DK146480B - Fremgangsmaade til fremstilling af et stabiliseret glucoseisomeraseenzymkoncentrat - Google Patents

Description

V p.a (19) DANMARK —'

jÉB da) FREMLÆGGELSESSKRIFT n, 146480 B

kfega

DIREKTORATET FOR

PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 1202/77 (51) Int.CI.3: C12N 9/96 (22) Indleveringsdag: 18 mar 1977 (41) Aim. tilgængelig: 20 sep 1977 (44) Fremlagt: 17 okt 1983 (86) International ansøgning nr.: - (30) Prioritet: 19 mar 1976 US 668380 (71) Ansøgen *CPC INTERNATIONAL INC.; Englewood Cliffs, US.

(72) Opfinder: Robert Paul *Cory; US.

(74) Fuldmægtig: Patentbureauet Hofman-Bang & Boutard_ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af et stabiliseret glucoseisomeraseenzymkoncentrat

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et stabiliseret glucoseisomeraseenzymkoncentrat.

Det opnås forholdsvis rent og i en vandopløselig form, der har en høj specifik aktivitet og en forbedret lagerstabilitet.

Omdannelse af glucose til fructose, kendt som usomerisering, giver produkter, der i praksis er en erstatning for det kommer-q cielle invertsukker. Her går man ud fra glucose, et mono- 3 saccharid-sukkerstof, der er 70 pct. så sødt som saccharose eller ® invertsukker, og omdanner op tilhalvdelen af det til et sukker- ^5 stof, der er cirka 140 pct„ så sødt som saccharose eller invert- “ sukker. Det er denne ekstra sødeevne, der gør majsforarbejdsin- <L 3 2 146480 dustrien interesseret i fructoseholdige majssiruper (i dag almindeligvis kendt som højfructoseholdige majssiruper, HFCS) samt i fremstilling af disse siruper.

Studiet af den enzymatiske isomeriseringsfremgangsmåde begyndte i 1955} og ud fra dette arbejde kom USA-patentskrift nr. 2.950.228 samt artiklen af Marshall og Kooi i Science, 125, 648 (1957).

Fra dette tidspunkt begyndte en eksplosiv udvikling førende til store mængder litteratur og patenter med beskrivelser af arbejder udført af forskere, der blev ansporet af det oprindelige arbejde som nævnt ovenfor.

En af de mest betydningsfulde artikler er skrevet af Drs. Sato og Tsumura fra Japanese Food Research Institute i det foreløbige tryk af Annual Meeting of the Agricultural Chemical Society of Japan, holdt i Sapporo 20. juli 1964. I dette foreløbige tryk og senere i japansk patentskrift nr. 17.640 beskrives, at adskillige stammer af mikroorganismer af slægten Streptomyces, når de dyrkes på xylose, frembringer enzymet glucoseisomerase, og det blev rapporteret, at det var virksomt til at isomerisere glucose til fructose. I en påfølgende udvikling fandt en anden gruppe forskere, der arbejder sammen med Dr. Takasaki fra Japanese Fermentation Research Institute, der er et institut under Ministry of International Trade and Industry (MITI), at visse stammer af mikroorganismer af Streptomyces-slægten, der assimilerer xylan (en polymer af xylose), kan dyrkes på xylan til fremstilling af glucoseisomerase. Den fundne proces er beskrevet i japansk patentskrift nr. 27.525 og i USA patentskrift nr. 5.616.221.

Fabrikanter af majssirup med højt fructoseindhold har fundet, at enzymatisk isomerisering af glucose fortrinsvis skal udføres som en kontinuerlig proces for på økonomisk måde at fremstille et kommercielt acceptabelt majssirup-produkt med højt fructose-indhold. Ved en sådan fremgangsmåde bringes glucosesirup generelt i kontakt med en massiv mængde glucoseisomeraseenzym, der er anbragt på en inert bærer, dvs. et immobiliseret glucoseisomeraseenzym. En vigtig ting ved en sådan fremgangsmåde er anvendelsen af et immobiliseret glucoseisomeraseenzym, der besidder 3 146480 en høj koncentration af isomeraseaktivitet pr. enhedsvolumen for herved at gøre enzymet egnet til en kontinuerlig enzymatisk isomeriseringsproces.

Glucoseisomerase fremstilles generelt intracellulært, dvs. hovedmængden af glucoseisomeraseenzymet findes i og/eller på cellevæggene i mikroorganismerne, hvorfra det produceres. Ved nogle kontinuerlige isomeriseringsprocesser anvendes hele celler indeholdende glucoseisomerase. Sådanne fremgangsmåder kræver generelt specielle behandlinger af cellerne for at hindre udtrækning af glucoseisomerase fra cellerne, således at enzymet faktisk immobiliseres i selve cellerne, og/eller et særligt udstyr, der imødegår de hydrauliske problemer, der opstår ved at lede den glucoseholdige opløsning igennem cellelejet indeholdende glucoseisomeraseenzymet. Eksempler på sådanne fremgangsmåder, der anvender hele celler indeholdende glucoseisomerase, i USA-patentskrifterne nr. 3.694.314, 3.753.858, 3.779.869, 3.817.832, 3.821.086, tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.317.680 og tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.345.186. Disse fremgangsmåder, hvor hele celler indeholdende glucoseisomerase anvendes, lider af et antal ulemper. Disse ulemper omfatter de hydrauliske problemer, dannelsen af urenheder på grund af nærværelsen af ikke-isomeraseenzymer, nucleinsyrer og andre stoffer fra cellevæggene samt længere kontakttider mellem glucoseopløsningen og den cellulære enzympræparation (hvor sidstnævnte under alkaliske betingelser vil forårsage dannelsen af uønskede alkalikatalyserede! reaktionsprodukter af fructose, såsom psicose og hydroxymethyl-furfural [ΕΜΕ]). Nævnte problemer fører til højere fremstillingsomkostninger på grund af den oprensning, det er nødvendigt at udføre for at fjerne de dannede urenheder, og /eller fremstilling •af et ringere produkt.

I et forsøg på at løse de problemer, der mødes, når man anvender hele celler indeholdende glucoseisomerase intracellulært, har tidligere forskere foreslået fremgangsmåder, hvor glucoseisomerase fjernes fra cellerne til en opløselig form, hvorefter de immobiliseres på en vanduopløselig inert bærer. Det immobi-liserede enzym er herefter egnet til anvendelse ved kontinuerlig omdannelse af glucose til majssirup med højt fructoseindhold. Eksempler på sådanne fremgangsmåder er beskrevet i USA-patent- 146480 4 skrifterne nr. 3-708.397, 3-788.945, 3.850.751, 3*868.304, belgisk patentskrift nr. 819*859 og belgisk patentskrift nr. nr. 810 480,

Selv om disse fremgangsmåder, der anvender cellebefriet immobi-liseret glucoseisomerase, løser nogle af de ovennævnte problemer, .er det påkrævet ved de navnte fremgangsmåder at solubi-lisere glucoseisomerase (dvs. fjerne glucoseisomerase fra de hele celler). Fremgangsmåder til opløsning af glucoseisomerase er velkendte.. Imidlertid er det ønskværdigt at fremstille cellebefriet og opløselig glucoseisomerase med høj renhedsgrad, og som endvidere har en høj isomeraseaktivitet pr. en-hedsvolumen. Anvendelsen af særdeles rene og koncentrerede enzymer forøger den effektivitet, hvormed enzymet kan anbringes på den uopløselige bærer.

Fremgangsmåder til ekstraktion og oprensning af glucoseisomerase fra celler af mikroorganismer i en koncentreret og oprenset form har derfor hidtil involveret kostbare og komplicerede fremgangsmåder, der kun er egnede til fremstilling af produkt i lille skala. .

En sådan laboratoriefremgangsmåde til ekstraktion og oprensning af opløselig; glucoseisomerase er beskrevet af Danno et al. i Agr. Biol. Chem., bind 31, pp* 284-292 (1967)· Den her beskrevne fremgangsmåde til rensning af glucoseisomerase går ud fra Bacillus coagulans stamme HN-68 ved at underkaste ethylendiamin-tetraeddikesyre-behandlede celler en behandling med lysozym til fremstilling af et cellebefriet ekstrakt efterfulgt af behandling af dette med mangansulfat til fremstilling af et bundfald af uønskede stoffer. Den ovennævnte væske behandles igen med ammoniumsulfat til udfældning af et proteinholdigt glucose-isomeraseprodukt, der yderligere oprenses ved dialyse og kromatografi på DEAE-"Sephadex" A-50 (et registreret varemærke). En forøgelse på 60 gange af glucoseisomerasekoncentrationen blev rapporteret.

En anden laboratoriefremgangsmåde til rensning af glucoseisomerase er beskrevet af Takasaki et al., (Agri. Biol. Chem., bind 33, pp* 1527-1534 [1969] fog i "Fermentation Advances", udgivet 5 146480 af D. Perlman, pp. 561-589 Academic Press, Inc., New York, New York [1969]. Her beskrives, at intracellulær glucoseisomerase afledt af Streptomyces albus kan frigives fra celler ved at behandle med et kationisk overfladeaktivt middel, nemlig cetyl-pyridiniumchlorid og herefter fraktionere ved sekventiel behandling af den cellebefriede ekstrakt med acetone, dialysebehandling efterfulgt af DEAE-cellulose og DEAE-Sephadex kolonnekromatografi og yderligere dialyse. Den oprensede cellefri ekstrakt rensedes yderligere ved dialyse i en opløsning indeholdende 0,005 M magnesiumsulfat og 0,0002 M CoC^. Acetone blev gradvis sat til den fremkomne opløsning til en koncentration på 40, 45 og endelig 50 pct. til udkrystallisering af glucoseisomeraseenzymet.

Denne fremgangsmåde er for kompliceret og tidsrøvende til at kunne anvendes i stor skala.

I USA-patentskrift nr. 3.708.397 er beskrevet en fremgangsmåde til ekstraktion af glucoseisomerase fra EDTA-behandlede celler af mikroorganismen Streptomyces phaeochromogenes dyrket på hvedeklid efterfulgt af behandling med en opløsning indeholdende lysozym, toluen, magnesiumchlorid, puffer og vand. Den lyserede opslæmning behandledes derefter med magnesiumchlorid, og endelig udfældedes enzymet ved hjælp af gradvis tilsætning af kold acetone. Dette enzymbundfald opløstes i vand og immobiliseredes på DEAE-cellulose til anvendelse som en biokatalysator til omdannelse af glucose til majssirup med højt fructoseindhold.

I USA-patentskrift nr. 3*788.945 er der beskrevet en fremgangsmåde, hvori intracellulær glucoseisomerase afledt af Streptomyces sp.ATCC 21.175, dyrket på xylose og xylan-hydrolysat, behandledes med en kationisk detergent (Arquad 18-50), efterfulgt af behandling med DEAE-cellulose til fjernelse af ikke-isomerase-stof. Filtratet indeholdende glucoseisomerase immobiliseredes herefter på DEAE-cellulose eller en syntetisk anionionbytter-harpiks til fremstilling af en biokatalysator til kontinuerlig omdannelse af glucose til majssirup med højt fructoseindhold.

I USA-patentskrift nr. 3*847.740 og 3*847 741 er beskrevet en fremgangsmåde til behandling af celler indeholdende intracellulær glucoseisomerase med en lille mængde af et overfladeaktivt middel Tween 80 (et registreret varemærke) i en pufret lysin- 6 1^6480 opløsning. Efter grundig blanding blev cellemembranen fjernet, og filtratet indeholdende 17,5 U/ml isomerase-aktivitet blev opnået.

I USA-patentskrift nr. 3.847.740 er beskrevet en fremgangsmåde til immobilisering af oprenset glucoisomerase på en basisk magne-siumcarbonatbærer, og i USA-patentskrift nr. 3.850.751 og 3.868.304 er beskrevet fremgangsmåder til immobilisering af glucoseisomerase på kontrollerede porøse bærere af aluminiumoxid. Anvendelsen af disse immobiliserede enzympræparationer giver bedre fremgangsmåder til fremstilling af majssirup med højt fructoseindhold, men kræver særdeles rent og koncentreret glucoseisomerase for effektivt og økonomisk at kunne kommercialiseres.

På trods af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder er der stadigvæk behov for en økonomisk egnet fremgangsmåde, der kan anvendes i stor skala til fremstilling af et i det væsentlige opløseligt og oprenset glucoseisomeraseprodukt, der har en høj aktivitet pr. enhedsvolumen og stor stabilitet, og som er egnet til at binde til et vanduopløseligt bærestof til anvendelse i en kontinuerlig proces ved fremstilling af majssiruper med højt fructoseindhold, men som også kan anvendes per se og ved andre immobiliseringsfremgangsmåder .

