FI58513C - Foerfarande foer framstaellning av ett stabilt glukosisomerasenzymkoncentrat - Google Patents

Description

RSHr^l M «iiKUULUTUSjULKAISU CQC1-Z

UTLACGNINÖSSKIIIFT ÖöOl ό C(4Jj) Γ' l, '· I ·/ 1 > 0^ 1031 (S,) K«*.W3 0 12® 9/92 SUOMI —FINLAND (21) *wrtdh*#mw-*t«ww<ta*.| 77061*5 (22) HakamtapUvI—AmBknlnt·^^ 01.03.77 * (23) AHnpMvi—GIMgh«t*dac 01.03.77 (41) Tullut JulkbaM — WMt off«ntH( 20.09.77

Patent- och rt(lltirityrtllin Antökin utlagtf och utUkrlftun publleund 31.10.80 (32)(33)(31) Pyydetty «βιοΙΙ»·*—««flrtf prloritut 19.03.76 USA(US) 668380 (71) CPC International Inc., International Plaza, Englewood Cliffs,

New Jersey 07632, USA(US) (72) Robert Paul Cory, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5M Menetelmä pysyvän glukoosi-isomeraasientsyymitiivisteen valmistamiseksi - Förfarande for framställning av ett stabilt glukosisome-ras en zymkon centrat Tämän keksinnön kohteena on menetelmä pysyvän glukoosi-isomeraasientsyymi-tiivisteen valmistamiseksi, jonka kosteuspitoisuus on noin 50 - noin 80 #, kuiva-ainepitoisuus noin 5- noin 30 paino-#, entsyymipitoisuus vähintään noin 8012,5 IGIU/g kuiva-ainetta ja ominaisisomeraasiaktiivisuus noin 15»1 ~ noin 28 IGIU/mg proteiinia ja jonka pysyvyys on niin hyvä, että ainakin noin 80 * 10 % sen alkuperäisestä isomeraasiaktiivisuudesta säilyy sitä varastoitaessa l8°C:ssa jopa vuoden ajan, glukoosi-isomeraasin ollessa peräisin Streptomyces-suvun mikro-organismista.

Muuttamalla glukoosi fruktoosiksi, jota prosessia kutsutaan isomeroinnik-si, saadaan tuote, joka käytännössä korvaa teollisen inverttisokerin. Lähtöaineen, glukoosin, makeus on vain 70 % sakkaroosin tai inverttisokerin makeudesta, ja muutetaan jopa puolet siitä sokeriksi, jonka makeus on noin iko % sakkaroosista ja inverttisokerista. Tämä suuri makeusarvo on syynä maissiteollisuuden kiinnostukseen maissiuutteisiin, jotka sisältäisivät runsaasti fruktoosia (ks US-patentti n:o 2 950 228 sekä Matshallin ja Kooi:n julkaisu Science, 125 (1957) 6U8. Vuodesta 2 5651 3 1955 lähtien on julkaistu hyvin runsaasti tämän alan kirjallisuutta.

Sato ja Tsumura ovat todenneet (ks. "Agricultural and Chemical Society of Japan":n Sapporossa 20 heinäkuuta 196H pitämän kokouksen julkaisua ja japanilainen patentti n:o 17 6H0), että useat Streptomyces-suvun mikro-organismikannat tuottavat glukoosi-isomeraasientsyymiä, kun niitä kasvatetaan ksyloosilla. On myös todettu, että määrätyt Streptomyces-suvun mikro-organismikannat, jotka assimiloivat ksylaania (polyksyloosia), voidaan viljellä ksyloosilla, jolloin saadaan glukoosi-isomeraasia (Takasaki et ai., japanilainen patentti n:o 27 525 ja US-patentti n:o 3 616 221.

Runsaasti fruktoosia sisältävien maissisiirappien valmistajat ovat havainneet, että glukoosin entsymaattinen isomerointi tulisi mieluiten suorittaa jatku-vatoimisesti. Tällöin yleensä glukoosisiirappi saatetaan kosketukseen suuren iso-meraasientsyymipreparaattimäärän kanssa, joka on kiinnitetty inerttiaineeseen, t.s. käytetään immobilisoitua glukoosi-isomeraasientsyymipreparaattia. On tärkeätä, että käytetyllä immobilisoidulla glukoosi-isomeraasientsyymipreparaatilla on suuri iso-meraasiaktiviteetti tilavuusyksikköä kohti.

Glukoosi-isomeraasi muodostuu ja toimii yleensä solunsisäisesti, ts. suurin osa glukoosi-isomeraasientsyymistä sijaitsee mikro-organismin soluseinämien sisäpuolella tai soluseinämillä. Tämän takia joissakin jatkuvatoimisissa isomeroin-tiprosesseissa käytetään kokonaisista soluista koostuvia preparaatteja. Luonnollisesti solut erikoiskäsitellään, jottei glukoosi-isomeraasi uuttaudu pois soluista, eli entsyymi immobilisoidaan itse soluihin, ja/tai käytetään erikoisia reak-torilaitteita (ks. US-patentit n:ö 3 69^ 31*i, 3 753 858, 3 779 869, 3 817 832 ja 3 829 086, ja saksalaiset hakemusjulkaisut 2 317 680 ja 2 3^5 186). Kokonaisten solujen käytön haittoja ovat hydrauliset ongelmat ja epäpuhtauksien syntyminen johtuen ei-isomeraasientsyymien, nukleiinihappojen ja muitten aineitten läsnäolosta sekä siitä, että glukoosiliuos joutuu olemaan kauan kosketuksessa soluentsyymipreparaatin kanssa (emäksisissä olosuhteissa muodostuu ei-toivottuja emäskatalysoituja sivutuotteita, kuten psikoosia ja hydroksimetyylifurfuraalia). Yllä mainitut ongelmat aiheuttavat korkeampia valmistuskustannuksia, koska raakatuotteen puhdistus on välttämätön.

On yritetty ratkaista kokonaisten solujen käyttöön liittyviä ongelmia kehittämällä prosesseja, joissa glukoosi-isomeraasi poistetaan soluista ja senjäl-keen immobilisoidaan veteen liukenemattomaan kantaja-aineeseen (ks. US-patentit nro 3 708 397, 3 788 9^5, 3 850 751. 3 868 30U ja 3 960 663, ja belgialainen patentti nro 819 859)·

Vaikka soluvapaan immobilisoidun glukoosi-isomeraasin käyttö ratkaisee muutamia ongelmia, sen valmistuksen vaikeutena on vuorostaan glukoosi-isomeraasin eristäminen kokonaisista soluista. Glukoosi-isomeraasin uutto soluista on hyvin 3 5851 3 tunnettua. Kuitenkin on toivottavaa, että soluvapaa ja liukeneva glukoosi-isomeraasi on erittäin puhtaassa muodossa, jolla on korkea isomeraasiaktiviteetti tilavuus-yksikköä kohti. Erittäin puhtaan ja väkevän entsyymin käyttö parantaa hyötysuhdetta millä entsyymi voidaan kiinnittää liukenemattomaan kantaja-aineeseen.

