DE2003981A1

DE2003981A1 - Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakten

Info

Publication number: DE2003981A1
Application number: DE19702003981
Authority: DE
Inventors: Kengo Ishida; Masanobu Kawai; Noboru Mukai; Atsushi Yamamoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-02-08
Filing date: 1970-01-29
Publication date: 1970-09-10
Also published as: JPS494379B1; GB1278561A; FR2033934A5; CA922576A; DE2003981C3; DE2003981B2; IT1050419B; NL7001583A; CH537156A

Description

" Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakten "

Priorität: 8. Februar 1969, Japan, Nr. 9004/69

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakten mit angenehmem Geschmack und Aroma, indem man ein neues zeilspaltendes Enzym mit einer Hefe zur Umsetzung ;bringt.

Neuerdings werden Fleischextrakte und Hefeextrakte usw., die einen natürlichen Geschmack und ein natürliches Aroma entwickeln können, häufig anstelle von cnemischen Würzen, wie Natriumglutamat, Natrium-5'-inosinat, Natrium-5'-guanylat oder Natriumsuccinat, verwendet, die keinen natürlichen Geschmack und kein natürliches Aroma besitzen.

Bisher wurden Hefeextrakte aus Kulturhefe entweder mittels 1) Extraktion, 2) Proteaseabbau, 3) Säurezersetzung oder 4) Auto lyse hergestellt. Diese herkömmlichen Verfahren sind jedoch nicht zufriedenstellend und haben eine lieihe von Nachteilen. Beispielsweise ist bei den Verfahren 1), urm 2) die Ausbeute gering und der Extrakt hat einen bitteren Geschmack. Bei dom Ver-

009837/1888

fahren 3) entsteht ein unangenehmer Geruch und wertvolle;Komponenten können abgebaut werden. Das Verfahren 4) ist schwierig zu steuern und kann nicht bei wärmegetrockneten

Hefezellen verwendet werden. ;

Aufgabe der Erfindung war es, -ein Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakten zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der herkömmlichen Verfahren nicht aufweist und womit sich Hefeextrakte von guter Qualität und mit angenehmem Geschmack und Aroma in hoher Ausbeute herstellen lassen. \

Dies wird erfindungsgemäss dadurch erreicht, dass man ein neues zeilspaltendes Enzym, das durch Stämme der Gattungen Coprinus, Daedaleposis oder Irpex gebildet wird und starke Glucanase- und Proteaseaktivität sowie die Fähigkeit besitzt, Hefezellen in kurzer Zeit und in charakteristischer Weise abzubauen und zu solubilisieren, mit Hefezellen oder Hefezellen enthaltenden Substanzen umsetzt, wodurch die Zellwände zerstört und das Protein in den Zellen abgebaut und solubilisiert und in Zucker, Amino- ^ säuren und Peptide umgewandelt wird, und dass man anschliessend die solubilisierten Substanzen aufkonzentriert oder pulverisiert.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakten, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Hefe mittels mindestens eines zeilspaltenden Enzyms, das durch einen Mikroorganismus der Gattung Coprinus, Daedaleopsis oder irpex gebildet wird, abbaut und den Hefeextrakt isoliert.

009837/1888

Die erfindungsgemäss verwendeten zeilspaltenden Enzyme werden durch Züchtung von Stämmen der Gattungen Coprinus, wie Coprinus macrorhizus f. microsporus, Coprinus radians, Coprinus micaceus, Daedaleopsis, wie Daedaleopsis styracina, JDaedaleopsis ' confragosa, Daedaleopsis tricolor, Daedaleopsis ηίρροηΐοφ. oder Irpex, wie Irpex .lacteus, in festem oder flüssigem Medium erhalten. Es ist erforderlich, dass das Medium eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle und andere für das Wachstum der Mikro-. Organismen notwendige Bestandteile enthält. Als Kohlenstoffquell'e können Sucrose, Stärke, Lactose, Maltose oder Dextrose, als Stickstoffquelle lösliche Schlempe, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Sojabohnenkuchen, Gluten, Aminosäuren, Ammoniumsalze, Nitrate oder Harnstoff verwendet werden. Darüberhinaus kann das Medium gegebenenfalls noch Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsälze, Phosphate oder Zink, Mangan, Eisen und Kobalt als Spurenelemente enthalten. \ '

