DE2712007C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft das stabilisierte
Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat
des Anspruchs 1 und die Herstellung eines solchen gemäß
Anspruch 10. Die Unteransprüche 2 bis 9 und 11 bis 18 nennen
Ausgestaltungen der Erfindung.
Die als Isomerisierung bekannte Umwandlung von Dextrose in
Lävulose liefert ein Produkt, das in der Praxis einen vollwertigen
Ersatz für handelsüblichen Invertzucker darstellt. Bei
der Isomerisierung geht man von Dextrose aus, einem Monosaccharid,
das nur etwa 70% der Süßkraft von Saccharose besitzt, und wandelt
bis zu etwa 50% davon in einen Zucker um, der etwa 140%
der Süßkraft von Saccharose oder Invertzucker besitzt. Dieses
besondere Süßungsvermögen ist es, das die Stärkeindustrie an
lävulosehaltigem Maissirup (der heute üblicherweise als fructosereicher
Maissirup [HFSC] bezeichnet wird) und dem Verfahren
zur Herstellung derartiger Sirupe so stark interessiert.
Die Erforschung des enzymatischen Isomerisierungsverfahrens
begann 1955. Diese Arbeiten haben ihren Niederschlag im US-Patent
29 50 228 und einer Veröffentlichung von Marshall und Kooi
in Science, 125, 648 (1957), gefunden. Seit dieser Zeit sind
die Veröffentlichungen über Arbeiten von Forschern, die durch
die grundlegenden Arbeiten von Marshall und Kooi angeregt
wurden, in Fachliteratur und Patenten buchstäblich explosionsartig
angeschwollen.
Eine der wichtigeren Veröffentlichungen auf diesem Gebiet stellt
der Vorabdruck des Manuskriptes eines Berichtes von Dr. Sato und
Dr. Tsumura vom Japanese Food Research Institute auf der Jahrestagung
der Agricultural Chemical Society of Japan in Sapporo
am 20. Juli 1964 dar. In diesem 1964 erschienenen Vorabdruck
und dem am 7. Oktober 1966 veröffentlichten japanischen Patent
17 640 offenbarten Dr. Sato und Dr. Tsumura, daß mehrere
Stämme von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, wenn sie
auf Xylose kultiviert werden, das Enzym Glucoseisomerase erzeugen
sowie, daß dieses Enzym die Isomerisierung von Glucose zu
Fructose bewirkt. Im Zuge nachfolgender Entwicklungsarbeiten
stellte eine andere Gruppe von Wissenschaftlern unter der Leitung
von Dr. Takasaki vom Japanese Fermentation Research
Institute, einem Organ des Ministry of International Trade and
Industry (MITI), fest, daß bestimmte Stämme von Mikroorganismen
der Gattung Streptomyces, die Xylan, ein Polymer der Xylose,
assimilieren, auf Xylan kultiviert werden können und dabei
Glucoseisomerase erzeugen (jap. Patentschrift 27 525 und
US-Patentschrift 36 16 221).
Die Hersteller von hochfructosehaltigem Maissirup haben festgestellt,
daß die enzymatische Isomerisierung von Glucose vorzugsweise
kontinuierlich durchgeführt werden sollte, um ein
kommerziell annehmbares fructosereiches Maissirupprodukt wirtschaftlich
herzustellen. In der Regel wird bei derartigen Verfahren
ein Glucosesirup mit einer großen Menge eines auf einer
inerten Trägersubstanz aufgebrachten Glucoseisomerase-Enzympräparats
in Berührung gebracht, d. h. einem immobilisierten
Glucoseisomerase-Enzympräparat. Ein wesentlicher Punkt eines derartigen
Verfahrens ist es, daß man ein immobilisiertes Glucoseisomerase-
Enzympräparat verwendet, das pro Volumeneinheit
eine hohe Isomeraseaktivitätskonzentration aufweist, so daß es
sich für den Einsatz in einem kontinuierlichen enzymatischen
Isomerisierungsverfahren eignet.
Glucoseisomerase wird in der Regel intrazellular erzeugt, d. h.,
daß der größte Teil des Glucoseisomerase-Enzyms innerhalb der
und/oder an den Zellwänden der Mikroorganismen sitzt, von denen
es erzeugt wird. Bei einigen kontinuierlichen Isomerisierungsverfahren
verwendet man die ganzen, die Glucoseisomerase enthaltenden
Zellen. Bei derartigen Verfahren ist es in der Regel
erforderlich, die Zellen einer speziellen Behandlung zu unterwerfen,
durch die verhindert wird, daß die Glucoseisomerase
aus den Zellen extrahiert wird, so daß bei dieser Behandlung
somit im Endeffekt das Enzym in den Zellen selbst immobilisiert
wird, und/oder spezielle Vorrichtungen zu verwenden, um die hydraulischen
Probleme lösen zu können, die damit verbunden sind,
die glucosehaltige Lösung durch das Bett aus das Glucoseisomerase-
Enzym enthaltenden Zellen zu treiben. Verfahren, bei
denen ganze Glucoseisomerase enthaltende Zellen verwendet
werden, sind beispielsweise in den US-Patentschriften 36 94 314,
37 53 858, 37 79 869, 38 17 832 und 38 21 086 sowie den deutschen
Offenlegungsschriften 23 17 680 und 23 45 186 beschrieben.
Diese Verfahren, bei denen ganze, Glucoseisomerase enthaltende
Zellen verwendet werden, sind mit einer Reihe von Nachteilen
behaftet. Nachteilig sind dabei u. a. das Auftreten hydraulischer
Probleme, die Bildung von Verunreinigungen aufgrund
der Anwesenheit anderer Enzyme als Isomerase, von Nucleinsäuren
und anderen Stoffen in den Zellwänden sowie längerer
notwendiger Kontaktzeiten zwischen der Glucoselösung und dem
Zell-Enzympräparat, wobei letztere unter alkalischen Bedingungen
zur Bildung unerwünschter, durch alkalikatalysierte Reaktion
aus Fructose entstehender Produkte, wie Psicose und Hydroxymethylfurfural
(HMF) führen. Die vorstehenden Probleme führen
zu höheren Herstellungskosten aufgrund der zur Entfernung
der erzeugten Verunreinigungen erforderlichen Reinigung und/oder
zur Erzeugung eines minderwertigen Produktes.
Um die bei der Verwendung ganzer, intrazellulare Glucoseisomerase
enthaltender Zellen auftretenden Probleme zu lösen, wurden
nach dem Stand der Technik bereits Verfahren vorgeschlagen, bei
denen die Glucoseisomerase aus den Zellen abgetrennt wird,
um sie in eine lösliche Form zu bringen, worauf man sie an
einem nicht-wasserlöslichen inerten Träger immobilisiert. Das
immobilisierte Enzym eignet sich dann zur Verwendung bei der
kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in einen hochfructosehaltigen
Maissirup. Beispiele derartiger Verfahren sind in
den US-Patentschriften 37 08 397, 37 88 945, 38 50 751 und
38 68 304, der belgischen Patentschrift 8 19 859 und der US-
Patentanmeldung 5 05 823 bzw. der belgischen Patentschrift
8 10 480 beschrieben.
Diese Verfahren, bei denen zellfreie immobilisierte Glucoseisomerase
verwendet wird, lösen zwar einige der mit der Verwendung
ganzer Zellen verbundenen Probleme, erfordern jedoch
die Solubilisierung der Glucoseisomerase, d. h., die Abtrennung
der Glucoseisomerase von bzw. aus den ganzen Zellen. Verfahren
zur Solubilisierung der Glucoseisomerase sind zwar
bekannt, jedoch ist es wünschenswert, zellfreie und lösliche
Glucoseisomerase in hochreiner Form zu erhalten, die eine
hohe Isomeraseaktivität pro Volumeneinheit aufweist. Die Verwendung
eines hochgereinigten und -konzentrierten Enzyms erhöht
nämlich die Effizienz, mit der das Enzym auf den unlöslichen
Träger aufgebracht werden kann.
Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Glucoseisomerase
aus Mikroorganismenzellen in konzentrierter und gereinigter
Form machten bislang die Anwendung teurer und komplizierter Arbeitsgänge
erforderlich, die nur für Versuchsarbeiten im kleinen
Labormaßstab geeignet waren.
Ein derartiges Laborverfahren zum Extrahieren und Reinigen
solubilisierter Glucoseisomerase ist von Danno und Mitarbeitern
in Agr. Biol. Chem., Band 31, Seiten 284 bis 292 (1967), beschrieben
worden. Danno und Mitarbeiter beschrieben ein Verfahren
zum Reinigen von aus Bacillus coagulans, Stamm HN-68 stammender
Glucoseisomerase, bei dem man mit Äthylendiamintetraessigsäure
(EDTA) behandelte Zellen der Einwirkung von Lysozym
aussetzt, um einen zellfreien Extrakt herzustellen, aus dem man
dann durch Behandeln mit Mangansulfat unerwünschte Stoffe ausfällt.
Die überstehende Flüssigkeit wird dann mehrmals mit
Ammoniumsulfat behandelt, um eine proteinhaltige Glucoseisomerasefraktion
auszufällen, die durch Dialyse und Chromatographie
an DEAE-Sephadex A-50 weiter gereinigt
wird. Auf diese Weise wird angeblich eine Konzentrationssteigerung
auf das 60fache erreicht.
Eine andere Labormethode zum Reinigen von Glucoseisomerase wurde
von Takasaki und Mitarbeitern beschrieben (Agri. Biol. Chem.,
Band 33, Seiten 1527 bis 1534 [1969], und "Fermentation Advances",
Seiten 561 bis 589 [1969]), Academic Press, Inc., New York,
New York). Takasaki und Mitarbeiter offenbarten, daß intrazellulare
Glucoseisomerase von Streptomyces albus aus den
Zellen durch Behandlung mit einem kationischen Netzmittel,
Cetylpyridiniumchlorid, freigesetzt und dann fraktioniert werden
kann, indem man den zellfreien Extrakt mit Aceton behandelt,
dialysiert, anschließend nacheinander in einer mit DEAE-Cellulose
gefüllten und einer mit DEAE-Sephadex gefüllten chromatographischen
Säule chromatographiert und schließlich einer
weiteren Dialyse unterwirft. Der gereinigte zellfreie Extrakt
wurde dann weiter durch Diaylse in einer pro Liter 0,005 Mol Magnesiumsulfat
und 0,0002 Mol CoCl₂ enthaltenden Lösung gereinigt.
Zu der dabei erhaltenen Lösung wurde allmählich Aceton bis zu
einer Konzentration von 40, 45 und schließlich 50% zugegeben,
um das Glucoseisomerase-Enzym zu kristallisieren. Dieses Verfahren
ist zu kompliziert und zeitraubend, um beim Arbeiten
in großem Maßstab angewendet werden zu können.
Aus der US-Patentschrift 37 08 397 ist ein weiteres derartiges
Verfahren bekannt, bei dem Glucoseisomerase aus mit EDTA behandelten
Zellen von auf Weizenkleie kultivierten Mikroorganismen
der Spezies Streptomyces phaeochromogenes durch Behandeln mit
einer Lysozym, Toluol, Magnesiumchlorid, einen Puffer und Wasser
enthaltenden Lösung abgetrennt werden. Die lysierte Aufschlämmung
wird dann mit Magnesiumchlorid behandelt, worauf man
das Enzym schließlich durch allmähliche Zugabe von kaltem
Aceton ausfällt. Die so erhaltene Enzymfällung wird in Wasser
gelöst und an DEAE-Cellulose immobilisiert, wodurch man einen
zur Umwandlung von Glucose in einen fructosereichen Maissirup
verwendbaren Biokatalysator erhält. Bei einem weiteren, aus
der US-Patentschrift 37 88 945 bekannten Verfahren wird von
auf Xylose und Xylanhydrolysat kultivierten Mikroorganismen
vom Stamm Streptomyces sp, ATCC 21 175, stammende intrazelluläre
Glucoseisomerase mit einem kationischen Netzmittel (Arquad
18-50) und dann mit DEAE-Cellulose behandelt, um Nicht-Isomerasematerial
abzutrennen. Das Glucoseisomerase enthaltende
Filtrat wird dann an DEAE-Cellulose oder einem synthetischen
Anionaustauscherharz immobilisiert, wodurch man einen Biokatalysator
für die kontinuierliche Umwandlung von Glucose
in hochfructosehaltigen Maissirup erhält.
Auch in den US-Patentschriften 38 47 740 und 38 47 741 ist
ein derartiges Verfahren beschrieben, bei dem intrazellulare
Glucoseisomerase enthaltende Zellen mit einer kleinen Menge
eines Netzmittels, Tween 80, in
einer gepufferten Glycinlösung behandelt werden. Nach innigem
Durchmischen werden die Zelltrümmer entfernt, wobei man ein
17,5 Isomeraseaktivitätseinheiten pro ml enthaltendes Filtrat
erhält.