Glukoosi-isomeraasin uutto mikro-organismisoluista ja sen puhdistus on ollut kallista ja monimutkaista ja sitä on käytetty vain laboratoriomittakaavassa.

Danno et ai. Agr. Biol. Chem., Voi. 31 (196?) 28^-292) ovat selittäneet menetelmää glukoosi-isomeraasin puhdistamiseksi, joka entsyymi on saatu Bacillus coagulans-kannasta HN-68 saattamalla etyleenidiamiinitetraetikkahapolla käsiteltyjä soluja lysotsyymin vaikutuksen alaisiksi, jolloin saadaan soluvapaa uute, jonka jälkeen soluvapaa uute käsitellään mangaanisulfaatilla, jotta sivutuotteet saostuisivat. Jäännösliuosta käsitellään toistamiseen ammoniumsulfaatilla, jolloin proteiininen glukoosi-isomeraasijae saostuu, ja se puhdistetaan edelleen dialysoimalla ja kromatografoimalla, jolloin saadaan 60-kertainen väkevyyden kasvu.

Takasaki et ai. ovat selvittäneet (ks. Agr. Biol. Chem., Voi. 33 (1969) 1527-153^ ja "Fermentation Advances", toim. D. Perlman, Academic Press, Inc.,

New York, 1969» s. 561-589» että Streptomyces albus:sta saatu solunsisäinen glukoosi-isomeraasi voidaan vapauttaa soluista setyylipyridiinikloridillä ja sitten erottaa jakeisiin vuoronperään käsittelemällä soluvapaata uutetta asetonilla ja dialysoimalla; ja tämän jälkeen kromatografoimalla DEAE-selluloosa- ja DEAE-Sephadex-kolonnissa ja dialysoimalla uudestaan. Puhdistettu soluvapaa uute dialy-soidaan vielä liuoksessa, jossa on 0,005-m magnesiumsulfaattia ja 0,0002-m CoCl^. Asetonia lisätään hitaasti saatuun liuokseen ho-%, U5-$, ja lopuksi 50-$ väkevyyteen asti glukoosi-isomeraasientsyymin kiteyttämiseksi. Tämä menetelmä on niin monimutkainen, ettei se ole taloudellisesti sovellettavissa suuressa mittakaavassa.

US-patentissa n:o 3 708 397 on selitetty menetelmää, jossa glukoosi-isome-raasia uutetaan DETA:lla käsitellyistä soluista, joita on saatu viljelemällä mikro-organismia Streptomyces phaeochromogenes vehnäleseillä, ja senjälkeen käsitelemäl-lä liuoksella, joka sisältää lysotsyymiä, tolueenia, magnesiumkloridia, puskuria ja vettä. Hydrolysoitua seosta käsitellään magnesiumkloridilla, ja lopuksi entsyymi saostetaan lisäämällä vähitellen asetonia. Tämä entsyymisaostuma liuotetaan veteen ja immobilisoidaan DEAE-selluloosaan biokatalysaattorina käytettäväksi muuttamaan glukoosia fruktoosisiirapiksi.

US-patentissa n:o 3 788 9^5 on kuvattu menetelmä, jossa solunsisäinen glukoosi-isomeraasi, jota on saatu Streptomyces sp. ATCC 21 715:stä ja viljelty ksyloosi- ja ksylaanihydrolysaatilla, käsitellään kationisella pinta-aktiivisella aineella, jonka jälkeen puhdistetaan DEAE-selluloosan avulla. Glukoosi-isomeraa-sia sisältävä suodos immobilisoidaan senjälkeen DEAE-selluloosalle tai synteetti- 1. 5851 3 selle anioniselle ioninvaihtomassalle; saadulla biokatalysaattorilla voidaan muuttaa glukoosia fruktoosisiirapiksi jatkuvatoimisesti.

Yllä kuvatuista prosesseista huolimatta, kaivataan edelleen taloudellisesti kannattavaa, suureen mittakaavaan sovellettavissa olevaa menetelmää käytännöllisesti katsoen täydellisesti liukenevan, puhtaan, korkea-aktiivisen ja pysyvän glu-koosi-isomeraasin valmistamiseksi; glukoosi-isomeraasin tulisi soveltua kiinnitettäväksi veteen liukenemattomiin kantaja-aineisiin, jotta saataisiin jatkuvatoimisiin prosesseihin soveltuvia biokatalysaattoreita, ja sen tulisi lisäksi olla käyttökelpoinen myös ilman immobilisointia.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) sekoitetaan vesipitoista seosta, joka sisältää solunsisäistä glukoosi-isomeraasientsyymiä sisältäviä soluja, jotka on saatu mikro-organismista Strepto-myces olivochromogenes ATCC n:o 21 713 tai ATCC n:o 21 715, veteen sekoittuvaan orgaaniseen liuottimeen, nimittäin 2-propanoliin, asetoniin, metanoliin, etanoliin, 1-propanoliin, tert-butanoliin tai dioksaaniin, niin että sekoituksen jälkeen orgaanisen veteen sekoittuvan liuottimen pitoisuus on noin 1+0- noin 1+5 paino-#.

b) käsitellään veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja veden seoksessa olevia soluja lysotsyymi-entsyymivalmisteella, jolloin muodostuu liukeneva solu-vapaa glukoosi-isomeraasientsyymi, joka ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan nukleiinihappoja, c) poistetaan liukenemattomat aineet ja otetaan talteen vesiliuos, joka sisältää soluvapaan glukoosi-isomeraasientsyymin, veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja veden, d) käsitellään mainittua vesiliuosta, joka sisältää soluvapaan glukoosi-isomeraasientsyymin ja veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen, magnesiumsulfaatti-heptahydraatilla tai magnesiumsulfaatilla niin, että magnesiumsulfaattiheptahyd-raatin tai magnesiumsulfaatin pitoisuus syntyneessä seoksessa on noin 0,023 -0,125 mol/1, jolloin saadaan pysyvä väkevä entsyymivalmiste, joka käsittää entsyymin ja magnesiumin muodostaman saostuman, johon sisältyy väkevä soluvapaa glu-koosi-isomeraasientsyymi, veteen sekoittuva orgaaninen liuotin, vesi ja magnesium, ja e) otetaan talteen pysyvä glukoosi-isomeraasientsyymitiiviste, joka sisältää glukoosi-isomeraasientsyymin, noin 0,16 - 0,77 mol/l magnesiumia määritetty- 2+ . . ...

nä Mg - pitoisuutena, ja veden sekä veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen.