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af et stabiliseret glucoseisomeraseenzymkoncentrat. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte. Det fremstillede koncentrat indeholder (1) et cellebefriet glucoseisomeraseenzym, der i det væsentlige er frit for nucleinsyrer og (2) et i det væsentlige vandopløseligt magnesiumsalt, hvilket enzymkoncentrat yderligere har (a) et proteinindhold på 50-80 vægtprocent på tørstofbasis, (b) et Mg++-indhold på 3-45 mg Mg++ pr. ml enzymkoncentrat, (c) et Mg++/proteinforhold på 0,02 - 0,75, (d) en specifik isomera-seaktivitet på mindst 10 IGIU/mg protein og (e) en sådan stabilitet, at det bibeholder op til 95 pct. af den oprindelige iso-meraseaktivitet, når produktet lagres ved stuetemperatur (26°C) i op til 30 dage , og op til 80 “ 10 pct. af den oprindelige isome- raseaktivitet, når det lagres ved 18°C I op til 12 måneder.

7 146480

En2ymkoncentratet indeholder fortrinsvis et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom 2-propanol, i en mængde på fra 5 til 25 vægtprocent og har en isomeraseaktivitet på mindst 5000 IGIU/g på tørstofbasis og helst cirka 8.000 IGIU/g på tørstofbasis.

Det stabiliserede enzymkoncentrat fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen foreligger i form af en tyk opslæmning og fortyndes fortrinsvis med en lille mængde vand for at lette sorptionen på en vanduopløselig bærer til dannelse af en særdeles stabil, immobiliseret glucoseisomerasebio-katalysator, der har en høj isomeraseaktivitet pr. enhedsvolumen bærer. Foretrukne enzymkoncentrater har et vandindhold på 50-80 pct., fortrinsvis 55-70 pct. Tørstof af enzymkoncentraterne ligger fortrinsvis på 5-30 pct. og helst på 20-30 pct. Koncentration, oprensning og stabilisering giver mere end 70 gange forøgelse i koncentrationen af enzymet fra den oprindelige fermenteringsvæske og fortrinsvis mere end en forøgelse på 100 gange. Enzymkoncentratet er også 10-15 gange mere rent end det oprindelige enzym.

På grund af den overflod af begreber, der er almindeligt anvendt inden for denne videnskab, gives her nogle få definitioner for at simplificere nærværende ansøgning og for at gøre den mere præcis.

D_.E_.

Betegnelsen "D.E." er en forkortelse for dextrose ækvivalent, og dette refererer til indholdet af reducerende sukker i et stof, beregnet som dextrose, og udtrykkes som procent af det totale faste stof.

Stivelseshydrolysat

Betegnelsen "stivelseshydrolysat" anvendes på generel måde til at beskrive en sirup eller et tørprodukt, der fremstilles ved 146480 8 hydrolyse af stivelse. Et sådant produkt kan fremstilles ved sur eller enzymatisk hydrolyse eller ved en kombination af sur og enzymatisk hydrolyse. En foretrukken type stivelseshydrolysat til anvendelse ved isomerisering med enzymkoncentratet fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles ved syre- eller enzymfortynding til en D.E. på 10 eller mindre efterfulgt af enzymatisk sacdiarifikation til en D.E. på ca. 90, fortrinsvis over 95. Betegnelsen "dextrose" anvendes i kommerciel sammenhæng som betegnelsen for raffineret, krystallinsk sukker (et mono-saccharid), der udvindes fra et stærkt omdannet stivelseshydrolysat. Betegnelsen "glucose" vil heri blive anvendt både i den sædvanlige kommercielle mening, men også omfattende monosaccharid-dextrose i enhver form, i opløsning eller på tør form, som en konstituent af en stivelseshydrolysatsirup eller sirupfaststof eller i raffineret krystallinsk form.

Fructoae. og Jevulose_

Betegnelserne "fructose" og "levulose" anvendes generelt som synonymer og refererer til levo-rotationsisomer af glucose, der er sødere end dextrose. Denne isomere findes naturligt i honning og i invert sukker sammen med glucose og er værdifuld på grund af dens sødeevne. Betegnelsen "fructose” vil blive anvendt til at henvise til dette monosaccharid.

5i2222®i®25®22s®®22Z5i "Glucoseisomeraseenzym" er det enzym eller det enzympræparat, der er i stand til at isomerisere xylose til xylulose og glucose til fructose. Den dominerende aktivitet hos dette enzym er omdannelse af xylose til xylulose og betegnelsen "xyluloseisomerase" er det mest nøjagtige videnskabelige navn (EC 5.3.1.5). Man har også inden for dette fagområde refereret til enzymet som dextro-seisomerase, xylose (dextrose) isomerase og glucoseisomerase.

Den mest almindeligt anvendte betegnelse er "glucoseisomerase", og denne vil blive anvendt heri for at simplificere og gøre forståelsen bedre.

9 146480

Enheder I nærværende ansøgning er alle dele og procenter vægtdele og vægtprocenter og på en "som det foreligger "-basis, med mindre andet er anført.

IGIU

Betegnelsen "IGIU" er en forkortelse for International Glucose Isomerase Enhed. En IGIU er den mængde glucoseisomeraseenzym, der danner et mikromol fructose pr. minut i en 0,8 molær opløsning af glucose ved pH 7,5 og ved 60°C, idet der anvendes forsøgsmetoden beskrevet nedenfor.

Analysemetoden omfatter udførelsen af en spectrophotometrisk bestemmelse af ketose produceret fra en glucoseopløsning under standardiserede betingelser.

En stamopløsning fremstilles på følgende måde:

Stamopløsning til analyse

Komponent Mængde 0,1 M MgSO^ · 7H20 1 ml 0,01 M CoCl2 · 6H20 1 ml 1,0 M phosphatpuffer, pH 7,5 0,5 ml

Vandfri D-glucose 1,44 g

Destilleret vand Op til et volumen på 7,5 ml

Det enzympræparat, der skal analyseres, fortyndes først, således at det indeholder 1-6 IGIU/ml.

10 146480

En enzymatisk isomer!sering udføres ved at sætte 1 ml af enzympræparatet til 3 ml af stamopløsningen og inkubere dette i 30 minutter ved 60°C. Herefter udtages en 1 ml prøve, der udhældes i 9 ml 0,5 N perchlorsyre. Prøven fortyndes til et totalvolumen på 150 ml. Som kontrol til sammenligningsformål køres en glucose-blindværdi ved at substituere enzympræparatet med 1 ml vand. Ke-tose bestemmes herefter ved en cystein-svovlsyremetode. Til analyseformål defineres en IGIU som den enzymaktivitet, der kræves til at producere et mikromol fructose pr. minut under isomerise-ringsbetingelseme beskrevet ovenfor.

Lys o zymenzympræparation

Lysozymenzym (EC 3.2.1.17) er et enzym, der hydrolyserer β- 1,4-bindinger mellem N-acetyl-muraminsyre (eller 2-acetamido- 2-deoxy-D-glucose) og 2-acetamido-2-deoxy-D-glucose-grupper i et mucopolysaccharid, mucopolypeptid eller i chitin. Lysozym fremstilles generelt fra æggehvider. Det katalyserer hydrolysen (lysis) af cellevægge hos mange mikroorganismer.

Det stabiliserede enzymkoncentrat fremstilles som nævnt fortrinsvis ved først at behandle cellerne indeholdende intra-cellulær glucoseisomerase med et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel valgt blandt methanol, ethanol, propanol, 2-propanol, tert.-butylalkohol, acetone og p-dioxan og et lysozymenzym udvundet af æggehvider i tilstrækkelig lang tid til at fordøje det cellulære materiale og til at frigive glucose-isomeraseenzymet fra cellerne. Cellemembranen og nucleinsyrer-ne fjernes herefter ved centrifugering efter indstilling af opslæmningen på et indhold af det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel på 30-67 vægt-% ved eventuel tilsætning af yderligere opløsningsmiddel, og en opløsning indeholdende det cellebefriede glucoseisomeraseenzym, det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel og vand bliver tilbage.

Den maksimale koncentration af opløsningsmiddel vil naturligvis variere fra det ene opløsningsmiddel til det andet. Generelt ligger den øvre grænse for de fleste opløsningsmidler på 60 pet.; for methanol dog på 67 pct. Når 2-propanol anvendes, 146480 11 vil den vandige opløsning af den cellebefriede glucoseisomerase typisk indeholde 40-45 vægtprocent og fortrinsvis 42-1 vægtprocent 2-propanol.

Det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel tjener flere forskellige bestemte formål; det virker nemlig som konserverende middel for enzymet under fremstillingen (og under lagring, hvis ikke opløsningsmidlet fjernes fuldstændigt), og det nedsætter opløseligheden af enzymet under salttilsætningen. Det virker også som udfældende middel for nucleinsyrer og andre ikke-isome-raseproteinholdige stoffer fra den solubiliserede glucoseisomerase før behandling med det omhandlede magnesiumsalt. Der opnås således en koncentreret og særdeles ren isoraerase ved anvendelse af det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel.

Hvornår og hvordan det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel sættes til opslæmningen indeholdende glucoseisomerase kan variere. Ved en metode behandles først en centrifugeret pasta af celler, der indeholder intracellulær glucoseisomerase, med en del af det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel. Den vandige opslæmning af celler og opløsningsmiddel behandles herefter med lysozym. Efter enzymet er frigivet fra cellerne, sættes yderligere mængder af opløsningsmidlet til opslæmningen, indtil det punkt, hvor nucleinsyrerne og fremmede proteinholdige stoffer udfældes, men hvor isomeraseenzymet forbliver opløseligt. Cellevæggen og det udfældede fremmede stof fjernes. Herefter tilsættes det vandopløselige magnesiumsalt til udfældning af det stabiliserede enzymkoncentrat.

Ved anden teknik sættes i det væsentlige hele den forudbestemte mængde opløsningsmiddel til den cellulære pasta af glucoseisomerase. Ved denne teknik behandles den cellulære pasta, der er opnået ved centrifugering af dyrkningsmediet indeholdende celler med intracellulær glucoseisomerase, med den fulde mængde med vand blandbart organiske opløsningsmiddel sammen med vand til opnåelse af en opløsningsmiddel/vand-opslæmning af celler. Denne opslæmning 146480 12 indeholdende det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel behandles således, at glucoseisomeraseenzymet frigives fra cellerne. Efter fjernelse af uopløselige materialer, der omfatter cellevægge og nucleinsyrer, behandles den rensede opløsning indeholdende cellebefriet glucoseisomerase, opløsningsmiddel og vand med det vandopløselige magnesiumsalt til udfældning af det stabiliserede enzymkoncentrat.

Temperaturen og pH-betingelserne linder fremgangsmåden skal være sådanne, at enzymet ikke inaktiveres. Generelt skal pH ligge fra 6 til 9 og fortrinsvis fra 7 til 7,5 under hvert trin i processen. Temperaturen kan ligge fra 5 til 65°C, fortrinsvis 15 -35 °C og helst 25-30 °C.

Det i alt væsentligt vandopløselige magnesiumsalt anvendt ved den omhandlede fremgangsmåde er fortrinsvis et, der er vandopløseligt i en koncentration på 0,02-2 molær ved stuetemperatur. Typiske anvendelige magnesiumsalte er magnesiumchlorid, magnesiumbromid, magnesiumnitrat, magnesiumsulfat-heptahydrat, magnesiumacetat og magnesiumlactat. Magnesiumsulfat-hepta-hydrat, magnesiumacetat og magnesiumchlorid foretrækkes, og magnesiumsulfat-heptahydrat er det mest foretrukne. (Når der i beskrivelsen refereres til magnesiumsulfat, er det til heptahydrat-formen).

Mængden af opløseligt magnesiumsalt anvendt ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal være tilstrækkelig til at give en koncentration på 0,02 molær med hensyn til magnesiumion. Den øvre grænse for koncentrationen af magnesiumsalt vil variere, afhængigt af det anvendte salt. Magnesiumsaltet skal ikke' tilsættes i så store mængder, at en total udsaltning eller en salt-vandfase-separation forekommer. Generelt er den maksimale mængde magnesiumsalt i opløsningen cirka 0,3 molær. Fortrinsvis er magnesiumsaltkoncentrationen i opløsningen 0,02 - 0,2 molær baseret på magnesiumionindholdet. De bedste resultater har man fundet véd at tilsætte magnesiumsalt i en mængde, der giver en opløsning med 0,05 mol magnesiumion.

13 146480

Det intracellulære glucoseisomeraseenzym, hvorfra det stabiliserede enzymkoncentrat kan fremstilles, kan afledes fra enhver egnet mikroorganisme, der kan producere glucoseisomeraseenzymet. Eksempler på egnede mikroorganismer omfatter de, der er afledt af slægterne Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes og Curtobacterium. Specifikke mikroorganismer, der kan anvendes ved fremstilling af det intracellulære glucoseisomerase-enzymudgangsmateriale, er Streptomyces fradiae, Streptomyces phaeo-chromogenes, Streptomyces albus ATCC No. 21.132, Streptomyces wed-morensis ATCC No. 21.230; de to sidstnævnte er nævnt i USA-patent-skrift nr. 3.616.221, Streptomyces rubiginosus ATCC No. 21.175 og ATCC No. 21.176 nævnt i USA-patentskrifterne nr. 3.666.628 og 3.788.945, Streptomyces olivaceus NRRL 3583 nævnt i USA-patent-skrift nr. 3.625.828 og Streptomyces olivaceus NRRL 3916 nævnt i britisk patentskrift nr. 1.376.787, Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 21.114 nævnt i USA-patentskrifterne nr. 3.622.463 og 3.770.589 og Streptomyces olivochromogenes ATCC nr. 21.713, 21.714 og 21.715 nævnt i USA-patentskrift nr. 3.813.318, Streptomyces ve-nezuelae ATCC No. 21.113 nævnt i USA-patentskrift nr. 3.622.463, Streptomyces glaucescens nævnt i britisk patentskrift nr. 1.410.579, Streptomyces violaceoniger nævnt i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.417.642, Arthrobacter nov sp.NRRL B-3724, NRRL B-3725, NRRL B-3726, NRRL B-3727 og NRRL B-3728 nævnt i USA-patentskrift nr. 3.645.848, Bacillus stearothermophilus ATCC No. 21.365, NRRL B-3680, NRRL B-3681 og NRRL B-3682 nævnt i USA-patentskrift nr.