Das zellspaltende Enzym wird im allgemeinen aus einer Enzymlösung hergestellt, die durch Abtrennung von Zellen aus einer Gärmaische nach herkömmlichen Enzymreindarstellungsverfahren, wie Ausfällung mit organischen Lösungsmitteln, Aussalzen, Aufkonzentrieren unter vermindertem Druck, Adsorption oder Desorption mittels Ionenaustausch erhalten wird. Jedoch können die Zellen, oder das Kulturbrühenfiltrat nach der Züchtung auch ohne;weitere Behandlung als Enzymquelle verwendet werden. :

Die erfindungsgemäss eingesetzte Hefe umfasst alle .üblichen Hefen, wie nach herkömmlichen Verfahren gezüchtete Backhefe, SuI-fitablaugenhefe, sogenannte "kohlenwaüaerütoffzehrende Hefen"₍ die in einem Kohlenwasserstoffmc.dium, wio n-Paraffinen, gezüchtet

ORIGINAL INSPECTED

wertöl oder Hefe, die aus der RückstartüGflüssigkeit bei der alkoholischen Gärung abgetrennt wurde. Diese Hefen können nach der Züchtung und Abtrennung in getrocknetem Zustand oder als Presshefen verwendet werden, man kann jedoch auch die Kulturbrühe ohne weitere Behandlung verwenden. Die Abbaufähigkeit des zeilspaltenden Enzyms wird zwar im allgemeinen erhöht, wenn man die Zellen durch Erhitzen abtötet, doch können auch ohne weiteres lebende Zellen verwendet werden.

Die Hefekonzentration, die Menge des zugegebenen Enzyms, Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und p^-Wert und sonstige Bedingungen zur Herstellung des Hefeextrakts hängen von der Art des verwendeten Enzyms und der Art der Probenahme aus einer Enzymquelle ab. Wird z.B. ein durch Stämme der Gattung Coprinüs, wie Coprinus macrorhizus f. microsporus oder Coprinüs radians, gebildetes Enzym verwendet, so liegen "optimale Bedingungen vor, wenn eine Suspension von Zellen verwendet wird, deren Hefekonzentration 5 bis 25 i» beträgt, der p„-V/ert mit Natriumhydroxid und sekundärem Natriumphosphat auf 8 bis 8,5 eingestellt, 0,02 bis 1,5 i» (bezogen auf das Trockengewicht der als Rohmaterial verwendeten Hefe) Enzym zugegeben und der Abbau 5 bis 48 Stunden bei 50 bis 55 C durchgeführt wird. Wird ein durch Stämme der Gattungen Daedaleopsis, wie Daedaleopsis styracina, oder Irpex, wie Irpex lacteus, gebildetes Enzym verwendet, werden vorzugsweise 0,02 bis 2 $> Enzym zur Hefezellensuspension mit einer Konzentration von 5 bis 25 $> gegeben und der enzymatische Abbau bei P_H 2,5 bis 3,0 und 5 bis 48 Std. bei 45 bis 50⁰C durchgeführt.

ORIGINAL INSPECTED

00.9837/1888

Im allgemeinen treten bei den Abbaureaktionen keine Störungen durch Infektionen auf, da die Temperatur meist hoch ist, doch können gegebenenfalls als Konservierungsmittel Äthylacetat oder Alkohole verwendet werden«

Durch die Abbaureaktion werden die Zellwänae der Hefezellen zerstört und die darin enthaltenen Polysaccharide und Proteine zu

Ribose,

Zuckern, wie Glucose, Mannose, Galactose,/verschiedenen geniessbaren Aminosäuren, hauptsächlich Glutaminsäure und Alanin, sowie niederen und mittleren Peptiden, abgebaut₀ Andererseits werden verschiedene Vitamine, Aminosäuren und nucleinsäureartigen Verbindungen,·organische Säuren und Phosphorsäureverbindungen, die in den Hefezellen oder dem Nährmedium enthalten sind, als lösliche Komponenten ausgenutzt. Wird die Hefe mittels eines durch Coprinus macrorhizus f. microsporus gebildeten Enzyms abgeoaut, so werden mehr als 90 °/o der Hefezellen solubilisiert und als Hefeextrakt gewonnen. Ferner bilden sich in den Abbauprodukten keine Bitterstoffe. Man kann die Menge der entstandenen Aminosäuren dadurch erhöhen, dass man ein handelsübliches Proteasepräparat nach dem Abbau mittels des zellspaltenden Enzyms zugibt.

