DE3000188A1 - Verfahren zur herstellung eines hefeextrakts - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines hefeextrakts

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DE3000188A1
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autolysis
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Tomoyoshi Hachiya
Kanagawa Kawasaki
Hiroshi Takashima
Tetsuo Tanekawa
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Ajinomoto Co Inc
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Description

BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Hefeextrakts mit ausgezeichnet hoher Qualität und mit verbessertem Aroma und Geschmack. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Hefeextrakts, der durch verbesserte Geschmackstärke bzw. verbesserten Körper des Geschmacks gekennzeichnet ist. Dieses Verfahren umfaßt die nachstehenden Verfahrensstufen, in denen suspendierte Hefezellen durch Autolyse unter Bedingungen zersetzt werden, unter denen die Zersetzung von intrazellulärer RNA so weit wie möglich unterdrückt wird, die RNA aus den autolysierten Hefezellen durch Erhitzen der Autolysat-Suspension extrahiert wird und die extrahierte RNA mit Hilfe eines Enzyms unter Bildung von 5'-Nucleotiden hydrolysiert wird.
Während die Versorgung mit Rindfleischextrakt oder Walextrakt begrenzt ist, kann Hefeextrakt in einfacher Weise in großen Mengen und zu niederem Preis aus Bäckerhefe und Bierhefe hergestellt werden und wurde bereits in weitem Umfang als Bestandteil verschiedener Würzmittel verwendet.
Gemäß einer üblichen Methode können Hefeextrakte durch Autolyse oder durch Hydrolyse unter Verwendung von Enzymen, Säuren oder Alkalien hergestellt werden. Unter diesen Methoden ist die Autolyse die am stärksten bevorzugte Methode, da die Qualität des erhaltenen Hefeextrakts ausgezeichnet ist.
Es ist bekannt, daß die Qualität des Hefeextrakts, insbesondere die Stärke oder der Körper des Geschmacks, durch Zugabe von Dinatrium-guanosin-5'-monophosphat (GMP) oder Dinatrium-inosin-5'-monophosphat (IMP), das als Geschmackstoff des Shiitake-Pilzes oder von getrocknetem Blaufisch (Skipjack) bekannt ist, verbessert werden kann.
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Es ist außerdem gut bekannt, daß in Hefeζeilen eine beträchtliche Menge an RNA enthalten ist. Ungünstigerweise kann jedoch ein Hefeextrakt, der einen wesentlichen Anteil an Geschmack verursachenden 5'-Nucleotiden, wie GMP, enthält, nicht erhalten werden, da die intrazelluläre RNA von Hefezellen normalerweise während des Autolyse-Vorgangs unter Bildung von nicht geschmacksbildenden niedermolekularen Substanzen, wie Nucleosiden oder Basen, zersetzt wird. Außerdem ist die Menge an GMP, unter der Annahme, daß GMP während der Autolyse gebildet wird, zu gering, um die Qualität des Hefeextrakts zu verbessern. Tatsächlich läßt sich in handelsüblichen Hefeextrakten kein geschmacksbildendes 5'-Nucleotid feststellen.
Nach einer üblichen Methode wird ein Hefeextrakt, der als Geschmackstoffe wirkende 5'-Nucleotide enthält, durch Extraktion einer intrazellulären RNA aus Hefezellen hergestellt, indem eine Suspension von Hefezellen, die 5 bis 15 % NaCl enthält, erhitzt wird, die extrahierte RNA mit Hilfe von 5'-Phosphodiesterase zu 5'-Nucleotiden, die GMP enthalten, hydrolysiert wird,, und schließlich die erhaltenen, geschmacksbildenden 5'-Nucleotide zu einer mit Säure oder Enzym hydrolysierten Lösung der als Rückstand erhaltenen Hefezellen zugefügt r aus denen die RNA vorher extrahiert worden ist.
Dieses übliche Verfahren ist jedoch unwirtschaftlich, da teures Enzym eingesetzt werden muß und da bei diesem Verfahren keinerlei Enzym eingesetzt wird, welches in den Hefezellen selbst enthalten ist und welches zur Autolyse oder Hydrolyse der Hefezellen befähigt ist. Darüber hinaus ist die Qualität des gebildeten Hefeextrakts nicht gut, da dieser nicht durch die Autolysemethode hergestellt worden ist.