3.826.714, Lactobacillus brevis, Bacillus coagulans, NRRL Nos.

5649 - 5666 og især NRRL No. 5650 nævnt i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.400.323, Actinoplanes missouriensis NRRL B-3342, Actinoplanes philippinesis ATCC No.12.427, Actinoplanes armeniacus ATCC No. 15.676 og Actinoplanes sp.ATCC 23.342 nævnt i USA-patentskrift nr. 3.834.988, Aerobacter levanicum NRRL B-1678 nævnt i USA-patentskrift nr. 3.813.320, og Nocordia asteroides ATCC No. 21.943, Nocardia dassonvillei ATCC No. 21.944, Micromonospora coerula ATCC No. 21.945, Microbisporarosea ATCC No. 21.946 og Microellobospora flavea ATCC No. 21.947 nævnt i USA-patentskrift nr. 3.829.362 og Curtobacterium nævnt i japansk Sho 50/132176 (1975)· 14 146480

De mest foretrukne glucoseisomeraseenzymer, der er nyttige som udgangsmaterialer ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er de, der afledes af stammer af Streptomyces-slægten, fortrinsvis af Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 21.713, ATCC No.

21714 og ATCC No. 21.715 (hvoraf sidstnævnte er en enkelt koloni isoleret fra ATCC No. 21.713) nævnt i USA-patentskrift nr. 3.813.318, især når de fremstilles ved fremgangsmåden beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.770.589.

Det intracellulære glucoseisomeraseenzym fremstilles ved at dyrke en glucoseisomerase-producerende mikroorganisme, såsom ovennævnte stammer, i et egnet kulturmedium med en egnet carbon-kilde og andre anvendelige næringsstoffer, der gør det muligt at danne enzymet.

Por eksempel fremstilles et podningsmedium indeholdende en glucoseisomerase-producerende stamme på en agar-skråflade, og denne anvendes til at pode et egnet kulturmedium. Herefter dyrkes organismen til fremstilling af det intracellulære glucoseisomeraseenzym. Inkuberingstiden kan variere afhængigt af den særligt anvendte mikroorganisme og kulturmediet, men ligger fortrinsvis mellem 4 og 48 timer. En prøve af eller hele kulturen anvendes herefter til at pode et egnet kulturmedium i et eller flere udviklingstrin, hvorefter podningsmediet fra det endelige udviklingstrin anvendes til at pode et egnet medium i en fermentator.

Væsken indeholdende det intracellulære glucoseisomeraseenzym kan udvindes og koncentreres ved egnede metoder, såsom centrifugering og/eller filtrering. Cellepastaen indeholdende cellerne med intracellulær glucoseisomerase findes således i en egnet form til behandling ifølge den foreliggende fremgangsmåde.

Pølgende eksempler tjener til nærmere at beskrive fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Alle dele er vægtdele med mindre andet er angivet Glucoseisomeraseaktiviteten er bestemt som anført ovenfor.

15 146480 EKSEMPEL 1 (a) Fremstilling_af_intracellulær_glucoseisomerase

Det intracellulære glucoseisomeraseenzym-præparat anvendt til at fremstille det stabiliserede enzymkoneentrat fremstilledes i fire podningsudviklingstrin, der startede med 1-liter rystekol-ber og førte op til en 3.785 liters beholder og kulminerede i den endelige 75.708 liters fermenteringsbeholder. Hvert påfølgende udviklingstrin og den store fermenteringsbeholder podedes med et volumen podningsmedium svarende til 5 procent af volumenet i den podede beholder. Sammensætning af mediet for udviklingen og driftsbetingelserne er anført i tabel I. Mediet til hvert trin steriliseredes i 30 minutter ved 120°C. Tiden for udvikling af podningsmediet var 48 timer i første trin, 24 timer i andet trin, 22 timer i tredje trin og 15-17 timer i fjerde trin. I første trin blev celler fra en sporuleret mutantstamme af en mikroorganisme identificeret som Streptomyces olivochromogenes ATOC No. 21.715 (en enkelt koloni isoleret af ATCC 21.713 som beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.813.318 ) sat til kulturmediet. De fire podningsudviklingstrin udførtes ved en temperatur på 28°C og et pH på 7,0 (indstillet før steriliseringen med 10 N natriumhydroxid).

16 14 6 Λ 8 O

TABEL· I

Udviklingstrin Medium Vaegtpct. Vægt Volumen 1. trin (1-li- Majsstøbevand, 3,6 7,2 g 200 ml ber)ryStek0l~ 15 E.E. fast majssirup 1,0 2,0 g 200 ml

Magnesiumsulfat · 7H20 0,05 0,7 g 200 ml

Antiskummiddel, HODAG 2000 (Polypropylenglycol) ---- 0,07 ml 200 ml 2. trin (14- Majsstøbevand, 3,6 271 g 9 liter fermentor) 15 Ε·Ε· fast *»3ssirup 2,0 180 g 9 liter

Magnesiumsulfat · 7H20 0,05 4,5 g 9 liter

Antiskummiddel, HODAG 2000 (Polypropylenglycol) ---- 1,3 ml 9 liter 3. trin (190- .Majsstøbevand, 3,6 5,44 leg 150 liter niilstaSki Stivelse, Kode 3005 2,0 3,04 kg 150 liter

Magnesiumsulfat · 7H20 0,05 75,75 g 150 liter

Antiskummiddel, HODAG 2000 (Polypropylenglycol) ---- 51 ml 150 liter 4. trin (3780- Majsstøbevand, 3,6 108,86 kg 3000 liter liter tank) Dextrose, 2,0 60,33 kg 3000 liter

Magnesiumsulfat · 7H20 0,05 1,497 kg 3000 liter

Antiskummiddel, HODAG 2000 (Polypropylenglycol) ---- 1 liter 3000 liter

Under andet, tredje og fjerde udviklingstrin beluftedes kolber og beholdere, og de omrørtes under fermenteringen.

De endelige fermenteringer udførtes i 75.700-liters fermenteringsbeholdere. Ingredienserne, bortset fra xylose og dextrose, tilsattes til ialt 52.996 liter kondensat. Efter tilsætning opvarmedes til 60 °C, og pH indstilledes til 5,6 - 5,8 med 16°

Baumé-soda. Væsken opvarmedes før indstillingen til uddrivning af kuldioxid, der udvikledes ved tilsætningen af soda. Efter pH af mediet var indstillet, tilsattes antiskummiddel, og fermenteringsbeholderens indhold steriliseredes i 17 146480 30 minutter ved 120°C. Efter sterilisering blev temperaturen sat ned til 60°C. Sukkerstofferne, xylose og dextrose og kondensat fyldtes i 3.785 liters beholdere i en mængde på 1514 liter pr. beholder. Sukkeropløsningen steriliseredes 30 minutter ved 120°C, og efter nedkøling overførtes sukkeropløsningen til 75.700-liters fermenteringsbeholderen under anvendelse af en podningsslange. Efter sukkertilsætning stabiliseredes fermenteringstemperaturen til driftsbetingelsen på 32°C,og fermenteringsbeholderen podedes med podningskulturen. 20 timer efter podningen begyndte man at udtage prøver af fermenteringsvæsken hver anden time, og der analyseredes for isomeraseaktivitet, cellevægt, reducerende sukkerstoffer og totalt kulhydrat. Fermenteringen betragtedes som tilendebragt, når produktionen af isomeraseenzvm var toppet.

Under fermenteringen holdtes pH ved ikke under 5,4 - 5,6 ved automatisk eller manuel tilsætning af ammoniakgas igennem rør under præsteriliserede betingelser. Mediet samt driftsbetingelserne ved fermentering i 75·800-liters fermenteringsbeholdere, der er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.770.589 og 3.813.318, er vist i detaljer i tabel II.

TABEL II

Medium til 75.800-liters fermenteringsbeholdere Volumen - 64.352 liter

Indhold Vægtpct. Vægt, kg

Majsstøbevand 4,0 2.600,44 ·

Stivelse 2,5 1.625,22

Dextrose 0,2 130,18

Xylose 1,0 649,99

Glycin 0,1 64,86

Ammoniumnitrat 0,2 130,18

Magnesiumsulfat 0,05 32,66

Antiskummiddel, H0DAG (polypropylenglycol) 20,82-22,71 liter

Natriumbicarbonat (Tilsat før steriliseringen for at indstille pH til 5,8 - 6,0)

Endelig volumen = 68.137,4 liter Drifttemperatur = 31°0.

18 146480

Intet cobalt sattes til under noget trin af fermenteringen eller under udvikling af podningsmediet.

Det intracellulære glueoseisomeraseenzym udvundet fra mediet havde en aktivitet på 19,5 IGITJ/ml. En portion på 8857,9 liter af mediet "blev udtaget for anvendelse ved fremstilling af det stabiliserede glucoseisomeraseenzymkoncentrat. En anden portion af mediet udvandtes i form af hele celler, idet der anvendtes magnesiumhydroxid, Sil-Elo 332 filterhjælp og 2-propanol. Sidstnævnte udvundne hele celler anvendtes til enzymatisk omdannelse af glucose til fructose i en batch-konverter.

(b) . Er ems tilling af stabiliseret. glucose isomer aseenz ^koncentrat _

En portion på 8.857,9 liter af det intracellulære glucoseisomera-seenzymmedium fra 75.700 liters-beholderen som fremstillet ovenfor med en 19,5 IGIU/ml ( i alt 173 x 10^ IGIIJ ) behandledes igenném en Delaval BRPX-207 faststofudskillelsescentrifuge.

Maskinen fyldtes med en mængde på 19 liter pr. minut med 2 minutter mellem hvert skud. Task og prime-vand blev tilsat et sekund lige før og efter skuddet. Cellepasta på 917,5 kg med 187 IGIU/g fra skuddet hældtes i en 850 liter rundbundet beholder sammen med 76 liter vand. Når 294,8 - 317,5 kg cellepasta var opsamlet, behandledes cellepastaen med 8 g af en lyso-zymenzymprsparation (et 2 gange krystalliseret frysetørret pulver fremstillet af Miles-Seravac fra æggehvider med en aktivitet på 23300 enheder pr. milligram materiale) til at begynde fordø jningen af cellevæggene, hvorved der frigives intercellulært glueoseisomeraseenzym i opløselig form. En opløsning af 2-propanol (85 volumenprocent) og vand sattes til cellepastaen i en mængde på 21,2 liter opløsning pr. 45,36 kg pasta. Yderligere 41,64 liter 2-propanol-vandopløsning sattes til blandingen, hvorved alkoholindholdet i væsken øgedes til 30 volumenprocent. Pasta-2-propanol-vandblandingen pumpedes herefter over i en 3.785,4-liters beholder, og fordøjningen fortsattes i 24 timer, lemperaturen i væsken blev holdt på .26°C - 1°C. Efter 24 timers fordøjning modificeredes blandingen ved tilsætning af 85 pct.

2-propanol, hvorved 2-propanol-indholdet blev øget til 52 volumen- 19 146480 procent, red hvilken koncentration nucleinsyrer, såsom ribonucle-insyre og desoxyribonucleinsyre i det væsentlige er uopløselige, og det proteinholdige enzym er opløseligt. Et roterende vakuumfilter precoatedes med 90,7 kg Eicalite 4200 filterhjælp.

Når precoaten var påsat, tilsattes 2-propanol til precoat-vandet for at bringe alkoholindholdet op på cirka 52 volumenprocent, hvorved nucleinsyren blev holdt på uopløselig form, med andre ord for at hindre opløsning af nucleinsyre. Vand-alkohol-blan-dingen, der anvendtes ved precoatingen, ledtes igennem filteret, efter filtreringen af pastaopslemningen var tilendebragt. Pasta-opslæmningen, der forblev på filteret, blev pumpet til et Nutsch-filter for at holde enzymtabet .mindst muligt. Dicalite -4200 tilsattes for at lette filtreringen på Nutsch-filteret.·

Filtratet fra både det roterende precoat-filter og Nutsch-fil-teret pumpedes til en 5.785 liter tank, der anvendtes som lagertank for overpumpning til en tank, hvortil var sat 57 liter 1 molær magnesiumsulfat (MgSO^^E^O) opløsning, og 49,2 liter 85 volumenprocent 2-propanol blev tilsat. Blandingen førtes til en Delaval BRPX-207 centrifuge med en hastighed på 62,8 liter pr. minut med 5 minutter mellem hvert skud. Når centrifugeringen var tilendebragt, tømtes centrifugen med fem på hinanden følgende 1-sekund spulinger og skud. Remanensen, der indeholdt det stabiliserede enzymkoncentrat, blev i centrifugen og afskrabedes, og centrifugen vaskedes med noget af den lette fase fra centrifugen.