Magnesiumsuolalla käsittely aikaansaa glukoosi-isomeraasientsyymin magnesium-kompleksin saostumisen. Sakka otetaan talteen tunnetuilla menetelmillä, kuten sentrifugoimalla. Väkevöinti-, puhdistus- ja stabilointiprosessi aikaansaa 5 58513 yli 70-kertaisen entsyymiväkevyyden nousun verrattuna alkuperäiseen viljelyliemen väkevyyteen, jopa yli 100-kertainen väkevyyden nousu on mahdollista. Entsyymitii-viste on 10-15 kertaa puhtaampi kuin alkuperäinen entsyymi.

Käytettyjen termien määritelmät D.E.

Termiä "D.E." (dextrose equivalent = glukoosia vastaava määrä) käytetään kuvaamaan pelkistävän sokerin pitoisuutta, glukoosiksi laskettuna, prosentteina kuiva-aineesta.

Tärkkelyshydrolysaatti Tärkkelyshydrolysaatilla tarkoitetaan siirappia tai tärkkelyshydrolysaattia. Tällainen tuote voidaan aikaansaada happamella tai entsymaattisella hydrolyysillä tai yhdistämällä hapan ja entsymaattinen hydrolyysi. Suositeltu tärkkelyshydrolysaatti saadaan happo- tai entsyymihydrolyysilla D.E.-arvoon noin 10, jota seuraa entsyymikäsittely D.E.-arvon yli 90, mieluiten yli 95-

Glukoosi

Glukoosilla tarkoitetaan yleensä puhdistettua kiteistä monosakkaridia, joka on otettu talteen pitkälle konvertoidusta tärkkelyshydrolysaatista.

Termiä käytetään tässä sekä sen normaalissa kaupallisessa merkityksessä että merkitsemään glukoosin liuosta, tärkkelyshydrolysaattisiirappia tai siirapin kiintoaineosaa, mahdollisesti puhdistetussa kiteisessä muodossa.

Fruktoosi

Termiä "fruktoosi" käytetään tarkoittamaan vasemmalle kiertävää isomeeriä.

Fruktoosia tavataan luonnossa hunajassa ja inverttisokerissa glukoosin kanssa, ja se on makeutensa johdosta arvokas.

Glukoosi-isomeraasientsyymi "Glukoosi-isomeraasientsyymi" on entsyymi tai entsyymivalmiste, joka iso-meroi ksyloosia ksyluloosiksi ja glukoosia fruktoosiksi. Tämän entsyymin dominoiva aktiviteetti on ksyloosin konversio ksyluloosiksi, joten nimi "ksyloosi-iso-meraasi" on myös sopiva nimitys (toisia nimityksiä ovat dekstroosi-isomeraasi , ksyloosi-(dekstroosi)-isomeraasi ja glukoosi-isomeraasi).

Yksiköitä

Selityksessä kaikki osat ja prosentit ovat painosuhteita, ellei erikoisesti toisin ilmoiteta.

IGIU

Termi IGIU (International Glucose Isomerase Unit) on kansainvälinen glu-koosi-isomeraasiyksikkö. Yksi IGIU on se glukoosi-isomeraasientsyymimäärä, joka yhdessä minuutissa muodostaa yhden mikromoolin fruktoosia 0,8-m glukoosi-liuoksessa pH 7,5-’ssä ja 60°C:ssa (ks. seuraavaa kohtaa).

5851 3 6

Isomeraasiaktiviteetin määritys

Menetelmä perustuu muodostuneen ketoosin spektrofotometriseen määritykseen vakio-olosuhteissa.

Varastoliuos tehdään seuraavasti: Määrityksen varastoiiuos

Aine Määrä 0,1-m MgSO^ . 7H20 1 ml 0,01-m CoCl2 . βΗ20 1 ml 1,0-m fosfaattipuskuria, pH = 7,5 0,5 ml

Vedetöntä D-glukoosia 1,i+U g

Tislattua vettä tilavuuteen 7»5 ml.

Määritettävä entsyymivalmiste laimennetaan ensin pitoisuuteen 1 - 6 IGIU/ml.

Entsymaattinen isomerointi aikaansaadaan lisäämällä 1 ml entsyymivalmistettä 3 ml:aa varastoiiuosta, ja inkuboimalla 30 min 6o°C:ssä. Inkuhaation loputtua, otetaan 1 ml näyte ja lisätään 9 ml tilavuuteen 0,5-n perkloorihappoa. Seos laimennetaan sitten kokonaistilavuuteen 250 ml. Glukoosivapaata vertailunäytettä käsitellään rinnakkain (korvataan 1 ml:aa entsyymivalmistettä 1 ml:11a vettä inku-baatiojakson alussa). Ketoosi määritellään sitten kysteiini-rikkihappomenetelmäl-lä. Tällöin 1 IGIU on se entsyymiaktiviteettimäärä, jota tarvitaan muodostamaan 1 yamol fruktoosia/min, yllä kuvatuissa isomerointiolosuhteissa.

Lysotsyymientsyymivalmiste

Lysotsyymi (EC 3.2.1.17) on entsyymi, joka hydrolysoi >0-1,1* -sidoksia N-asetyyli-muramiinihapossa (tai 2-asetamido-2-deoksi-D-glukoosissaj ja 2-aset-amido-2-deoksy-D-glukoosiryhmiä mukopolysakkaridissä, mukopolypeptidissä tai kitiinissä· Lysotsyymi valmistetaan yleensä munan valkuaisista. Se katalysoi soluseinämien hydrolyysiä.

Keksinnön mukaisen menetelmän kuvaus

Keksinnön mukaisesti valmistetulla entsyymivalmisteilla on seuraavat ominaisuudet: (a) niiden proteiinipitoisuus on 50...noin 80 paino-# kuiva-aineesta las- 2+ p+ kettuna; (b) Mg -pitoisuus on noin 0,16 - 0,77 mol/1 entsyymitiivistettä; (c) Mg / proteiini-suhde on edullisesti noin 0,03 - noin 0,5, (d) ominaisisomeraasiaktiivisuus on noin 15,1 - noin 28 IGIU/mg proteiinia; (e) veteen sekoittuvan liuottimen pitoisuus on edullisesti 10 - 20 paino-#; ja (f) niillä on sellainen pysyvyys, että ainakin noin 80 + 10 # alkuperäisestä isomeraasiaktiviteetista säilyy varastoitaessa l8°C:ssa jopa vuoden ajan. Pysyvän entsyymitiivisteen entsyymipitoisuus on vähintään noin 8012,5 IGIU/g, kuiva-ainetta.

7 5851 5 Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut entsyymitiivisteet ovat käytännöllisesti katsoen vapaat esimerkiksi ribonukleiinihaposta (RNA) ja deoksiribonukleiinihaposta (dna).

Suositellun entsyymitiivisteen kosteuspitoisuus on 50 - 80 #, ja edullisesti 55 - 70 #. Entsyymitiivisteen kuiva-ainepitoisuus on edullisesti alueella noin 5 - noin 30 #, edullisesti 20 - 30 paino-#.