Außerdem ist ein weiteres übliches Verfahren zur Herstellung eines Hefeextrakts, der als Geschmackstoff wirksames 5f-Nucleotid enthält, bekannt, bei dem spezielle Enzyme, welche von einem Mikroorganismus der Gruppe der Strahlenpilze stammen, angewendet werden, um in dem Autolyse-Prozeß die als Geschmackstoffe dienenden 5'-Nucleotide auszubilden.
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Dieses bekannte Verfahren kann jedoch nicht praktisch angewendet werden, da die Ungefährlichkeit des Enzyms und des zur Herstellung des Enzyms verwendeten Mikroorganismus' nicht gesetzlich bestätigt ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung eines Hefeextrakts zur Verfügung zu stellen, der als Geschmackstoff wirkendes 5'-Nucleotid enthält und verbesserte Stärke bzw. verbesserten Körper des Geschmacks besitzt.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß in autolysierten Hefezellen 50 bis 80 % der intrazellulären RNA unzersetzt zurückbleibt, während der größte Teil des Proteins der Hefezellen nahezu in die aufbauenden Aminosäuren und Oligopeptide hydrolysiert wird, wenn die Autolyse der Hefezellen bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 6,6, vorzugsweise im Bereich von 6,2 bis 6,4 durchgeführt wird, und daß die zurückbleibende intrazelluläre RNA in einfacher Weise aus den autolysierten Hefezellen extrahiert werden kann, indem die Autolysatlösung ohne Verwendung von NaCl erhitzt wird, und daß ein Hefeextrakt, der als Geschmackstoff 5f-Nucleotid enthält und verbesserte Stärke bzw. verbesserten Körper des Geschmacks besitzt, erhalten werden kann, indem die extrahierte RNA mit 5'-Phosphodiesterase oder 5'-Phosphodiesterase und einer AMP-Desaminase hydrolysiert wird, um das als Geschmackstoff dienende 5'-Nucleotid, wie GMP und IMP, zu bilden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch folgende Verfahrensstufen gekennzeichnet:
(1) Autolyse von Hefezellen in Gegenwart eines Stimulators für die Autolyse bei einem konstanten pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 6,6, insbesondere von 6,2 bis 6,4, und bei einer Temperatur von 30 bis 600C während 10 bis 30 Stunden;
(2) Erhitzen der der Autolyse unterworfenen Suspension der Hefezellen während 1,0 bis 3,0 Stunden auf eine Temperatur von 90 bis 1000C, um die zurückgebliebene RNA zu extrahieren,
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und anschließendes Durchführen der nachstehenden Stufen in jeder geeigneten Reihenfolge:
(3) Hydrolyse der extrahierten RNA mit 5'-Phosphodiesterase und gewünschtenfalls Umwandlung von AMP in IMP mit AMP-Desaminase, sowie
(4) Abtrennen des gebildeten klaren Extrakts von dem unlöslichen Rückstand.
Erfindungsgemäß kann jede beliebige Hefe aus der großen Vielfalt von eßbaren Hefen angewendet werden. Zu diesen Hefen gehören Bäckerhefe,wie Saccharomyces cerevisiae CBS 1172, CBS 1234, Bierhefe, wie Saccharomyces cerevisiae CBS 1171, CBS 1230, und Saccharomyces uvarum CBS 1503, sowie Saccharomyces carlsbergensis IFO 2015, Sakehefe, wie Saccharomyces cerevisiae IFO 2165, IFO 2342, Weinhefe, wie Saccharomyces cerevisiae IAM 4274 und Pichia farinosa C3S 2004 oder CBS 2006.
Die in dieser Beschreibung durch CBS-Hinterlegungsnummern definierten Hefestämme sind von dem Centraalbureau voor Schimmelkultures, Baarn, Holland, frei erhältlich.
.Hefestämme, die durch IFO-Hinterlegungsnummern gekennzeichnet sind, sind von dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan, frei erhältlich.
Für die Zwecke der Erfindung werden die Hefezellen mit Hilfe einer vollständig üblichen Methode unter Verwendung eines Kulturmediums hergestellt, welches eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysat, Melasse, organische Säuren oder einen Alkohol enthält.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Hefezellen, die als Rückstände beim Brauen von Bier, Sake und Wein erhalten werden, besonders gut geeignet. Diese Hefezellen können ohne vorherige Isolierung der Hefezellen direkt der Autolyse unterworfen werden.