Både remanens og vaskevand blandedes til det stabiliserede en-zymkoncentrat-produkt. Produktet omrørtes med en laboratorie-omrører og pakkedes i 3,8 liter plastikbeholdere med henblik på vurdering og til anvendelse til enzymatisk omdannelse af glucose til fructose.

Totaludbyttet af stabiliseret glucoseisomeraseenzymkoncentrat (portion nr. 1) var 41,64 liter af koncentreret væske indeholdende 109 x 10^ IGIU eller cirka 11.261 IGIU/g på tørstofbasis.

Dette svarer til et udbytte på 63 pct. af den totale aktivitet i helcellemediet, der anvendtes som udgangsmateriale. En mere komplet analyse af det stabiliserede enzymkoncentrat er anført i tabel III nedenfor.

20 U6*80

TABEL III

Analyse af staTDiliseret_glucoseisomeraseenz^concentrat___

Portion nr. 1

Isomeraseaktivitet, ICrIU/g, d.s. 11.261

Specifik aktivitet, I&IU/mg, protein 15,1 Tørstof, pct. 22,2 7and, Earl Fischer, pct. 65,8

Protein, Kjeldahl, pct. d.h. 74,7

Aske (oxid), pct. d.b. 11,4

Uopløseligt tørstof, pct. d.b. 5,3

Mg++, mg/ml 5,8

Mg++, molær 0,24

Mg++/protein forhold 0,035 2-Propanol, ved differens, pct. 14 'd.b. = beregnet på tørstofbasis.

EKSEMPEL 2

Adskillige portioner af intracellulær glucoseisomeraseenzym fra Streptomyces olivochromogenes ATCO nr. 21.715 fremstilledes i udviklingstrin som beskrevet i eksempel 1(a) under anvendelse af 7,5 liter, 40 liter og 400 liter fermenteringsbeholdere til udvikling af podningsmediet og en 4000 liter fermenteringsbeholder til det endelige væksttrin. Efter fermenteringen blev hver portion, der indeholdt helceller af intracellulær glucoseisomeraseenzym, nedbragt til en temperatur på 32-22°C for at undgå yderligere mikrobiel vækst og mulig celleautolyse. Portioner af mediet centrifugeredes til koncentrering af celler til dannelse af en cellepasta. Denne opsamledes i 37,8 liters spande, veje-des, og blev herefter pumpet til en 3.785 liter fordøjelsestank til cellefordøjelse. Til cellepastaen sattes under omrøring et ly-sozymenzym (2 gange krystallinsk frysetørret pulver fremstillet af Miles-Seravac fra æggehvide med en aktivitet på 23.300 enheder pr. milligram materiale) til fordøjning af cellevægge og frigivelse af den intracellulære glucoseisomerase i opløselig 21 146480 form. Lysozym-doseringen for hver portion var 6,8 enheder pr. milligram celletørstof. Den totale cellevægt på tørstofbasis der var til stede i cellepastaen, beregnedes, idet der anvendtes den endelige tørcellevægt af den hele fermenteringsvæske og fermenteringsvæskevolumenet. Dette forudsætter 100 pct. udvinding af cellerae på tørstofbasis ved den første koncentration, lyso-zym sattes til cellepastaen efter centrifugering af hele dyrkningsvæsken og før tilsætning af alkohol til cellepastaen. Efter tilsætning af lysozym tilsattes azeotrop 2-propanol til opnåelse af en koncentration på 42 i 1 vægtprocent. Den første tilsætning af 2-propanol beregnedes på basis af cellepastavægten, fratrukket 8 pct. uopløselige stoffer på tørstofbasis samt kvaliteten af den tilførte alkohol. Efter justering af alkoholkoncentrationen indstilledes pH af lysatet (cellepasta-alkohol-opslæmningen) til 7}0 med vandfri natriummonophosphat (for at sænke pH). Natriummonophosphatreagenset sattes til i portioner på 250 g. Eor at forhindre lokale "hot spots" opløstes reagenset i vandj før det blev tilsat, lysaterne blev holdt ved en temperatur på 28-30°C med en turbulent omrøring, indtil 100 pct. opløsning af enzymet var tilendebragt. Graden af solubilisering bestemtes ved en sammenlignende enzymanalyse af en hel lysatprøve og en del af samme prøve, hvorfra det faste cellestof var fjernet ved centrifugering.

Efter fordøjningsperioden blev koncentrationen af alkohol i lysaterne checket igen og indstillet til 42 - 1 pct. Cellevæggen fjernedes fra lysatet, idet der anvendtes et precoated filter, coated med filterhjælp (både "Dicalite" 4200 og "Dicalite Speed-flow" blev anvendt som anført nedenfor) opslæmmet i 44-46 pct. vandig opløsning af 2-propanol. En alkoholkoncentration lidt over det nævnte område på 42 - 1 pct. anvendtes til precoatingen for at modregne tab af alkohol på grund af afdampning på indersiden af vakuumfilteret. Det fordøjede lysat filtreredes, som det var, dvs. ved et pH på 7,0 - 0,3 og ved en temperatur på 28-30°C. Eiltrateme fra precoat-filteret ledtes til en 3.785 liter tank, der anvendtes som fødebeholder til udfældningstrinnet.

I fire af portionerne udførtes udfældningen under anvendelse af denne beholder som udfældningsbeholder. Det klarede filtrat førtes portionsvis ind i beholderen (for hvert forsøg) i en mængde 22 146480 på 643 liter. Hertil sattes 1,0 molær magnesiumsulfatopløsning i en mængde på 0,189 liter pr. 3,785 liter klaret lysat og et volumen azeotrop 2-propanol til at holde totalkoncentrationen af 2-propanol på cirka 42 vægtprocent. Under tilsætningerne omrør-tes opløsningen, og der recirkuleredes igennem en pumpe for at gøre "blandingen lettere. Det udfældede enzym "blev holdt yderligere i 10-15 minutter for at tillade agglomerering til større partikler, hvorefter enzymet blev udvundet ved centrifugering, idet der anvendtes en Deiaval BRPX-207 centrifuge. Opløsningen førtes til centrifugen med en hastighed på 6-10 g/minut, og der blev skudt to gange ved hver portion.

Ved en portion (portion 10) blev udfældningen udført kontinuerligt , idet der anvendtes fødetanken som kontinuerlig omrørt reaktor (OSIR). Det klarede lysat og magnesiumsulfatopløsningen blev kontinuerligt ført til beholderen. 2-propanolkoncentra-tionen af det klarede lysat blev indstillet til 44-45 vægtprocent for at kompensere for fortynding med magnesiumsulfatopløsning, hvorved koncentrationen blev holdt på 42 - 1 pot. under udfældningen. Strømningen af klaret lysat blev kontrolleret under anvendelse af en strømningsmåler. Den 1,0 molære magnesiumsulfatopløsning afmåltes med en hastighed på 0,189 liter pr. 3,785 liter klaret lysat, idet der anvendtes en lille diafragma-pumpe. Strømningen af begge opløsninger blev startet, og et vist niveau blev opbygget i fødetanken. lanken blev fyldt til et volumen, der med de givne strømningshastigheder af klaret lysat og magnesiumsulfat gav en opholdstid på 15 minutter. Blandingen ledtes herefter til centrifugen med samme strømningshastighed som strømningen til beholderen. Strømningshastigheden til centrifugen blev indstillet til at holde et konstant niveau i fødebeholderen.

Der blev givet et partielt skud hvert 10. minut. Et sådant opnåedes ved nedsættelse af vandtrykket i kuglevandet.

Efter centrifugeringen var tilendebragt af de respektive portioner, fjernedes restenzym fra overfladen af centrifugen med destilleret vand og blandedes med det stabiliserede enzymkoncentrat-produkt. Hver af de udvundne portioner af stabiliseret enzymkoncentrat omrørtes, indtil de blev homogene, hvorefter de blev hældt på flaske og lagret ved 4°C.

23 146480 I tabellerne IV og V er givet en oversigt over enzymudvindin-dingsvirkningsgraderne ved procestrinnene. I tabel V er givet en komplet analyse af det stabiliserede enzymkoncentrat.

24 146480 -P H .

d a -P^. "t (\l M3 (Jl cn •H Lud *»«*·**·*

ί> Η N 03 't CO

•H Ci3 tr\ (M CM CM *—

-P -P H

d ,W

0 -aj 4=

Η P fit O O O

•H 0 v-·· >_/

ft d 0 H" VO VO i- vO

a d3 ·» «* ·ι λ λ

3 -P tA C\1 t- CO ΓΗ Ή C*- VO C\J v CM

OH i- IP VO VO VO

{> V“ T— V T— V—

-P

SI CD W

>J CO 03 K3 4· 4-

Cst I ·Η 03 ·» » » » λ

01 l>H O CM C O CM

CDI ·Η c£s Η" Η- •'ί· H- «4-

I -P H

•PI +» Λ CDI d <j øl ra CDI >; mi hø! ω

•HI ,Μ CM CM CO CM CO

[—j I tv fv r> tv *· •hi ' kv 4· cn in

> HI -P VO CM CM f- O

H dl tu[ t- t— 'φ x- -P| 85 i- τ- t— v- τ-

Η ml lift I

ft -pi

oj dl -P

E-l dl CD (3C

01 -p\. to IH >- σι t- 0| .Hid'·---'· -p ί>| i> H IA C33 M- 03 03 d dl d ·Ηώ t- Γ- CO CO 00 0 øl -p -p η ω I m ft !>

Hi d <! 0 dl P d I d -p dl H ft d mi Η Μ H 0 >d d ft tiO 83 d HI O (C3 4 N 03 0‘i-5j> dl ----- -H ,0 0 Øl -P H* CO CM CO E- 0 0 d <j}l b£ oo c- o in oo dd SB in in vo vo in Η -P £

{>· 83 Η O

ft -Η H

g d H CH

3 -P 0 d •H d Μ O d d -P\ t- 00 O in O Μ O d d ·Η jl3 — — — — — ·Η CM ft

g t>H in CO CO CO VO HH-CQ

CQ-HtiJ t— t-t— t-τ- 0 b£ -PH d d d

0ft 0 -P -P

•H -aj 0 ·Η H

0 ·Η Η H

d -P d d

•Pø 0 O O

0 dø o in in ο Ο ο·Η·Η a>Sd m vo cm cm o ft ft ft S 0-P r O CM OJ ^ ^

0 Η ·Η [C3 1C3 K3 K3 [Λ d ft O

d O H

[if |> 0 0 d N-/ 0

o vo c- CO cn O

•H t- •p 0 o ft 25 146480

TABEL V

Analyse af stabiliseret cflucoseisomeraseenzygikoncentrat__

Portion nr.

6 7 8 9 10

Isomeraseaktivitet 8012,5 9089,3 9532,1 6680,6 8963,6 IGIU/G, d.s.

Specifik aktivitet 12,3 14,9 14,7 13,6 15,0 IG-IU/mg protein Tørstof, pot. 25,61 28,0 21,8 21,4 24,7

Yand, Karl Eischer, pot. 61,9 60,9 59,4 61,4 66,2

Proteinv, K;jeldahl, pct.

d.b.x' 64,9 61,0 64,8 49,4 59,9

Aske (oxid) pct. d.b. 37,6 13,5 13,6 35,5 13,4

Uopløseligt, d.s. pct.

a.b. 9,7 4,6 3,7 31,6 3,3

Mg++, mg/ml 3,8 11,6 3,3 6,73 18,6

Mg++, molær 0,16 0,48 0,14 0,28 0,77

Mg++/Proteinforhold 0,023 0,068 0,023 0,11 0,125 2-Propanol, pct.

(ved differens) 12,5 11,1 18,8 17,0 9,1

Phosphor, pct., d.h. - 2,33 1,80 8,1 2,10

Endelig vægt af udvundet stabiliseret enzymkoncentrat, tørstofba- sis (g) 18278 14939 16453 24649 12939 x) 'd.b. = beregnet på tørstofbasis EKSEMPEL 3

En stor portion intraeellulær glucoseisomeraseenzym fra Strepto-myces olivochromogenes ATCC nr. 21.715 blev fremstillet i udviklingstrin som beskrevet i eksempel 1(a), idet der anvendtes 1 li- 26 146480 ter, 14 liter, 190 liter og 3785 liter fermenteringsbeholdere til podningsmediet og en 75700 liter fermenteringsbeholder til den endelige vækst. Efter tilendebragt fermentering afkøledes væsken i 75700 liter-beholderen til 20°C. Her blev den holdt uden beluftning og omrøring i en kort periode før koncentrering af faststoffet. Een endelige væske, i alt 60565,6 liter, havde en aktivitet på 21,0 IGIU/g væske med et tørstofindhold på 16,5 g/liter og en totalaktivitet på 1270,7 x 10^ IG-ITJ.