Aus der US-Patentschrift 38 47 740 ist ein Verfahren zum Immobilisieren
gereinigter Glucoseisomerase-Präparate an einem
basischen Magnesiumcarbonat-Träger und aus den US-Patentschriften
38 50 751 und 38 68 304 ein Verfahren zum Immobilisieren von
Glucoseisomerase-Präparaten an Aluminiumoxyd-Trägern mit geregelter
Porosität bekannt. Die Verwendung auf diese Weise
erhaltener immobilisierter Enzympräparate ergibt zwar überlegene
Verfahren zur Erzeugung hochfructosehaltiger Maissriupe,
erfordert jedoch hochgereinigte und -konzentrierte Glucoseisomerase,
um sie effizient und wirtschaftlich industriell
nutzen zu können.
Trotz der vorstehend beschriebenen Verfahren besteht somit immer
noch ein Bedarf an einem wirtschaftlichen Verfahren, nach dem
in großem Maßstab im wesentlichen lösliche und gereinigte
Glucoseisomerase-Präparate hergestellt werden können, die eine
hohe Aktivität pro Volumeneinheit und eine hohe Stabilität
besitzen und sich zur Herstellung von bei kontinuierlichen
Verfahren zum Herstellen hochfructosehaltiger Maissirupe verwendbaren
Biokatalysatoren durch Binden bzw. Immobilisieren
des Glucoseisomerase-Präparats an einen wasserunlöslichen
Träger eignen, aber auch an sich wertvoll und nützlich sowie
in anderen Immobilisierungsverfahren brauchbar sind.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, derartige Glucoseisomerase-
Enzymkonzentrate zur Verfügung zu stellen und
ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen.
Diese Aufgabe wird durch das stabilisierte Glucoseisomerase-
Enzymkonzentrat des Patentanspruchs 1 gelöst.
Die Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate der Erfindung sind
so stabil, daß sie bei Lagerung unter den angegebenen Bedingungen
durchschnittlich etwa 95% ihrer anfänglichen Aktivität behalten
und vorzugsweise sogar so stabil, daß sie bis zu 80±10% ihrer
anfänglichen Isomeraseaktivität behalten, wenn sie bis zu
12 Monate lang bei 18°C gelagert werden.
Das erfindungsgemäße Enzymkonzentrat enthält vorzugsweise
zusätzlich 5 bis 25 Gew.-% Methanol, Ethanol, Propanol,
tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise
Propan-2-ol. Es besitzt ferner vorzugsweise
eine Isomeraseaktivität von mindestens 5000 und insbesondere
mindestens 8000 IGIU/g Trockensubstanz.
Vorzugsweise beträgt der Proteingehalt des Enzymkonzentrats
60 bis 75 Gew.-%, bezogen auf die Trockensubstanz, und das
Mg++-Protein-Verhältnis liegt vorzugsweise zwischen 0,03 und
0,5, wobei das Konzentrat vorzugsweise einen Mg++-Gehalt von
5 bis 25 mg/ml Enzymkonzentrat aufweist.
Ferner beträgt der Wassergehalt des erfindungsgemäßen Enzymkonzentrats
vorzugsweise 50 bis 80 und der Trockensubstanzgehalt
5 bis 30 Gew.-%.
Ferner stammt vorzugsweise die in dem Enzymkonzentrat enthaltene
Glucoseisomerase von den Streptomyces olivochromogenes
ATCC 21 713, ATCC 21 714 und/oder ATCC 21 715.
Ein ganz besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Glucoseisomerase-
Enzymkonzentrat enthält 20 bis 30 Gew.-% Propan-2-ol und
55 bis 70 Gew.-% Wasser, während sein Mg++-Gehalt aus Magnesiumacetat,
-chlorid und/oder -sulfat stammt.
Das erfindungsgemäße Enzymkonzentrat kann nach dem Verfahren
des Patentanspruchs 10 hergestellt werden.
Der in der Stufe a) dieses Verfahrens erhaltene Glucoseisomerase-
Magnesium-Niederschlag kann nach an sich bekannten
Methoden, beispielsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt
werden.
Das Enzymkonzentrat kann dazu verwendet werden, auf wasserunlösliche
Träger, beispielsweise DEAE-Cellulose, synthetische
Anionenaustauscherharze, poröse, wasserunlösliche Materialien,
wie basisches Magnesiumcarbonat und poröse Aluminiumoxydmaterialien,
aufgebracht zu werden zur Herstellung von Biokatalysatoren,
die zur kontinuierlichen Umwandlung von Glucose
in Fructose geeignet sind. Das abgetrennte Enzymkonzentrat,
das in Form eines dicken Breies bzw. einer dicken Aufschlämmung
vorliegt, wird vorzugsweise mit einer kleinen
Menge Wasser verdünnt, um es leichter auf wasserunlöslichen
Trägern unter Bildung außerordentlich stabiler, immobilisierter
Glucoseisomerase-Biokatalysatoren mit hoher Isomeraseaktivität
pro Trägervolumeneinheit sorbierbar zu machen. Das
Konzentrations-, Reinigungs- und Stabilisierungsverfahren
ergibt eine Steigerung der Enzymkonzentration auf mehr als
das 70fache und insbesondere mehr als das 100fache der in
der ursprünglichen Kulturbrühe vorliegenden Konzentration.
Das Enzymkonzentrat ist außerdem 10- bis 15mal reiner als das
ursprüngliche Enzym.
Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens zur Herstellung
des erfindungsgemäßen Enzymkonzentrats sind Gegenstand der
Patentansprüche 11 bis 18.
Wegen der Vielfalt und oftmals fehlenden Eindeutigkeit der
im gegebenen Zusammenhang allgemein gebräuchlichen Fachausdrücke
werden nachfolgend einige Definitionen gegeben, die das Verständnis
der Beschreibung und der Ansprüche erleichtern und
exakte und eindeutige Angaben ermöglichen sollen.
"DE" ist eine gebräuchliche Abkürzung für die Bezeichnung "Dextroseäquivalent",
die den Gehalt einer Substanz an reduzierenden
Zuckern, berechnet als Dextrose und angegeben in Prozent
des gesamten Feststoffgehaltes, bedeutet.
Der Ausdruck "Stärkehydrolysat" wird als allgemeiner Begriff
zur Bezeichnung eines Sirup- oder Trockenproduktes benutzt, das
durch Hydrolyse von Stärke hergestellt ist. Ein derartiges
Produkt kann durch saure und/oder enzymatische Hydrolyse hergestellt
werden. Für die Isomerisierung bevorzugt
verwendbare Stärkehydrolyse erhält man durch Verflüssigung
bzw. Verdünnung von Stärke mit Säure oder Enzym bis
zu einem DE von 10 oder weniger und anschließende enzymatische
Verzuckerung bis zu einem DE von über 90 und vorzugsweise über
95. Die Bezeichnung "Dextrose" ist im wirtschaftlichen Sprachgebrauch
üblicherweise dem raffinierten, kristallinen Zucker
(einem Monosaccharid) vorbehalten, der aus einem hochgradig
konvertierten Stärkehydrolysat gewonnen wird. Die Bezeichnung
"Glucose" wird in der Beschreibung und den Ansprüchen sowohl
in ihrer im wirtschaftlichen Sprachgebrauch üblichen Bedeutung
als auch zur Bezeichnung des Monosaccharids Dextrose in beliebiger
Form, gleich, ob in Lösung oder trocken, als Bestandteil
eines Stärkehydrolysatsirups oder von Stärkehydrolysatfeststoffen
oder aber in raffinierter kristalliner Form gebraucht.
Die Ausdrücke "Fructose" und "Lävulose" werden vom Fachmann in der
Regel gegeneinander austauschbar zur Bezeichnung des linksdrehenden
Isomeren der Glucose gebraucht, das süßer als Dextrose
ist. Dieses Isomere kommt in der Natur im Honig und in Invertzucker
zusammen mit Glucose vor und wird wegen seiner hohen
Süßkraft geschätzt. Nachfolgend wird dieses Monosaccharid als
"Fructose" bezeichnet.
"Glucoseisomerase" ist ein Enzym oder Enzympräparat, das Xylose
zu Xylulose und Glucose zur Fructose isomerisieren kann.
Die vorherrschende Aktivität dieses Enzyms ist die Umwandlung
von Xylose in Xylulose, so daß die Bezeichnung "Xyloseisomerase"
die wissenschaftlich exakteste Benennung darstellt (EC 5.3.1.5.).
Dieses Enzym ist fachsprachlich auch schon als "Dextroseisomerase",
"Xylose-(Dextrose-)Isomerase" und "Glucoseisomerase" bezeichnet
worden. Die gebräuchlichste Bezeichnung ist "Glucoseisomerase",
so daß nachstehend dieser Ausdruck der Einfachheit und leichteren
Verständlichkeit wegen benutzt wird.
In der Beschreibung und den Ansprüchen beziehen sich Angaben
in Teilen und Prozenten stets auf das Gewicht des jeweiligen
Produktes, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.
Die Angabe "IGIU" ist eine Abkürzung der Bezeichnung
International Glucose Isomerase Unit (Internatinonale Glucoseisomeraseeinheit).
Eine IGIU ist diejenige Glucoseisomerasemenge,
die in einer 0,8molaren Glucoselösung bei pH 7,5 und 60°C
sowie unter Anwendung der nachstehend beschriebenen Testmethode
ein Mikromol Fructose pro Minute erzeugt.
Bei der zur Bestimmung der Isomeraseaktivität benutzten Testmethode
wird die in einer Glucoselösung unter standardisierten
Bedingungen erzeugte Ketose spektrophotometrisch bestimmt.
Zur Durchführung der Isomeraseaktivitätsbestimmung wird zunächst
jeweils eine Probestammlösung nach folgender Rezeptur angesetzt:
Das Enzympräparat, dessen Aktivität bestimmt werden soll,
wird zunächst so weit verdünnt, daß es 1 bis 6 IGIU/ml enthält.
Dann führt man eine enzymatische Isomerisierung durch, indem
man 3 ml der Probe-Stammlösung mit 1 ml des verdünnten Enzympräparats
versetzt und das Gemisch 30 Minuten bei 60°C bebrütet.
Am Ende der Inkubationsperiode wird eine 1 ml-Probe gezogen
und in 9 ml 0,5normaler Perchlorsäure "abgeschreckt". Die abgeschreckte
Probe wird dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml
verdünnt. Zu Vergleichszwecken wird jeweils auf analoge Weise
ein Blindversuch durchgeführt, wobei statt 1 ml der zu
untersuchenden Enzympräparatlösung 1 ml Wasser am Beginn der
Bebrütungszeit zugegeben wird. Der Ketosegehalt wird dann nach
der Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Wie vorstehend bereits
erwähnt, wird die nach dieser Methode bestimmte Aktivität
in IGIU angegeben, wobei eine IGIU als diejenige Enzymaktivität
definiert ist, die erforderlich ist, um unter den
vorstehend beschriebenen Isomerisierungsbedingungen ein Mikromol
Fructose pro Minute zu erzeugen.
"Lysozym" (EC 3.2.1.17) ist ein Enzym, das β-1,4-Bindungen
zwischen N-Acetylmuraminsäure (oder 2-Acetamido-2-dexoxy-D-
glucose) und 2-Acetamido-2-desoxy-D-glucoseresten in Mucopolysacchariden,
Mucopolypeptiden oder in Chitin hydrolysiert.
Lysozym wird in der Regel aus Eiweiß erzeugt. Es katalysiert
die Hydrolyse (Lyse) der Zellwände vieler Mikroorganismen.
Aufgrund des erwähnten Verfahrens, nachdem die erfindungsgemäßen
Enzymkonzentrate hergestellt werden können, sind sie
im wesentlichen frei von Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure
(RNA) und Desoxyribonucleinsäure (DNA).
Die stabilisierten Enzymkonzentrate weisen, wenn sie in
flüsiger Form vorliegen, in der Regel eine Magnesiummolarität
in einem Bereich von etwa 0,1 bis 2 und vorzugsweise 0,2 bis
1,0 Magnesium pro Liter auf, wobei ihr Wassergehalt insbesondere
55 bis 70% und ihr Trockensubstanzgehalt 20 bis 30 Gew.-%
beträgt. Ferner enthalten sie kein zugesetztes Kobalt.
Bei der Durchführung des obenerwähnten Verfahrens zur Herstellung
der erfindungsgemäßen Enzymkonzentrate sollten die
Temperatur- und pH-Bedingungen so gewählt werden, daß das
Enzym nicht inaktiviert wird. In der Regel sollte der pH-Wert
während aller Verfahrensstufen in einem Bereich von etwa 6
bis 9 und insbesondere zwischen 7 und 7,5 liegen. Die Temperatur
kann zweckmäßigerweise in einem Bereich von etwa 5 bis 55,
vorzugsweise 15 bis etwa 35 und insbesondere 25 bis 30°C
liegen.
Als im wesentlichen wasserlösliches Magnesiumsalz wird beim
Verfahren der Erfindung vorzugsweise ein Salz verwendet, das
bei Raumtemperatur in Wasser in einer Konzentration von etwa 0,02
bis 2 Mol/Liter im wesentlichen löslich ist. Typische geeignete
Magnesiumsalze sind beispielsweise Magnesiumchlorid, -bromid,
-nitrat, -sulfatheptahydrat, -acetat und -lactat. Vorzugsweise
verwendet man Magnesiumchlorid und insbesondere Magnesiumsulfat
(wenn in dieser Beschreibung Magnesiumsulfat erwähnt wird, so
ist damit stets die Heptahydratform gemeint).