Unter den vorstehend genannten Hefezellen werden frische Hefezellen, die durch Züchten von Bäcker- oder Bierhefe, insbesondere
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Saccharomyces cerevisiae CBS 1171 oder CBS 1172, unter aeroben Bedingungen in einem üblichen Nährkulturmedium erhalten werden, besonders bevorzugt, da ein aus frischen Hefezellen erhaltener Hefeextrakt weniger unangenehmen Geruch oder Geschmack hat, als ein aus anderen Hefezellen gewonnener.
Bei der Durchführung der Autolyse beträgt die Menge der Hefezellen in der Suspension vorzugsweise 5 bis 20 Gewichtsprozent, angegeben als Trockengewicht.
Die Autolyse wird normalerweise in Gegenwart von 1 bis 5 % eines Stimulators für die Autolyse, wie Äthylacetat, bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 6,6 bei einer Temperatur von 30° bis 600C, insbesondere bei einem pH-Wert von 6,2 bis 6,4 bei einer Temperatur von 45 bis 55°C vorgenommen und wird gewöhnlich während 10 bis 30 Stunden durchgeführt.
Während des Verlaufes der Autolyse fällt der pH-Wert der Suspension von Hefezellen scharf ab; es ist daher erforderlich, den pH-Wert durch Zugabe von Alkali zu der Suspension innerhalb des vorstehend angegebenen Bereiches einzustellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß zuerst die Autolyse von Hefezellen in wirksamer Weise unter den angegebenen spezifischen Bedingungen durchgeführt wird, unter denen das Protein der Hefezellen wirksam bis zu den aufbauenden Aminosäuren und Oligopeptiden hydrolysiert wird, während die Zersetzung oder Hydrolyse der intrazellulären RNA soweit wie möglich unterdrückt wird, d.h., indem die Autolyse bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 6,6 durchgeführt wird.
Wenn die Autolyse der Hefezellen bei dem vorstehend angegebenen konstanten pH-Wert durchgeführt wird, wird zwar ein Teil der intrazellulären RNA zu nicht geschmacksbildenden niedermolekularen Bestandteilen hydrolysiert, 50 bis 80 % der RNA verbleiben jedoch in nicht zersetzter Form in den autolysierten Hefezellen und andere Komponenten als RNA, wie Proteine, werden in wirksamer Weise zu den aufbauenden Aminosäuren und Oligopeptiden hydrolysiert. Die Ausbeute an Feststoffen, ausgedrückt durch
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das prozentuale Verhältnis von Gesamtextrakt an Feststoffen zu Hefezellen, erreicht gewöhnlich 40 bis 65 %·
Das zweite charakteristische Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß in Stufe (2) die verbliebene RNA durch Erhitzen der autolysierten Hefezellen ohne Verwendung von NaCl aus den autolysierten Hefezellen extrahiert wird.
Normalerweise ist es zur wirksamen Extraktion von RNA aus Hefezellen erforderlich, eine ziemlich hoch konzentrierte NaCl-Losung zu verwenden, da RNA ohne Verwendung von NaCl nicht extrahiert werden kann.
Im Vergleich mit den üblichen Verfahren kann erfindungsgemäß die verbliebene intrazelluläre RNA der autolysierten Hefezellen in einfacher Weise lediglich durch Erhitzen der Autolyse-Suspension auf eine Temperatur von 90 bis 1000C während 1 bis 3 Stunden ohne Verwendung von NaCl extrahiert werden.
Sowohl die Ausbeute an Feststoffen, als auch die Menge der extrahierten RNA, d.h. die Menge des geschmacksbildenden 5-Nucleotids, in dem resultierenden Hefeextrakt werden in hohem Maß durch den pH-Wert beeinflußt, bei welchem die Autolyse durchgeführt wird. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, wird zwar bei Durchführung der Autolyse bei einem pH-Wert von weniger als 6,0 (5,5 bis 5,8) eine Ausbeute an Feststoffen von mehr als 60 %, d.h. mit einem relativ hohen Wert, erreicht, das Verhältnis der GMP-Bildung (prozentuales Verhältnis von 5'-GMP/extrahierter getrockneter Hefe) hat so niedrige Werte wie 0 bis 0,17 %. Es scheint, daß die intrazelluläre RNA durch die in den Hefezellen vorliegenden RNA zersetzenden Enzyme fast vollständig zu nicht geschmacksbildenden Bestandteilen zersetzt worden ist.