Væsken indeholdende dét intracellulære glucoseisomerase koncentrerede s ved centrifugering i en DeLaval BRPX-207 centrifuge til koncentrering af faststoffet med en fødehastighed på cirka '19 liter pr. minut og med et skud hvert 1,75 minut.

Overflow i form af en let fase blev periodisk analyseret og smidt væk. Een tunge fase af cellepastaen opsamledes i en modtagebeholder og pumpedes kontinuerligt til en af tre tanke, der anvendtes til fordøjning. Koncentrationstrinnet førte til cirka 6,4 gange koncentrering af cellerne (på volumenbasis). Een totale cellepasta udvundet var i alt 9463,5 liter med en vægt på 9593,4 kg og et tørstofindhold på 1102,6 kg. Cellepastaen analyseredes til at have et askeindhold på 131,09 kg, 649,99 kg protein, 8290,76 kg vand og en enhedsaktivitet på 132 IGIU/g og en totalaktivitet på 1240,0 x 10^ IGIIJ (98 pct. af det totale).

Når volumenet af cellepastaen i fordøjelsesbeholderen nåede 757 liter, tilsattes 757 - 870,6 liter 91,5 pct. 2-propanol til opslæmningen, indtil fordøjningstanken var fyldt. Efter hver tilsætning af alkohol blev pH af den fremkomne opslæmning i fordøjningsbeholderen analyseret og indstillet til 7,0 - 7,2, hvis det var nødvendigt, med vandfri mononatriumphosphat. Efter den første tilsætning af alkohol i hver beholder tilsattes lyso-zymenzym i en mængde på cirka 6,8 enheder pr. mg celler på tørstofbasis. Eysozymet anvendt var et 2 x krystallinsk frysetørret pulver fremstillet af Miles-Seravac fra æggehvider med en rapporteret aktivitet på 23.000 lysozymenheder pr. mg enzympræ-parat.

Efter hver tank var fyldt, blev den endelige indstilling udført for at bringe alkohol-koncentrationen af opslæmningen til det ønskede område på 42 ±vægt-%. Lysatet (alkohol-cellepasta-lysozym-

27 146 4 BO

opslæmning) omrørtes konstant og recirkuleredes igennem en ekstern varmeveksler for at holde temperaturen. lempereret vand. førtes til den ene side af varmeveksleren for at holde temperaturen i lysatet på 28 - 30°C. Graden af enzymsolubilisering blev målt ved en sammenlignende enzymanalyse på en hel lysat-prøve og en del af den samme prøve, hvorfra faststoffet var fjernet ved centrifugering. Når forhøjningen af en given tank nåede cirka 100 pct. solubilisering, var lysatopslsmningen klar til klaring for at fjerne cellevæggene. Fordøjningstiden var 52 - 73 timer startende med påfyldningen. Hele lysatopslsmningen fra de tre for dø jningsbeholdere havde et totalvolumen på 19944,94 liter, en vægt på 17957,72 kg og et totalt tørstofindhold på 1.019,2 kg. Lysatopslæmningen analyseredes og havde et indhold på 187,78 kg aske, 649,09 kg protein, 7721,2 kg 2-propanol og 9717.3 kg vand. lysatet havde en enhedsaktivitet på 66,6 IGIU/g og en totalaktivitet på 1178,9 x 10^ IGIU (hvilket svarer til 93 pct. af det oprindelige fra fermenteringsmediet).

Lysatopslæmningen blev klaret med et precoat-filter, der var pre-coated med Dicalite Speedflow (fra Grefco Inc.) filterhjælp 56.3 - 62,5 mm. I alt 272,16 kg filterhjælp blev anvendt til klaring af lysatopslæmningen. Precoat-opslæmningen blev fremstillet som en 50 pct. 2-propanolopslæmning med 5 pct. koncentration. Por at bevare precoat-opløsningen blev precoat-væsken ført tilbage til beholderen, når precoaten var ophørt. Umiddelbart efter tømning af precoatens bagside tilsattes lysatopslæm-ning til filteret. Filtreringshastigheden varierede fra ca. 106 til ca. 159 liter/time/m med en gennemsnitlig strømningshastig-

O

hed på 118 liter/time/m . Efter filtreringen pumpedes det klarede filtrat til en 3785 liter lagerbeholder. Filterkagen analyseredes periodisk og blev smidt væk. Det totale lysat havde et volumen på 19556,7 liter, en vægt på 16205 kg og et totaltørstofindhold på 351,08 kg. Det klarede lysat blev analyseret til at have et indhold på 48,08 kg aske, 223,17 kg protein, 7165,9 kg 2-propa-nol og 8673,59 kg vand. Enhedsaktiviteten af det klarede lysat var 54,0 IGIU/g og en totalaktivitet på 875,7 x 10 δ IGIU (hvilket svarer til 69 pct. af den oprindelige aktivitet).

28 146480

Efter klaringstrinnet forøgedes alkoholkoncentrationen af de individuelle "beholdere af klaret lysat til 44 - 45 vægtprocent bestemt ved vægtfylden før behandling i udfældnings- og stabiliseringstrinnet. Udfældning og stabilisering af glucose-isomeraseenzymet i den klarede lysatopløsning udførtes ved kontinuerlig tilførsel af det klarede lysat og en 2,0 molær opløsning af magnesiumsulfat (439»1 liter) (105»23 kg magnesiumsulfat og 426,8 kg vand) igennem et blande-T ind i en fødebeholder forbundet til en Delaval BRPX 207 centrifuge. Den 2,0 molære opløsning af magnesiumsulfat blev tilsat med en hastighed på 0,0946 liter pr. 3,785 liter af klaret lysat til opnåelse af en endelig opløsning med 0,05 molær koncentration af magnesiumsulfat. Strømningen af både magnesiumsulfatopløsning og klaret lysatopløsning blev startet, og et niveau blev bygget op i fødebeholderen. Denne fyldtes til et volumen, der med de givne strømningshastigheder gav en opholdstid på 15 minutter. Blandingen blev ført til centrifugen med en hastighed, der svarer til strømningen til fødetanken. Eødningen til centrifugen blev indstillet således, at der blev holdt konstant niveau i fødetanken.

Overflow fra centrifugen ledtes til en 30.000 liter tank og behandledes derefter til udvinding af 2-propanol til genanvendelse, Det stabiliserede enzymkoncentrat opvarmedes i 75 liter rustfri stålspande og blandedes i en 379 liter omrørt beholder.

Det stabiliserede enzymkoncentrat var mudderagtigt i konsistens og mediumbrun i farve. Destillieret vand blev sat til det stabiliserede enzymkoncentrat for at resolubilisere enzymet om nødvendigt (resolubilisering blev bestemt visuelt). Når det destillerede vand var tilsat, når det stabiliserede enzymkoncentrat var opløst, og når farven blev relativ klar kaffesort, havde det en konsistens svarende til en let olie.

Det udvundne stabiliserede (i resolubiliseret form) enzymkoncentrat havde et volumen på 276,3 liter og en vægt på 287,57 kg samt et tørstofindhold på 76,66 kg. Det stabiliserede enzym-koncentrat analyseredes, og der blev fundet 8,6 kg aske, 57,15 kg protein, 47,17 kg 2-propanol og 163,29 kg vand. Det stabiliserede enzymkoncentrat havde en enhedsaktivitet på 11.654 IGIU/g tørstof og en totalaktivitet på 892,8 x 10 IGIU (svarende til 70,3 pct. udbytte af den totale aktivitet til stede i helcelle- 29 146480 mediet anvendt som udgangsmateriale, hvor hovedtahet (23 - 24 pct.) skete i lysatklaringstrinnet. Af denne mængde foreligger cirka halvdelen (cirka 11,8 pct.) i filterkagen. Resten af tabet skyldes inaktivering.

Tabellerne VI og VII giver et samlet overblik over enzymudvindingseffektiviteten over de forskellige procestrin. Tabel VII giver en fuldstændig analyse af de stabiliserede enzymkoncentrater.

TABEL· VI

Analyse af udvundet stabiliseret enzymkoncentrat (portion 11)

Total Aktivitet pr. enhed Total aktivitet Procestrin vægt, kg IGIU/g IGITJ

Helt fermen- teringsmedium 60454,79 21,0 1270,7 x 10

Cellepasta^a 9393,44 132,0 1240,0 x 106 Råt lysat 17698,72 66,6 1178,9 x 106 6(c

Klaret lysat 16200,51 54,0 875,7 x 10°

Stabiliseret /-u ^(c enzymkoncentrat 287,58 11654^ 892,8 x 10 ^Repræsenterer værdier opnået ved difference, eller som er estimeret.

^Værdien er på tørstof basis.

^°Totalaktivitet af det klarede lysat bestemtes ved at bestemme vægten af det klarede lysat og måle isomeraseaktiviteten heri. . Naturligvis er den aktuelle totalvægt højere end den mængde, der estimeres, idet mængden af stabiliseret enzymkoncentrat udvundet var mere, end hvad der bestemtes i det klarede lysat.

30 146480

TABEL YII

Analyse af staT3iliseret_^lucoseisomer_aseenzv_rgkQncerLfc.r.a.t

Portion nr. 11-336

Isomeraseaktivitet, IGITJ/g (tørstof) 11654

Specifik aktivitet, IGItf/mg, protein 15,5 Tørstof, pct. 26,6

Tand, Earl Fischer, pct. 56,9

Protein, Kjeldahl, pct. d.b.x^ 75,0

Aske (oxid), pct., d.b. 11,3

Uopløseligt d.s.22^, pct., d.h. 0,53

Mg++, mg/ml 5,99

Mg’1"4-, molær 0,25

Mg++/proteinforhold 0,032 2-Propanol, pct. (ved differens) 16,5

Endelig vægt af udvundet enzym, kg, d.s. 287,58 x) 'd.b. = beregnet på tørstofbasis ^d.s. = tørstof

Adskillige prøver af det udvundne stabiliserede glucoseisomerase-enzymkoncentrat fra eksemplerne 1-3 og andre lignende prøver af forskellig aktivitet underkastedes forsøg for at bestemme deres stabilitet ved lagring ved forskellige temperaturer. Prøverne lagredes ved 4, 18, 26 og 37°C og analyseredes for glucoseisome- raseaktivitet med intervaller på 4, .8 og 12 måneder. Følgende tabel opsummerer resultaterne af denne undersøgelse.

31 14 6 Λ 8 O

TABBL VIII

enz^mkoncentrater

Procent af oprindelig isomeraseaktivitet^d Temperatur

Oprindeligt 4°C 18°C 26°C 37°C

Por- aktivitet måneder måneder måneder måneder tion IGIU/g, nr. d.s. 4 812 481248124812 1 10162 101 101 105 - 97 98 92 96 96 43 10 6 2 10289,8 100 102 105 - 103 107 96 103 106 77 46 40 3 3910,7^ 94 100 101 - 80 81 76 80 80 39 28 6 4 2441,47 ^ 100 105 102 88 89 82 84 80 61 1 0 - 5 5823,7 96 103 107 - 91 91 86 90 86 3 1 0 6 7960,9 95 100 105 - 99 100 91 98 97 44 5 0 7 9228,57 95 100 107 - 98 97 89 96 101 62 23 21 8 10215,59 101 93 821 85 88 82 83 88 78 5 3 - 9 7504,6 100 95 91 88 89 82 83 84 69 5 1- 10 9113,36 901 96 90 86 87 81 86 86 80 58 48 42 11 11654,0 88^° 93 - 85 90 - 83 88 - 33 26 -

Gennemsnit 96 99 100 86 92 90 86 90 85 34 17 13 (a v Dette er begyndelsesanalyseværdien for denne stabilitetsundersøgelse, og ikke den oprindelige analyseværdi udført efter fremstilling af enzymet rapporteret i de foregående eksempler.

tpisse prøver havde en usædvanlig lav begyndelsesaktivitet på grund af fejlagtige procesbetingelser.

(c v Lave værdier skyldes krystallisation af proteinholdigt materiale i enzympræparationen .

tAnalyse af isomeraseaktiviteten havde en nøjagtighed på 10 pct. af ud-gangsisomeraseaktiviteten, hvilket forklarer værdierne over 100 pct. af udgangsaktiviteten.

32 146480

Forsøgsdataene i tabel VIII viser, at det omhandlede stabiliserede enzymkoncentrat er i stand til at bibeholde mere end 80 -10 pot. (og generelt mere end 90 - 10 pot.) af udgangsisomeraseak-tiviteten i op til 12 måneder, når det lagres ved 4°C og 18°C, og det er i stand til at bibeholde 80 - 10 pot. af udgangsisomerase-aktiviteten i op til 8 måneder, når det lagres ved 26°C. Med andre ord taber det stabiliserede enzymkoncentrat i gennemsnit mindre end 5 pct. af udgangsisomeraseaktiviteten, når det lagres ved 4°C i 12 måneder, og det gennemsnitlige tab er på 15 pct. af udgangsaktiviteten, når det lagres i 12 måneder ved 18 og 26°C.

