DE2003981B2

DE2003981B2 - Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakt durch Abbau der Hefen mit zellspaltenden Enzymen von Mikroorganis men

Info

Publication number: DE2003981B2
Application number: DE2003981A
Authority: DE
Inventors: Kengo Ishida; Masanobu Kawai; Noboru Machida Mukai; Atsushi Yamamoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-02-08
Filing date: 1970-01-29
Publication date: 1973-10-04
Also published as: DE2003981A1; NL7001583A; JPS494379B1; CH537156A; DE2003981C3; GB1278561A; CA922576A; IT1050419B; FR2033934A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakt durch Abbau der Hefen mit zellspaltenden Enzymen von Mikroorganismen.

Neuerdings werden Fleischextrakte und Hefeextrakte usw., die einen natürlichen Geschmack und ein natürliches Aroma entwickeln können, häufig an Stelle von chemischen Würzen, wie Natriumglutamat, Natrium-5'-inosinat, Natrium-5'-guanylat oder Natriumsuccinat, verwendet, die keinen natürlichen Geschmack und kein natürHches Aroma besitzen.

Bisher wurden Hefeextrakte aus Kulturhefe entweder mittels 1) Extraktion, 2) Proteaseabbau, 3) Säurezersetzung oder 4) Autolyse hergestellt. Diese herkömmlichen Verfahren sind jedoch nicht zufriedenstellend und haben eine Reihe von Nachteilen. Beispielsweise ist bei den Verfahren 1) und 2) die Ausbeute gering, und der Extrakt hat einen bitteren Geschmack. Bei dem Verfahren 3) entsteht ein unangenehmer Geruch und wertvolle Komponenten können abgebaut werden. Das Verfahren 4) ist schwierig zu steuern und kann nicht bei wärmegetrockneten Hefezellen verwendet werden.

Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakt durch enzymatischen Abbau von Hefen sind aus folgenden Literaturstellen bekannt:

Im Verfahren der britischen Patentschrift 1 084 265 werden Trametes sanguinea ATCC 14622, Trametes cinnabarina ATCC 14623 und Stämme von Trametes albida, Trametes suaveolens sowie Trametes purpurea verwendet.

Die deutsche Offenlegungsschrift 1 442 108 beschreibt ein Verfahren zur Zersetzung der Zellwände mittels ß-Glucanase.

Die deutsche Patentschrift 960 982 schildert ein Verfahren zur Gewinnung des Zellinhalts von Hefe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Hefe mit Glutaminsäure oder deren Salzen der Plasmolyse unterworfen wird.

In Beispiel 4 der französischen Patentschrift 1525191 ist die Auflösung verschiedener Hefestämme mit einem von Flavobacterium sp. B-225 ATCC 21045 gebildeten Enzym beschrieben.

In Beispiel 1 der französischen Patentschriitl 519204 wird unter Einsatz von Papain, Cellulase und Lipase als abbauende Enzyme ein Hefeextrakt erhalten.

Aufgabe der Erfindung war es, sin Verfahren zur

Herstellung von Hefeextrakt zur Verfugung zu stellen, das die Nachteile der herkömmlichen Verfahren nicht aufweist bzw. höhere Ausbeuten liefert und womit sich Hefeextrakt von guter Qualität und mit angenehmem Geschmack und Aroma herstellen läßt.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakt durch Abbau der Hefen mit zellspaltenden Enzymen von Mikroorganismen, das dadurch gekennzeichnet ist. ίο daß man mindestens ein zellspaltendes Enzym, das durch Coprinus macrorhizus f. microsporus ATCC 20120. Coprinus micaceus ATCC 20122 oder Coprinus radians ATCC 20014 gebildet wird, einsetzt und daß man den Hefeextrakt gewinnt.
Die beim erfinduncsgemäßen Verfahren verwendeten zellspaltenden En? ie werden durch Züchtung der genannten Coprini -Mikroorganismen in festem oder flüssigem Medium erhalten. Es ist erforderlich, daß das Medium eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle und andere für das Wachstum der Mikroorga nismen notwendige Bestandteile enthält. Als Kohlenstoffquelle können Saccharose, Stärke, Lactose, MaI-tose oder Dextrose, als Stickstoff quelle lösliche Schlempe, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Sojabohnenkuchen, Gluten, Aminosäuren, Ammoniumsalze, Ni- träte oder Harnstoff verwendet werden. Darüber hinaus kann das Medium gegebenenfalls noch Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Phosphate oder Zink, Mangan, Eisen und Kobalt als Spurenelemente enthalten.