Lie erhaltene Abbauflüssigkeit v/ird filtriert und das Filtrat durch Behandlung mit Aktivkohle, lonenaustauscherharzen oder nicntionischen Austauscherharzen auf den gewünschten Geschmack und das gewünschte Aroma abgestellt. Auch können Geschmack und Aroma uer Abbauflüssigkeit durch Zugabe von verschiedenen Aminosäuren und organischen Säuren, wie 5'-Nucleotiden oder Natriumglutamat, verändert werden.

009837/1888

Anschliessend wird das Abbaufiltrat auf p„ 5 bis 6,5 eingestellt und auf 40 bis 85 C erhitzt, um die Umsetzung der Zuckerarten mit den Aminosäuren zu beschleunigen, die durch den Abbau entstanden sind, wodurch eine "Alterung" erzielt wird. Die so gealterte Würzflüssigkeit wird entweder als solche als Hefeextrakt verwendet oder durch Aufkonzentrieren oder Sprühtrocknen in Pasten- bzw. Pulverform gebracht.

Wie vorstehend beschrieben, hat das erfindungsgemässe Verfahren unter Verwendung der neuen zeilspaltenden Enzyme eine Reihe von Vorteilen und ist daher sehr wertvoll. Beispielsweise können die Hefeextrakte aus der Hefe in hohen Ausbeuten hergestellt werden. Aus Trockenhefen, wie kohlenwasserstoffzehrenden Hefen oder SuI-fitablaugenhefen, lassen sich gute Würzen herste .en. Während des Abbaus bilden sich keine Bitterstoffe und d<;r Salzgehalt der Hefeextrakte ist gering. ,

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

in 20 Liter eines 3 $> Sucrose, 3 ^cß> lösliche Schlempe, 0,5 $> Hefezellen, 0,02 "ja Magnesiumsulfat und 0,5 "A primäres Kaliumphosphat enthaltenden Nähi'mediums wird Coprinus macrorhizus f. microsporus (ATCC 20120) unter Belüftung und Rühren bei 28⁰C 40 Std. gezüchtet (p_H 6,0). ^;

Die Zellen werden abfiltriert. Das erhaltene FiI trat wird mit

das man eine 75^-ige Aoetonlösung (Vol./Vol.) erhält./

einer solchen Menge Aceton versetzt,/Die entstandene Fällung wird gefriergetrocknet. Man erhält IYO g des rohen Enzyms.

ORIGINAL INSPECTED

009837/1888 |

In einem getrennten Behälter werden 80 Liter einer auf p,, 8,5 eingestellten 10 $-igen Suspension von Hefe der Art Candida utilis, die aus Sulfitablauge hergestellt wurde, 10 Min. auf

ο ο

ICO C erhitzt, dann abgekühlt und bei 55 G gehalten. 17 _;g des rohen Enzyms werden zugegeben, und der Abbau wird bei 55⁰C unter Rühren 10 Std. durchgeführt. Die Zellen werden in dieser Abbaustufe abgebaut und Zucker, Aminosäuren, Peptide, usw. freigesetzt. Die Abbauflüssigkeit wird mit Salzsäure auf ρ_Η 6,0 eingestellt. Durch Zentrifugieren werden 62 Liter Flüssigkeit abgetrennt. Der Gesamtfeststoffgehalt der abgetrennten Flüssigkeit beträgt 118 g/Liter, d.h., dass mehr als 90 $> des Heferohmaterials so^bilisiert sind. Die Flüssigkeit wird 2 Std. auf 60⁰C erhitzt und hierauf konzentriert. Man erhält 8,8 kg Hefeextrakt in Pastenform. Typische Analyse werte für die erhaltene . Würze sind folgende: Gesamtgehalt an Stickstoff 7_f9 i°\ Natriumglutamat 4,4 #; Gesamtgehalt an Zuckern 8,2 $>\ Aschegehalt 14,3 1»\ Kochsalz 2,8 56; Wassergehalt 16 96.