Wenn die Autolyse von Hefezellen bei einem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 6,6 durchgeführt wird, sind sowohl die Ausbeute an Feststoffen, als auch die Rate bzw. das Verhältnis der GMP-Bildung hoch und aus diesem Grund wird die Autolyse der Hefezellen vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 6,6 durchgeführt.
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untersucht man die auftretenden Erscheinungen genauer, so wird festgestellt, daß in diesem pH-Bereich die Ausbeute an Feststoffen allmählich absinkt, daß jedoch im Gegensatz dazu die Rate der GMP-Bildung erhöht wird, wenn der pH-Wert von 6,0 auf 6,6 ansteigt. Der GMP-Gehalt eines gewünschten Hefeextrakts kann daher geregelt werden, indem der pH-Wert gewählt wird, bei welchem die Autolyse durchgeführt wird.
Wenn die Autolyse der Hefezellen bei einem pH-Wert von mehr als 6,6 durchgeführt wird, ist die Ausbeute an Feststoff zu niedrig, um· das Verfahren wirtschaftlich durchzuführen.
Nach der Extraktion der RNA kann der unlösliche Rückstand, der hauptsächlich aus den Zellwänden der Hefe besteht und in der erhitzten Suspension vorliegt, mit Hilfe einer völlig üblichen Methode, wie durch Zentrifugieren und Filtration, entfernt werden. Der Zeitpunkt der Entfernung des unlöslichen Rückstands kann entweder nach Stufe (2), der Extraktion der RNA, oder nach Stufe (3}> der Hydrolyse von RNA zu 5'-Nucleotiden mit Hilfe von 5*-Phosphodiesterase, gewählt werden.
Das dritte kennzeichnende Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in Stufe (4), der Ausbildung des geschmacksbildenden 5'-Nucleotids in der Autolysat-Lösung oder -Suspension durch Hydrolyse der extrahierten RNA mit Hilfe von 5'-Phosphodiesterase zu 5'-Nucleotiden und gewünschtenfalls Umwandlung von AMP in IMP mit Hilfe von AMP-Desaminase.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden 5'-Phosphodiesterasen verwendet, die befähigt sind, RNA zu GMP und AMP enthaltenden 5'-Nucleotiden zu hydrolysieren. So kann beispielsweise 5'-Phosphodiesterase verwendet werden, die aus Mikroorganismen der Genera Aspergillus und Penicillium oder aus Malz oder Malzwurzeln stammt. Unter diesen Enzymen wird vorzugsweise das Enzym aus Malzwurzeln angewendet, da es in einfacher Weise aus billigen, handelsüblichen Malzwurzeln erhältlich ist und da es zurwirksamen Hydrolyse von RNA befähigt ist und darüber hinaus kein Zweifel im Hinblick auf die Ungefährlichkeit des Enzyms besteht. Für die Zwecke der Erfindung werden handels-
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übliche Malzwurzeln zu kleinen Stücken zerkleinert,in Wasser getaucht, um das Enzym zu extrahieren, und das klare Filtrat wird dann 5 bis 10 Minuten auf eine Temperatur von 60 bis 65°C erhitzt, um ein schädliches Enzym zu inaktivieren, welches das resultierende 5'-Nucleotid zu 5f-Nucleosid und Base zersetzt.
Wenn eine aus Malzwurzeln abgeleitete 5'-Phosphodiesterase verwendet wird, muß die Anwendung von Phosphationen als Puffersubstanz in dem Autolysevorgang vermieden werden, da die enzymatische Aktivität in Gegenwart von 4x10" m Phosphationen vollständig inhibiert wird.
Es ist außerdem vorteilhaft, von der Zugabe von Milchsäure vor der Hydrolyse von RMA abzusehen, da die normalerweise zur Verbesserung der Qualität von Hefeextrakt verwendete Milchsäure auch die enzymatische Aktivität inhibiert.