Keksinnön mukaisesti valmistetut entsyymitiivisteet eivät sisällä kobolttia.

Veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen tai liuotinseoksen liukoisuus veteen on mieluiten vähintään 30 #, ja mieluiten vähintään bo # huoneen lämpötilassa. Veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen tulisi olla sellainen, että proteiinien ja nukleiinihappojen liukenevuus vesiliuoksiin pienenisi. Tyypillisiä veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia ovat metanoli, etanoli, propanoli, 2-propanoli, tert.-butyylialkoholi, asetoni ja p-dioksaani. Suositeltavin veteen sekoittuva orgaaninen liuotin on 2-propanoli.

Keksinnön mukaisesti veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen määrän tulee yleensä olla sellainen, että vesiliuos sisältää vähintään noin 30 paino-#, ja mieluiten vähintään noin 11·0 paino-# orgaanista veteen sekoittuvaa liuotinta. Kuitenkin käytetyn veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen määrän tulee olla sellainen, että pääosa proteiineista ja nukleiinihapoista saostuu liuoksesta ennen suolali-säystä. Liuottimen enimmäismäärä on yleensä 60 paino-#. Käytettäessä 2-propanolia soluvapaa glukoosi-isomeraasivesiliuos sisältää yleensä noin U0-U5 paino-# liuotinta, mieluiten k2 - 1 paino-#.

Veteen sekoittuva orgaaninen liuotin toimii entsyymin säilöntäaineena sekä valmistuksen aikana että varastoinnin aikana, ja se alentaa entsyymin liukoisuutta suolalisäyksen aikana. Se toimii myöskin nukleiinihappojen ja proteiinien saostajana.

Lämpötilan ja pH:n tulisi olla sellaiset ettei entsyymi inaktivoidu. Yleensä pH:n tulee olla noin 6...9 ja mieluiten 7·.-7*5 jokaisessa prosessivaiheessa. Lämpötila voi olla alueella noin 5··-noin 55°C, mieluiten alueella 15°C...noin 35°C, parhaiten 25°C...30°C. Magnesiumsuolaa ei tulisi lisätä niin paljon, että totaalinen "ulossuolaus"-vaikutus taikka suolaliuoksen faasierotus tapahtuu.

Mieluiten liuoksen magnesiumionipitoisuuden tulisi olla noin 0,023- noin 0,125 mol/1. Parhaimmat tulokset on saatu lisäämällä magnesiumsuolaa sellainen määrä, että liuos on 0,05-m magnesiumionien suhteen.

Suositeltavimmat glukoosi-isomeraasientsyymilähtöaineet ovat ne, jotka on saatu kannoista Streptomyces olivochromogenes ATCC n:o 21 713 ja ATCC n:o 21 715 (US-patentit n:o 3 813 318 ja 3 770 589)· 8 56513

Solunsisäinen glukoosi-isomeraasientsyymi valmistetaan viljelemällä edellä mainittua glukoosi-isomeraasia muodostavaa mikro-organismia sopivalla kasvualustalla sopivan hiililähteen ja muiden sopivien ravintoaineiden läsnäollessa.

Solunsisäistä glukoosi-isomeraasientsyymiä sisältävä viljelyliemi voidaan ottaa talteen ja väkevoida millä tahansa sopivalla menetelmällä, kuten sentrifu-goimalla ja/tai suodattamalla. Saatu solupasta on sopivassa muodossa käsiteltäväksi tämän keksinnön mukaisesti.

Seuraavat esimerkit kuvaavat selvemmin tapaa soveltaa yllä mainittua keksintöä, ja myöskin selvittävät parasta tutkittua tapaa suorittaa keksinnön eri vaiheet. Kaikki osat ovat paino-osina, ellei toisin ole esitetty. Glukoosi-iso-meraasiaktiviteetti määrättiin niinkuin edellä on esitetty otsikon "Isomeraasi-aktiviteetin määritys" alla.

Esimerkki 1 (a) Solunsisäisen glukoosi-isomeraasin valmistus

Solunsisäinen glukoosi-isomeraasi valmistettiin neljässä siirrostusvaihees-sa, jolloin alussa käytettiin 1 l:n sekoituspulloja ja lopuksi 3800 l:n ja jopa 80 000 l:n viljelytankkeja; jokaisessa viljelyvaiheessa käytetyn ymppiliuoksen tilavuus oli 5 % viljelyliemen tilavuudesta. Kasvualustojen koostumus ja viljelyolosuhteet on esitetty taulukossa I. Viljelyliemi stabiloitiin 30 minuutin ajan 190°C:ssa. Inkubointiaika oli 1*8 tuntia ensimmäisessä vaiheessa, 2h tuntia toisessa vaiheessa, 22 tuntia kolmannessa vaiheessa ja 15-17 tuntia neljännessä vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa sporuloidun Streptomyces olivochromogenes ATCC n:o 21 715-kannan soluja (yksittäisestä ATCC n:o 21 713-pesäkkeestä, ks. US-patentti n:o 3 ö13 318) lisättiin kasvualustaan. Kaikki viljelyvaiheet suoritettiin 28°C:ssa ja pH 7,0:ssa (säädettiin ennen sterilointia 10-n natriumhyd-roksidilla).

9 5851 3

Taulukko I

Siirrostusten kasvualustan koostumus:

Kehitysvaihe Viljelyliemen (paino-$) Määrä Viljelylie- koostumus men tila vuus

Ensimmäinen vaihe Maissiuutetta 3,6 7,2 g 200 ml (kolme 1 l:n sekoi- Maissisiirapin kiin- tuspulloa) toaineita 1,0 2,0 g

Magnesiumsulfaatti. 7H20 0,05 0,7 g

Vaahdonestoainetta --- 0,07 ml (polypropyleeniglykolia)

Toinen vaihe Maissiuutetta 3,6 271 g 9 litraa (11+ l:n penkki- Maissisiirapin kiinto- fermenttori) aineita 2,0 180 g

Magnesiumsulfaatti. 7Hg0 0,05 lt,5 g

Vaahdonestoainetta (poly- --- 1,3 ml propyleeniglykolia}

Kolmas vaihe Maissiuutetta 3,6 5,^ kg 150 1 (200 l:n siirros- Tärkkelystä 2,0 3,0 kg tustankki) Magnesiumsulfaatti. 7^0 0,05 75,8 g

Vaahdonestoainetta (polypropyleeniglykolia) --- 51 ml

Neljäs vaihe Maissiuutetta 3,6 109 kg 3030 1 (3800 l:n siemen- Dekstroosia 2,0 60,3 kg tankki) Magnesiumsulfaatti. 7^0 0,05 1,5 kg

Vaahdonestoainetta --- 1- (polypropyleeniglykolia) 10 5 8 51 3

Toisen, kolmannen ja neljännen kehitysvaiheen aikana pulloihin ja tankkeihin johdettiin ilmaa ja sekoitettiin fermentoinnin aikana.