Der Geschmack einer 2 $-igen Lösung des erhaltenen Hefeextrakts wurde von 5 Personen nach der Profilmethode getestet. Alle Versuchspersonen gaben an, dass der Extrakt keinerlei bitteren,'son dern einen guten, kräftigen, fleischähnlichen Geschmack und ein volles fleischähnliches Aroma aufwies. ;

Beispiel 2 :

Durch Filtration einer Kulturbrühe von Coprinus macrorhizus f. microsporus, der nach dem Verfahren von Beispiel 1 gezüchtet worden war, erhält man 18 Liter Filtrat. ;

ORtGINAL INSPEQTEO

009637/1888 |

In einem getrennten Behälter werden 10 kg Trockenhefe, die durch Züchtung der Gattung Candida unter Verwendung von n-Paraffinen als Kohlenstoffquelle und Waschen mit Hexan und Wasser erhalten wurde, mit 82 Liter Wasser und 18 Liter des Piltrats versetzt. Der p„-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt, und die Hefezellen werden unter Rühren bei 55°C 8 Std. abgebaut. Die Flüssigkeit wird mit 400 g Aktivkohle versetzt und bei 6O⁰C 1 Std. gerührt und hierauf filtriert. Es werden 100 g Natrium-5¹-inosinat zugegeben, und das Piltrat wird in einem Sprühtrockner getrocknet. Man erhält 10,2 kg hellgelbes Pulver.

Typische Analysewerte für die erhaltene Würze sind folgende: Wassergehalt 4 #, Kochsalzgehalt 2,5 $>, Gesamtgehalt an Stickstoff 8,1 #, Natriumglutamatgehalt 5,1 "/«, Aschegehalt 17,5 $>. Es wurde kein bitterer oder unangenehmer Geschmack und kein*ölgeruch festgestellt.

Beispiel 3

In 20 Liter eines 3 i» Sucrose, 3 ^c/° lösliche Schlempe, 0,3 i> Hefeextrakt, 0,04 i> Magnesiumsulfat und 0,5 $ primäres Kaliumphosphat enthaltenden Nährmediums wird Daedaleopsis styracina (ATCC 20188) unter Belüftung und Rühren 72 Std. gezüchtet. Die Zellen werden abfiltriert und auf übliche Weise mit Aceton dehydratisiert. Man erhält 400 g Trockenzellen. :

In einem getrennten Behälter werden 50 Liter einer 8 $-igen Hefesuspension (bezogen auf das Trockengewicht) auf p„ 3»0 eingestellt und 10 Min. auf 100°C erhitzt und dann abgekühlt. Die Gesamtmenge der auf diese Weise erhaltenen Trockenzellen der Gattung Daedaleopsis styracina wird zu der Suspension gegeben und

• 009837/1888 original inspected

der Abbau der Hefezellen wird 5 Std. bei A¹J⁰C durchgeführt» Hierauf wird der p^-Wert mit Natriumhydroxid auf 7,2 eingestellt, und anschliessend werden 8 g des von Kyowa Hakko Kogyo Co. unter dem Warenzeichen "Prozyme" vertriebenen PrJteaseenzyms zugegeben. Der Abbau wird 3 Std. bei 48 C durchgeführt. Es bildet sich eine grosse Menge Aminosäuren. Der ρ,,-Wert wird hierauf mit Salzsäure auf 6,0 eingestellt, und mittels Zentrifugieren werden 38 Liter Flüssigkeit abgetrennt. Der Gesamtfeststoffgehalt in der Flüssigkeit beträgt 95 g/Liter, und 90 ^c/o der Hefezellen s'ind solubilisiert. Durch Aufkonzentrieren unter vermindertem Druck erhält man aus dieser Flüssigkeit 20 Liter einer flüssigen Würze.

Beispiel 4

In 20 Liter eines 3 °/> Sucrose, 3 ^c/> lösliche Schlempe, 0,5 $ Hefezellen, 0,05 $> Magnesiumsulfat und 0,6 $ primäres Kaliumphosphat enthaltenden Nährmediums wird Irpex lacteus (ATGC 20123) unter Belüftung und ßühren 72 Std. gezüchtet (p_H 5,0). i»ie Zellen werden abfiltriert und mit 65 ^cß> (Gew./Vol.) Ammoniumsulfat versetzt. Die erhaltene Fällung wird in V/asser gelöst und elektrodialysiert. Durch Gefriertrocknen erhält man 19 g des rohen Enzyms.