Bei der Hydrolyse von RNA beträgt die Menge der Malzwurzeln, die als Enzymquelle zur Hydrolyse von RNA erforderlich ist, 10 bis 30 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht der erhitzten· Autolysat-Lösung.
Die Hydrolyse der RNA wird gewöhnlich bei neutralem pH-Vert und einer Temperatur von 50 bis 60°C während 2 bis 20 Stunden durchgeführt. Auf diese Weise wird die extrahierte RNA zu 5'-Nucleotiden, die GMP und AMP enthalten, hydrolysiert. Das gebildete AMP kann gewünschtenfalls mit Hilfe von AMP-Desaminase in geschmacksbildendes IMP übergeführt werden und zu diesem Zweck kann eine beliebige aus einer Vielfalt bekannter AMP-Desaminasen verwendet werden.
Unter solchen bekannten AMP-Desaminasen wird vorzugsweise das Enzym aus einem gelben Koji-Schtmmelpilz, wie Aspergillus oryzae oder Aspergillus sojae, verwendet, da sowohl das Enzym, als auch der das Enzym bildende Fungus bei der Verwendung für Nahrungsmittel ungefährlich sind.
Für die Zwecke der Erfindung kann eine AMP-Deaminase mit Hilfe einer üblichen Methode zur Züchtung dieser Fungi in einem üblichen Nährkulturmedium hergestellt werden.
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Vorzugsweise wird ein wässriger Extrakt eines festen Kulturmediums des gelben Koji-Schimmels oder eine rohe Enzymzubereitung verwendet, die daraus mit Hilfe einer völlig üblichen Methode, wie der Methode des Aussalzens unter Verwendung von (NH. )pSO^ oder Na2SO^, erhalten wird.
Als rohe AMP-Desaminase kann außerdem vorteilhaft eine handelsübliche Snzymzubereitung für medizinische Zwecke verwendet werden, wie Takadiastase.
Die Menge des Rohenzyms für die Umwandlung von AMP in IMP beträgt 0,05 bis 0,2 Gewichtsprozent Rohprotein, bezogen auf die verwendeten Hefezellen, angegeben auf trockener Basis.
Die enzymatische Reaktion zur Umwandlung von AMP in IMP wird gewöhnlich bei einem pH-Wert in der Nähe des optimalen pH-Werts des verwendeten Enzyms und bei einer Temperatur im Bereich von 30 bis 55°C während 2 bis 10 Stunden durchgeführt. Die Dauer der Enzymreaktion kann vermindert werden, indem diese Enzymreaktion gleichzeitig mit der Reaktion der Hydrolyse von RNA zu 5'-Nucleotiden durchgeführt wird.
Nach der Enzymreaktion wird das Gemisch vorzugsweise während bis 10 Minuten auf eine Temperatur von 90 bis 1000C erhitzt „. um die enzymatische Aktivität zu zerstören» Danach v/ird durch Abtrennen des unlöslichen Rückstandes ein klarer Hefeextrakt erhalten, der das 5'-Nucleotid als Geschmackstoff enthält.
Der so erhaltene Hefeextrakt kann in Form einer Lösung für verschiedene Nahrungsmittel und Getränke verwendet werden. Die Extrakte können außerdem als Pasten mit einem Wassergehalt von 30 bis 60 % Anwendung finden, die durch Konzentrieren des klaren Hefeextrakts unter vermindertem Druck oder mit Hilfe einer osmotischen Membran hergestellt werden. Darüber hinaus kann der Hefeextrakt in Form von Pulver oder Granulat eingesetzt werden^ das mit Hilfe einer üblichen Methode, wie durch Sprühtrocknung, hergestellt wird.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von spezifischen Beispielen
ausführlicher erläutert, soll jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt sein.
Beispiel 1
50 Liter eines Nährmediums, das 5 % Glucose, 1 % Ammoniumsulfat, 0,3 % KH2PO4, 0,1 % MgSO4.7H2O, 0,05 % CaCl2-2H2O, 0,1 % Maisquellflüssigkeit enthielt und einen pH-Wert von 5,5 hatte, wurden in einen 70 Liter-Krugfermenter gegeben und 15 Minuten lang bei 1100C sterilisiert. Danach wurde das Medium mit 200 ml einer Impfkulturbrühe von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae CBS 1523), die unter Schütteln unter aeroben Bedingungen in dem. gleichen Kulturmedium bei 300C während 18 Stunden gezüchtet worden war, eingeimpft und die Kultur wurde aerob bei 30 C während 20 Stunden unter kräftiger Belüftung (1/2 V.V.M) und unter Rühren mit 500 Upn> unter einem Druck von 0,5 kg/cm durchgeführt.
