichen Salze, zugeführt werden.
Beispielsweise kann das Kalium als Kaliumchlorid, -phosphat,
-sulfat, -citrat, -acetat und -nitrat-zugesetzt werden. Eisen
und Phosphor können in Form von Sulfaten und Phosphaten, z.B. als Eisensulfat und Eisenphosphat, eingeführt werden. Im allgemeinen
wird der größte Teil des Phosphors als Ammoniurnphosphat zugeführt. Bei Verwendung von Ammoniumphosphat oder
saurem Arnmoniumphosphat kann das Phosphat als kombinierte Quelle von Stickstoff und Phosphor (Phosphation) für das
V/achstum der Zellen des Mikroorganismus dienen.
Nach dem Impfen werden die Fermentationen gemäß der Erfindung bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20° bis 50°C durchgeführt.
Innerhalb dieser Grenzen ist das Wachstum optimal. Vorzugsweise wird jedoch die Temperatur im Bereich von 26
bis J57°C, insbesondere im Bereich Von 52 bis 25°C gehalten.
309846/1074
Bei diesen Temperaturen wurden die besten Ergebnisse erhalten.
Der pH-Wert des Mediums wird während der Fermentation zwischen etwa 3,5 und 9,5 gehalten.· In diesem Bereich
wächst der Mikroorganismus zufriedenstellend. Vorzugsweise wird jedoch der pH-Wert bei etwa 7*2 gehalten. Bei diesem
Wert wurden die besten Ergebnisse erhalten.
Die oben genannten Mikroorganismen sind aerob und müssen daher in Gegenwart von Luft gezüchtet werden, wenn das Wachstum
gut sein soll. Die Mikroorganismen können demzufolge
auf der Oberfläche flacher Schichten des Mediums oder in belüfteten Submerskultüren gezüchtet werden. Im letzteren
Fall werden tiefe Tanks verwendet, denen Luft zugeführt wird. Beide Verfahren werden von der Anmelderin angewandt.
Sie erwiesen sich als gut geeignet für die Herstellung von
Amylase. Für die Großherstellung ist natürlich das in tiefen
Tanks durchgeführt Submersverfahren am geeignetsten.
Die Fermentation wird fortgesetzt, bis die Ausbeute an
oc-Amylase maximal ist. Im al !gemeinen liegt die Fermentationszeit zwischen 12 und 72 Stunden, jedoch konnte nachgewiesen
werden, daß Amylase-Aktivität bereits nach vier Stunden vom Beginn der Fermentation im Nährmedium vorhanden ist. Im allgemeinen
erreicht die Ausbeute nach etwa 12 bis 16 Stunden ein Maximum, das jedoch erheblich geringer ist, als nach der
längeren Zeitgrenze von 72 Stunden, so daß die Fermentation
vorzugsweise für eine Zeit von etwa J>§ Stunden durchgeführt
wird.
Sauerstoff kann dem Kulturmedium in be.l iebiger Form zugeführt werden, die leicht Vom Mikroorganismus assimiliert
werden kaiin. Sauerstoffhai tige Verbindungen können verwendet werden, so lange sie. das Wachstum der Zellen des Mikroorganismus
nicht beeinträchtigen. Der Sauerstoff wird jedoch
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zweckmäßig in Form von sauerstoffhaitigen Gasen, z.B. Luft,
die 19 bis 22 Gew.-$ Sauerstoff enthalten, zugeführt. Zwar .
wird die Verwendung von Luft bevorzugt, jedoch kann auch mit Sauerstoff angereicherte Luft, die mehr a3s 22 Gew.-$ Sauerstoff
enthält, verwendet werden.
Nach der Isolierung der ausgefällten Amylase aus dem Nährmedium wird das Material getrocknet, wobei das endgültige
Präparat erhalten wird, das außergewöhnlich hohe a-Amylase-Aktivität
aufweist. Die Trocknung kann unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur über Calciumchlorid oder bei Temperaturen
bis etwa 65 C ohne Verminderung der Aktivität des a-Amylase-Präparats erfolgen.
Nach der Bildung der Amylase im Kulturmedium wird sie wie folgt isoliert: Zuerst werden die Peststoffe aus dem Medium
entfernt, worauf die Amylase durch Zusatz eines Fällmittels, das nachstehend beschrieben wird, aus dem ze!!freien Medium
ausgefällt wird. Die Feststoffe können nach beliebigen üblichen
Methoden, z.B. durch Filtration und Zentrifugieren, aus dem Kulturmedium entfernt werden. In vielen Fällen ist
es vorteilhaft, die α-Amylase in Lösung zu verwenden, so daß eine Ausfällung hierbei nicht notwendig i-st und die Lösung,
die nach der Entfernung der Zellen vom Kulturmedium zurückbleibt, ohne weiteres für diesen Zweck verwendet werden kann.