Die beim Verfahren der Erfindung verwendete Menge an im wesentlichen
wasserlöslichen Magnesiumsalz sollte zumindest so hoch
gewählt werden, daß die die wäßrige Aufschlämmung des wasserlöslichen
organischen Lösungsmittels und der zellfreien Glucoseisomerase
enthaltende Flüssigkeit bezüglich ihres Magnesiumionengehaltes
mindestens etwa 0,02 molar ist. Die obere Grenze
der Magnesiumsalzkonzentration schwankt in Abhängigkeit von
dem jeweils verwendeten Salz. Man sollte nicht soviel Magnesiumsalz
zusetzen, daß ein totaler "Aussalzeffekt" oder eine
Salz-Wasser-Phasentrennung auftritt. Allgemein gesagt, liegt
die Höchstmenge an Magnesiumsalz in der Lösung bei etwa 0,3 Mol/
Liter. Vorzugsweise sollte die Magnesiumsalzkonzentration in
der Lösung in einem Bereich von etwa 0,02 bis etwa 0,2 Mol Magnesiumionen/
Liter liegen. Die besten Ergebnisse erzielt man,
wie gefunden wurde, wenn man das Magnesiumsalz in einer Menge
zusetzt, die eine Magnesiumionenkonzentration in der Lösung
von etwa 0,05 Mol/Liter ergibt.
Die intrazellulare Glucoseisomerase, aus der die stabilisierten
Enzymkonzentrate der Erfindung hergestellt werden, kann aus
jedem geeigneten Mikroorganismus gewonnen werden, der Glucoseisomerase
zu erzeugen vermag.
Das intrazellulare, Glucoseisomerase enthaltende Enzym wird
vorzugsweise hergestellt, indem man einen Glucoseisomerase
erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium,
das eine geeignete Kohlenstoffquelle und andere entsprechende
Nährstoffe enthält, kultiviert und das Enzym sich dabei bilden
läßt.
Beispielsweise stellt man zunächst eine Impfkultur eines Glucoseisomerase
erzeugenden Stammes, z. B. auf einer Agar-Platte, her
und beimpft damit ein geeignetes Kulturmedium. Dann läßt man
den Mikroorganismus wachsen und intrazellular Glucoseisomerase
(nachstehend kurz "intrazellulare
Glucoseisomerase") erzeugen. Die Inkubationsdauer kann, je nachdem,
welcher spezielle Mikroorganismus auf welchem Kulturmedium
jeweils gerade verwendet wird, innerhalb eines breiten Bereiches
schwanken und liegt vorzugsweise zwischen 4 und 48 Stunden.
Dann wird eine Teilmenge der auf diese Weise erhaltenen Impfkultur
dazu verwendet, ein geeignetes Kulturmedium in einer oder
mehreren Entwicklungsstufen zu beimpfen, worauf das Inoculum
aus der letzten Entwicklungsstufe zum Beimpfen eines geeigneten
Kulturmediums in einem (Produktions-)Fermenter verwendet wird.
Die die Mikroorganismen mit der intrazellularen Glucoseisomerase enthaltende Kulturbrühe
kann nach jeder beliebigen geeigneten Methode
konzentriert werden, z. B. durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren.
Die Zellpaste aus intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden
Zellen liegt dann in zur weiteren Aufarbeitung nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren geeigneter Form vor.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Es sei darauf hingewiesen, daß sich
Angaben in Teilen jeweils auf das Gewicht beziehen, wenn nichts
anderes angegeben ist. Die in den Beispielen angegebenen Glucoseisomeraseaktivitäten
wurden nach der vorstehend beschriebenen
Methode bestimmt und sind jeweils in IGIU angegeben.
Die zur Herstellung des stabilisierten Enzymkonzentrats verwendeten,
intrazellulare Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismen wurden in vier mit 1 Liter fassenden
Schüttelkolben beginnenden und bis zu 3785,4 Liter fassenden
Impfkultur-Tanks führenden Impfkultur-Entwicklungsstufen sowie
einer abschließenden Produktionsstufe in 75 708 Liter fassenden
Fermentern hergestellt. Jede der aufeinanderfolgenden Entwicklungsstufen
und die Fermenter der Produktionsstufe wurden
jeweils mit einer 5 Vol.-% des Fassungsvermögens des beimpften
Fermentationsgefäßes entsprechenden Impfkulturmenge angeimpft.
Die Zusammensetzung der Kulturmedien für die Impfkultur-Entwicklung
und die Produktionsstufe sind aus der nachfolgenden
Tabelle I zu ersehen. Die Kulturmedien für alle Stufen wurden jeweils
30 Minuten bei 120°C sterilisiert. Die Fermentations- bzw.
Bebrütungszeiten bei der Impfkultur-Entwicklung betrugen 48 Std.
für die erste Stufe, 24 Std. für die zweite Stufe, 22 Std. für
die dritte Stufe und 15 bis 17 Std. für die vierte Stufe. In
der ersten Stufe wurde das Kulturmedium mit Zellen von
Streptomyces
olivochromogenes ATCC 21 715 (ein Einzelkolonieisolat aus
dem Stamm ATCC 21 713, vgl. die US-Patentschrift 38 13 318)
versetzt bzw.
angeimpft. Die vier Impfkultur-Entwicklungsstufen wurden jeweils
bei einer Temperatur von 28°C und einem pH-Wert von
7,0 durchgeführt, der vor dem Sterilisieren mit 10normaler
Natronlauge eingestellt wurde.
In der zweiten, dritten und vierten Impfkultur-Entwicklungsstufe
wurde der Inhalt der Kolben bzw. Tanks während der Fermentation
jeweils belüftet und gerührt.
Die abschließende Produktionsfermentation wurde in ca. 75 m³
fassenden Fermentern durchgeführt. Die Kulturmediumingredienzien
(außer der Xylose und der Dextrose) wurden in 52 996
Litern Kondensat angesetzt. Dann wurde das Kulturmedium auf
etwa 60°C erhitzt und sein pH-Wert mit Natriumcarbonatlösung
mit einer Dichte von 16° Baum´ auf 5,6 bis 5,8 eingestellt.
Vor der Einstellung wurde die Kulturbrühe erhitzt, um das
bei der Natriumcarbonatzugabe entwickelte Kohlendioxyd abzutreiben.
Nach der Einstellung des pH-Wertes wurde dem Kulturmedium
das Antischaummittel zugesetzt und der Fermenterinhalt
dann 30 Minuten bei 120°C sterilisiert, worauf es wieder auf
60°C abgekühlt wurde. Die Zucker, Xylose und Dextrose, wurden
in dem ca. 3800 Liter fassenden Impfkulturtank in 1514 Litern
Kondensat angesetzt. Die Zuckerlösung wurde 30 Minuten bei
120°C sterilisiert und nach dem Herunterkühlen mittels eines
Inoculumschlauches in den Produktionsfermenter überführt. Nach
der Zugabe der Zucker wurde die Temperatur des Fermenters
beim Betriebswert von 32°C stabilisiert, worauf der Fermenter
mit der Impfkultur angeimpft wurde. Ab der 20. Stunde nach dem
Animpfen wurden alle zwei Stunden Proben aus der Fermenterkulturbrühe
gezogen und auf ihre Isomeraseaktivität, das Zellengewicht,
den Gehalt an reduzierenden Zuckern und den Gesamtkohlenhydratgehalt
analysiert. Die Fermentation wurde als
vollendet angesehen, wenn die Erzeugung von Isomeraseenzym das
Maximum überschritten hatte. Während der Fermentation wurde
der pH-Wert durch automatische oder manuelle Zufuhr von vorsterilisiertem
Ammoniakgas durch die Fermenterlufteinblasleitungen
so eingestellt, daß er nicht unter 5,4 bis 5,6 fiel. Die Mediumzusammensetzung
und die Betriebsparameter bzw. -bedingungen für
die Fermentation im ca. 75-m³-Produktionsfermenter, die bereits
in den US-Patentschriften 37 70 589 und 38 13 318 beschrieben
worden sind, sind in der nachfolgenden Tabelle II wiedergegeben.
Weder während der Impfkultur-Entwicklungsstufen noch während
der Produktions-Fermentation wurde Kobalt zugesetzt.
Die aus der Kulturbrühe gewonnene intrazellulare Glucoseisomerase
besaß eine Aktivität von 19,5 IGIU/ml. Zur Herstellung des
stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrats wurde eine
Teilmenge von 8857,9 Litern der Kulturbrühe verwendet. Ein anderer
Teil der Kulturbrühe wurde in Form ganzer Zellen unter
Verwendung von Mg(OH)₂, Filterhilfe und Propan-2-ol
gewonnen. Die auf diese Weise gewonnenen ganzen Zellen wurden
dann zur enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose in
einem Chargenkonverter verwendet.
8857,9 Liter wie vorstehend beschrieben im Produktionsfermenter
hergestellter intrazellularer Glucoseisomerase-Kulturbürhe mit
einer spezifischen Aktivität von 19,5 IGIU/ml, entsprechend
einer Gesamtisomeraseaktivität von 173×10⁶ IGIU, wurden in
einer Feststoffe ausstoßenden Zentrifuge
verarbeitet. Die Zentrifuge wurde mit einer Zufuhrgeschwindigkeit
von 18,93 Litern/Minute und einem 2-Minuten-Schußzyklus
gespeist. Unmittelbar vor und nach dem Schüsselschuß wurde
jeweils eine Sekunde Wasch- und Spülwasser
zugeführt. Die Zellpaste aus dem Schußauslaß der Zentrifuge,
insgesamt 917,6 kg mit einer Isomeraseaktivität von
187 IGIU/g, wurde mit 75,7 Litern Wasser in einen ca. 850 Liter
fassenden Tank mit rundem Boden gegeben. Wenn 294,8 bis 317,5 kg
Zellpaste gesammelt waren, wurde diese jeweils mit 8 g eines
Lysozym-Enzympräparats (ein
aus Eiweiß stammendes, zweimal kristallines, gefriergetrocknetes
Pulver mit einer Aktivität von 23 300 Einheiten/mg)
behandelt bzw. versetzt, um den Abbau der Zellwände
und damit die Freisetzung der intrazellularen Glucoseisomerase
in löslicher Form in Gang zu setzen. Der Zellpaste wurde eine
85-vol.-%ige, wäßrige Propan-2-ol-Lösung in einer Menge von
21,2 Litern Lösung auf 45,36 kg Zellpaste zugesetzt. Dann
wurde das Gemisch mit weiteren 41,64 Litern der wäßrigen
Propan-2-ol-Lösung versetzt, um den Alkoholgehalt der Flüssigkeit
auf 30 Vol.-% zu bringen. Das so erhaltene Zellpaste-
Propan-2-ol-Wasser-Gemisch wurde dann in einen ca. 3800 Liter
fassenden Abbautank gepumpt, worauf man den Zellwandabbau
24 Std. ablaufen ließ. Die Temperatur der Flüssigkeit im Zellabbautank
wurde bei etwa 26°C gehalten. Nach 24 Std. wurde
dem Gemisch so viel 85-vol.-%ige Propan-2-ol-Lösung zugesetzt,
daß sein Propan-2-ol-Gehalt auf 52 Vol.-% gebracht wurde,
d. h. auf eine Propan-2-ol-Konzentration, bei der die Nucleinsäuren,
wie Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure, im
wesentlichen unlöslich sind, während das Enzymproteinmaterial
löslich ist. Auf einem Vakuumrotationsfilter wurden zur Vorbeschichtung
90,7 kg Filterhilfe angeschwemmt.
Nach der Vorbeschichtung wurde dem in der angeschwemmten Filterhilfeschicht
enthaltenen Wasser so viel Propan-2-ol zugesetzt,
daß der Alkoholgehalt auf etwa 52 Vol.-% gebracht wurde, um
die Nucleinsäuren in unlöslicher Form zu halten bzw., anders
gesagt, um eine Lösung der Nucleinsäuren zu verhindern.
Bei diesem Rotationsfilter wurde kein Waschwasser verwendet,
sondern nach beendeter Filtration des Zellpastenbreies das
Vorbeschichtungsanschwemm-Wasser/Alkohol-Gemisch durch den
Filter geschickt. Der im Vorbeschichtungsfilterbett verbleibende
Zellpastenbrei wurde zu einem Nutschenfilter gepumpt,
um den Enzymverlust so gering wie möglich zu halten. Beim
Filtrieren auf den Nutschenfilter wurde die erwähnte Filterhilfe zugesetzt.
Die Filtrate aus dem Anschwemm-Rotationsfilter und dem Nutschenfilter
wurden jeweils in einen als Lager- bzw. Vorratstank für
die Beschickung eines Beschickungstanks dienenden, ca. 3800 Liter
fassenden Tank gepumpt, in dem 56,8 Liter 1,0molare Magnesiumsulfat-
(MgSO₄ · 7H₂O)-Lösung und 49,2 Liter 85-vol.-%iger Propan-
2-ol zugesetzt wurden. Das so erhaltene Gemisch wurde mit einer
Geschwindigkeit von 62,8 Litern/Minute in einem 5-Minuten-
Schußzyklus einer Zentrifuge zugeführt.