Nach der Züchtung wurden durch Zentrifugieren 2,75 kg Hefezellen in Form eines Kuchens mit einem Wassergehalt von 60 % erhalten.
Der Kuchen wurde dann mit Wasser gewaschen und schließlich wurde dem Kuchen Wasser zugesetzt, so daß 8,0 Liter einer Suspension der Hefezellen gebildet wurden.
Die Suspension wurde mit 150 ml Äthylacetat vermischt, wobei durch Rühren gut durchmischt wurde. Dann wurde die Suspension in 1,0 Liter-Anteile der Suspension unterteilt und der pH-Wert der Anteile der Suspension wurde in der in Tabelle 1 gezeigten Weise mit 30 % NaOH auf Werte im Bereich von 5,5 bis 7,5 eingestellt. Jede der Suspensionen wurde 18 Stunden lang bei 45°C stehengelassen und jeder pH-Wert wurde während der Autolyse mit Hilfe von Alkali kontrolliert.
Nach der Autolyse wurde jede Autolysat-Suspension 2,0 Stunden auf 900C erhitzt. Auf diese Weise wurden die verbliebenen Enzyme desaktiviert und die verbliebene RNA wurde extrahiert.
Andererseits wurden 20 Liter Wasser zu 20 kg handelsüblicher Malzkeime gegeben und das Gemisch wurde zerkleinert. Durch Entfernen des Rückstands durch Filtration wurde ein klarer Extrakt
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erhalten, der 5 Minuten lang auf 63°C erhitzt wurde, um 5'-Nu-Cleotidase zu inaktivieren, wobei eine rohe Enzymlösung für die Hydrolyse von RNA erhalten wurde.
Zu jeder der vorstehend hergestellten erhitzten Suspensionen wurden 200 ml der Rohenzymlösung zugesetzt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der Suspension auf 6,0 wurde die enzymatische Reaktion 5 Stunden lang bei 6O0C durchgeführt. Nach der Enzymreaktion wurde jedes der Reaktionsgemische 5 Minuten auf 90 C erhitzt und ein klarer Extrakt wurde durch Entfernen des unlöslichen Rückstands durch Zentrifugieren erhalten. Der klare Extrakt wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei Hefeextrakt in Form von Pulver erhalten wurde. Bei jedem der Ansätze wurde die Ausbeute an Feststoff und die Rate der 5'-GMP-BiIdung (prozentuales Verhältnis von GMP im Hefeextrakt/GMP in den ursprünglichen Hefezellen) gemessen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wirkung, des pH-Wertes auf die Ausbeute an Feststoff und die Rate der GMP-Bildung.
pH der Ausbeute an Autolyse Feststoff (
61
5,8 65
6,0 65
6,2 64
6,4 57
6,6 41
7,0 25
7,5 15
Rate der GMP-Gehalt im
GMP-Bildung {_%) Extrakt (%)
4,2 0,17
TO 0,41
18 0,75
25 1,17
30 1,95
21 2,67
20 3,55
Für die in Tabelle 1 angegebenen Werte wurde der RNA-Gehalt der Hefezellen nach der Methode von Schmidt-Thannhauser und Schneider
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bestimmt und der GMP-Gehalt der RNA der Hefezellen wurde unter der Annahme errechnet, daß die 4 verschiedenen Basen (Guanidin, Adenin, Uracil und Cytosin) in gleichen Anteilen vorliegen.