Viimeinen viljelyvaihe suoritettiin 76000 1 tankissa. Käymisliuoksen pää-aineosat, paitsi ksyloosi ja dekstroosi, panostettiin 53 000 l:aan kondensaattia. Panostuksen jälkeen seos lämmitettiin noin 60°C:een ja pH säädettiin 5,6.·.. 5,ö:aan 16° Baume natriumkarbonaatilla. Liuos lämmitettiin ennen pH-säätöä, jotta natrium-karbonaattilisäyksen takia kehittyvä hiilidioksidi poistuisi. Tämän jälkeen lisättiin vaahdonestoainetta ja seos steriloitiin 30 min 120°C:ssa. Steriloinnin jälkeen liuoksen lämpötila alennettiin 6o°:hen. Sokerit, ksyloosi ja dekstroosi, panostettiin 1500 l:aan kondensaattia 3800 l:n tankkiin. Sokeriliuos steriloitiin 30 min 120°C:ssä ja jäähdytettiin jälkeen, ja siirrettiin sitten 76000 1 tankkiin. Sokerilisäyksen jälkeen lämpötila säädettiin toiminta-arvoon 31°C ja sitten lisättiin ymppiliuosta. Kun 20 tuntia oli kulunut, ryhdyttiin ottamaan näytteitä 2 tunnin välein, ja määritettiin isomeraasiaktiviteetti, solupaino, pelkistävien soke-reiden ja kokonaishiilen pitoisuus. Käyminen lopettiin, kun iscmeraasimiodostus oli saavuttanut huippuarvonsa. Käymisen aikana pH säädettiin joko automaattisesti tai käsin johtamalla ammoniakkikäasua tankin ilmapuhallusputkistojen kautta esi-steriloiduissa olosuhteissa siten, ettei pH laskenut alle 5,6. Kasvualustan koostumus ja viljelyolosuhteet on esitetty taulukossa II (ks. myös US-patentit n:o 3 770 589 ja 3 813 318, joissa on selitetty käytetyn käymislaitteiston rakennetta ).

Taulukko II

Kasvualustan koostumus 76000 l:n käymistankissa Viljelyliemen tilavuus 6U 350 1

Koostumus_Paino-%_Paino, kg_

Maissiuutetta U,0 2 600 Tärkkelystä 2,5 1 625

Dekstroosia 0,2 130

Ksyloosia 1,0 650

Glysiinia 0,1 65

Ammoniumnitraattia 0,2 130

Magnesiumsulfaattia 0,05 33

Vaahdonestoainetta (polypropyleeniglykolia) 21-23 1

Natriumbikarbonaattia (pH 5,8-6,0:ksi)

Lopullinen tilavuus = 68 lUO 1)

Toimintalämpötila = 31°C.

Kobolttia ei lisätty missään viljelyvaiheessa.

Solunsisäinen glukoosi-isomeraasin pitoisuus oli tällöin 19,5 IGIU/ml. Käytettiin 8860 l:n erä saatua käymisliuosta väkevän pysyvän glukoosi-isomeraasientsyymivalmisteen valmistukseen. Loput liuoksesta käytettiin kokonais- 5851 3 ten solujen muodossa olevan valmisteen valmistamiseksi käyttäen MgiOH^ta, suo-datusapuainetta ja 2-propanolia, jota valmistetta käytettiin muuttamaan entsymmaat-tisesti glukoosia fruktoosiksi panosreaktorissa.

, (b) Väkevän glukoosi-isomeraasientsyymivalmisteen valmistus 8860 litran erä solunsisäistä glukoosi-isomeraasientsyymiliuosta 76 000 l:n fermenttorista, entsyymipitoisuus 19»5 IGIU/ml, eli kokonaismäärä 173 x 10 IGIU) sentrifugoitiin (DeLaval BRPX-207) sakan poistamiseksi. Linkoon syötettiin 19 1/min 2 minuutin syöttöaikana. Pesu- ja huuhteluvesi lisättiin sekunnin ajan juuri ennen ja jälkeen rummun täytön. Saatu solupasta (918 kg; 187 IGIU/g) syötettiin 852 l:n pyöreäpohjaiseen tankkiin 76 1:11a vettä. Kun 290-320 kg solupastaa oli kerätty, solupastaa käsiteltiin 8 g:11a lysotsyymientsyymivalmistetta (2 kertaa kiteytetty kylmäkuivattu jauhe; Miles Seravac:n munan valkuaisesta valmistama tuote, jonka aktiivisuus on 23 300 yksikköä/mg ainetta), jotta soluseinämien hajoittaminen alkaisi vapauttaen glukoosi-isomeraasientsyymin liukenevassa muodossa. Liuos, jossa oli 2-propanolia (85 tilavuus-#) ja vettä, lisättiin solupastaan (21 1 liuosta 1+5,1+ kg kohti pastaa). Tämän jälkeen lisättiin vielä 1+1,6 1 edellä mainittua 2-pro-panoliliuosta, jotta nesteen alkoholipitoisuus nousisi 30 tilavuus-#:iin. Pastamainen 2-propanoli-vesi-seos pumpattiin sitten 3800 l:n digerointiastiaan, jossa sitä pidettiin 2b tunnin ajan lämpötilassa 26UC - 2°C. Tämän jälkeen seokseen lisättiin edellä mainittua 85~# 2-propanoliliuosta, jotta 2-propanolipitoisuus nousisi 52 tilavuus-#:iin, jolloin nukleiinihapot, kuten ribonukleiinihappo- ja deoksiribonukleiinihappo (DNA), saostuvat, ja proteiininen entsyymiaines jää liuokseen. Pyörivä vakuumisuodatin päällystettiin 91 kg:11a suodatusapuainetta. Kun apuainekerros oli muodostunut, johdettiin järjestelmään 2-propanolia, kunnes alkoholipitoisuus oli noin 52 tilavuus-#, jotta nukleiinihapot eivät liukenisi. Tämän jälkeen suodatettiin pastaliete, jolloin lopuksi johdettiin apukerroksen vesi-alko-holiseos suodattimen läpi (varsinaista pesua ei suoritettu). Entsyymitappioiden minimoimiseksi siirrettiin suodattimen pinnalle jäänyt liete vielä Nutsche-suodat-timeen, johon myös lisättiin suodatusapuainetta.