EKSEMPEL 4

En portion på 64,35 liter medium indeholdende intracellulær glu-coseisomerase fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1(a) fortyndedes med vand og centrifugeredes til fremstilling af en cellepasta. Den 64,35 liter store portion kom fra to 37,8 liter fermenteringsportioner, der havde 18,0 IGIU/ml og 16,8 IGIU/ml. De to fermenteringsportioner blandedes ved fremstilling af cellepastaen. Centrifugekagen (cellepasta) anbragtes i en 7»5 liter fermenteringsbeholder og fortyndedes med vand til opnåelse af et totalt volumen på 4,5 liter opslæmning. Opslæmningen, der lagredes ved 4°C i to dage, behandledes med 77 mg lysozymenzym (afledt af æggehvide med 8000 lysozymenheder pr. mg) og 1930 ml 2-propanol. Opslæmningen omrørtes i 4 timer, hvorefter yderligere 500 mg lysozym tilsattes. Opslæmningen omrørtes natten over, hvorved temperaturen indstilledes til 20-30°C (temperaturen steg til 35-40°C efter 2. lysozymtilsæt-ning, hvilket menes at forårsage nogen deaktivering af enzymet).

Efter fordø jningen fortyndedes en 500 ml prøve af det rå lysat med 500 ml vand. 123 ml prøver af det fortyndede lysat indstilledes til 50 pct. 2-propanol (på en volumen/volumenbasis) ved tilsætning af 2-propanol. En prøve af lysatet anvendtes som kontrol.

Til hver lysatprøve sattes nedenfor anførte (se tabel IX) mængder af natriumchlorid (som sammenligning) og magnesiumsulfatheptahydrat. Efter salttilsætning som anført i tabellen centrifugeredes suspensionerne, herunder kontrolprøven, og analyseredes for glucose-isomeraseaktivitet og proteinindhold (sidstnævnte ved forholdet mellem optisk tæthed ved 260 og 280 nm) idet der anvendtes nomogrammet af E. Adams, distribueret fra California Corp. for Biochem. Research 33 145480 3625 Medford St., Los Angeles, 63 California, baseret på extink-tionskoefficienterne for enolase og nucleinsyrer, der er givet af Warburg and Christian. Biochem. Z 310» 384 (1942)). Yderligere detaljer ved eksperimentet og resultaterne af forsøget er anført i følgende tabel:

TABEL IX

Optisk tæt-hed ved_ Vægt af / Aktivitet i ovenstå-

Salt salt, g 260 nm 280 nm pIT ende væske. IGIU/ml

Kontrol - 1,5 1,19 6,5 2,79

NaCl 1,0 1,53 1,06 6,40 3,33

NaCl 2,0 1,55 1,08 6,38 3,14

NaCl 5,09 1,82 1,30 6,35 2,76

MgS04 0,25 1,50 1,03 6,45 2,87

MgS04 0,50 1,48 0,995 6,45 2,36

MgS04 1,0 1,65 1,12 6,30 1,17

MgS04 2,0 1,68 1,11 6,25 0,20 ( 3.

v pH i disse forsøg var forholdsvis lav, hvilket forklarede den lave. isomeraseaktivitet. Imidlertid var pH ikke så lav, at det kan forklare den næsten fuldstændige mangel på isomeraseaktivitet i den ovenstående væske ved en magnesiumsulfatmængde på 2 g. Det menes, at temperaturstigningen til 35-40° efter den anden lysozymtilsætning har forårsaget det meste af deaktiveringen af enzymaktiviteten i dette forsøg.

Resultaterne i tabel IX illustrerer, at tilsætning af magnesiumsulfatsalt til alkohol-vandlysatet forårsager en sænkning af isomeraseaktiviteten i den ovenstående væske uden væsentligt at sænke nucleinsyreindholdet i den ovenstående væske (nucleinsyre absorberer lys ved 260 nm). Denne virkning fremkom ikke ved til- 146480 34 sætning af natriumchlorid. Således fører tilsætning af magnesium-sulfatsalt til alkohol-vand-lysatet til en separation af glucose-isomerase fra de opløselige nucleinsyrer. Det observerede fænomen var tilsyneladende ikke en typisk udsaltningseffekt, da koncentrationen af magnesiumsulfat var for lav, og resultatet med natriumchlorid var det modsatte. Natriumchloridforsøget gav ikke nogen væsentlig sænkning af isomeraseaktiviteten i den ovenstående væske.

EKSEMPEL 5

Til 4,5 liter råt lysat (indeholdende solubiliseret glucose-isomerase) fra eksempel 4 blev der sat filterhjælp og tilstrækkeligt 2-propanol til fremstilling af en 50 pot. opslæmning med hensyn til 2-propanol på volumen/volumenbasis. Opslæmningen filtreredes langsomt til klaring af den solubiliserede glucose-isomerase. En 335 ml prøve af filtratet analyseredes og havde 65,2 IGIU/ml (i alt 21842 IGIU). Til denne prøve sattes 16,5 ml 2-propanol og 16,5 ml af en 1 molær opløsning af magnesiumsulfat-heptahydrat ved pH 8. Således blev lysatopløsningen gjort til 1 pot. med hensyn til magnesiumsulfat og 2 pct. magnesiumsulfat på vandbasis. Et olieagtigt bundfald dannedes med det samme ve.d tilsætning af saltet. Opløsningen, der indeholdt bundfaldet, blev centrifugeret, og bundfaldet blev udvundet. Bundfaldet blev genopløst i vand til et totalvolumen på 10,5 ml. Denne prøve blev fortyndet med vand som 402 til 1, og den fortyndede opløsnings optiske tæthed ved 260 og 280 nm blev henholdsvis 0,284 og 0,350.

Fra disse data bestemtes proteinindholdet som 0,33 mg/ml eller 133 mg/ml for 10,5 ml opløsningen. Opløsningen analyseredes til at have 2040 IGIU/ml. Den havde derfor en total aktivitet på 21400 IGIU (98 pct. af udgangsaktiviteten af det klarede lysat). Det stabiliserede glucoseisomeraseenzymkoncentrat havde en specifik aktivitet på 15>3 IGIU/mg protein. Disse data i forbindelse med dataene i tabel IX viser, at magnesiumsulfat selektivt udfælder og renser isomeraseenzymet.

35 146480

En 67 ml prøve af det resolubiliserede alkoholfraktionat indeholdende solubiliseret cellebefriet glucoseisomerase omrørtes med 67 ml 2-propanolopløsning. Der blev ikke observeret noget bundfald. Herefter tilsattes 2 ml af en 1 molær opløsning af mag-nesiumsulfat-heptahydrat, og 2 ml af 2-propanolopløsningen sattes til den klarede alkohol-vand-isomeraseopløsning. Umiddelbart udfældedes et gråhvidt fast stof, der herefter fjernedes og genopløstes i vand i et volumen på 13 ml. Det stabiliserede enzymkoncentrat centrifugeredes igen og fortyndedes 101 til 1 med vand med henblik på analyse. Den optiske tæthed af den fortyndede opløsning ved 260 og 280 nm var henholdsvis 0,288 og 0,437· Proteinindholdet i den fortyndede opløsning bestemtes til 0,46 mg/ml. I den ufortyndede opløsning var indholdet af protein således 46,5 mg/ml, og aktiviteten var 482 IGIU/ml svarende til 10.4 IGIU/mg protein. Den totale aktivitet i 13,0 ml stabiliseret enzymkoncentrat var 6.266 IGIU. Centrifugatet indeholdt kun 150 IGIU.

EKSEMPEL 6

En 3250 ml portion af det klarede lysat indeholdende opløst glucoseisomerase med 109 IGIU/ml (fra den oprindelige 4,5 liter portion, refereret til i eksempel 4) blandedes med 162 ml af en 2-propanolopløsning og 162 ml opløsning af 1 molær magnesiumsul-fat-heptahydrat. Umiddelbart dannedes et olieagtigt’ bundfald, der opsamledes ved centrifugering. Bundfaldet havde et volumen på 69 ml og analyseredes, hvilket gav 4040 IGIU/ml og i alt 278760 IGIU. En fortynding i 1:1000 af en lille del af det stabiliserede enzymkoncentrat blev gjort med henblik på analyse.

Dets optiske tæthed ved 260 og 280 nm blev observeret og blev fundet til henholdsvis 0,315 og 0,345. Proteinindholdet bestemtes til 0,299 mg/ml, og den specifikke aktivitet bestemtes til 13.5 IGIU/mg protein. Det stabiliserede enzymkoncentrat fik lov at stå 48 timer, hvorpå der var dannet tre lag. De tre lag centrifugeredes og analyseredes. Toplaget på 18,2 ml havde 565 IGIU/ml, midterlaget på 39 ml havde 1970 IGIU/ml, og bund- 36 146480 laget på 36 ml havde 50,80 IGIU/ml. Bundlaget havde den laveste optiske tæthed ved 260 nm og den højeste ved 280. Toplaget havde den højeste optiske tæthed ved 260 nm.

EKSEMPEL 7

En 104 liter portion af medium indeholdende 17,5 IGIU/ml af in-tracellulær glucoseisomerase fremstillet som beskrevet i eksempel 1(a) blandedes med et lige så stort volumen vand og centrifugeredes til en fast kage. Filterkagen blandedes med vand til et volumen på 26 liter ved pH 7,45· Til denne opslæmning sattes 0,250 g lysozym og 11,5 liter' 2-propanol ved en temperatur på 27°C. En lille mængde antiskummiddel tilsattes under omrøring.

Den vandige suspension på 37,5 liter indeholdt 37 - 44 IGIU/ml.

Efter 20,5 timer fjernedes to 8 liter prøver, hvorefter 2-propanol tilsattes i en sådan mængde, at koncentrationen kom op på 50 pot. på volumen/volumenbas is. 3 g/g celler "sil-Flo "-filterhjælp sattes til opslæmningen, der herefter filtreredes og vaskedes med 2 liter 50 pct.s 2-propanol. Filtratet analyseredes, og der blev fundet 15 IGIU/ml. Yderligere 1 g lysozym sattes under omrøring til de 21,5 liter råt lysat til opnåelse af 2.,43 IGIU/ml i filtratet. Enzymet i filtratet blev umiddelbart udfældet ved at sætte 1,1 liter 1 molær opløsning af magnesiumsulfat og 1,1 liter 2-propanol til filtratet. Bundfaldet, der indeholdt det stabiliserede enzymkoncentrat, fjernedes ved centrifugering og opløstes i en lille mængde vand til et volumen på 200 ml med cirka 3450 IGIU/ml eller i alt 690000 IGIU og en specifik aktivitet på 12,5 IGIU/mg protein.

To prøver på 200 ml stabiliseret enzymkoncentrat (hvoraf den ene med tilsat propanol som konserverende middel og den anden uden) underkastedes lagerstabilitetsforsøg ved 26°C. Ved begyndelsen af lagerstabilitetsforsøget havde begge prøver cirka 3300 IGIU/ml. Prøverne analyseredes periodisk, og efter 33 dages lagring havde prøven med tilsat konserveringsmiddel 3165 IGIU/ml, og den anden prøve havde 3140 IGIU/ml. Dette forsøg viser, at det stabiliserede enzymkoncentrat ifølge opfindelsen (med eller uden konserveringsmiddel) er temmelig stabilt ved lagring, og at 37 146480 det er i stand til at bibeholde op til eller mere end 75 pct. af den oprindelige aktivitet i mere end 30 dage ved stuetemperatur.

EKSEMPEL 8 Sammenligningsforsøg

Formålet med disse forsøg var at vise virkningen af at anvende forskellige vandopløselige magnesiumsalte ifølge opfindelsen i sammenligning med andre salte, der kendes for deres evne til at udfælde proteiner, såsom ammoniumsulfat, natriumsulfat og natri-umchlorid. Andre divalente salte anvendtes også ved denne sammenligning.

En stor prøve lysat (alkohol-vand-glucoseisomerase-opløsning) fra portion 6 (beskrevet i eksempel 2 og tabel IV) centrifugeredes i en laboratoriecentrifuge ved 18000 omdrejninger pr. minut i 10 minutter før anvendelsen. Alkoholindholdet bestemtes til 41,6 vægtprocent eller 49,3 pct. (volumen/volumen). Til hver af adskillige 30 ml prøver af det klarede lysat (ved stuetemperatur) sattes herefter de anførte mængder af en molær opløsning af salte specificeret i tabel X sammen med en ækvivalent mængde 2-propanol. Efter salt- og alkoholtilsætningen blandedes prøverne og centrifugeredes ved 18000 omdr./minut i 10 minutter.

De ovenstående væsker fjernedes, og bundfaldet vaskedes ud af centrifugeglassene og fortyndedes med 25 ml cobaltphospha'tpuffer (10 M Co^ , pH 7,5, 0,05 Μ PO4 ) til analyse af glucos’eisome-raseaktiviteten og proteinbestemmelse. Virkningen af forskellige salte og koncentrationer på den selektive udfældning og rensning af det solubiliserede isomeraseenzym er vist i tabel X.