Der Anteil an GMP in dem erhaltenen Hefeextrakt wurde durch Flüssigkeits-Kolonnenchromatographie unter Verwendung einer mit einem Kationenaustauscherharz (LSZIZ) gefüllten Kolonne bestimmt. Zu der Bestimmung wurde das Elutionsmittel (H^PO^- NaOH Pufferlösung, pH 2,6) in einer Strömungsrate von 0,6 ml/min bei 400C durch die Kolonne (4 mm 0 χ 500 mm) geleitet. ¥ie in Tabelle 1 gezeigt ist, waren sowohl die Ausbeute an Feststoff, als auch die GMP-Bildungs-Rate hoch, wenn die Autolyse bei einem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 6,6 durchgeführt wurde. Durch die Ergebnisse eines organoleptischen Tests, der von einer Gruppe mit 20 Mitgliedern, die speziell für diesen Test ausgebildet waren, durchgeführt wurde, wurde festgestellt, daß der durch Autolyse bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,6, insbesondere bei einem pH-Wert von 6,2 bis 6,4, erhaltene Hefeextrakt in geringerem Maße einen ungünstigen Geruch hat, der auf die Hefe selbst zurückzuführen ist und,eine Würzkraft oder einen Geschmackskörper zeigt, der dem von Rindfleischextrakt gleicht und daß die Qualität des Hefeextrakts aufgrund seines starken würzigen Geschmacks ausgezeichnet ist.
Beispiel 2
1,0 Liter einer in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellten Hefezellen-Suspension wurde mit 30 ml Äthylacetat vermischt und die Autolyse der Hefezellen wurde 20 Stunden unter leichtem Rühren bei einem pH-Wert von 6,2 und einer Temperatur von 52°C durchgeführt. Während dieser Dauer wurde der pH-Wert der Suspension mit Hilfe von Alkali auf etwa 6,2 eingestellt. Nach der Autolyse wurde die Autolysat-Suspension 2,0 Stunden auf 92 C erhitzt, wodurch unerwünschte Enzyme desaktiviert wurden und die verbliebene intrazelluläre RNA extrahiert wurde. Aus der erhitzten Lösung wurde durch Zentrifugieren eine klare Extraktlösung erhalten und die zum Waschen des Rückstands
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verwendete Lösung wurde ebenfalls zu der klaren Lösung zugefügt. Auf diese Weise wurde 1 Liter Hefeextrakt erhalten.
Andererseits wurden 2 verschiedene Arten von Rohenzym-Zubereitungen mit Hilfe einer vollständig üblichen Methode hergestellt.
Zuerst wurden jeweils 50 ml eines Kulturmediums, das 5 % Glucose, 0,5 % Pepton, 0,1 % KH2PO4, 0,04 % MgSO4-TH2O, 0,04 % CaCl2 und 0,1 % Phytin enthielt und einen pH-Wert von 7,0 hatte, in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben und durch zehnminütiges Erhitzen auf 12O0C sterilisiert. Nachdem jedes der Medien abgekühlt war, wurden 1,5 nil Äthanol zugesetzt und dann wurde das Kulturmedium mit Penicillium citrinum IAM 1131, der auf Kartoffeldextrose-Schrägagar gezüchtet worden war, beimpft und die Kultur wurde unter aeroben Bedingungen unter Schütteln bei 300C während 3 Tagen durchgeführt- Nach der Züchtung wurde das klare Kulturfil trat 15 Minuten auf 600C erhitzt, um störende 5'-Nucleotidase zu inaktivieren, wobei 250 ml Rohenzymlösung erhalten wurden.
Zur Herstellung von AMP-Desaminase wurde Aspergillus oryzae ATCC 14578, der auf Kartoffeldextrose-Schrägagar gezüchtet worden war, in.jeweils 50 ml eines sterilisierten Kulturmediums eingeimpft, das 5 % Glucose, 0,5. % KH2PO4, 0,1 % MgSO4-TH2O und 0,05 % Maisquellflüssigkeit enthielt und einen pH-Wert von 6,0 hatte, und die Züchtung wurde 2 Tage lang unter Schütteln bei 300C durchgeführt .
Zu dem klaren Filtrat wurde festes Ammoniumsulfat zugesetzt und das durch achtzigprozentige Sättigung mit festem Ammonium-■ sulfat ausgefällte rohe Enzym wurde durch Filtration gewaschen, mit einer Äthanol-Wasser-Lösung (Äthanol zu V/asser = 2:1) gewaschen, und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 0,2 g einer Rohenzymzubereitung erhalten wurde.