Durch Konzentrierung der zellfreien Medien wird jedoch ihre
Wirksamkeit verbessert, so daß diese Arbeitsweise bevorzugt wird. Nach der Abtrennung der Feststoffe vom Nährmedium und
Gewinnung der zellfreien Lösung der Amylase wird diese vorzugsweise ausgefällt,indem Fällmittel, zum Beispiel organische
Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind, dem Medium zugesetzt werden. Als Fällmittel eignen sich beispielsweise
Ammoniumsulfat, Methyläthylketon, Aceton,' Dioxan und niedere
aliphatische Alkohole, z.B. Methanol, Äthanol, Isopropanol,
n-Propylalkohol und tert.-Butylalkohol, sowie Polyäthylen-
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glykol oder Gemische dieser Fällmittel. Das Lösungsmittel
wird in einer solchen Menge zugesetzt, daß die gesamte Amy-]ase ausgefällt wird. Hierbei wurde festgestellt, daß etwa
0,5 bis 2,0 Raumteile Fällmittel pro Raumteil des zellfreien Mediums genügen, um die gesamte α-Amylase auszufällen. Im
allgemeinen wird vorzugsweise Ammoniumsulfat als Fällmittel verwendet, da mit ihm gleich gute Ergebnisse ohne Rücksicht
auf die Konzentration der Amylase im zellfreien Kulturmedium
erhalten werden. Vorzugsweise werden zwei Raumteile PoIyäthylenglykol
pro Raumteil des die Amylase enthaltenden zellfreien Kulturmediums verwendet, da bei Verwendung dieser
Menge eine vollständige Ausfällung im allgemeinen gewährleistet 1st.
Bei der Ausfällung der a-Amylase erwies es sich als zweckmäßig, das zellfreie Kulturmedium vor der Ausfällung zu konzentrieren,
da auf diese Weise die zur Gewinnung einer gegebenen Amylasemenge erforderliche Menge des Zellmittels verringert wird. Vorzugsweise wird die Lösung auf ungefähr
l/lO ihres ursprünglichen Volumens eingeengt. Ferner erwies
es sich als zweckmäßig, das Nährmedium vor der Einengung zu
dialysieren, da hierdurch die Reinheit des Endprodukts erhöht
wird. Vorzugsweise wird die Lösung in Zellglasbeuteln
(Gellophan) gegen fl ießendes Leitungswasser etwa 24 Stunden
dialyslert, wenn diese Maßnahme nicht unpraktisch ist.
Zu Beginn der Fermentation wird das sterile Nährmedium mit dem zu züchtenden Mikroorganismus geimpft, z.B. unter Verwendung
eines vorher gezüchteten Inculums in einem Wachstummedium
oder im gleichen Nährrnedium, in dem es1 für die Produktion
gezüchtet werden soll, z.B. in den oben beschriebenen Nährmedien. Die Anfangskonzentration dos Inoculums, das den
Mikroorganismus enthält, zu Beginn der Fermentation kann in weiten Grenzen liegen und beispielsweise 0,0005 bis 50,0 g
pro Liter des gesamten Fermentationcmouiums betragen. Auch
andere Impi'rnethoden können angewandt werden. Beispielsweise
- -30 98 4 6/i 07 4
kann eine Impfkul tür verwendet werden, die durch vorherige
Züchtung das Mikroorganismus auf einem Medium, das von dem
Nährmedium für die Großherstellung verschieden ist, hergestellt
worden ist und dann in die Fermentationsbehälter überführt wird. Normalerweise wird die Kultur 1Λ bis 18 Stunden
entwickelt, bevor die Produktionsmedien mit ihr beimpft
werden.
werden.