38 146480

TABEL X

Virkning_af forskellige salte og koncentrationer _på udfæl^ing

Volumen af 1 M salt tilsat*^

Enzym

Salte udvundet 1 2,5 5 10 20

Magnesiumsalte_

MgSO, ·7Η?0 % . x 1 97 100 100 95 H Sp.Akt.' 2,4 15,7 15,8 13,6 11,0

MgOlp % 15 100 103 103 105 * Sp.Akt. 9,5 15,4 15,6 16,4 16,9

Mg(CpH,09) % 3 94 100 99 98 0 Sp.Akt. 3,7 15,1 15,4 15,3 15,9

Monovalente kationsalte

NapS0, % 0 0 0 1 16 * Sp.Akt. 0 0 0 2,6 8,4 (NH,)pS0, % 00011 H μ Sp.Akt. 0 0 0 2,6 1,9

NaCl % 0 0 0 1 1

Sp.Akt. 0 0 0 1,8 1,9

Andre divalente kation-salte_

BaClp % - 93 76 18

Sp.Akt. - 11,9 8,8 8,4

SrClp % - 104 94 28

Sp.Akt. - 14,3 12,7 12,7

CaClp % - 65 57 19 -

Sp.Akt. - 8,9 7,9 6,2

CoClp % - 61 18 1 -

Sp.Akt. - 9,1 5,6 0,8

MnClp % - 21 29 8 -

Sp.Akt. - 2,8 3,9 2,6 39 146480 TABEL X (forts. ...) a^De molære koncentrationer er henholdsvis 0,01, 0,025, 0,048, 0,09 og 0,17.

Protein til den specifikke aktivitet bestemtes ved optisk tæthed ved 280/260 nm og udtryktes som IGIU/mg protein.

Resultaterne vist i tabel X viser, at natriumsulfat og ammoniumsulfat ikke udfælder glucoseisomeraseenzymet fra lysatet så effektivt og ved så lav en koncentration som magnesiumsaltene. Ammoniumsulfat udfældede ikke noget enzym, og natriumsulfat gav kun 19 pct.s udvinding af glucoseisomeraseenzymet. Dette udbytte skyldtes (selv om det var lille) ikke nødvendigvis udfældningen, men kan henføres til en faseseparation (en alkoholvand- og salt-vand-fase. Protein er mere opløseligt i salt-vand-fasen end i alkohol-vand-fasen. Salt-vand-fasen ekstraherer ikke-specifikt protein fra alkohol-vand-fasen. Da salt-vand-fasen er tungere, opsamles den som produkt. Det andet monovalente salt, der blev afprøvet, nemlig natriumchlorid, udfældede ikke glucoseisomeraseenzymet .

Andre divalente salte end magnesiumsalte udfældede glucoseisomeraseenzymet, men udbytterne og renhedsgraden var ikke ækvivalente med de, der blev opnået med magnesiumsalte. Af afprøvede ikke-magnesiumsalte gav barium-.og strontiumsalte de bedste resultater? men disse salte er ikke ønskværdige set fra et fødevare synspunkt.

Af de salte, der blev afprøvet, var det kun magnesiumsaltene, der udfældede enzymet effektivt med høj specifik aktivitet.

Den magnesiumsaltkoncentration, der anvendes, er kun en lille del af det, der kræves for at udfælde proteiner fra en vandig opløsning under anvendelse af den klassiske udsaltningsteknik, dvs. under anvendelse af ammonium- og natriumsulfater. Faktisk er fænomenet stik imod det, der er rapporteret i litteraturen (f.eks. Advances in Protein Chemistry, bind XI, side 416-418 40 146480

[1956] og Advances in Protein Chemistry, bind 16, side 216 [l96l], hvor det i sidstnævnte reference angives, at magnesiumsulfat er mindre effektivt end natriumsulfat eller ammoniumsulfat ved udsaltning af proteiner.

Hvad der også fremgår af dataene i tabel X er, at en forøgelse af koncentrationen af magnesiumsulfat (til over 0,08 molær) fører til en nedgang i den specifikke aktivitet, hvilket indikerer en mere tilfældig udfældning af protein med glucoseisome-raseenzym. Det observeredes, at faseseparation fremkom med magnesiumsulfat. Nedgangen i specifik aktivitet følger den tilsyneladende forøgede opløselighed af protein i salt-vand-fasen. Med magnesiumchlorid.og magnesiumacetat fremkom ingen faseadskillelse, og den specifikke aktivitet forblev konstant, hvis den ikke steg som i tilfældet med magnesiumchlorid.

Immobilisering_af_opløselig_glucoseisomerase I det følgende vil det blive vist, at det omhandlede meget rene og stabiliserede enzymkoncentrat er i stand til at give et immobiliseret glucoseisomerase, der har en højere bindingskapacitet end normalt solubiliseret glucoseisomerase.

Den solubiliserede glucoseisomerase til sammenligning blev fremstillet fra hele celler indeholdende intracellulær glucoseisomerase fremstillet som beskrevet i eks. 1(a). Til hjælp ved udvinding af helcellerne tilsattes "Sil-Flo"-filterhjælp og magnesiumhydroxid, og blandingen vaskedes herefter med 2-propanol, tørredes og formaledes på en Wiley-mølle. Under ekstraktion af glucoseisomerase fra cellerne behandledes blandingen indeholdende cellerne med magnesiumsulfat-heptahydrat i en mængde, der var tilstrækkelig til at gøre opslæmningen 0,01 molær med hensyn til magnesiumsalt, og der blev indstillet til pH 8,0 med 0,1 molær kaliumhydroxid. Det rå glucoseisomeraseenzym ekstraheredes fra en 6,5 g prøve (sådan som den forelå) af tørt cellepræparat med 50 ml ekstraktionsmiddel. Blandingen omrørtes i 45 minutter 41 146480 ved stuetemperatur og centrifugeredes ved 4°C. En ekstrakt på 42 ml blev opnået indeholdende 26-27 IGHJ/ml. Glucoseisomerase-enzymopløsningen fremstillet ved denne teknik og det omhandlede stabiliserede enzymkoncentrat (fremstillet som i eksempel 1(b)) adsorberedes på en lang række vanduopløselige bærerstoffer under anvendelse af følgende metode: I et 150 ml bæger blandedes 2 g (tørbasis) af det vanduopløselige bærerstof med 50 ml af en opløsning indeholdende 0,1 molær magnesiumsulf at-heptahydrat , og pH indstilledes til 8,0 med kaliumhydroxid. Til denne blanding sattes tilstrækkelig isomerasevæske (enten normalt solubiliseret eller omhandlet enzymkoncentrat) til kontakt med bærerstoffet med 1.000 - 3.000 IGIU af isomerase (afhængigt af kapaciteten for bæreren). Herefter tilsattes yderligere 0,01 molær magnesiumsulfat-heptahydrat til opT nåelse af et væskevolumen på 50 ml. Blandingen indeholdende enzym og vanduopløselig bærer blandedes grundigt ved omrøring i 30 minutter, filtreredes og vaskedes med 0,01 molær magnesiumsulfat-heptahydrat-opløsning. Det kombinerede filtrat og vaskevand overførtes til en 250 ml volumetrisk kolbe, der til fortynding blev fyldt med 0,01 molær magnesiumsulfat-heptahydrat, og der analyseredes i forhold til den oprindelige opløselige isomerase-enzym-præparation for isomeraseaktivitet, idet der anvendtes en Technician Auto Analyzer.

Bindingskapaciteten ("BC") for de forskellige vanduopløselige bærerstoffer beregnedes efter følgende formel:

Total IGIU til stede - Total IGIU i filtrat og vaskevand "BC" IGIU/g tørstof = - g bærer, tørstof I tabel XI er anført resultaterne af disse forsøg, hvor bindingskapaciteten af forskellige bærerstoffer, der normalt anvendes til solubiliseret glucoseisomerase, sammenlignes med det omhandlede stabiliserede enzymkoncentrat.

42 146480

TABEL XI

af solubiliseret ^luconseisomerase i 8.

Anionbytter- Forkonditione- Isomerasev Bindingskapacitet harpikser ring af bærer anvendt IGIU/g/d.b.

Puffer (i N 152 "A”lRA-93å" Puffer (o SEC 333 nA“lRA-93e" Puffer <b * 37 ''^IRA-gj6" Puffer SEC 113 DEAE Cellulose nSS^ea20ln' »8S04 <d N 851 nSeTyplT2o''” Puffer (b SEC 1487 "^T^e*«)1"· “«»i (i N 936

Ca ^ N = normal opløselig glucoseisomerasej SEC = Stabiliseret enzymkoncentrat fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ^Pufferopløsning indeholdende 0,05 M pH 7,5 kaliumphosphat-puffer, 0,01 M magnesiumsulfat~monohydrat og 0,001 M cobalt-chlor id -hexahydrat.

^cTris-puffer (0,05 M, pH 7,5) indeholdende 0,01 M magnesiumsul-fat-heptahydrat.

^0,01 M magnesiumsulfat-heptahydrat indstillet til pH 3,0 med 0,1 N kaliumhydroxid d.b.= beregnet på tørstof 43 146480

Resultaterne i tabel XI viser, at bindingskapaciteten af DEAE-cellulose er næsten to gange større for det stabiliserede enzym-koncentrat for normalt solubiliseret enzym, og ved den syntetiske anionbytterharpiks 2-3 gange større. Det viste sig under disse forsøg, at bindingskapaciteten af DEAE-cellulose for det stabiliserede enzymkoncentrat forøges væsentligt ved prækonditionering af bæreren ved et lavere pH-niveau. For eksempel binder bæreren ved pH 6,5 3120 IGIU/g, medens den ubehandlede bærer kun binder 1634 IGIU/g. Ved anvendelse af det stabiliserede enzymkoncen-trat var det muligt at binde 385 mill. IGIU pr. m på en type 20 DEAE-cellulose. Denne biokatalysator kunne herefter anvendes til at omdanne glucose til majssirup med højt fructoseindhold ved kontinuerligt at lede en glucoseopløsening igennem biokatalysatoren, der kunne anbringes i en kolonne eller i et trykfilterelement.

Hvad man også kan se af tabel XI er, at den maksimale bindingskapacitet, der opnås under anvendelse af normalt solubiliseret glucoseisomerase, var 936 IGIU/g méd type 40 "Selectacel”, der havde en ionbytningskapacitet på 0,89 mækv./g. Selv om type 20 Selectacel, der havde en ionbytningskapacitet på 0,87 mækv./g, havde lidt lavere bindingskapacitet end type 40, er type 20 mere praktisk til kommerciel anvendelse, idet den har større partikler og derfor giver bedre strømningshastighed.

I følgende forsøg blev det omhandlede stabiliserede enzymkoncentrat immobiliseret på et antal vanduopløselige bærerstoffer og afprøvet ved kontinuerlig enzymatisk omdannelse af glucose til sirup med højt fructoseindhold. Kontinuerlig omdannelse under anvendelse af immobiliserede helceller blev også udført. Ved hver omdannelse, undtagen hvor det er angivet i tabel XII, blev en dobbeltkappet kolonne 1,5 x 8 cm anvendt.

Kolonnerne blev præpareret ved at anbringe en glasuldprop i bunden af kolonnen og delvis at fylde kolonnen med vand. I tilfælde, hvor der anvendes vanduopløselige bærerstoffer, sattes 44 146480 de vanduopløselige bærerstoffer til kolonnen, og der blev lukket med en glasuldprop. Det omhandlede stabiliserede enzymkoncentrat (portion 1, eksempel 1(b)) ledtes herefter langsomt igennem kolonnen efterfulgt af udvaskning med en lille smule destilleret vand. Vaskevand og kolonneeffluent blandedes og analyseredes for glucose-isomeraseaktivitet. Mængden af enzym, der sorberedes, bestemtes ved forskel.

I tilfælde med immobiliserede helceller (produktet fra eksempel 1(a) indeholdende "Sil-Flo"-filterhjælp) blev 5 g af helcelleen-zympræparatet med og uden 100 mg magnesiumhydroxid sat til kolonnerne. Kolonnerne stoppedes med en glasuldprop.

Den kontinuerlige omdannelse blev udført ved kontinuerligt at føde kolonnerne med 50 pct. (vægt/vægt) af genopløst krystallinsk dextrose (600 g/liter) indeholdende 0,004 - 0,0055 molær magnesiumsulfat med et pH på 8,4 - 8,6. Kolonnerne blev afbalancerede når nødvendigt, og den kontinuerlige enzymatiske isomerisering udførtes ved 60°C ved at pumpe 60°C vand igennem kolonnernes varmekappe. Fødestrømningen igennem kolonnen blev holdt ved en kombination af vakuum ved kolonnens bund beholderen. Strømningshastigheden blev reguleret ved at variere gastrykket på fødebeholderen.

Den tilsyneladende enzymaktivitet "KE" bestemtes under anvendelse af ligningen: KE = BVH x log [ hvor BVH = kolonnestrømningshastighed i lejet (volumen/time) %Le = dextrose-fructoseligevægtsværdi, der ved 60°C er 51,2 %L = procent ketose i kolonneeffluentet Lejevolumenet/time ved 45% levulose er BVH45 = KB/0,916.