Das zeilspaltende Enzym wird im allgemeinen aus einer Enzymlösung hergestellt, die durch Abtrennung von Zellen der genannten Mikroorganismen aus einer Gärmaische nach herkömmlichen Enzymreindarstellungsverfahren, wie Ausfällung mit organischen Lö- sungsmitteln, Aussalzen, Aufkonzentrieren unter vermindertem Druck, Adsorption mittels Ionenaustausch und Desorption erhalten wird. Jedoch können die Zellen oder das Kulturbrühenfiltrat nach der Züchtung auch ohne weitere Behandlung als Enzymquelle verwendet werden.

Zur Herstellung von Hefeextrakt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können alle üblichen Hefen, wie nach herkömmlichen Verfahren gezüchtete Backhefe, Sulfitablaugenhefe, sogenannte »kohlenwasser- stoffzehrende Hefen«, die in einem Kohlenwasserstoffmedium, wie η-Paraffinen, gezüchtet werden oder Hefe, die aus der Rückstandsflüssigkeit bei der alkoholischen Gärung abgetrennt wurde, eingesetzt werden. Diese Hefen können nach der Züchtung und Ab- trennung in getrocknetem Zustand oder als Preßhefen verwendet werden, man kann jedoch auch die Kulturbrühe ohne weitere Behandlung verwenden. Die Abbaufähigkeit des zellspaltenden Enzyms wird zwar im allgemeinen erhöht, wenn man die Zellen durch Erhitzen abtötet, doch können auch ohne weiteres lebende Zellen verwendet werden.

Die Hefekonzentration, die Menge des zugegebenen Enzyms, Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und pH-Wert und sonstige Bedingungen zur Herstellung des Hefeextrakts hängen von der Art des verwendeten Enzyms und der Art der Probenahme aus einer Enzymquelle ab. Wird z. B. ein durch Coprinus macrorhizus f. microsporus ATCC 20120 oder Coprinus radians ATCC 20014 gebildetes Enzym verwendet, so liegen optimale Bedingungen vor, wenn eine Suspension von Zellen verwendet wird, deren Hefekonzentration 5 bis 25% beträgt, der pH-Wert mit Natrium-

hydroxid und sekundärem Natriiimphosphat auf S bis wird mit einer solchen Menge Aceton versetzt, daß 8.5 eingestellt. 0.02 bis 1.5" „(bezogen auf das Trocken- man eine 75°, „ige Acetonlösung (Vol., Vol.) ei hält. Die gewicht der als Rohmaterial verwendeten Hefe) Enzym entstandene Fällung wird gefriergetrocknet. Man erzugegeben und der Abbau 5 bis 4S Stunden bei 50 bis hält 170 g des rohen Enzvms.
55 C durchgeführt wird. 5 In einem getrennten Behälter werden SO 1 einer auf

Im allgemeinen treten bei den Abbaureaktionen pH 8.5 eingestellten 10%igen S'ispensicn von liefe

keine Störungen durch Infektionen auf. da die Tempe- der Art Candida utilis. die aus Sulfitablauge herte-

ratur meist hoch ist. doch können gegebenenfalls als stellt wurde. 10 Minuten auf ICO'C eihitzt. denn atf e-