Nach dem Zentrifugieren wurde die Schüssel durch fünf aufeinanderfolgende,
jeweils eine Sekunde dauernde Spülwasserzufuhren
und Schüsse gespült. Der in der Schüssel und der Schußkammer
verbleibende, das stabilisierte Enzymkonzentrat enthaltende
Rückstand wurde ausgekratzt, worauf die Schüssel und
die Kammer mit etwas leichter Ablaufphase aus der Zentrifuge
gewaschen wurden. Sowohl der Rückstand als auch das Waschwaser
gingen in das stabilisierte Enzymkonzentratprodukt. Das Produkt
wurde mit einem Labormischer gerührt und in ca. 3,8 Liter fassende
Plastikbehälter zur Auswertung und zum weiteren Gebrauch zur
enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose abgefüllt. Die
Gesamtausbeute an stabilisiertem Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat
(Ansatz 1) betrug 41,64 Liter konzentrierte Flüssigkeit,
die eine Aktivität von insgesamt 109×10⁶ IGIU, entsprechend
einer Isomeraseaktivität von etwa 11 261 IGIU/g Trockensubstanz
enthielt. Dies entsprach einer Aktivitätsausbeute von 63% der
in der als Ausgangsmaterial verwendeten, ganze Zellen enthaltenden
Kulturbrühe enthaltenen Gesamtaktivität. Eine vollständigere
Übersicht über die Analysenkennwerte des stabilisierten
Enzymkonzentrats ist der nachstehenden Tabelle III zu entnehmen.
Analog Beispiel 1a) wurden unter Verwendung von 7,5 Liter,
40 Liter und 400 Liter fassenden Fermentern für die Impfkulturentwicklung
und eines 4000 Liter fassenden Fermenters
für die abschließende Produktionsstufe mehrere Chargen bzw.
Ansätze intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Streptomyces
olivochromogenes ATCC 21 715 hergestellt. Nach der Fermentation
wurde die Temperatur der ganze Zellen intrazellularer
Glucoseisomerase enthaltenden Chargen bzw. Ansätze jeweils
von 32 auf 22°C herabgesetzt, um das weitere Mikrobenwachstum
und eventuelle Zellautolyse zu verzögern. Die Ansätze
wurden dann zentrifugiert, um die Zellen zu einer Zellpaste
zu konzentrieren. Die schwere Zellpastenphase wurde in ca. 38 Liter
fassenden Eimern aufgefangen, gewogen und dann zum Zellabbau
in einen ca. 3800 Liter fassenden Abbautank gepumpt. Dort
wurde die Zellpaste unter Rühren mit dem auch in Beispiel 1
verwendeten Lysozym-Enzympräparat versetzt, um die Zellwände
abzubauen und die intrazellulare Glucoseisomerase in löslicher
Form freizusetzen. Das Lysozym wurde den Ansätzen jeweils
in einer 6,8 Einheiten/mg Zelltrockensubstanz entsprechenden
Menge zugesetzt. Das in der Zellpaste enthaltene Gesamtzelltrockensubstanzgewicht
wurde aus dem Zelltrockensubstanzgehalt
der Fermenterkulturbrühe und dem Fermenterkulturbrühenvolumen
berechnet. Dieser Berechnung lag somit die Annahme zugrunde,
daß die Zelltrockensubstanzausbeute bei der ersten Konzentrationsstufe
100% betragen hatte. Das Lysozym wurde der Zellpaste
nach dem Zentrifugieren der Gesamt-Kulturbrühe und
vor der Zugabe von Alkohol zugesetzt. Nach der Zugabe des
Lysozyms wurde eine azeotrope, wäßrige Propan-2-ol-Lösung
in einer eine Propan-2-ol-Konzentration von 42±1 Gew.-% ergebenden
Menge zugesetzt. Die anfängliche Zugabe von Propan-2-ol wurde
auf der Basis des Zellpastengewichtes minus 8% für Unlösliches
(T.S.) und der Qualität des zugesetzten Alkohols errechnet.
Nach der Einstellung der Alkoholkonzentration wurde der
pH-Wert des Lysats, d. h., der Zellpasten/Alkohol-Aufschlämmung
mit wasserfreiem Mononatriumphosphat (zur Verringerung des
pH) auf 7,0 eingestellt. Das Mononatriumphosphat wurde in
250-g-Anteilen nach Bedarf zugesetzt. Um örtliche "Hitzenester"
zu vermeiden, wurde das Reagens vor der Zugabe in Wasser gelöst.
Die Lysate wurden dann unter turbulentem Rühren bei
einer Temperatur von 28 bis 30°C gehalten, bis das Enzym
100%ig solubilisiert war. Der Solubilisierungsgrad wurde durch
eine Vergleichsenzymanalyse einer ganzen Lysatprobe und eines
Teils der gleichen Probe, aus dem die Zellfeststoffe durch
Zentrifugieren abgetrennt worden waren, bestimmt.
Am Ende der Abbauperiode wurde die Alkoholkonzentration im Lysat
nachgeprüft und auf den Sollwert von 42±1% eingestellt. Dann
wurden die Zelltrümmer aus dem Lysat unter Verwendung eines
Anschwemmfilters abgetrennt, der mit einer in 44- bis 46%igen
wäßrigen Propan-2-ol-Lösung aufgeschlämmten Diatomeenerde-Filterhilfe
beschichtet bzw. angeschwemmt worden war.
Beim Anschwemmen wurde also mit einem etwas über 42±1% liegenden
Alkoholgehalt gearbeitet, um den infolge von Entspannungsverdampfung
im Inneren des Vakuum-Anschwemmfilters auftretenden
Alkoholverlusten Rechnung zu tragen. Das abgebaute Lysat
wurde wie es war, d. h., mit einem pH-Wert von 7,0±0,3 und
bei einer Temperatur von 28 bis 30°C, filtriert. Die vom Anschwemmfilter
abgezogenen Filtrate wurden einem ca. 3800 Liter
fassenden Tank zugeführt, der als Vorratstank für die Ausfällungsstufe
verwendet wurde.
Bei vier Ansätzen wurde die Ausfällung chargenweise unter Verwendung
eines Vorratstanks als Ausfällgefäß durchgeführt.
Die geklärten Filtrate wurden jeweils in Chargen von etwa
643,5 Litern im Tank vorgelegt. Dann wurden pro Liter geklärtem
Lysat jeweils 0,05 Liter 1,0molare Magnesiumsulfatlösung und
so viel azeotrope Propan-2-ol-Lösung zugesetzt, daß der Gesamtgehalt
an Propan-2-ol bei etwa 42 Gew.-% gehalten wurde.
Während der Zugabe wurde die Lösung jeweils gerührt und mittels
einer Einspeispumpe umgepumpt, um die Durchmischung zu erleichtern.
Der Enzymniederschlag wurde 10 bis 15 Minuten ruhengelassen,
damit er sich zu größeren Flocken agglomerieren konnte,
und dann mittels einer Zentrifuge abgetrennt.
Die Lösung wurde der Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von
6 bis 10 g/Minute zugeführt und die Schale während jeder
Charge zweimal geschossen (entleert).
Bei einem Ansatz (Ansatz 10) wurde die Fällung kontinuierlich
durchgeführt, wobei der Vorratstank als kontinuierlich arbeitender
Rührkesselreaktor benutzt wurde. Das geklärte Lysat
und die Magnesiumsulfatlösung wurden dabei in den Vorratstank
kontinuierlich durch ein Misch-T-Rohr eindosiert. Der
Propan-2-ol-Gehalt des geklärten Lysats wurde auf 44 bis 45 Gew.-%
eingestellt, um die Verdünnung durch die Magnesiumsulfatlösung
auszugleichen und so einen Alkoholgehalt von 42±1% während
der Fällung einzuhalten. Der Zufluß von geklärtem Lysat wurde
mittels eines Durchflußreglers geregelt. Die 1,0molare Magnesiumsulfatlösung
wurde mittels einer kleinen Membranpumpe in
einer Menge von 0,05 Litern/Liter geklärtem Lysat zudosiert.
Zunächst wurden beide Lösungen so lange ohne Entnahme in den
Vorratstank eingespeist, bis sich darin ein Volumen angesammelt
hatte, das bei den gegebenen Zuflußgeschwindigkeiten des geklärten
Lysats und der Magnesiumsulfatlösung einer Verweilzeit
von 15 Minuten entsprach. Dann wurde damit begonnen, aus dem
Vorratstank das Gemisch mit der gleichen Geschwindigkeit abzuziehen
und der Zentrifuge zuzuführen, mit der der Vorratstank
gespeist wurde. Die Zufuhrgeschwindigkeit zur Zentrifuge wurde
also, anders gesagt, so eingestellt, daß das Flüssigkeitsniveau
im Vorratstank konstant blieb. Der Schale wurde alle
10 Minuten ein "Teilschuß" verpaßt, indem der Schalenbetriebswasserdruck
vermindet wurde.
Nachdem die jeweiligen Ansätze vollständig zentrifugiert waren,
wurde der Enzymrückstand von der Oberfläche der Zentrifuge
mit destilliertem Wasser entfernt und jeweils mit dem stabilisierten
Enzymkonzentratprodukt vereinigt. Die auf diese Weise
gewonnenen stabilisierten Enzymkonzentrate wurden jeweils
gerührt, bis sie homogen waren, in Flaschen abgefüllt und bei
4°C gelagert.
Die Tabellen IV und V geben eine Zusammenfassung der in den
verschiedenen Verfahrensschritten jeweils erzielten Enzymausbeuten
wieder. Tabelle V zeigt insbesondere eine vollständige
Analyse der stabilisierten Enzymkonzentrate.
Analog Beispiel 1a) wurde ein weiterer großer Ansatz
Streptomyces olivochromogenes
ATCC 21 715 hergestellt. Nach beendeter Fermentation wurde
die Kulturbrühe im ca. 75 m³ fassenden Fermenter auf etwa
20°C abgekühlt und vor dem Konzentrieren der Zellfeststoffe
eine kurze Zeit ohne Belüftung und Rühren ruhengelassen.
Die fertige Kulturbrühe (60 565,6 Liter) besaß eine Isomeraseaktivität
von 21,0 IGIU/g Kulturbrühe, eine maximale Zelltrockensubstanzkonzentration
von 16,5 g/Ltr. und eine Gesamtaktivität
von 1270,7×10⁶ IGIU.
Die die intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende ganze Kulturbrühe
wurde dann durch Zentrifugieren in einer Zentrifuge
bei einer Einspeisrate von etwa 18,93 Liter/
Minute mit einer Schalen-Schuß-Zeit von 1,75 Minuten konzentriert.
Der Leichtphasenüberlauf wurde in regelmäßigen Abständen
analysiert und dann verworfen. Die Schwerphasen-Zellpasten-
Schüsse wurden in einem Aufnahmekanister gesammelt und dann
kontinuierlich zu einem der drei Tanks gepumpt, in denen der
Zellabbau durchgeführt wurde. Die Konzentrationsstufe führte
zu einer etwa 6,4fachen Erhöhung der Zellfeststoffkonzentration
(auf Volumenbasis). Es wurden insgesamt 9463,5 Liter Zellpaste
mit einem Gewicht von 9393,4 kg und einem Gesamttrockensubstanzgehalt
von 1102,6 kg gewonnen. Die Analyse der Zellpaste ergab
einen Aschegehalt von 131,09 kg, einen Proteingehalt von 649,99 kg,
einen Wassergehalt von 8290,76 kg, eine Isomeraseaktivität von
132 IGIU/g und eine Gesamtaktivität von 1240,0×10⁶ IGIU
(98% der Theorie).
Wenn das in einem Abbautank vorgelegte Zellpastenvolumen
757 Liter erreicht hatte, wurden jeweils 757 bis 870,6 Liter
91,5%iger Propan-2-ol zugesetzt, bis der Abbautank voll war.