(c) Pysyvän glukoosi-isomeraasientsyymitiivisteen valmistus Pyörivältä vakuumisuodattuneita ja Nutsche-suodattimelta saatu suodos pumpattiin 3Ö00 l:n tankkiin, jota käytettiin varastotankkina, ja sitten syöttö-säiliöön, johon lisättiin 57 1 1,0-m magnesiumsulfaattiliuosta ja 1+9 1 85-tila-vuus-# 2-propanolia. Seos siirrettiin DeLaval BRPX-207 linkoon syöttönopeudella 63 1/min ja lingottiin 5 min. Lopuksi rumpu pestiin ruiskuttamalla viisi kertaa 1 sekunnin ajan vettä ja syöttöä. Pysyvän entsyymivalmisteen sisältävä jäännös kaavittiin pois, ja sekä rumpu että syöttökouru pestiin pienellä määrällä sentrifuugista poistuvaa kevyttä faasia. Sekä jäännös että pesunesteet lisättiin pysyvään entsyymivalmisteeseen. Tuote sekoitettiin laboratoriosekoittimella ia täytettiin 3,8 l:n muovisäiliöihin varastoitavaksi sekä jatkokäyttöön ontsy- 5851 3 maattiseen glukoosin muuttamiseen fruktoosiksi.

Pysyvän, väkevän glukoosi-isomeraasientsyymivalmisteen (panos n:o 1) kokonaissaanto oli 1+1,6 1 liuosta, joka sisälsi 109 x 10° IGIU eli noin 11 261 IGIU/g kuiva-ainetta kohti laskettuna. Tämä edusti 53 %:n saantoa koko solulietteen aktiivisuudesta laskettuna.

Pysyvän entsyymivalmisteen analyysi on esitetty taulukossa III.

Taulukko III

Pysyvän glukoosi-isomeraasientsyymivalmisteen ominaisuudet: Isomeraasiaktiviteetti (IGIU/g kuiva-ainetta) 11,261

Ominaisaktiviteetti (iGIU/ml proteiinia) 15»1

Kuiva-aine (%) 22,2

Kosteus, Karl Fischer {%) 63,8

Proteiini, Kjeldahl {% kuiva-aineesta) 7^,7

Tuhka, oksidina {% kuiva-aineesta) 11 ,U

Liukenemattomia aineita {% kuiva-aineesta) 5»3

Mg++ (mg/ml) 5,8

Mg++ (mol/1) 0,2l+

Mg /proteiini-suhde 0,035

2-propanoli, erotuksena (%) 1U

Esimerkki 2

Valmistettiin useita panoksia solunsisäistä glukoosi-isomeraasientsyymiä lähtien Streptomyces olivochromogenes ATCC n:o 21 715:sta, kuten esimerkissä 1 on kuvattu käyttäen 7»5 l:n, 1+0 l:n, 1+00 l:n ja 1+000 l:n käymisastioita. Käymisen jälkeen viljelyliemet jäähdytettiin 32°C:sta 22°C:een, jotta mikro-organismien kasvu ja mahdollinen autolyysi vähenisi. Käymiserät sentrifugoitiin, ja raskas solupastafaasi kerättiin 38 1:n astioihin, punnittiin ja pumpattiin 3800 l:n digerointitankkiin. Solupastaan lisättiin sekoittaen lysotsyymientsyymivalmistetta (2 kertaa kiteyttyä kylmäkuivattua jauhetta. Miles-Seravac:n munanvalkuaisista valmistama tuote, jonka aktiviteetti on 23300 yksikköä per mg ainetta) jotta so-luseinämät hajoaisivat ja solunsisäinen glukoosi-isomeraasientsyymi vapautuisi liukenevassa muodossa. Lysotsyymiannostus jokaiselle erälle oli 6,8 yksikköä per ml soluja (kuiva-ainetta). Solupastan kokonaissolupaino kuiva-aineena laskettuna laskettiin käyttäen koko viljelyliemen lopullista kuivaa solupainoa ja viljelylie-men tilavuutta. Oletettiin 100-$ solusaantoa kuiva-aineesta laskettuna alkuväke-vöintivaiheessa. Iysotsyymilisäyksen jälkeen aseotrooppista 2-propanolia lisättiin pitoisuuteen k2 1 paino-$. 2-propanolin alkulisäys laskettiin solupastan painosta, josta vähennettiin 8 % (liukenemattomat aineet) ja lisätyn alkoholin pitoisuudesta. Alkoholipitoisuuden säädön jälkeen, hydrolysaatin (solupasta-alkoholi-lietteen) pH säädettiin.

13 5851 5 7,0:ksi vedettömällä mononatriumfosfaatilla, jota lisättiin 250 g:n erissä, veteen liuotettuna. Hydrolysaatit pidettiin 28° - 30°C lämpötilassa ja sekoitettiin voimakkaasti, kunnes entsyymi oli täydellisesti liuennut.

Liukenemisaste määrättiin vertailevalla entsyymianalyysillä koko hydrolysaatti-näytteen ja sellaisen osanäytteen välillä, josta solun kiintoaineet oli poistettu sentrifugoimalla.

Digerointivaiheen päättyessä hydrolysaatin alkoholipitoisuus tarkistettiin uudelleen ja säädettiin arvoon k2 - 1 %. Solujäänteet poistettiin käyttäen apu-kerrossuodatinta ja 1+1+ - h6-% 2-propanolivesiliuosta. (alkoholipitoisuus oli hieman yli 1*2 - 1 % tässä vaiheessa, jotta haihtumisesta vakuumisuodattimen sisällä johtuvat alkoholihäviöt tulisivat kompensoitua. Käsitelty hydrolysaatti suodatettiin sellaisenaan, eli pH 7,0 - 0,3:ssa ja lämpötilassa 28°C - 30°C. Suodokset johdettiin 3800 l:n varastotankkiin.

Neljässä erässä saostus suoritettiin erissä käyttäen syöttötankkia saostus-astiana. Kirkkaat suodokset ajettiin erissä tankkiin noin 650 l:n tilavuuseränä. Tähän lisättiin 1,0-m MgSO^-liuosta annoksen ollessa 0,05 1/1 1 puhdasta hydroly-saattia, sekä sellainen tilavuus aseotrooppista 2-propanolia, että 2-propanolin kokonaismäärä pysyi noin 1+2 paino-/&:na. Lisäyksen aikana liuokset sekoitettiin ja kierrätettiin syöttöpumpun läpi, jotta sekoitus tehostuisi. Saostunutta entsyymiä seisotettiin 10-15 minuuttia, jotta saataisiin suurempia partikkeleita, ja sitten sentrifugoitiin käyttäen "Delaval BRPX-207"-linkoa. Liuos syötettiin linkoon nopeudella 6 - 10 g/min ja rumpu panostettiin kahdesti jokaisen erän aikana.