Konsenierungsmiuel Äthylacetat oder Alkohole \er- kühlt und bei 55 C gehalten. 17 g des roh,.n En7\ms

wendet werden. m werden zugegeben, und der Abbau wird bei 55 C

Durch die Abbaureaklion werden die Zellwände der unter Rühren 10 Stunden durchgeführt. Die Zellen Hefezellen zerstört und die darin enthaltenen Poly- werden in dieser Abbaustufe abgebaut und Ziel er. saccharide und Proteine zu Zuckern, wie Glucose. Aminosäuren, Peptide, usw. freigesetzt. Die Attau-Mannose, Galactose. Ribose. verschiedenen genieß- flüssigkeit wird mit Salzsäure auf pH 6,0 eingestellt, baren Aminosäuren, hauptsächlich Glutaminsäure und 15 Durch Zentrifugieren weiden 62 1 Flüssigl-eit atce-Alanin. sowie niederen und mittleren Peptiden. abge- trennt. Der Gesamtfeststoffgehalt der abgetrennten baut. Andererseits werden verschiedene Vitamine, Flüssigkeit beträgt 118 g/Liter, d.h.. daß mehr als Aminosäuren und nucleinsäureartige Verbindungen, 90¹V₀ des Heferohmaterials solubilisiert sird. Eie organische Säuren und Phosphorsäureverbindungen, Flüssigkeit wird 2 Stunden auf 60^c C erhitzt ι ndhieraif die in den Hefea Ilen oder dem Nährmedium enthalten 20 konzentriert. Man erhält 8,8 kg HefeeHrakt in Fastensind, als lösliche Komponenten verwertet. Wird die form. Typische Analysewerte für die erhaltene Würze Hefe mittels eines durch Coprinus macrorhizus f. mi- sind folgende: Gesamtgehalt an Stickstoff 7,9%; crosporus ATCC 20120 gebildeten Enzyms abgebaut, Natriumglutamat 4.4%; Gesamtgehalt an Zuckern so werden mehr als 90° „ der Hefezellen solubilisiert 8,2%: Aschegehalt 14,3%; Kochsalz 2,8%; Wasser- und als Hefeextrakt gewonnen. Ferner bilden sich in 25 gehalt 16%.
den Abbauprodukten keine Bitterstoffe. Der Geschmack einer 2%igen Lösung des erhaltenen

Vorzugsweise wird im Anschluß an die Behandlung Hefeextrakts wurde von 5 Fersonen nach der Profil-

der Hefen mit mindestens einem der zellspaltenden methode getestet. Alle Versuchspersonen raten an,

Enzyme ein enzymatischer Abbau mittels Protease daß der Extrakt keinerlei bitteren, sondern einen guten,

durchgeführt. Hierdurch kann die Menge der ent- 3° fleischähnlichen Geschmack und ein volles fleisch-

standenen Aminosäuren erhöht werden. ähnliches Aroma aufwies.

Die erhaltene Abbauflü^sigkeii wird filtriert und das _R . ■ \ ~>

Filtrat durch Behandlung mit Aktivkohle, Ionenaus- ' P^ie "

tauscherharzen oder nichtionischer, Austauscherharzen Durch Filtration einer Kulturbrühe des Coprinus

auf den gewünschten Geschmack und das gewünschte 35 macrorhizus f. microsporus ATCC 20120, der nach

Aroma abgestellt. Auch können Geschmack und dem Verfahren von Beispiel 1 gezüchtet worden war,

Aroma der Abbauflüssigkeit durch Zugabe von ver- erhält man 18 1 Filtrat.

schiedenen Aminosäuren und organischen Säuren, wie In einem getrennten Behälter v- erden 10 kg Trocken-

5'-Nucleotiden oder Natriumglutamat, verändert wer- hefe, die durch Züchtung der Gattung Candida unter

den. 40 Verwendung von η-Paraffinen als Kohlenstoffquelle

Anschließend wird das Abbaufiltrat auf pH 5 bis 6 5 und Waschen mit Hexan und Wasser erhalten wurde,

eingestellt und auf 40 bis 85 C erhitzt, um die Um- mit 821 Wasser und 181 des Filtrats versetzt. Der

Setzung der Zuckerarten mit den Aminosäuren zu be- pH-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 8,5 einge-

schleunigen, die durch den Abbau entstanden sind, stellt, und die Hefezellen weiden unter Rühren bei

wodurch eine »Alterung« erzielt wird. Die so gealterte 45 55⁰C 8 Stunden abgebaut. Die Flüssigkeit wird mit

Würzflüssigkeit wird entweder als solche als Hefe- 400 g Aktivkohle versetzt vnd tei 6O⁰C 1 Stunde ce-

extrakt verwendet oder durch Aufkonzentrieren oder rührt und hierauf filtriert. Es werden ICOg Natritm-

Sprühtrocknen in Pasten- bzw. Pulverform gebracht. 5'-inosinat zugegeben, und das Filtrat wird in einem

Wie vorstehend beschrieben, hat das erfindungsge- Sprühtrockner getrocknet. Man erhält 10,2 kg hel!-

mäße Verfahren unter Verwendung der zellspaltenden 5° gelbes Pulver.