45 146480

Halveringstiden - den tid, der kræves for en halvering af den tilsyneladende aktivitet - bestemtes ved at udtage prøver under to eller flere ugers kolonneoperation og måle KE. Halveringstiden blev opnået fra hældningen af den linie, der bestemtes ved mindste kvadraters metode i et diagram over InEE mod tiden. Denne metode antager, at enzymdeaktiveringen er af første orden. Det oprindelige lejevolumen/time ved 45 % ketose, BYH^, bestemtes ud fra afskæringen på aksen.

Effektiviteten, "Eff", bestemtes under anvendelse af ligningen:

Eff = BVH45oc/MM IGIU/ft5.

Resultaterne af disse kontinuerlige omdannelser er anført i tabel XII.

81 46 U6480

di oj Η I

-PI I

ct3l Mc\J

Ml δι I °co -P

dl -P Π S M “ P< . cti pj d tTi«3incMOif\(Min^-C0U) b, d oil·)

æi W)i> o w ιηψιοιον-ΓΐηιηίΛ S'3 H !=> to ta^H

Prl \ ----------- S. dH H d g1 d PJ p> Η ΟΟΟΟΟΟΙΜΟΟΟΟ e S O Ο H m tn II H o >T!2s:!H5P?s9 gicij-p ^ ® ώ Mb d >j H ra £- PiO -P 0)^·Η NI c -O PO ti P pq tn ωι i -d-p · d op d cd i tn^ ,¾ rj-j o) m to p ttø miftOO) ^øa»d^· dd g dl d Μ g Pi I d d M 3

Ml ·Η d OJ EP VO O tP dO 'dcu (Di Μ H - - - - - jjcqø-P'^-· f Hg

SI (D>— covo-idT-æinf-'t^f- m .p W) M M ti ®H

Ol i> trv t- t- t- T- EP 1— t— 0) s-| > H litid (DgQv- tni HH C8HMdH8j>> ·' •Hl d ·Η μΐΗφΒΡδί ΝΦΟ liK-p φ ij nid ® ®dw

di jjg H d <a ta ο Η ·η H

tal iHOWdøH-ppia

Ol-P -Η Φ ^4 l>P ft tti οι d μφΡ ni oti o d ΉΟ

dl -P MntiuiHHP <DP<ilA

Hl -H CD H r>p >)d > d P D'-

Μι [> i-dt-^d(MWdIA(TlH- p >1 1>) H -P d -P P

I -H (OWinlDtOWW'ir^-’i d'HM-P d d d H

dl p> ----------- øm dddd OM

HI M OOOOOOOOt-OO 4J dHddd^-d S> di d ddddgi-gcota mi <n o. c 5 —p d d dtp;r! dl H I d d d d o ·Η d ·Η Ph tal p fdoOdPdHta-pcQd· •Hl tO Η H (Q o d OdH P^-n

Hl DOOcdMdddH«!!·!-

•H! M .liWoa M tiMflH

rQid HHddoddPd

Ol -H -P · O -H · S 'H a O

•Hf si d dd-H

H g| H dgjSdH-HMrPM-P

Mi ·ΗΙ H >9<MH-PPdOdM

l>f FS.p-HPaaS'H-P'do P dl Hi S o d d Pi P fcuoi »drr, ^2 -pta IB-P d^ p -Hl Pig S ^ m -P · d d d -P p! <41 hi ^^iriCd-P’cci^ -p’^JDatoH-3 EH| Hl MP r- co -Q-Mataddd d d M d d

dl -HH - -P Η ·π>ΗΛ H-PSKJM

rMI H O oo (i'iinuiriincoiocoio 5 ,Η >rj !> d M d H IB Η -P

tal -PH cn io r-f η n r- cm r-ι vo r- S^tu dH dH M d MI H ,-ι n cm 03 π H ti !> -P ·Η Π d d oi dg _ 5 4-5 P H d ta d-po

Hl tag rri Φ d d a W> a ta i>H d

l3 °,«HOdddO

Hid O MM M-PdMP4 did n(nd"Pdd-P Η H o d g

>i d aSgtn-H-pd^dd^M

Id I 2 R M Ml·) M Sdd N

Ml O d'tooddd-p o S> o Md di paoMtaddHod -pi .jhftiBHpd todo dl goP^atiHO T- ΡΠ-Ρ -PI a o ddO^’d^^^^S®

hi d c\i HSpi«ii>)0 Hd-ndM

dl -p i ^ to ΗΉΛ M !>d tal ta s voM a tP p m ta

dl >s H 0M - !>!>j •Hd'dH

Ml ta t- d ^ undlAHdN dd-HdH

tai ta w o (M c\i d .-P. ιη·ΗΗ d d tn d 3 h dl d d cd OO .400^ -ρ^φ dsn a tai tn d -P -P K ffi g co o -- ohh d

Hl Η H cd O OO 3 00 M · d M d H ftl^d-P

dl d add ·®Μ-η®η o ομ^ to di d d o H ρι-ρηφ

dl d H.p d OfPgS φ H(qM d d H

hi d dd co S ov cn i ntn'da«® ρ'ημ^Β HI H dCd = , o + 0 O M ®ri o ffl dH s ai 3 M ® — cvi »p 1 i r c a ®8β, h ftd^ »co oi O O 3 ''"l h -¾ HI o ·Ή Pita Η I P) 3 d ,9 Π P .5 .9 -μ in g P14J-P H d 8-P O d

di -p tn d 9jd)KKHH 0)r^>5OddP ^ d d p H

Ml M -p ® otnd HHHH μ cd -ρημ d HI H d ® CM Η H °® _ ® S d O ® d O) Η -P H to H d

Hl Η M P-w ci d & V - 0 ° H 10 d -p O O ca ddO^H

Ml M ® ® ri i> 5 J, 2 S . . Η£Χ3£θω(ΰ4^ p d-P^H

dl d ngtaH-Hg^ii-T, Ο··τ1ο8ΐη-ρ phoibSo di d HsHd-ph-.'jl399 uti^di m® odMSrd di d ϋ c- a ή d η na® d •Hl Η Μ to Oddll s,‘12®^ M M tti di d dto<4<4<tj<jb'S'gn^ «drptndpd a tip Sh

Ml M MpqRRRPcs = = = M <M

47 146480

Tallene i tabel XII viser, at det stabiliserede enzymkoncentrat ifølge opfindelsen effektivt kan adsorberes på en lang række vanduopløselige bærerstoffer og kan anvendes til kontinuerligt at omdanne glucose til majssirup med højt fructoseindhold.

Den bedste enzymudnyttelse blev opnået ved at adsorbere stabiliseret enzymkoncentrat på den kontrollerede porealuminabærer. Den høje enzymudnyttelse er et resultat af den høje effektivitet og den lange halveringstid. Basisk magnesiumcarbonat og syntetisk anionbytterhar-piks "Amberlite" IRA-904-bærere i kombination med det omhandlede stabiliserede enzymkoncentrat giver også gode resultater ved de kontinuerlige omdannelsesforsøg.

Den ovenfor beskrevne procedure, hvor der anvendes porealuminabærer, blev gentaget under anvendelse af det stabiliserede enzymkoncentrat fra eksempel 3. Resultaterne af dette forsøg er anført i tabel XIII.

TABEL· XIII

(-|

Yirkning_af_enz2m2åiilåSiSS-Eå_i2SiiSSSEiie_2SåSSS2iSS

IG-ITJ IGIU Pct.

tilledt adsorberet enzym Halverings- MM IG-IU/ m3 MM IG-IU/m3 adsorberet Effektivitet tid (dage) 502 491 98 0,5 66 714 650 91 0,45 67 939 693 75 0,45 60+ (1Den kontrollerede porealumina-bærer bestod af 97-98 pct. aluminiumoxid og 2-2,4 pct. magnesiumoxid med et overfladeareal på 80 m^/g .

Det omhandlede stabiliserede enzymkoncentrat adsorberer på kontrolleret porealumina-bærer til opnåelse af en biokatalysator, der er egnet til kontinuerlig omdannelse af glucose til majssirup med højt fructoseindhold. De høje bindingseffektivi- 48 U6480 teter og lange halveringstider gør denne "biokatalysator egnet til kommercialisering i stor skala.

EKSEMPEL 9

Medens de tidligere eksempler viser anvendelsen af 2-propanol som med vand blandbart organisk opløsningsmiddel til fremstilling af det stabiliserede enzymkoncentrat, kan andre med vand blandbare organiske opløsningsmidler anvendes ifølge opfindelsen. Eølgende forsøg udførtes for at vise anvendelsen af andre organiske opløsningsmidler end 2-propanol.

Et intracellulært glucoseisomeraseenzympræparat med.18,1 IG-IU/g fremstilledes som i eksempel 1(a). Denne væske filtreredes til opnåelse af en cellepasta med 120 IGIU/g. Oellepasta-en behandledes med lysozymenzym-præparat tilfordøjelse af cellevæggene hos den intracellulære glucoseisomerase. Det opløselige stof fra dette lysat havde 123 IGIU/g isomeraseaktivitet. Lysatet fortyndedes med tilstrækkeligt vand, således at isomera-se-aktiviteten i lysatet var 110 IGI¥/ml. 50 ml prøver af dette lysat sattes langsomt til det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel som anført nedenfor. Der blev tilsat opløsningsmiddel, -indtil lige før isomeraseenzymet begyndte at udfælde. Opløsningsmiddel/lysat-blanding omrørtes 5-10 minutter, hvorefter uopløselige materialer omfattende cellulære membraner og nucleinsyrer fjernedes ved centrifugering. Til 20 ml prøver af hver af ovenstående væsker sattes under omrøring 1 ml 1 M magnesiumsulfat, heptahydrat (5 volumenprocent) og tilstrækkeligt opløsningsmiddel til at kompensere for fortynding af opløsningsmidlet i den ovenstående væske forårsaget ved magnesium-sulfattilsætningen. De vandige blandinger indeholdende det cellefri glucoseisomeraseenzym, med vand blandbart organisk opløsningsmiddel og magnesiumsulfat-heptahydrat henstod 15 minutter ved omrøring en gang imellem. Blandingen centrifugeredes, hvorefter det udfældede stabiliserede enzymkoncentrat udvandtes. Resultatet af dette forsøg er anført i tabel XIY.

49 146480

TABEL· XIV

Volumen af opløs-. ningsmiddel tilsat $ IGIU Specifik aktivitet Opløsningsmiddel -pr. volumen lysat udvundet IG-IU/mg protein 2-Propanol 1 100 11,8

Acetone 0,8 92 10,0

Methanol 2,4 87 12,0

Ethanol 1,3 98 11,6 1-Propanol 0,8 82 10,5 t-Butanol 0,65 95 6,4 p-Dioxan 0,7 25 5,7

Protein til specifik aktivitet bestemt ved optisk tæthed ved 280/260 nm.

b) 10 volumenprocent 1 M magnesiumsulfat anvendt til udfældningen; alle andre udfældninger udførtes med 5 volumenprocent 1 M magnesiumsulfat.

c) lysatet havde en specifik aktivitet på cirka 2 IGIU/mg protein.

Det kan ses af ovennævnte tal, at en række med vand blandbare organiske opløsningsmidler effektivt kan anvendes ved udførelsen af den omhandlede fremgangsmåde. Alkoholer og ketoner, der har op til 3 carbonatomer, foretrækkes ved udøvelse af opfindelsen, var de mest effektive opløsningsmidler til selektiv udvinding af isomeraseenzymet. Det fremgår også af tallene, at opløsningsmidler med lavest molekylvægt kræver mere opløsningsmiddel til effektivt at udvinde isomerasen. Por eksempel er den mængde methanol, der er påkrævet til selektiv udvinding, 2,4 volumen (cirka 67 vægtprocent) sammenlignet med 1 volumen 2-propanol (42 vægtprocent) pr. volumen lysat.

Claims (2)

50 146480 P a t_e_n t_k_r_a_y_j_

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et stabiliseret glucose-isomeraseenzymkoncentrat, kendetegnet ved, a) at man behandler en vandig opslæmning af mikroorganismeceller indeholdende intracellulær glucoseisomerase med et lysozymenzympræparat og fortrinsvis yderligere et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel valgt blandt methanol, ethanol, propanol, 2-propanol, tert.-butanol, acetone og dioxan til nedbrydning af det cellulære materiale, b) at man indstiller den resulterende vandige opslæmning på et indhold af det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel på 30 - 67 vægt-% ved eventuel tilsætning af yderligere opløsningsmiddel og derefter fraskiller uopløseligt materiale bestående af cellulære rester og nucleinsyrer, c) at man behandler den opnåede vandige blanding indeholdende et cellefrit glucoseisomeraseenzym og det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel med et i det væsentlige vandopløseligt magnesiumsalt i en mængde, der er tilstrækkelig til at give blandingen en koncentration på 0,02 - 0,3 molær med hensyn til magnesiumsalt baseret på det totale volumen af blandingen til udfældning af et stabilt enzymkoncentrat, og d) at man udvinder det stabiliserede enzymkoncentrat indeholdende koncentreret glucoseisomeraseenzym, magnesium i en mængde på ca. 0,1 - ca. 2 molær målt som Mg++, vand og med vand blandbart organisk opløsningsmiddel.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det i det væsentlige vandopløselige magnesiumsalt er magnesiumacetat, magnesiumchlorid eller magnesiumsulfat.