Nach jedem Alkoholzusatz wurde der pH-Wert der dabei erhaltenen
Aufschlämmung in dem betreffenden Abbautank geprüft und erforderlichenfalls
mit wasserfreiem Mononatriumphosphat auf 7,0 bis 7,2
gesenkt. Nach dem Beginn der Alkoholzugabe in den jeweiligen
Abbautanks wurde während des Restes der Auffüllperiode jeweils
portionsweise Lysozym-Enzym (wie in Beispiel 1) in einer ungefähr
6,8 Einheiten/mg Zelltrockensubstanz entsprechenden
Menge zugegeben. Wenn der Tank gefüllt war, wurde jeweils eine
Endeinstellung der Alkoholkonzentration in der Aufschlämmung
auf 42±1 Gew.-% vorgenommen. Das Lysat (Alkohol/Zellpaste/
Lysozym-Aufschlämmung) wurde ständig gerührt sowie durch außenliegende
Wärmeaustauscher umgepumpt, um die Temperatur beim
Sollwert zu halten. Der Mantel der Wärmeaustauscher wurde jeweils
mit temperiertem Wasser gespeist, um die Temperatur des
Lysats in einem Bereich von 28 bis 30°C zu halten. Der Grad
der Enzymsolubilisierung wurde mittels Enzymvergleichsanalysen
überwacht und verfolgt, wobei der analytisch ermittelte Enzymgehalt
einer ganzen Lysatprobe und einer Vergleichsprobe, aus
der die Zellfeststoffe durch Zentrifugieren abgetrennt worden
waren, miteinander verglichen wurden. Wenn der Abbau in einem
Abbautank so weit fortgeschritten war, daß die Solubilisierung
in etwa 100% betrug, war die Lysat-Aufschlämmung jeweils für
die Klärung zum Entfernen der Zelltrümmer bereit. Die hierfür
erforderlichen Abbauzeiten lagen in einem Bereich von etwa
52 bis 73 Stunden, vom Beginn des Auffüllens an gerechnet.
Die Gesamtmenge der Lysat-Aufschlämmungen aus den drei Abbautanks
betrug 19 994,94 Liter und hatte ein Gesamtgewicht von
17 957,72 kg sowie einen Gesamttrockensubstanzgehalt von
1019,2 kg. Die Analyse der Lysat-Aufschlämmung ergab einen Aschegehalt
von 187,78 kg, einen Proteingehalt von 649,09 kg, einen
Propan-2-ol-Gehalt von 7221,2 kg und einen Wassergehalt von
9717,3 kg. Das Lysat hatte eine Isomeraseaktivität von 66,6 IGIU/
g und eine Gesamtaktivität von 1178,9×10⁶ IGIU, entsprechend
93% der Theorie, d. h., der ursprünglich in der als Ausgangsmaterial
verwendeten Fermentationsbrühe enthaltenen Gesamtaktivität.
Die Lysat-Aufschlämmung wurde mit einem Anschwemmfilter, der mit
Filterhilfe 5,72 bis
6,35 cm dick vorbeschichtet worden war, geklärt. Zur Klärung
der Lysat-Aufschlämmung wurden insgesamt 272,16 kg Filterhilfe
verwendet. Die Vorbeschichtungsaufschlämmung, deren Filterhilfegehalt
5% betrug, wurde mit 50%iger Propan-2-ol-Lösung angerührt.
Um die Vorbeschichtungs-Ansetz-Lösung zu erhalten, ließ
man den Vorbeschichtungsablauf in den Vorbeschichtungsabsetztank
zurücktropfen bzw. -fließen, sobald die Vorbeschichtung
aufgetragen war. Unmittelbar nach dem Austropfen des Vorbeschichtungsablaufes
wurde die abgebaute Lysat-Aufschlämmung in
den Filter gebracht. Die Filtrationsgeschwindigkeiten bei der
Klärung schwankten zwischen 1,06 und 1,59 Liter/Stunde und
dm² Filterfläche, wobei der durchschnittliche Durchsatz 1,18 Liter/
Stunde und dm² betrug. Nach dem Filtrieren wurde das geklärte
Filtrat in ca. 3800 Liter fassende Lagertanks gepumpt. Die vom
Filter abgenommenen Filterkuchen-Schnittstücke wurden in regelmäßigen
Zeitabständen geprüft und verworfen. Das Lysat hatte
ein Gesamtvolumen von 17 556,7 Litern, wog 16 200,5 kg und
enthielt insgesamt 351,08 kg Trockensubstanz. Die Analyse des
geklärten Lysats ergab einen Aschegehalt von 48,08 kg, einen
Proteingehalt von 223,17 kg, einen Propan-2-ol-Gehalt von
7165,9 kg und einen Wassergehalt von 8673,59 kg. Die Isomeraseaktivität
des geklärten Lysats betrug 54,0 IGIU/g und seine
Gesamtaktivität 875,7×10⁶ IGIU, entsprechend 69% der Theorie,
bezogen auf die ursprüngliche Aktivität der Fermentationsbrühe.
Nach dem Klären wurde die Alkoholkonzentration in den einzelnen,
das geklärte Lysat enthaltenden Lagertanks jeweils auf 44 bis
45 Gew.-% (bestimmt durch Dichtemessung) erhöht. Danach wurde
die Ausfällung und Stabilisierung der in der geklärten Lysat-
Lösung enthaltenen Glucoseisomerase durchgeführt, indem das
geklärte Lysat und 439,1 Liter einer 2molaren wäßrigen Magnesiumsulfatheptahydrat-
Lösung aus 105,23 kg MgSO₄ und 426,8 kg Wasser
kontinuierlich durch ein Misch-T-Rohr in einen mit einer Zentrifuge
verbundenen Versorgungstank eingespeist,
wobei pro Liter geklärten Lysats 0,025 Liter 2,0molare
Magnesiumsulfatlösung zugeführt wurden, um eine Endlösung mit
einem Magnesiumsulfatgehalt von 0,05 Mol/Liter zu erhalten.
Dabei wurden zunächst nur die Magnesiumsulfat- und die geklärte
Lysat-Lösung so lange in den Versorgungstank eingespeist, bis
darin ein Volumen vorgelegt war, das bei den gegebenen Fließgeschwindigkeiten
einer Verweilzeit von 15 Minuten entsprach.
Wenn dieses Volumen erreicht war, wurde damit begonnen, kontinuierlich
das im Versorgungstank enthaltene Gemisch abzuziehen
und in eine Zentrifuge einzuspeisen, wobei die Entnahmegeschwindigkeit
der Zuflußgeschwindigkeit zum Tank entsprach, d. h.
so gewählt wurde, daß das Füllniveau im Versorgungstank und
damit die Verweilzeit konstant blieb.
Der Überlauf aus der Zentrifuge wurde einem ca. 30 m³
fassenden Tank zugeführt und nachfolgend in einer Destillationsanlage
zur Wiedergewinnung des darin enthaltenen Propan-2-ols
aufgearbeitet, der wiederverwendet wurde. Das stabilisierte
Enzymkonzentrat wurde in 75,7 Liter fassenden Eimern aus
nichtrostendem Stahl gesammelt und dann in einem ca. 380 Liter
fassenden Kessel vereinigt. Das stabilisierte Enzymkonzentrat
wies eine schlammartige Konsistenz auf und war mittelbraun gefärbt.
Zum stabilisierten Enzymkonzentrat wurde intermittierend
destilliertes Wasser zugesetzt, um das Enzym in der erforderlichen
Weise zu resolubilisieren (die Wiederauflösung wurde visuell bestimmt).
Wenn das destillierte Wasser zugesetzt war und das
stabilisierte Enzymkonzentrat sich löste, schlug die Farbe
in ein verhältnismäßig klares Kaffeebraun bzw. -schwarz um,
und das Produkt wies eine derjenigen eines leichten Öls gleichende
Konsistenz auf.
Auf diese Weise wurden 276,3 Liter (287,57 kg) stabilisiertes
Enzymkonzentrat in resolubilisierter Form gewonnen, deren Trockensubstanzgehalt
76,66 kg betrug. Die Analyse des stabilisierten
Enzymkonzentrats ergab einen Aschegehalt von 8,6 kg, einen Proteingehalt
von 57,15 kg, einen Propan-2-ol-Gehalt von 47,17 kg
und einen Wassergehalt von 163,29 kg. Das stabilisierte Enzymkonzentrat
besaß eine Isomeraseaktivität von 11 654 IGIU/g Trockensubstanz
und eine Gesamtaktivität von 892,8×10⁶ IGIU, entsprechend
einer Aktivitätsausbeute von 70,3% der Theorie, wobei
der größte Teil des Aktivitätsverlustes (23 bis 24%) beim Klären
des Lysats auftrat. Von diesem Teil des eingetretenen Aktivitätsverlustes
ging rund die Hälfte (etwa 11,8%) mit den abgeschälten
Filterkuchenstücken verloren. Der Rest der Verluste
war auf Inaktivierung zurückzuführen.
Die nachfolgenden Tabellen VI und VII geben einen zusammenfassenden
Überblick über die in den einzelnen Verfahrensschritten erzielten
Enzymgewinnungsausbeuten. Die Tabelle VII gibt insbesondere
eine vollständige Aufstellung aller wesentlichen Analysenkennwerte
des stabilisierten Enzymkonzentrats wieder.
Mehrere Proben der nach den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen
stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate und andere
gleichartige Proben unterschiedlicher Aktivität wurden bezüglich
ihrer Lagerungsstabilität bei verschiedenen Temperaturen
untersucht. Die Proben wurden bei 4, 18, 26 bzw. 37°C gelagert
und nach 4, 8 und 12 Monaten jeweils hinsichtlich ihrer Glucoseisomeraseaktivität
untersucht. Die nachfolgende Tabelle VIII
gibt die Ergebnisse dieser Untersuchung wieder.
Die in der Tabelle VIII angegebenen Werte lassen erkennen, daß
die erfindungsgemäßen stabilisierten Enzymkonzentrate bei
bis zu 12monatiger Lagerung bei 4 und bei 18°C mehr als 80±10
und im allgemeinen sogar mehr als 90±10% ihrer anfänglichen
Isomeraseaktivität, d. h. ihrer Isomeraseaktivität am Beginn
des Stabilitätstestes bzw. der Lagerung, behalten sowie, daß
sie, selbst wenn man sie bei 26°C lagert, immer noch bis zu
8 Monate lang etwa 80±10% ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität
behalten können. Anders gesagt, verloren die stabilisierten
Enzymkonzentrate im Durchschnitt weniger als 5% ihrer
anfänglichen Isomeraseaktivität, wenn sie 12 Monate bei 4°C gelagert
wurden, durchschnittlich weniger als etwa 15% ihrer
anfänglichen Isomeraseaktivität, wenn sie 12 Monate bei 18 oder
bei 26°C gelagert wurden.
64,35 Liter einer analog Beispiel 1a) hergestellten, intrazellulare
Glucoseisomerase enthaltenden Kulturbrühe wurden zur
Herstellung einer Zellpaste zunächst mit Wasser verdünnt und
dann zentrifugiert (die Ausgangsmaterialcharge stammte aus
zwei Fermenteransätzen von je 37,85 Litern, von denen die eine
eine spezifische Isomeraseaktivität von 18,0 IGIU/ml und die
andere eine spezifische Isomeraseaktivität von 16,8 IGIU/ml
aufwies; die beiden Fermenteransätze wurden für die Verwendung
als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Zellpaste vereinigt).
Der Zentrifugenkuchen bzw. die Zellpaste wurde in einen 7,5 Liter
fassenden Fermenterkolben gegeben und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen
von 4,5 Litern verdünnt. Die dabei erhaltene Aufschlämmung
wurde 2 Tage bei einer Raumtemperatur von 4°C stehengelassen
und dann 77 mg eines aus Eiweiß stammenden Lysozym-Enzympräparats
mit etwa 8000 Lysozymeinheiten/mg und 1930 ml Propan-
2-ol versetzt. Die Aufschlämmung wurde 4 Stunden gerührt, worauf
weitere 500 mg Lysozym-Enzympräparat zugesetzt wurden. Nachdem
hierauf zunächst seine Temperatur auf 20 bis 30°C eingestellt
worden war (die Temperatur war nach der zweiten Lysozymzugabe
auf etwa 35 bis 40°C gestiegen, was vermutlich zu
einer gewissen Enzymdesaktivierung führen dürfte), wurde die
Aufschlämmung über Nacht gerührt. Nach dem Abbau wurde eine
500-ml-Probe des rohen Lysats mit 500 ml Wasser verdünnt.
Proben von jeweils 123 ml des verdünnten Lysats wurden dann
mit so viel Propan-2-ol versetzt, daß ihr Propan-2-ol-Gehalt
etwa 50 Vol.-% (V/V) betrug. Eine Lysatprobe wurde für einen
Blindversuch verwendet. Die Lysatproben wurden dann mit den
in der nachstehenden Tabelle IX angegebenen Mengen Natriumchlorid
(zum Vergleich) bzw. Magnesiumsulfatheptahydrat
(MgSO₄ · 7H₂O) versetzt. Nach der Salzzugabe wurden die Suspensionen,
einschließlich der Blindprobe, zentrifugiert und
auf ihre Glucoseisomeraseaktivität und ihren Proteingehalt,
der anhand des Verhältnisses der optischen Dichte bei 260
und 280 nm unter Verwendung des Nomographen von E. Adams auf
der Basis der von Warburg und Christian in Biochem. Z. 310, 384
(1942), angegebenen Extinktionskoeffizienten für Enolase und
Nucleinsäuren bestimmt wurde, analysiert. Die weiteren Einzelheiten
bezüglich der Durchführung und Ergebnisse dieser Versuche
sind aus der nachstehenden Tabelle IX zu ersehen.