Enzyme der genannten Coprinus-Mikroorganismen Typische Analysewerte für die erhaltene Würze sind

eine Reihe von Vorteilen und ist daher sehr wertvoll. folgende: Wassergehalt 4%. Kochsalzgehalt 2,5%,

Beispielsweise können die Hefeextrakte aus der Hefe Cesamtgehalt an Stickstoff 8,1%- Natriimglutemat-

in hohen Ausbeuten hergestellt werden. Aus Trocken- gehalt 5,1%, Aschegehalt 17,5%. Es wurde kein

hefen, wie kohlenwasserstoffzehrenden Hefen oder 55 bitterer oder unangenehmer Geschmack und kein

Sulfitablaugenhefen, lassen sich gute Würzen her- Ölgeruch festgestellt,

stellen. Während des Abbaus bilden sich keine Bitter- _R . . .

stoffe, und der Salzgehalt der Hefeextrakte ist gering. Beispiel

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Durch Filtration einer Kulturbrühe von Coprinus

. 60 radians ATCC 20014 und Coprinus micaceus ATCC

Beispiel 1 20122, die im wesentlichen nach dem Verfahren von

Tn 20 1 eines 3% Saccharose, 3%'ösliche Schlempe, Beispiel 1 gezüchtet wurden, erhält man 18 1 Filtrat. 0,5% Hefezellen, 0,02% Magnesiumsulfat und 0,5% In einem getrennten Behälter werden 82 1 Wasser primäres Kaliumphosphat enthaltenden Nährmediums und 18 1 Filtrat des rohen Enzyms zu 10 kg Trockenwird Coprinus macrorhizus f. microsporus ATCC 65 hefezellen gegeben, die durch Züchtung von Hefe der 20120 unter Belüftung und Rühren bei 28*C 48 Stun- Gattung Candida unter Verwendung von n-Paraffinen den gezüchtet (pH = 6,0). als Kohlenstoffquelle und Waschen mit Hexan und

Die Zellen werden abfiltriert. Das erhaltene Filtrat Wasser hergestellt wurden. Der pH-Wert wird mit

2 003 98l(f

Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt, und die Hefezellen werden bei 55¹C 8 Stunden abgebaut. Hierauf wird der pH-Wert der Abbauflüssigkeit mit Salzsäure auf 6,0 eingestellt, und durch Zentrifugieren werden 1 Flüssigkeit abgetrennt.

Die Flüssigkeit wird mit 400 g Aktivkohle versetzt, bei 60 C ! Stunde gerührt und hierauf filtriert. Das Filtrat wird mit 100 g Natrium-5'-inosinat versetzt und in einem Sprühtrockner getrocknet. Man erhält 9,8 bzw. in einem anderen Versuch 10,5 kg hellgelbes Pulver.

Im folgenden wird der technische Fortschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber bekannten Verfahren dargelegt.

Beim Verfahren der deutsche . Patentschrift 960 982 werden nur Zellinhaltsstoffc abgebaut, während beim erfindungsgemäßen Verfahren auch die Wandungen der Hefezellen abgebaut werden.

Im Beispiel 1 der französischen Patentschrift 1 519204 werden als abbauende Enzyme Papain, Cellulase und Lipase verwendet, die aus verschiedenen Quellen stammen, während im erfindungsgemäden Verfahren nur die zellspaltenden Enzyme, die von einem einzigen Mikroorganismus erhalten werden, zum Einsatz kommen.