Zu 1,0 Liter des vorher hergestellten Hefeextrakts wurden 250 ml der aus Penicillium citrinum erhaltenen Rohenzymlösung zugefügt land nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 4,5 wurde die Mischladung Z Stunden bei 700C stehengelassen, um die extrahierte RNA zu 5'-Nucleotiden zu hydrolysieren. Nach der Enzymreaktion
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wurde der pH-Wert der Lösung mit Alkali auf 6,0 eingestellt und 0,2 g AMP-Desaminase in Form des Rohenzyins wurde zugesetzt und die enzyinatische Reaktion wurde 3 Stunden bei 45 C durchgeführt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 95°C erhitzt und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 86 g Hefeextrakt erhalten wurden. Der gebildete Hefeextrakt enthielt 0,78 % 5'-GMP und 0,7 % 5'-IMP und hatte starken, würzigen Geschmack.
Beispiel 3
Pichia farinosa CBS 2006, die auf Kartoffeldextrose-Schrägagar gezüchtet worden war, wurde in ein Kulturmedium eingeimpft, das 0,5 % Ammoniumacetat, 1 % Maisquellflüssigkeit, 0,2 % KH2PO^, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,1 % MgSO^.7HpO enthielt, und die Züchtung wurde bei einem pH-Wert von 6,0 und einer Temperatur von 300C durchgeführt. Der pH-Wert wurde während der Züchtung durch Zugabe eines Gemisches aus Essigsäure und Ammoniumacetat bei 6,0 gehalten. Nachdem das maximale Wachstum erreicht worden war, wurde die Kultur unterbrochen und die Hefezellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen. Nach dem Waschen mit Wasser wurde 1,0 Hefepaste mit einem Viassergehalt von 85 % erhalten und diese wurde 20 Stunden bei 45°C stehengelassen, um die Autolyse durchzuführen. Der pH-Wert der Paste wurde während der Autolyse mit Hilfe von dreißigprozentiger NaOH bei 6,6 gehalten. Dann wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 50 g Hefeextrakt mit einem Wassergehalt von 5 % hergestellt. Der so gebildete Hefeextrakt enthielt 1,4 % 5'-GMP und hatte starken würzigen Geschmack.
030029/0803

Claims (4)

  1. ΛΛΓέΝ TANV^ÄLT E
    SCHIFF ν. FÜNER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBBINGHAUS FINCK
    MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-800O MÖNCHEN 95
    PROFESSIONAL REPRESENTATIVES ALSO BEPORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE
    • KARL LUDWIG SCHIFF (1364-1978)
    DIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNER
    DIPL. ING. PETER STREHL
    DhPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPP
    DIPL. ING. DIETER EBBINGHAUS
    DR. ING. OIETER FINCK
    TELEFON (Ο39) 48 3Ο54 TELEX 5-23 565 AURO D TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN
    DEA - 13 357
    AJINOMOTO CO., INC. 4. Januar 1980
    Verfahren zur Herstellung eines Hefeextrakts
    PATENTANSPRÜCHE
    ·.) Verfahren zur Herstellung eines Hefeextrakts, der als Geschmackstoff ein 5'-Nucleotid enthält und verbesserte Würzkraft bzw. Stärke des Geschmacks aufweist, dadurch gekennzeichnet , daß man
    (1) suspendierte Hefezellen in Gegenwart eines Stimulators für die Autolyse bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 6,6 autolysiert,
    (2) die durch Autolyse erhaltene Suspension 1 bis 3 Stunden auf eine Temperatur von 90 bis 100°C erhitzt, um verbliebene intrazelluläre RNA zu extrahieren, und danach folgende Stufen in beliebiger Reihenfolge durchführt:
    030029/0803
    30001Π8
    (3) Hydrolyse der extrahierten RNA mit einer 51-Phosphodiesterase und erforderlichenfalls Umwandlung
    von AMP in IMP mit einer AMP-Desaminase, und
    (4) Abtrennen des erhaltenen klaren Extrakts von dem unlöslichen Rückstand.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Stufe (2) zuerst die Stufe (3) und danach die Stufe (4) durchführt.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Stufe (2) die Stufe (4) und dann
    die Stufe (3) durchführt.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet , daß man als 5'-Phosphodiesterase aus Malz oder Malzwurzeln stammende 5f-Phosphodiesterase einsetzt.
    030029/0803
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