Die in Tabelle IX angegebenen Versuchsergebnisse zeigen, daß
die Zugabe des Magnesiumsulfats zu dem alkoholisch-wäßrigen
Lysat zu einer Abnahme der Isomeraseaktivität in der überstehenden
Flüssigkeit führt, ohne den in der überstehenden Flüssigkeit
vorhandenen Nucleinsäuregehalt (Nucleinsäuren absorbieren Licht
einer Wellenlänge von 260 nm) wesentlich zu verringern. Dieser
Effekt trat bei der Zugabe von Natriumchlorid nicht auf. Der
Zusatz des Magnesiumsulfats zum alkoholisch-wäßrigen Lysat
bewirkt somit eine Trennung der Glucoseisomerase von den löslichen
Nucleinsäuren. Dieser Effekt war offensichtlich kein
typischer "Aussalzeffekt", da die Magnesiumsulfatkonzentration
hierfür zu niedrig war und mit Natriumchlorid eine derartige
Trennung nicht erreicht wurde. Die unter Verwendung von Natriumchlorid
durchgeführten Versuche ergaben nämlich keinerlei
nennenswerte Abnahme der Isomeraseaktivität in der überstehenden
Flüssigkeit.
Dem Rest des 4,5 Liter rohen, solubilisierte Glucoseisomerase
enthaltenden Lysats von Beispiel 5 wurden Filterhilfe und
so viel Propan-2-ol zugesetzt, daß die Aufschlämmung einen
Propan-2-ol-Gehalt von 50 Vol.-% (V/V) besaß. Die Aufschlämmung
wurde langsam filtriert, um die solubisierte Glucoseisomerase
zu klären. Eine Probe von 335 ml dieses Filtrats mit einer
analytisch bestimmten Isomeraseaktivität von 65,2 IGIU/ml,
entsprechend einem Gesamtaktivitätsgehalt der Probe von
21 842 IGIU, wurde bei einem pH-Wert von 8 mit je 16,5 ml
Propan-2-ol und 1molarer Magnesiumsulfatheptahydratlösung
versetzt. Der Magnesiumsulfatgehalt des Gemisches betrug somit
1%, bezogen auf das ganze Gemisch, bzw. 2%, bezogen auf
das darin enthaltene Wasser. Nach der Zugabe des Magnesiumsalzes
bildete sich sofort ein öliger Niederschlag. Die den
Niederschlag enthaltende Lösung wurde zentrifugiert und der
Niederschlag dadurch abgetrennt. Der Niederschlag wurde mit
Wasser in einer ein Volumen von insgesamt 10,5 ml ergebenden
Menge wieder aufgelöst. Diese Probe wurde mit Wasser im Verhältnis
(zu Probe) von 402 : 1 verdünnt, worauf die
optische Dichte der verdünnten Lösung bei 260 und 280 nm bestimmt
wurde, die 0,284 bzw. 0,350 betrug. Aus diesen Werten
wurde der Proteingehalt der verdünnten Lösung zu 0,33 mg/ml
ermittelt, entsprechend einem Proteingehalt der unverdünnten
Probe (10,5 ml-Lösung) von 133 mg/ml. Die Bestimmung der Isomeraseaktivität
der Lösung ergab einen Wert von 2040 IGIU/ml,
so daß die Gesamtaktivität der Probe 21 400 IGIU betrug, entsprechend
einer Ausbeute von 98%, bezogen auf die anfängliche
Aktivität des geklärten Lysats. Das stabilisierte Glucoseisomerase-
Enzymkonzentrat besaß eine spezifische Isomeraseaktivität
von 15,3 IGIU/mg Protein. Diese Werte zeigen in Verbindung
mit den in der Tabelle IX aufgeführten Ergebnissen,
daß das Magnesiumsulfat die Isomerase selektiv ausfällt und
reinigt.
Eine Probe (67 ml) resolubilisierten Alkoholfraktionats, die
solubilisierte, zellfreie Glucoseisomerase enthielt, wurde
mit 67 ml der Propan-2-ol-Lösung verrührt. Dabei konnte keine
Niederschlagsbildung beobachtet werden. Hierauf wurden der
geklärten, Isomerase enthaltenden Alkohol/Wasser-Lösung je
2 ml einer 1molaren Magnesiumsulfatheptahydrat-Lösung und
der Propan-2-ol-Lösung zugesetzt, worauf sich sofort eine
grau-weiße, feste Fällung bildete, die anschließend abgetrennt
und in Wasser zu einem Volumen von 13,0 ml gelöst wurde. Das
stabilisierte Enzymkonzentrat wurde erneut zentrifugiert und
im Verhältnis 101 : 1 (Wasser : Enzymkonzentrat) mit Wasser
verdünnt, um dann analysiert zu werden. Die Lichtdurchlässigkeit
der verdünnten Lösung bei 260 nm betrug 0,288 und diejenige
bei 280 nm Wellenlänge 0,437. Hieraus wurde der Proteingehalt
der verdünnten Lösung zu 0,46 mg/ml ermittelt. Die das
solubisierte, stabilisierte Enzymkonzentrat enthaltende
unverdünnte Lösung, deren Isomeraseaktivität mit 482 IGIU/ml
ermittelt wurde, besaß somit einen Proteingehalt von 46,5 mg/ml
und eine spezifische Isomeraseaktivität von 10,4 IGIU/mg Protein.
Die in den 13,0 ml stabilisierten Enzymkonzentrats vorhandene
Gesamtaktivität betrug 6266 IGIU. Das Zentrifugat enthielt dagegen
nur 150 IGIU.
Eine Probe von 3250 ml des geklärten, solubilisierte Glucoseisomerase
enthaltenden Lysats der ursprünglich 4,5 Liter großen
Charge von Beispiel 5 mit einer Isomeraseaktivität von 109 IGIU/
ml wurde mit je 162 ml der Propan-2-ol-Lösung und der 1molaren
Magnesiumsulfatheptahydrat-Lösung versetzt. Dabei bildete
sich sofort ein öliger Niederschlag, der durch Zentrifugieren
abgetrennt und gewonnen wurde. Der Niederschlag hatte
ein Volumen von 69 ml und wies, wie die Analyse ergab, eine
Isomeraseaktivität von 4040 IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtaktivität
von 278 760 IGIU auf. Zur Durchführung der Proben
bzw. Analysen wurde ein kleiner Teil des stabilisierten Enzymkonzentrats
in einem Verhältnis von 1 : 1000 verdünnt. Die
bei einer Wellenlänge von 260 bzw. 280 nm gemessene Lichtdurchlässigkeit
betrug 0,315 bzw. 0,345. Daraus wurde der
Proteingehalt zu 0,299 mg/ml und die spezifische Aktivität
zu 13,5 IGIU/mg Protein bestimmt. Der Rest des stabilisierten
Enzymkonzentrats wurde 48 Stunden lang stehengelassen, worauf
sich drei Schichten gebildet hatten. Die dreischichtige Aufschlämmung
wurde zentrifugiert und analysiert, wobei sich zeigte,
daß die oberste, lipidhaltige Schicht (18,2 ml) eine Isomeraseaktivität
von 565 IGIU/ml, die mittlere (39 ml) eine Isomeraseaktivität
von 1970 IGIU/ml und die unterste Schicht (36 ml)
eine Isomeraseaktivität von 50,80 IGIU/ml besaß. Die Bodenschicht
bzw. unterste Schicht wies den niedrigsten Lichtdurchlässigkeitsmeßwert
bei 260 nm und den höchsten Lichtdurchlässigkeitsmeßwert
bei 280 nm auf. Die oberste Schicht wies den
höchsten Lichtdurchlässigkeitsmeßwert bei 260 nm auf.
104,096 Liter analog Beispiel 1a) hergestellter, intrazellulare
Glucoseisomerase enthaltender Kulturbrühe mit einer Isomeraseaktivität
von 17,5 IGIU/ml wurden mit der gleichen Volumenmenge
Wasser vermischt und dann zu einem festen Kuchen zentrifugiert.
Der Kuchen wurde bei pH 7,45 mit so viel Wasser vermischt,
daß das sich ergebende Volumen 26 Liter betrug. Diese
Aufschlämmung wurde mit 0,250 g Lysozym und 11,5 Liter Propan-2-ol
bei einer Temperatur von 27°C vermischt. Außerdem wurde eine
kleine Menge eines Antischaummittels zugesetzt und die Aufschlämmung
dann gerührt. Die wäßrige Suspension (37,5 Liter)
enthielt 37 bis 44 IGIU/ml. Nach 20,5 Stunden wurden zwei
Proben von je 8 Litern entnommen, worauf Propan-2-ol in einer
Menge zugesetzt wurde, die einen Alkoholgehalt von 50 Vol.-%
(V/V) ergab. Dann wurden die Aufschlämmungen zunächst mit Filterhilfe
in einer Menge von 3 g/g Zellen versetzt und
dann filtriert sowie anschließend mit 2 Litern 50%iger
Propan-2-ol-Lösung gewaschen. Die Analyse des Filtrats ergab
eine Isomeraseaktivität von 15 IGIU/ml. In die restlichen
21,5 Liter des rohen Lysats wurde ein weiteres Gramm Lysozym
eingerührt, wodurch man eine Isomeraseaktivität von 24,3 IGIU/ml
im Filtrat erhielt. Das im Filtrat enthaltene Enzym wurde durch
Zugabe von je 1,1 Liter Propan-2-ol-Lösung und 1molarer
Magnesiumsulfatlösung sofort ausgefällt. Die das stabilisierte
Enzymkonzentrat enthaltende Fällung wurde abzentrifugiert und
in einer kleinen Menge Wasser zu einem Volumen von 200 ml gelöst.
Die dabei erhaltene Lösung besaß eine Isomeraseaktivität
von 3450 IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtaktivität von 690 000
IGIU und eine spezifische Aktivität von etwa 12,5 IGIU/mg Protein.
Zwei Proben des so erhaltenen stabilisierten Enzymkonzentrats
(200 ml), von denen eine mit Propanol als Konservierungsmittel
versetzt wurde, die andere dagegen nicht, wurden
einem Lagerungsstabilitätstest bei Raumtemperatur (etwa 26°C)
unterworfen. Am Beginn des Lagerungsstabilitätstestes wiesen
beide Proben eine Isomeraseaktivität von 3300 IGIU/ml auf. Die
Proben wurden in regelmäßigen Zeitabständen geprüft. Nach
31tägiger Lagerung wies die Probe mit dem Konservierungsmittelzusatz
eine Isomeraseaktivität von 3165 IGIU/ml und die andere
Probe (ohne Konservierungsmittel) eine Isomeraseaktivität von
3140 IGIU/ml auf. Dieses Versuchsergebnis zeigt, daß die
stabilisierten Enzymkonzentrate der Erfindung (mit oder ohne
Konservierungsmittel) ziemlich lagerungsstabil sind und, wenn
sie bei Raumtemperatur über 30 Tage lang gelagert werden, bis
zu 95% oder mehr ihrer Anfangsaktivität behalten können.
Der Zweck der in diesem Beispiel beschriebenen Versuche ist es,
die Wirksamkeit und Effektivität verschiedener erfindungsgemäß
zu verwendender wasserlöslicher Magnesiumsalze im Vergleich
zur Verwendung anderer für ihre Fähigkeit, Proteine auszufällen
bekannter Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und Natriumchlorid,
aufzuzeigen. In den Vergleich wurden auch andere
Salze zweiwertiger Metalle einbezogen.
Eine große Probe des Lysats (Alkohol/Wasser/Glucoseisomerase-
Lösung) von Ansatz 6 (vgl. Beispiel 2 und Tabelle IV) wurde
in einer Laborzentrifuge mit 18 000 UpM vor ihrer Verwendung
10 Minuten zentrifugiert. Der Alkoholgehalt wurde zu 41,6 Gew.-%
bzw. 49,3 Vol.-% (V/V) bestimmt. Jeder der jeweils aus 30 ml
geklärtem Lysat (bei Raumtemperatur) bestehenden Proben wurde
eine 1molare Lösung eines der in der nachfolgenden Tabelle X
aufgeführten Salze in der weiter unten angegebenen Menge sowie
die gleichhohe Volumenmenge an Propan-2-ol zugesetzt. Nach dem
Zusatz von Salz und Alkohol wurden die Proben durchgemischt und
dann jeweils 10 Minuten bei 18 000 UpM zentrifugiert. Die
überstehende Flüssigkeit wurde jeweils entfernt und der Niederschlag
aus den Zentrifugengläsern ausgewaschen und auf ein
Gesamtvolumen von 25 ml mit einem Kobaltphosphatpuffer (10-3 m Co++;
pH 7,5; 0,05 mPO₄) verdünnt, worauf die Glucoseisomeraseaktivität
und der Proteingehalt bestimmt wurden. Die Wirkung
der Verwendung verschiedener Salze und Konzentrationen bezüglich
der Selektivität der Fällung und der Reinigung der solubilisierten
Glucoseisomerase ist aus der nachfolgenden Tabelle X
zu ersehen.