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Claims (1)
- Patentanspruch eVerfahren zur Herstellung von a-Amy]ase duroh Vergärung von Nährmedien, die eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff und essentielle Nährstoffe enthalten, unter aeroben Bedingungen mit Hilfe von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man Geil Ugelexkrement wenigstens als Teil des Nährmediums und als Mikroorganismen Bakterien, Pilze und Hefen, die a-Amylase durch Verstoffwechseln von Geflügelexkrement zu bilden vermögen, verwendet.2) Verfahren zur Herstellung von a-Amylase durch Vergärung von Nährmedien, die eine Quelle für Stärke, proteinhaltiges Material und Mineralsalze enthalten, unter aeroben Bedingungen mit Hilfe von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man Geflügelexkrement wenigstens als Teil des Nährmediums und als Mikroorganismen Stämme der Gattungen Pseudomonas, Aspergillus, Corynnebacterium, Cellumonas, Bacillus und Candida, die a-Amylase durch Verstoffwechseln von Geflügelexkrement zu bilden vermögen, verwendet.3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus brevis, Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus oereus als Arten der Gattung Bacillus verwendet.K) Verfahren nach Anspruch 2 und j5> dadurch gekennzeich·< - ■■ ■net, daß man als Bacillus cereus die Stämme Bacillus eereus ATCC 23768, Bacillus cereus ATCC 21769, Bacillus cereus ATCC 2177O, Bacillus cereus ATCC 21771 oder Bacillus cereus ATCC 21772 verwendet.5) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man PseuSomonas aeruginosa, Pseudomonas amyloderamosa oder Pseudomonas atrofaciens als Arten der Gattung Pseudomonas verwendet.309846710746) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Aspergi3 3us awamori, Aspergi3 3us diastaticus, Aspergi3 3us f3avus, Aspergi3 3us foetidus, Aspergillus niger, Aspergi3 3us orzae, Aspergi3 3us phoenicis, Aspergi3 3us ruber, Aspergi3 3us saito3, Aspergi3 3us terreae oder Aspergi3.3us usamii als Arten der Gattung AspergiHus verwendet .7) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium 313 ium oder Corynebacterium hydrocarboc3astus a3s Arten der Gattung Corynebacterium verwendet.8) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Ce3 3umonas biazotea oder Ce3 3umonas flmi a3s Arten der Gattung Ce3 3umonas verwendet.9) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Candida so3ami oder Candida parapso3osis a3s Arten der Gattung Candida verwendet.3 0) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gef3üge3exkrement im Nährmedium in einer Menge von 0,03 bis 3 0$ verwendet.33) Verfahren nach Anspruch 2 bis 3 0, dadurch gekenn zeichnet, daß man das Gef3 üge3 exkrernent in getrockneter Form und in Form von Tei3chen einer Größe von ^2/U bis2 mm, vorzugsweise 3 25 bis 297 Mt insbesondere 3^9 bis 377 M verwendet.3 2) Verfahren nach Anspruch 2 bis 3.1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das V/asser, Gef3üge3exkremente 0,01 bis 1^>% Stärke und 0,0] bis 3 5$ Proteinnateria] entliä3t.309846/ 107Λ13) Verfahren nach Anspruch 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man Nährmedien verwendet, die Carbonate, Phosphate und/oder Sulfate von Eisen, Mangan, Calcium, Kalium, Natrium und Magnesium a]s Mineralsalze enthalten.14) Verfahren nach Anspruch 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Nährmedien verwendet, die als Stärke. Reisstärke, Maisstärke, Kartoffelstärke, Pfeilwurzelstärke, Weizenstärke und/oder Cassavastärke enthalten.15) Verfahren nach Anspruch 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Nährmedien verwendet, die als Proteinquelle Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maisquellwasser, Zein, Protein, Casein, Maismehl, grobes Maismehl, Hafermehl, Roggenmehl, Weizenmehl, Weizenkaff und/oder gebrochenen Reis enthalten.16) Verfahren nach Anspruch 2 bis 15> dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung bei einer Temperatur im Bereich von 18 bis 1700C, vorzugsweise 26 bis 37°C durchgeführt wird.17) Verfahren nach Anspruch 2 bis l6, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung bei einem pH-Wert im Bereich von 1 bis 11, vorzugsweise 6,5 bis 7,5 durchgeführt wird.■f -3.8) Verfahren nach Anspruch 2 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung 1 bis 72 Stunden, vorzugsweise bis 35 Stunden durchgeführt wird.19) Verfahren nach Anspruch 2 bis l8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärung in Nährmedien durchgeführt wird, die wachstumsfördernde Anteile von Weizenkaff und Glycin gleichzeitig enthalten.30 98 46/10720) Verfahren nach Anspruch 2 bis 1$, dadurch gekennzeichnet, daß Nährmedien verwendet werden, die Weizenkaff in Mengen von 3 bis 5$ und G3ycin in Mengen von 0,0] bis enthaJten.309846/1074Leerse i te
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US00250506A US3808102A (en) | 1972-05-05 | 1972-05-05 | Process for preparing alpha amylase |
| US25050672 | 1972-05-05 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2321334A1 true DE2321334A1 (de) | 1973-11-15 |
| DE2321334B2 DE2321334B2 (de) | 1976-07-08 |
| DE2321334C3 DE2321334C3 (de) | 1977-03-10 |
Family
ID=
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS4941585A (de) | 1974-04-18 |
| CA1006837A (en) | 1977-03-15 |
| FR2183756B3 (de) | 1976-04-16 |
| FR2183756A1 (de) | 1973-12-21 |
| NL7306142A (de) | 1973-11-07 |
| DE2321334B2 (de) | 1976-07-08 |
| US3808102A (en) | 1974-04-30 |
| IT981952B (it) | 1974-10-10 |
| GB1421448A (en) | 1976-01-21 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
| EHJ | Ceased/non-payment of the annual fee |