Eräässä erässä (erä 10) saostus suoritettiin jatkuvatoimisesti, käyttäen syöttösäiliötä jatkuvasti sekoitettuna tankkireaktorina (CSTR). Kirkastettu hydrolysaatti ja MgSO^-liuos syötettiin jatkuvasti syöttösäiliöön sekoitus-T-kappa-leen kautta. Kirkkaan hydrolysaatin 2-propanolipitoisuus säädettiin HL - 1+5 paino-^: iksi, jotta MgSOliuoksen laimentava vaikutus kumoutuisi, ja alkoholipitoisuus pysyisi 1+2 - 1 /5:ssa saostuksen aikana. Kirkkaan hydrolysaatin virtausta valvottiin virtaussäätimellä. 1,0-m MgSO^-liuosta syötettiin nopeudella 0,05 1/1 1 puhdasta hydrolysaattia käyttäen pientä diafragmapumppua. Molempien liuosten virtaus aloitettiin ja nestepinta nousi syöttösäiliössä. Tankkiin johdettiin hydrolysaattia ja MgSO^-liuosta 15 minuutin ajan. Seos syötettiin sitten linkoon samalla nopeudella kuin syöttötankkiin. Virtausnopeus linkoon säädettiin siten, että syöttösäiliön pinnankorkeus pysyi muuttumatta. Rumpuun syötettiin osittainen panos joka kymmenes minuutti. Osittainen panostus suoritettiin vähentämällä rummun käyttövesi-painetta.

Sentrifugointien jälkeen jäännösentsyymi poistettiin lingon pinnalta tislatulla vedellä ja yhdistettiin pysyvään entsyymivalmisteeseen. Jokainen talteenotetuista pysyvästä entsyymivalmiste-eristä sekoitettiin homogeeni- "* 5851 3 seksi, pullotettiin ja säilytettiin l+°C:ssa.

Taulukot IV ja V antavat yhteenvedon talteenottotehokkuudesta eri proses-sinvaiheissa. Taulukossa V on esitetty pysyvien entsyymivalmisteiden analyysi.

Taulukko IV

Pysyvän entsyymin talteenottoanalyysi

Erä Tilavuus Koko viljelyliemi Solupasta Hydrolysaatti Suodos

Aktiivisuus Paino Aktiivisuus Paino Aktiivisuus Tilavuus Aktiivisuus n:o 1 IGIU/g kg IGIU/g kg IGIU/g 1 IGIU/ral 6 3190 15,1 581+,3 75,3 1167,2 1+0,8 1173 32~b 7 3065 18,8 578,U 79,7 1123,2 1+2,8 1362,^6 29,2 8 3125 18,0 602,7 8U ,7 1121+,8 1+7,3 1627,^° 2b,6 9 3220 18,5 658,1 89,9 1U19,2 1+0,1+ l6l8,l(c 2U,9 l(f^ 3200 16,0 587,9 89,1 1105,8 1+2,1+ 1627 ,^C 18,9 I ____ a) jatkuvatoiminen saostus h) suodatus apuainetta käytetty (Dicalite 1+200, valmistaja Grefco Inc.) c) suodatusapuainetta käytetty (Dicalite Speedflov, valmistaja Grefco Inc.) 15 5851 3

Pysyvien glukoosi-isomeraasientsyymivalmisteiden analyysi

Erä n:o 6 1 8 9 10

Iscmeraasiaktiivisuus 8 012,5 9 089,3 9 532,1 6 680,6 8 963,6 IGIU/g, (k.a.)

Qninaisaktiivisuus 12,3 1^,9 1**,7 13,6 15,0 IGIU/mg proteiini

Kuiva-ainetta, % 25,6l 28,0 21,8 21,U 2l,7

Kosteutta, Karl Fischer, % 61,9 60,9 59, ^ 6l,U 66,2

Proteiinia, Kjeldahl, 6U,9 6l,0 61»,8 ^9,¾ 59,9 % (k.a. )

Tuhkaa oksidina, % (k.a.) 37,6 13,5 13,6 35,5 13,U

Liukenematonta ainetta, % (k.a.) 9,7 ^,6 3,7 31,6 3,3

Mg**, mg/ml 3,8 11,6 3,3 6,73 18,6

Mg++, mol/1 0,16 0,1*8 O.lit 0,28 0,77

Mg++/proteiini-suhde 0,023 0,068 0,023 0,11 0,125 2-propanolia, % 12,5 11,1 18,8 17,0 9,1 (erotuksena)

Fosforia, % (k.a.) - 2,33 1,80 8,1 2,10

Taltioidun pysyvän entsyymivalmisteen lopullinen paino, g (k.a.) 18 278 ik 939 l6 1+53 2k 6^9 12 939

Esimerkki 3

Suuri erä solunsisäistä glukoosi-isomeraasientsyymiä valmistettiin Streptomyces olivochrcmogenes ATCC n:o 21715:n avulla niin kuin esimerkissä 1 (a) on selitetty, käyttäen 1 l:n, li* l:n, 200 l:n, 3800 l:n ja 75 700 l:n käymis-astioita. Käymisen loputtua 75 700 l:n astiassa oleva liani jäähdytettiin noin 20°C:hen. Se pidettiin ilmastamatta ja sekoitettiin lyhyitä aikoja ennen väkevöintiä. Loppuliuosta oli βθ 600 1 ja sen aktiivisuus oli 21,0 IGIU g liuosta, se sisälsi korkeintaan 16,5 g kuivaa soluja/litra ja sen kokonaisaktiivisuus oli 1 270,7 x 106 IGIU.

Saatu liuos väkevöitiin sentrifugoimalla DeLaval BRPX-207 lingossa; syöttö-nopeus oli noin 19 1/minuutti ja syöttöaika oli 1,75 min. Kevyt faasi analysoitiin jaksottain ja johdettiin sitten viemäriin. Raskas solupastafaasi kerättiin vastaanottoastiaan, ja pumpattiin sitten jatkuvasti yhteen kolmesta digerointi-tankista. Väkevöintivaihe antoi noin 6,1*-kertaisen väkevöinnin solujen kiintoaineissa (tilavuutta kohti laskettuna). Koko määrä solupastaa, joka otettiin tai- 5851 3 16 teen, oli 9 U60 1, sen paino oli 939 kg ja se sisälsi kuiva-aineita 1 100 kg.

Solupasta sisälsi 131 kg tuhkaa, 650 kg proteiinia, ja 8 290 kg vettä; sen aktiivisuus oli 132 IGIU/g ja kokonaisaktiivisuus 12^0,0 x 10^ IGIU (9¾ % kokonaismäärästä) .

Kun solupastan tilavuus oli 757 1 » lisättiin 760 111 870 1 91 ,5~? 2-propa-nolia, kunnes digerointilaite oli täynnä. Jokaisen alkoholilisäyksen jälkeen saadun lietteen pH tarkistettiin ja säädettiin arvoon 7,0-7,2 (mikäli tarpeen) mononat-riumfosfaatilla. Alkoholin jälkeen lisättiin lysotsyymientsyymiä annoksittain koko täyttövaiheen aikana annosten ollessa noin 6,8 yksikköä/mg soluja (kuiva-aineena laskettuna). Käytetty lysotsyymi oli 2 kertaa kiteytetty pakastuskuivat-tu jauhe (Miles-Seravac:n munanvalkuaisesta valmistama tuote), ja jonka aktiivisuus oli 23 000 lysotsyymiyksikköä/mg entsyymivalmistetta.