Der technische Fortschritt gegenüber der britischen Patentschrift 1 084 265, der französischen Patentschrift 1 525 191 und der deutschen Offenlegungsschrift 1 442 108 ergibt sich aus den folgenden Versuchsberichten.

Versuchsbericht I I. Untersuchte Stämme

Coprinus micaceus ATCC 20122, Coprinus radians ATCC 20014, Coprinus macrorhizus f.microsporusATCC20120 Trametes sanguinea ATCC14 622 (britische Patentschrift 1084 265; Beispiel 1),
TraL.etes cinnabarina ATCC 14623 (britische Patentschrift 1 084 265; Beispiel 2).

II. Zellspaltende Aktivität bestimmt an

Candida albicans ATCC 20260, Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248.

45 III. Zusammensetzung des Reaktionsmediums

Medium A:

Saccharose 10 %

Polypepton 0,3 %

Asparagin 0,5 %

KH₂PO₄ 0,5%

MgSO₄ -7H₂O 0,2%

pH 6,0

Medium B:

Saccharose 3 %

Schlempe (lösliche Rückstände der

Alkoholdestillation) 3 %

Trockenhefe 1 %

KH₂PO₄ 0,5%

MgSO₄ · 7H₂O 0,05%

pH 6,0

Medium C:

Dextrin 5%

Maisquellflüssigkeit 2%

KH,PO₄ 0,15%

MgSO₄-7H₂O 0,05%

Thiamin HCl 2 mg/1

oH 5.5

IV. Inkubationsbedingungen

Coprinus micaceus ATCC 20122 und Coprinus macrorhizus f. microsporus ATCC 20 120 werden im Medium B bei 30^;C 6 Tage auf einer Drehschüttelmaschine (220 Umdrehungen/Min.) geschüttelt. Coprinus radians ATCC 20014 wird im Medium B Tage bei 30"C auf einer Drehschüttelmaschinc (220 Umdrehungen/Min.) geschüttelt.

Trametes sanguinea ATCC 14622 und Trametes cinnabarina ATCC 14623 werden im Medium B bzw. C Tage bei 30^:C auf einer Drehschütteimaschine (220 Umdrehungen/Min.) geschüttelt.

Candida albicans ATCC 20260 und Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 werden im Medium A 2 Tage bei 30"C auf einer Drehschüttelmaschine (220 Umdrehungen/Min.) geschüttelt.

V. Reaktionsbedingungen

a) Substrat:

Die vorgenannten Stärtur; ATCC 20260 und 15248 werden abzentrifugiert und isoliert. Die isolierten Zellen werden mit Wasser gewaschen und dann in Wasser suspendiert. Die Zellenkonzentration wird so eingestellt, daß die Trübung der Reaktionslösung einen Wert für die optische Dichte bei 660 nm OD_6(i0 =-- -0,5 hat. Es wird eine Suspension lebender Zellen erhalten. Ferner wird ein Teil der Suspension 10 Minuten auf 100^cC erhitzt. Es wird eine Suspension erhitzter Zellen erhalten (OD₆₆₀ = - 0,5).

b) Puffer:

0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,0),

0,05 M Citrat-Phosphatpuffer (pH 4,0).

c) Enzymlösung:

Filtrate der Kulturen, die durch Inkubation der vorgenannten Stämme und Abfiltrieien der Kulturflüssigkeit erhalten wurden, werden als solche verwendet.

d) Zusammensetzung der Reaktionslösung:

Puffer 8 ml

Substrat 1 ml

Enzymlösung 1 ml

e) Reaktionstemperatiir:
4O⁰C

f) Reaktionszeit:
60 Minuten.