Die in Tabelle X wiedergegebenen Versuchsergebnisse zeigen, daß
Natrium- und Ammoniumsulfat Glucoseisomerase nicht so wirksam
und in so niederen Konzentrationen auszufällen vermögen, wie
die Magnesiumsalze. Ammoniumsulfat fällte überhaupt kein
Enzym, und Natriumsulfat ergab nur eine Ausbeute von 19%. Abgesehen
davon, daß diese Ausbeute sehr gering ist, war sie nicht
notwendigerweise auf eine Fällung zurückzuführen, sondern könnte
auch einer Phasentrennung in eine Alkohol/Wasser- und eine
Salzwasserphase zuzuschreiben sein. Das Protein ist in der
Salzwasserphase besser löslich als in der Alkohol/Wasser-Phase.
Die Salzwasserphase extrahiert somit (nicht spezifisch) Protein
aus der Alkohol/Wasser-Phase. Da die Salzwasserphase eine
höhere Dichte besitzt, wird sie als Produkt gewonnen. Auch das
als weiteres Salz eines einwertigen Metalls in die Untersuchung
einbezogene Natriumchlorid fällte die Glucoseisomerase nicht
aus.
Die geprüften Salze anderer zweiwertiger Metalle als Magnesium
fällten die Glucoseisomerase zwar ebenfalls aus, jedoch waren
bei ihrer Verwendung die Ausbeuten und Reinheiten nicht so hoch
wie bei der Verwendung der erfindungsgemäß einzusetzenden Magnesiumsalze.
Die Barium- und Strontiumsalze erwiesen sich von
den geprüften Nicht-Magnesiumsalzen als noch am besten geeignet
bzw. leistungsfähigsten, jedoch sind diese Salze im Hinblick auf
eine Verwendung für Lebensmittel unerwünscht.
Von den geprüften Salzen fällten nur die Magnesiumsalze das
Enzym wirksam mit hoher spezifischer Aktivität aus. Die angewandte
Magnesiumsalzkonzentration beträgt nur einen Bruchteil
derjenigen, die erforderlich ist, um Proteine aus einer wäßrigen
Lösung nach klassischen "Aussalztechniken", d. h. unter Verwendung
von Ammonium- und Natriumsulfat, auszufällen. Tatsächlich steht
dieses Phänomen im Gegensatz zu den einschlägigen Angaben in der
Literatur (vgl. zum Beispiel Advances in Protein Chemistry, Band XI,
Seiten 416 bis 418 [1956], und Advances in Protein Chemistry,
Band 16, Seite 216 [1961] ). Insbesondere die letztgenannte
Literaturstelle behauptet, daß Magnesiumsulfat beim Aussalzen
von Proteinen weniger effektiv als Natrium- oder Ammoniumsulfat
sei.
Aus den in der Tabelle X angegebenen Werten ist auch klar zu
ersehen, daß beim Erhöhen der Magnesiumsulfatlösungskonzentration
(über 0,08molar) die spezifische Aktivität abnimmt, was darauf
hinweist, daß dann eine weniger selektive Fällung stattfindet,
d. h. mehr anderes Protein zusammen mit der Glucoseisomerase
ausgefällt wird. Es wurde beobachtet, daß mit dem Magnesiumsulfat
Phasentrennung stattfand. Die Abnahme der spezifischen Aktivität
entspricht der anscheinend erhöhten Löslichkeit von Protein
in der Salzwasser-Phase. Bei der Verwendung von Magnesiumchlorid
und -acetat trat keine Phasentrennung auf, und die spezifischen
Aktivitäten blieben mit steigender Magnesiumsalzkonzentration
konstant, soweit sie nicht, wie bei Magnesiumchlorid, sogar zunahmen.
Dieses Beispiel zeigt, daß die hochgereinigten und stabilisierten
erfindungsgemäßen Enzymkonzentrate eine immobilisierte Glucoseisomerase
mit höherer Bindungskapazität liefern können als auf
übliche Weise solubilisierte Glucoseisomerase. Aus gemäß Beispiel
1a) hergestellten, intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden
ganzen Zellen wurde solubilisierte Glucoseisomerase hergestellt.
Um die Gewinnung der ganzen Zellen zu unterstützten, wurden der
Kulturbrühe Filterhilfe (Sil-Flo) und Magnesiumhydroxyd zugesetzt
und das Gemisch dann mit Propan-2-ol gewaschen, getrocknet
und in einer Wiley-Mühle gemahlen. Während der Extraktion der
Glucoseisomerase aus den Zellen wurde das die Zellen enthaltende
Gemisch mit so viel Magnesiumsulfatheptahydrat behandelt, daß
die Aufschlämmung 0,01 Mol Magnesiumsalz/Liter enthielt und
mit 0,1 m Kalilauge auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt.
Das rohe Glucoseisomerase-Enzym wurde aus einer 6,5-g-Probe (wie
Material vorlag) trockenem Zellpräparat mit 50 ml Extraktionsmittel
extrahiert. Das Gemisch wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt und dann bei 4°C zentrifugiert. Dabei wurden 42 ml
eines Extraktes mit einer Isomeraseaktivität von 26 bis 27
IGIU/ml erhalten. Die so hergestellte Glucoseisomerase-Enzymlösung
und das erfindungsgemäße stabilisierte Enzymkonzentrat
[hergestellt nach Beispiel 1b) ] wurden nach folgenden
Verfahren an eine Vielzahl verschiedener wasserunlöslicher
Träger sorbiert:
In einem 150 ml fassenden Becherglas wurden jeweils 2 g (Trockensubstanz)
des wasserunlöslichen Trägers mit 30 ml einer mit
KOH auf pH 8,0 eingestellten 0,01molaren Magnesiumsulfatheptahydratlösung
vermischt. Diesem Gemisch wurde so viel
Isomeraseflüssigkeit (entweder die auf herkömmliche Weise solubilisierte
Isomerase oder das erfindungsgemäße Enzymkonzentrat)
zugesetzt, daß der Träger (je nach seiner Kapazität)
mit 1000 bis 2000 IGIU in Kontakt gebracht wurde. Danach wurde
durch Zugabe weiterer 0,01molarer Magnesiumsulfatheptahydratlösung
das Flüssigkeitsvolumen auf 50 ml ergänzt. Das
das Enzym und den wasserunlöslichen Träger enthaltende Gemisch
wurde dann zunächst 30 Minuten durch Rühren gründlich durchgemischt
und darauf filtriert und mit der 0,01molaren Magnesiumsulfatheptahydratlösung
gewaschen. Die Filtrate und
Waschflüssigkeiten wurden dann vereinigt und in einen 250-ml-
Meßkolben überführt, wo sie durch Auffüllen bis zur Eichmarke
mit 0,01molarer Magnesiumsulfatheptahydratlösung verdünnt
und danach im Vergleich zum ursprünglichen löslichen Isomerase
Enzympräparat mit Hilfe eines automatischen Analysengerätes
(Technician Auto Analyzer) auf ihre Isomeraseaktivität untersucht
wurden.
Die "Bindungskapazität" ("BC") der jeweiligen wasserunlöslichen
Träger wurde durch Differenzrechnung nach folgender Formel berechnet:
In der Tabelle XI sind die Ergebnisse dieser Versuchsreihe
zusammengefaßt, in der die Bindungskapazitäten verschiedener
Träger für auf normale bzw. bekannte Weise solubilisierte
Glucoseisomerase einerseits und das stabilisierte Enzymkonzentrat
der Erfindung andererseits miteinander verglichen
werden.
Die in der Tabelle XI angegebenen Werte zeigen, daß die Bindungskapazität
von DEAE-Cellulose für das erfindungsgemäße
stabilisierte Enzymkonzentrat nahezu zweimal so hoch wie die
für in herkömmlicher Weise solubilisiertes Enzym ist sowie,
daß auch die synthetischen Anionenaustauscherharze für die
erfindungsgemäßen Enzymkonzentrate eine zwei- bis dreimal so
hohe Bindungskapazität aufweisen, wie für das zum Vergleich
untersuchte, in herkömmlicher Weise solubilisierte Enzym.
Im Verlauf dieser Versuche wurde außerdem gefunden bzw. festgestellt,
daß die Bindungskapazität von DEAE-Cellulose für
das erfindungsgemäße stabilisierte Enzymkonzentrat beträchtlich
gesteigert wird, wenn man den Träger bei einem niedrigeren
pH-Wert vorkonditioniert. Beispielsweise bindet der Träger bei
einem pH-Wert von 6,5 3120 IGIU/g, während der unbehandelte
Träger nur 1634 IGIU/g zu binden vermag. Durch die Verwendung
des erfindungsgemäßen stabilisierten Enzymkonzentrats war es
möglich, an DEAE-Cellulose (Type 20) pro dm³ 0,386 Mill. ("MM")
IGIU zu binden. Der so erhaltene Biokatalysator konnte dann
zur Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen Maissirup
durch kontinuierliches Durchleiten einer Glucoselösung durch
den Biokatalysator, der in Kolonnen bzw. Säulen oder in Druck-
Blattfilter-Elementen angeordnet werden konnte, verwendet werden.
Aus Tabelle XI ist auch zu ersehen, daß die höchste unter Verwendung
auf herkömmliche Weise solubilisierter Glucoseisomerase
erreichte Bindungskapazität 936 IGIU/g betrug und bei
Selectacel Type 40 erreicht wurde, das eine Austauschkapazität
von 0,89 mäq./g besaß. Obwohl Selectacel Type 20, das
eine Austauscherkapazität von 0,87 mäq./g hatte, eine etwas
niedrigere Bindungskapazität als die Type 40 aufwies, ist es
für den Einsatz in der industriellen Praxis besser geeignet,
weil es eine größere Teilchengröße besitzt und daher bessere
Fließgeschwindigkeiten zu erzielen sind.
Bei den nachfolgenden Versuchen wurde das erfindungsgemäße
stabilisierte Enzymkonzentrat an einer Anzahl verschiedener
wasserunlöslicher Träger immobilisiert und dann jeweils bezüglich
seiner Verwendbarkeit bei der kontinuierlichen enzymatischen
Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen Maissirup erprobt.
Zum Vergleich wurden auch kontinuierliche Umwandlungen
unter Verwendung immobilisierter ganzer Zellen durchgeführt.
Für die Umwandlungen wurde außer in den Fällen, in denen in
der Tabelle XII etwas angegeben ist, jeweils eine Kolonne
bzw. Säule mit den Abmessungen 1,5×8 cm verwendet.
Die Kolonnen wurden vorbereitet, indem zunächst am unteren Ende
ein Glaswollpfropfen eingesetzt und die Kolonne dann teilweise
mit Wasser gefüllt wurde. Bei der Verwendung wasserunlöslicher
Träger wurden diese dann in die Kolonnen gefüllt und mit
einem Glaswollpfropfen abgedeckt. Dann wurde das erfindungsgemäße
stabilisierte Enzymkonzentrat [Beispiel 1b), Ansatz 1] langsam
durch die Kolonne geführt, worauf mit einer kleinen Menge
destillierten Wassers nachgewaschen wurde. Die Wasch- und
anderen Kolonnenabläufe wurden vereinigt und auf ihre Glucoseisomeraseaktivität
untersucht. Die in der Kolonne sorbierte
Enzymmenge wurde durch Differenzrechnung ermittelt.
Bei der Verwendung immobilisierter ganzer Zellen [das Sil-Flo-
Filterhilfe enthaltende Produkt von Beispiel 1a) ] wurden
5 g des Enzympräparats mit oder ohne Zusatz von 100 mg Magnesiumhydroxyd
in die Kolonnen gefüllt, worauf ebenfalls Glaswollpfropfen
aufgesetzt wurden.
Zur Durchführung der kontinuierlichen Umwandlung wurden die
Kolonnen jeweils kontinuierlich mit einer durch Auflösen kristalliner
Dextrose erhaltenen, 50gew.-%igen, d. h. 600 g Glucose/
Liter Lösung enthaltenden Glucoselösung, beschickt, die pro Liter
0,004 bis 0,0055 Mol Magnesiumsulfat enthielt und einen pH-Wert
von 8,4 bis 8,6 besaß. Die Kolonnen wurden erforderlichenfalls
ins Gleichgewicht gebracht und die kontinuierliche enzymatische
Isomerisation bei 60°C durchgeführt, indem durch den Mantel
der Kolonnen jeweils 60°C warmes Wasser gepumpt wurde. Der
Durchfluß der den Kolonnen zugeführten Lösung durch die Kolonnen
wurde durch Anlegen eines Vakuums am Kolonnenboden und durch
Aufpressen von Stickstoffgas auf die Beschickung aufrechterhalten.
Die Durchflußgeschwindigkeit wurde durch Variieren
des auf der Beschickung lastenden Gasdrucks reguliert.
Die anscheinende Enzymaktivität "KE" wurde nach der Beziehung
bestimmt bzw. errechnet, in der
BVHdie Säulenfließgeschwindigkeit in Bettvolumina/h,
% Leden Dextrose/Fructose-Gleichgewichtswert, der bei
60°C 51,2 beträgt, und
% Lden Ketosegehalt des Kolonnenablaufs
bedeuten.
Die Säulenfließgeschwindigkeit in Bettvolumina pro Stunde bei
einem Lävulosegehalt von 45%, abgekürzt "BVH₄₅" ist somit
gleich KE/0,916.