In einem getrennten Behälter wird eine Hefegärmaische erhalten, indem man Saccharomyces cerevisiae 30 Std. bei 28 C in 200 Liter eines 5 # Glucose, 0,5 1» Pepton, 0,5 ^ Hefeextrakt, 0,15 $ sekundäres Kaliumphosphat, 0,02 $> Magnesiumsulfat und 0,2 '/£ CaI-ciumcarbonat enthaltenden Nährmediums züchtet (p,, 6,0). Die erhaltene Kulturbrühe wird 15 Min. auf 95°C erhitzt und hierauf ab gekühlt. Der Pu-Wert wird mit Salzoäure auf 3,0 eingestellt. Die gesamte Menge dee rohen Enzyme wird zugegeben und die Zellen wer-

009837/1888

- ίο -

den 10 Std. bei 50 C abgebaut» Anschliessend wird der ρ '-Wert mit Natriumhydroxid auf 5,8 eingestellt, und durch Zentrifugieren werden 185 Liter Flüssigkeit abgetrennt. Die erhaltene Flüssigkeit enthält verschiedene organiscne Säuren und nucleinsäureartige Substanzen, die die Hefe zusammen mit ihren Abbauprodukten bildet. Die Flüssigkeit wird mit 9 kg Aktivkohle versetzt, bei 60 C 1 Std. gerührt und hierauf filtriert. Das erhaltene Filtrat wird mit 2 kg Natriumglutamat versetzt. ,Durch Aufkonzentrieren unter vermindertem Druck erhält man 27 kg einer Würze in Pastenform. i

Beispiel 5

Durch Filtration einer Kulturbrühe von Coprinus radians (ATCC 20014) und Coprinus micaceus (ATCC 201<2), die im wesentlichen nach dem Verfahren von Beispiel 1 gezüchtet wurden, erhält man 18 Liter Filtrat.

In einem getrennten Behälter werden 82 Liter Wasser und 18 Liter Filtrat des rohen Enzyms zu 10 kg Trockenhefezellen gegeben, die durch Züchtung von Hefe der Gattung Candida unter Verwendung von η-Paraffinen als Kohlenstoffquelle und Waschen mit Hexan und Wasser hergestellt wurden. Der p„-Wert wird mit Natriumhydroxid auf 8,5 eingestellt, und die Hefezellen werden bei 55⁰C 8 Std. abgebaut. Hierauf wird der p„-Wert der Abbauflüssigkeit mit Salzsäure auf 6,0 eingestellt, und durch Zentrifugieren werden 80 Liter Flüssigkeit· abgetrennt.

0 0 9 8 3 7/1888 »™*™- ^lf^^{PECTED :}

Die Flüssigkeit wird mit 400 g Aktivkohle versetzt, bei (?0°C 1 Std. gerührt und hierauf filtriert. Das Piltrat wird mit 100 g

L^Tatrium~5'-inosinat versetzt und in einem Sprühtrockner getrocknet. Man erhält 9,8 bzw. in einem anderen Versuch l6_f5 kg hellgelbes Pulver. _ '· ■

INSPECTED

009837/1888 . ;

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Hefeextrakten, dadurch gekennzeichnet, dass man Hefe mittels mindestens eines zellspaltenden Enzyms, das durch einen Mikroorganismus der Gattung Coprinus, Daedaleopsis oder Irpex gebildet wird, abbaut und den Hefeextrakt isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Hefezellen vor dem enzymatischen

i Abbau durch Erhitzen abtötet. j

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Coprinus macrorhizus f. nicrosporus verwendet. !

4. Verfahren nach Anspruch 1, —tl· a durch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Coprinus radians verwendet. . ί

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Coprinus micaceus verwendet. '<

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

zeichnet, dass man als Mikroorganismus Daedaleopsis styracina verwendet. ·

ORIGINAL INSPECTED

009837/1888

20Q3981

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Irpex lacteus verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man deri Hefeextrakt nach dem enzymatischen Abbau mit einem Proteaseenzym behandelt.

ORlQiNAL INSPECTED

009837/1888