VI. Ergebnisse

Tabelle I
Wirkung bei lebenden Zellen

Eingesetzter	Me	pH	Aktivität (⁰U) ·)	S. cerevisiae
Mikro-	dium		Hefe	ATCC 15 248
organismen-		7	C. albicans	9,0
stamm	B	7	ATCC 20 260	57,0
ATCC 20122	B	7	1,2	35,8
ATCC 20014	B	7	f,6	0
ATCC 20120	B	4	2,1	6,2
ATCC 14622	B	4	0	0
ATCC 14622	C	7	0	0
ATCC 14622	B	4	0	0
ATCC 14623	B	4	0	0
ATCC 14623	C	0
ATCC 14623		0

Tabelle II
Wirkung bei erhit/tcn /eilen

Eingesetzter

Mikroorganismen
stamm

ATCC 20122
ATCC 20014
ATCC 20120

ATCC 14622
ATCC 14622
ATCC 14622

ATCC 14623
ATCC 14623
ATCC 14623

Me dium	pH
β	7
ß	7
ß	7
B	7
B	4
C	4
B	7
ß	4
C	4

Aktivität (■·/„) ·) liefe

C. alhicans
ATCC 20 260

4,6

19,0

2,1

0
0
0

2.1

S. cerevisiae ATCC 15 248

26,4
70,8
66,6

9,3
44,9
0

3,9
20,7
15,0

*) Die Aktivität zeigt sich als Abnahme der relativen Trübung, die mit einem piezoelektrischen Colorimeter bestimmt wird.

VII. Zusammenfassung

1. Die Stämme der Galtung Coprinus haben Aktivität bei lebenden Zellen beider I lefearten, insbesondere starke Aktivität gegenüber S. cerevisiae. Die Stämme der Gattung Trametes haben praktisch keine Aktivität gegenüber lebenden Zellen. Trametes sanguinea ATCC 14622 zeigt eine geringe Aktivität gegenüber Saecharomyces cerevisiae, weil!! dieser Stamm \\\\ Medium B inkubicrt wird und die Umsetzung unter aauicn Bedingungen durchgeführt wird.

2. Die Stämme der Gattung Coprinus haben eine starke Aktivität gegenüber den erhitzten Zellen beider Hefen, insbesondere gegenüber S. cerevisiae. Die Stämme der Gattung Trametes sind gegenüber erhitzten Zellen von S cerevisiae ziemlich aktiv, wenn die Umsetzung unter sauren Bedingungen durchgeführt wird. Die Aktivität ist jedoch nicht so stark wie die der Stämme der Galtung Coprinus. Die Stämme der Galtung Trametes sind gegenüber erhitzten Zellen von C. albicans inaktiv, mit Ausnahme des Stammes ATCC 14623, wenn dieser im Medium B inkubiert und die Umsetzung unter neutralen Bedingungen durchgeführt wird.

Versuchsbericht II

I. Herstellung der Enzyme

a) Erfindungsgemäßes Verfahren

Coprinus macrorhizus f. microsporus ATCC 20120. Coprinus radians ATCC 20014 und Coprinus niicaccus ATCC 20122 werden 72 Stunden bei 28 C unter Belüftung und Rühren in 20 I eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung gezüchtet.

Saccharose 3 ⁰Z₀

Schlempe (lösliche Rückstände der

Alkoholdestillation) 3° ₀

Hefezellen 0,5 °'_o

Magnesiumsulfat 0,02 °/₀

Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 ⁰Z₀

pH-Wert 6,0

Nach der Züchtung werden die Zellen abfiltriert. Das Filtrat wird bis zu einem Gehalt von 75 Volumprozent mit Aceton versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abliltriert und zu einem rohen Enzym gefriergetrocknet.

Ausbeuten:

, ATCC 20120 170 g

ATCC 20014 150 g

ATCC 20122 162 g

b) Enzym der französischen Patentschrift 1 525 191

ι» I lavobacterium sp. Nr. 225 ATCC 21045 wird in 20 1 eines 2% Glucose und 2"/₀ Fischmehlextraktl'ulver enthaltenden Nährmediums vom pH-Wert 7 unter Belüftung und Rühren 2 Tage bei 30⁰C gezüchtet. Die erhaltene Ciärmaische wird K) Minuten

is mit 9(XX) Umdrehungen/Min zentrifugiert. Der Überstand wird als Enzymprobe verwendet.