Die Halbwertszeit, d. h. diejenige Zeit, die erforderlich ist,
bis die Hälfte der "anscheinenden Aktivität" der Kolonne verlorengegangen
ist, wurde bestimmt, indem während einer 2 Wochen oder
länger dauernden Kolonnenbetriebsperiode Proben gezogen und
an ihnen die "KE" gemessen wurde. Die dabei erhaltenen Analysenwerte
wurden graphisch ausgewertet, indem in einem Diagramm
lnKE gegen die Zeit aufgetragen und aus der Steigung der dabei
erhaltenen Kurve, die nach der Methode der kleinsten Felderquadrate
bestimmt wurde, die Halbwertszeit erhalten.
Bei dieser Methode wird unterstellt, daß der Abfall der Enzymaktivität
wie eine Reaktion erster Ordnung verläuft. Die anfängliche
bzw. ursprüngliche Säulenfließgeschwindigkeit in
Bettvolumina/h bei einem Lävulosegehalt von 45%, BVH₄₅, wurde
aus dem Schnittpunkt der Regressionsgeraden bestimmt.
Die Effizienz, "Eff", wurde nach der Beziehung
Eff = BVH₄₅ / MM IGIU / dm³
bestimmt.
Die bei diesen kontinuierlichen Umwandlungen erzielten Ergebnisse
sind in der nachfolgenden Tabelle XII wiedergegeben.
Die in der Tabelle XII angegebenen Daten zeigen, daß das stabilisierte
Enzymkonzentrat der Erfindung effizient an einer
Vielzahl wasserunlöslicher Träger sorbiert und zur kontinuierlichen
Umwandlung von Glucose in hoch-fructosehaltige Maissirupe verwendet
werden kann. Die beste Enzymausnutzung wurde beim Sorbieren
bzw. Immobilisieren des stabilisierten Enzymkonzentrats
an dem Aluminiumoxydträger mit geregelter Porosität erzielt.
Die dabei erreichte hohe Enzymausnutzung ist das Ergebnis der
dadurch erzielten hohen Effizienz und langen Halbwertszeit.
Das basische Magnesiumcarbonat und die synthetischen Anionenaustauscherharzträger
(Amberlite® IRA-904) lieferten in Kombination
mit dem erfindungsgemäßen stabilisierten Enzymkonzentrat bei der
kontinuierlichen Umwandlung ebenfalls gute Ergebnisse.
Die vorstehend in bezug auf den Aluminiumoxydträger mit geregelter
Porosität beschriebene Arbeitsweise wurde unter Verwendung des
stabilisierten Enzymkonzentrats von Beispiel 3 wiederholt. In
der Tabelle XIII sind die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse
zusammengefaßt.
Das stabilisierte Enzymkonzentrat der Erfindung läßt sich
effizient an dem Aluminiumoxydträger mit geregelter Porosität
unter Bildung eines Biokatalysators sorbieren, der zur
kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltige
Maissirupe gut geeignet ist. Die hohe Bindungseffizienz und
die lange Halbwertszeit dieses Biokatalysators ermöglichen
seinen wirtschaftlichen Einsatz in großtechnischen Verfahren.
Wenn auch in den vorhergehenden Beispielen nur die Verwendung
von Propan-2-ol als wassermischbares organisches Lösungsmittel
bei der Herstellung der stabilisierten Enzymkonzentrate erläutert
ist, so können erfindungsgemäß, wie bereits erwähnt,
jedoch auch noch andere wassermischbare organische Lösungsmittel
verwendet werden. Der nachfolgende Versuch wurde durchgeführt,
um die Verwendbarkeit anderer wassermischbarer organischer
Lösungsmittel als Propan-2-ol aufzuzeigen.
Gemäß Beispiel 1a) wurde eine intrazellulare Glucoseisomerase
enthaltende Kulturbrühe mit einer Isomeraseaktivität von
18,1 IGIU/g Kulturbrühe hergestellt. Diese Kulturbrühe wurde
filtriert, wobei eine Zellpaste mit einer Isomeraseaktivität
von 120 IGIU/g erhalten wurde. Die Zellpaste wurde mit einem
Lysozym-Enzympräparat behandelt, um die Zellwände der intrazellularen
Glucoseisomerase abzubauen. Die löslichen Bestandteile
des so erhaltenen Lysats besaßen eine Isomeraseaktivität
von 123 IGIU/g. Das Lysat wurde mit so viel Wasser verdünnt,
daß seine Isomeraseaktivität nach dem Verdünnen 110 IGIU/ml
betrug. Proben von jeweils 50 ml dieses Lysats wurden jeweils
allmählich mit einem der nachstehend angegebenen wassermischbaren
organischen Lösungsmittel versetzt. Dabei wurde jeweils
so lange Lösungsmittel zugesetzt, bis das Isomeraseprotein
gerade auszufallen begann. Das Lösungsmittel/Lysat-Gemisch
wurde dann jeweils 5 bis 10 Minuten gerührt, worauf das
unlösliche Material, einschließlich der Zelltrümmer und Nucleinsäuren
durch Zentrifugieren abgetrennt wurde. Proben von jeweils
20 ml der dabei gewonnenen überstehenden Flüssigkeiten
wurden dann unter Rühren mit 1 ml einer 1molaren Magnesiumsulfatheptahydratlösung
(5 Vol.-%) und so viel Lösungsmittel
versetzt, wie erforderlich war, um die durch die zugesetzte
Magnesiumsulfatlösung bedingte Verdünnung der Probe
in bezug auf den Lösungsmittelgehalt auszugleichen. Die die
zellfreie Glucoseisomerase, das wassermischbare organische
Lösungsmittel und Magnesiumsulfatheptahydrat enthaltenden
wäßrigen Gemische wurden dann jeweils etwa 15 Minuten stehengelassen,
wobei sie zwischendurch gelegentlich gerührt wurden.
Dann wurden die Gemische zentrifugiert, wobei die ausgefällten
stabilisierten Enzymkonzentrate als Produkt gewonnen wurden.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle
XIV wiedergegeben.
Aus den vorstehenden Versuchsergebniss 01775 00070 552 001000280000000200012000285910166400040 0002002712007 00004 01656en bzw. -werten ist zu
ersehen, daß eine Reihe verschiedener wassermischbarer organischer
Lösungsmittel wirksam für die Zwecke der Erfindung verwendet
werden kann. Die Alkohole und Ketone mit bis zu 3 C-Atomen
erwiesen sich als die bezüglich der selektiven Gewinnung
des Isomeraseenzyms wirksamsten Lösungsmittel. Ihre Verwendung
stellt daher eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der
Erfindung dar. Aus den vorstehend angegebenen Werten ist weiterhin
zu ersehen, daß um so mehr Lösungsmittel erforderlich ist,
um die Isomerase wirksam bzw. in hoher Ausbeute und selektiv
zu gewinnen, je niedriger das Molekulargewicht des betreffenden
Lösungsmittels ist. Beispielsweise benötigt man zur selektiven
Abtrennung bzw. Gewinnung pro Volumen Lysat bei der Verwendung
von Methanol 2,4 Volumina (etwa 67 Gew.-%), bei der Verwendung
von Propan-2-ol dagegen nur 1 Volumen (42 Gew.-%).
Es sei darauf hingewiesen, daß der Fachmann die in den vorstehenden
Beispielen erläuterte Erfindung ohne weiteres in
vielerlei Hinsicht abwandeln und modifizieren kann, ohne den
Rahmen des in der Beschreibung offenbarten und in den Ansprüchen
gekennzeichneten Erfindungsgedankens zu verlassen.
Es sei abschließend darauf hingewiesen, daß ein wichtiges
Definitionskriterium der erfindungsgemäßen stabilisierten
Glucoseisomeraseenzymkonzentrate neben dem Proteingehalt, dem
Magnesiumgehalt, dem Verhältnis dieser beiden Größen und der
spezifischen Isomeraseaktivität eben die Stabilität ist, die
so groß ist, daß das Präparat bei bis zu 30tägiger Lagerung
bei 26°C 95% seiner ursprünglichen Stabilität
beibehält.
Claims (19)
1. Stabilisiertes Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat, das
- 1) zellfreie Glucoseisomerase, die im wesentlichen nucleinsäurefrei ist, und
- 2) Mg++
enthält, gekennzeichnet durch
- a) einen Proteingehalt von 50 bis 80 Gew.-%, bezogen auf Trockensubstanz,
- b) einen Mg++-Gehalt von 3 bis 45 mg/ml Enzymkonzentrat,
- c) ein Mg++/Protein-Verhältnis von 0,02 bis 0,75,
- d) eine spezifische Isomeraseaktivität von mindestens 10 IGIU/mg Protein und
- e) eine solche Stabilität, daß es bei 30tägiger Lagerung bei 26°C 95% seiner anfänglichen Isomeraseaktivität behält.
2. Enzymkonzentrat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch
einen Proteingehalt von 60 bis 75 Gew.-%, bezogen auf
Trockensubstanz.
3. Enzymkonzentrat nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet
durch ein Mg++/Protein-Verhältnis von 0,03 bis 0,5 und
einen Mg++-Gehalt von 5 bis 25 mg/ml Enzymkonzentrat.
4. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß es zusätzlich 5 bis 25 Gew.-%
Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-
Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol,
enthält.
5. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet
durch einen Wassergehalt von 50 bis 80
und einen Trockensubstanzgehalt von 5 bis 30 Gew.-%.
6. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet
durch eine Aktivität von mindestens 5000,
vorzugsweise mindestens 8000 IGIU/g Trockensubstanz.
7. Enzymkonzentrat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß es eine so hohe Stabilität besitzt, daß es bei einjähriger
Lagerung bei 18°C mindestens 80±10% seiner
Anfangs-Isomeraseaktivität behält und eine spezifische
Isomeraseaktivität von mindestens 12 IGIU/mg Protein
aufweist.
8. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die darin enthaltene Glucoseisomerase
von den Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 713,
ATCC 21 714 und/oder ATCC 21 715 stammt.
9. Enzymkonzentrat nach einem der Ansprüche 3, 7 und 8, dadurch
gekennzeichnet, daß es 20 bis 30 Gew.-% Propan-2-
ol und 55 bis 70 Gew.-% Wasser enthält und sein Mg++-
Gehalt aus Magnesiumacetat, -chlorid und/oder -sulfat
stammt.
10. Verfahren zur Herstellung des stabilisierten Glucoseisomerase-
Enzymkonzentrats gemäß einem der Ansprüche 1
bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) durch Behandeln eines zellfreie Glucoseisomerase und Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2- ol, enthaltenden, wäßrigen Gemisches mit einem im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz in einer Menge, die eine Magnesiummolarität von 0,002 bis 0,3 (Mol Magnesiumsalz/ Liter Gemisch) im Gemisch ergibt, eine Enzym- Magnesium-Fällung erzeugt und
- b) das stabilisierte, konzentrierte Glucoseisomerase, Magnesium in einer Mg++-Molarität von 0,1 bis 2 entsprechenden Menge, Wasser und Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol, umfassende Enzymkonzentrat gewinnt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
man als im wesentlichen wasserlösliches Magnesiumsalz
Magnesiumacetat, -chlorid und/oder -sulfat einsetzt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet,
daß man Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol,
Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise
Propan-2-ol, in der Verfahrensstufe a) in einer
einem Gehalt von 30 bis 60 Gew.-%, bezogen auf das Gemisch,
entsprechenden Menge einsetzt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, daß das zellfreie Glucoseisomerase und
Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton,
p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol
enthaltende wäßrige Gemisch hergestellt wird, indem man
- a) intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Zellen in Anwesenheit von Wasser mit Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol, und einem Lysozym-Enzympräparat behandelt,
- b) das Lysozym-Enzym auf das Zellmaterial einwirken läßt,
- c) die unlöslichen Substanzen abtrennt und
- d) dabei ein wäßriges, zellfreie Glucoseisomerase und Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan- 2-ol enthaltendes Gemisch gewinnt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß
man dem die Zellen enthaltenden wäßrigen Gemisch so viel
Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-
Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol
zumischt, daß der Lösungsmittelgehalt der erhaltenen
wäßrigen Mischung 40 bis 45 Gew.-% beträgt.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet,
daß man jeweils so viel Methanol, Äthanol,
Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan und/oder
Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-ol zusetzt, wie erforderlich
ist, um in den Verfahrensstufen a), b) und
c) einen Lösungsmittelgehalt von 42±1 Gew.-% aufrechtzuerhalten.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, daß Glucoseisomerase eingesetzt wird,
die von Streptomyces olivochromogenes ATCC 21 713,
ATCC 21 714 und/oder ATCC 21 715 stammt und
gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 15 aus den
Zellen abgetrennt und gewonnen wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch
gekennzeichnet, daß das die zellfreie Glucoseisomerase
und Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton,
p-Dioxan und/oder Propan-2-ol, vorzugsweise Propan-2-
ol, enthaltende wäßrige Gemisch mit Magnesiumsulfatheptahydrat
in einer Menge behandelt wird, die einer Konzentration
von 0,05 Mol dieses Salzes pro Liter entspricht.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, daß man das in der Verfahrensstufe b)
gewonnene stabilisierte Enzymkonzentrat mit einer
kleinen Menge Wasser verdünnt.
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