c) /i-Glucanase
der deutschen Offcnlcgungsschrift I 442 108

In Beispiel 1 der genannten deutschen Offenlegungssihrift wird /i-Glucanase durch Züchtung eines bestimmten Stammes von Trichoderma viridae hergestellt. Da jedoch dieser Stamm nicht erhältlich war, wird handelsübliche! durch Mikroorganismen erzeugte /i-Glucanaf.e verwendet. Dieses handelsübliche Enzym wird gereirvyt. Es wird bei dem Verfahren nach Anspruch 2 dieser deutschen Offenlegungsschrift eingesetzt (Arbeitsbedingungen pH-Bereich 3,0 bis 6,5 und Temperaturen von 25 bis 60 C; vcl. nachstehende Tabelle III).

d) Enzyme der britischen Patentschrift I 084 265

20 I eines wäUrigen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung werden in einen 40 1 fassenden lank gegeben, der 10 Minuten hei 115 C sterilisiert und auf 28"C gekühlt worden ist.

Nährmedium:

Saccharose 4"/₀

Glucose 2 "/„

Sojahohnenkuchen 3"'_n

Maisquelliliissigkeit I "./„

Ammoniumsulfat 0,1"l_a

Kaliumdihydrogenphosphat 0,2"Z₀

Magnesiunisulfat-heptahydrat 0,1 " „

Kupfersulfat 0,05",,,

pH-Wert (mit Natriumhydroxid eingestellt) '. 6,0

5a Trameies Albida (Er.) Bourd. et GaIz ATCC 20119 und Trametes suaveolens (L.) Fr. ATCC 9417 werden jeweils als Inoculum in den Tank übertragen und 140 Stunden bei 28"C unter einer Rührgeschwindigkeit von 160 Umdrehungen'Min. und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 20 l/Min, gezüchtet. Die erhaltene Ciärmaische wird mit Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,0 gebracht und nitriert. 161 des erhaltenen Filtrats werden mit 8 kg Ammoniumsulfat versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abzentrifugiert und bei 35 C zu einem Rohenzym getrocknet.

Ausbeute:

ATCC 20119 150 g

ATCC 9417 144 g

Mit Trametes purpurea Cook konnten keine Vergleichsversuche durchgeführt werden, da kein entsprechender Stamm erhältlich war.

309 540/237

34*3

ιυ

l-ji/yme

FrIi ndiingsgemältes Verfahren:
Züchtung von ATCC 20 120. .
Züchtung von ATCC 20014. .
Züchtung von ATCC¹ 20122..

deutsche Offenlegungsschrift
442 108//-Glucana.se ....

französische Patentschrift

525 191

Züchtung von A ICC 21 045..

britische Patentschrift

084 265:

Züchtung von ATCC 20 l^l>9..
Züchtung von A ICC 9417 .. .

Tabelle III

Veisuchsheiliniiiiiigei!

\ei- weiulete Menge	pH-Weil	lein!«;- UItUl
17g 17 g 17g	8,5	SS SS 55
17g	4,0	40
21 5 I	9,0 9,0	37 37
17g 17g	3,0 3,0	37 37

Hauer SUl.

IO 10 IO

Ausbeute an

Hefeeitiakt (ky)

'4 (Probe Λ) 6,9 (Probe H) 7,0 (Probe C)

5,4 (Probe D)

4,4 (Probe F) 5,4 (Probe F)

6,1 (Probe G) 5,7 (Probe Ll)

Aiialvsenilalen

( iCSilMU'

stickstof (kg)

0,70 0,61 0,63

0,47

0,38 0,46

0,55 0,50

MtMlO

natriuni-

glutamiit

(kg)

0,39 0,35 0,35

0,25

0,17 0,22

0,27 0,22

Gesamt

zucker (kg)

0,72 0,66 0,68

0,39

0,28 0,36

0,43e 0,38

HI. Geschmackstest

In Tabelle IV sind die Geschmacksbewertungeii angegeben, die 5 Personen des Tokyo Research Laboratory de Kyowa llakko 2prozentigen, wäürigtn lösungen der einzelnen Proben gaben:

Tabelle IV

XII

Probe	I	2	Versuch.«
	I	1	\
A	3	3	I
E	2	2	2
F	1	I	3
U	2	2	1
F	1	2	2
C	2	1	1
F	2	2	2
D	1	I	2
Λ	1	2	1
D	1	1	1
D	2	2	2
Ü	1	1	2
C	2	2	1
G	1	1	1
A	2	2	2
G	1	1	2
B	2	1	I
G	1	2	2
C	2	2	1
H	I	1	I
A	P-I	2	2
H	1	1	2
B	P-I	2	1
H	1	1	2
C		1

2 3

2 1 1

2 1 -ι 1

-v

2 i

1 2

2 1

2 L

Total

Hemerieiingen

starker Fleischgeschmack, angenehmer Geruch schwacher Fleischgeschmack, angenehmer Geruch

starker Fleischgeschmack, angenehmer Geruch

schwacher Fleischgeschmack, unangenehmer Geruch

starker Fleischgeschmack, unangenehmer Geruch

II. Versuchsdurchführung und Ergebnisse
80 1 einer lfl°/_oigen Hefesuspension (Candida utilis) werden mit Natronlauge auf den pH-Wert 8,5 gebracht und 10 Minuten auf KX)C erwärmt. Anschließend wird die Hefesuspension auf eine in der Tabelle III angegebene optimale Temperatur abgekühlt, bei der eine Zersetzung der Hefezellen stattfindet. In Tabelle IH sind außerdeir¹ die Versuchsbedingungen und die verwendeten Enzyme angegeben.

Nach der Zersetzung wird die Flüssigkeit mit Salzsäure auf den pH-Wert 6,0 gebracht und anschließend zentrifugiert. Die abgetrennte Flüssigkeit wird 2 Stunden auf 60° C erwärmt und sodann zu einem Hefeextrakt in Breiform eingedampft. Die Ausbeuten an Hefeextrakt und die Analysenergebnisse sind ebenfalls in Tabelle III aufgeführt.

Anmerkungen

Die Zahlen I, 2 und 3 geben die Einstufung durch die einzelnen Testpersonen wieder. Dabei bedeutet I das am besten bewertete Produkt, 2 das nächste und 3 das am niedrigsten bewertete.

IV. Zusammenfassung

Wie aus Tabelle IiI hervorgeht, erhält man beim ertiudungsgemäßen Verfahren unter Verwendung der durch Züchtung von Coprinus macrorhiziis f. microsporus ATCC 2OI2O_: Coprinus radians ATCC 200H und Coprinus inicaccus ATCC 20122 hergestellten Enzyme bessere Hefeextraktausbeuten als bei Verwendung der durch Züchtung von Flavobacterium sp. ATCC 21045, Trametes albida ATCC 20 119 oder Tiametes suaveolens A FCC 9417 hergestellten Enzyme oder der eingesetzten handelsüblichen und noch gereinigten /i-Glucanase. Außerdem sind der Gesamtstickstoffgehalt, Mononatiiumglutamatgehalt und Gesamtzuckei gehalt der ertindungsgemäß hergestellten Hefeextrakte höher als bei den Verfahren der genannten Patentveröffentlichungen. Dies bedeutet, daß die durch Züchtung von ATCC 20120, 20014 und 20122 gebildeten Enzyme eine stärkere Aktivität zur Auflösung der Flefezellen besitzet· als die anderen in Tabelle Hl aufgeführten Enzyme.
Außerdem geht aus Tabelle IV hervor, daß die nacr dein erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Hefe extrakte A, B und C im Vergleich zu den Extrakten D E, F, G und Fl einen starken Fleischgeschmack um einen angenehmen Geruch aufweisen. Dies zeig wiederum, daß die erfindungsgemäß verwendeten En

as zyme eine stärkere Aktivität zur Auflösung der Hefe zellen besitzen.

Claims

Patentansprüche:

1. Ve; Lihren zur Herstellung von Hefeextrakt durch Abbau der Hefen mit zellspaltenden Enzymen von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein zellspaltendes Enzym, das durch Coprinus macrorhizus f. microsporus ATCC 20120, Coprinus micaceus ATCC 20122 oder Coprinus radians ATCC 20014 gebildet wird, einsetzt und daß man den Hefeextrakt gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Behandlung der Hefen mit mindestens einem der zellspaltenden Enzyme ein enzymatischer Abbau mittels Protease durchgeführt wird.