Kun jokainen tankki oli täytetty, säädettiin lietteen alkoholipitoisuus noin k2 - 1 paino-/?:iin. Hydrolysaatti (alkoholi-solupasta-lysotsyymiliete) sekoitettiin jatkuvasti ja kierrätettiin ulkopuolisten lämmönvaihtimien kautta, jotta lämpötila pysyisi muuttumattomana noin 28°C-30°C:ssa. Entsyymin liukenemista seurattiin vertailevalla entsyymianalyysillä ottaen näytteitä hydrolysaat-ista ja siitä osasta, josta solun kiintoaineet oli poistettu suodattamalla. Kun määrätyn tankin hajoitusaste oli noin 100-?, oli hydrolysaattiliete valmis kirkastettavaksi. Digerointiaika oli noin 52...73 tuntia. Koko hydrolysaattiliete kolmesta hajoitustankista oli kokonaistilavuudeltaan 19 950 litraa ja painoi 17 958 kg ja sen kokonaiskuiva-ainemäärä oli 1 019 kg). Hydrolysaattilietteen analyysi antoi 188 kg tuhkaa, 650 kg proteiinia, 7 220 kg 2-propanolia ja 9 720 kg vettä. Hyd-rolysaatin yksikköaktiviteetti oli 66,6 IGIU/g ja kokonaisaktiivisuus 1,180 x 10^ IGIU (joka edustaa 93 % käymislietteen kokonaisaktiivissudesta.

Hydrolysaattiliete kirkastettiin suodattamalla käyttäen "Dicalite Speedflow"-suodatusapuainetta (valmistaja Grefco Inc.); kerrospaksuus oli 53—57 mm. Kokonaisuudessaan käytettiin 272 kg suodatusapuainet- ta hydrolysaattilietteen kirkastamiseen. Apuaine lietettiin 50-? 2-propanoliliuok- seen pitoisuuteen 5 %· Propanolin säästämiseksi, suodattimen läpäissyt liuos kierrätettiin takaisin apuainelietetankkiin kun apuainekerros oli saatu aikaan.

Heti kun lieteliuos oli poistunut apuainekerroksen läpi, hydrolysoitu liete johdet- 2 tiin suodattimen läpi. Kirkastusvaiheen suodatusnopeus oli 100-180 1/h m , keskiar- 2 von ollessa 1U0 1/h m . Suodatuksen jälkeen kirkas suodos pumpattiin 3800 l:n varastotankkeihin. Suodattimelta poiskaavittu aines analysoitiin määräajoin ja heitettiin pois. Koko hydrolysaatin tilavuus oli 17 560 litraa ja painoi 16 200 kg ja sen kokonaiskuiva-ainepitoisuus oli 351 kg. Kirkastetun hydrolysaatin analyysi oli U8 kg tuhkaa, 223 kg proteiinia, 7166 kg 2-propanolia ja 867 kg vettä. Kirkastetun hydrolysaatin aktiivisuus oli 5^,0 IGIU/g eli kokonaisaktiivisuus oli 875,7· 10c IGIU (joka edusti 69 % alkuperäisestä aktiivisuudesta).

17 5851 3

Kirkastusvaiheen jälkeen hydrolysaattien alkoholipitoisuus nostettiin 44-1*5 paino-#: iin. Edellämainittu saostus samoin kuin glukoosi-isomeraasientsyy-min stabilointi suoritettiin johtamalla kirkastettuun hydrolysaattiin 2,0-m magnesiumsulfaattiliuosta nopeudella 0,025 1/1 kirkasta hydrolysaattia jolloin saatiin lopullinen liuos, jossa oli 0,05 mol/1 magnesiumsulfaattia. Sekä magne-siumsulfaattiliuoksen että kirkkaan hydrolysaattiliuoksen pumppaus aloitettiin ja syöttösäiliöön muodostui nestepinta* Tankki täytettiin sellaiseen tilavuuteen, että ko. virtausnopeuksilla viipymä oli 15 minuuttia. Seos pumpattiin sitten linkoon nopeudella, joka vastasi syöttönopeutta syöttötankkiin, eli virtausnopeus säädettiin sellaiseksi, että syöttötankissa nestepinta pysyi vakiokorkeudella noin 15 min ajan.

Lingon yläjuoksu ohjattiin 30300 l:n tankkiin ja käsiteltiin tämän jälkeen tislauslaitteessa, jotta 2-propanoli saataisiin talteen uudelleen käytettäväksi. Stabiloitu entsyymitiiviste kerättiin 76 l:n happoteräsastioihin ja yhdistettiin sitten 380 l:n sekoitettuun säiliöön, pysyvä entsyymitiiviste oli paksu ja mutamainen ja väriltään vaaleanruskea. Pysyvään entsyymitiivisteeseen lisättiin pienissä erissä tislattua vettä, jolloin entsyymi liukeni. Liuoksen väri oli suhteellisen kirkas, kahvin musta, ja sillä oli kevyen öljyn konsistenssi.

Saadun stabiloidun, uudelleenliuotetun entsyymivalmisteen tilavuus oli 276 litraa ja se painoi 288 kg ja sisälsi kuiva-ainetta 77 kg. Sen koostumus oli seuraava: 8,6 kg tuhkaa, 57,2 kg proteiinia, 47,2 kg 2-propanolia ja l63 kg vettä. Pysyvän entsyymivalmisteen aktiivisuus oli 11 654 IGIU/g kuiva-ainetta eli kokonaisaktiivisuus oli 892,8 x 10υ IGIU (70,3 #:n talteenottosaanto). Pääosa häviöistä (23-24 %) tapahtui hydrolysaatin kirkastusvaiheessa; tästä noin puolet (noin 11,8 %) oli suodatushäviöitä ja puolet johtui inaktivoitumisesta.

Taulukoissa VI ja VII on esitetty yhteenveto entsyymitalteenottotehokkuu-desta eri prosessivaiheissa; taulukossa VII on esitetty stabiloidun entsyymitiivisteen analyysi.

Taulukko VI

Pysyvän entsyymitiivisteen talteenottoanalyysi (Erä 11)

Prosessivaihe Kokonaispaino Qminaisaktiivisuus Kokonaisaktiivisuus (kg) (IGIU/g) (IGIU)

Koko viljelyliuos 60 455 21,0 1 270,7 x 10^

Solupasta (a) 9 393 132,0 1 240,0 x 10^

Raaka hydrolysaatti 17 700 66,6 1 178,9 x 10^

Kirkas hydrolysaatti 16 200 54,0 875,7 x 10^(^c^

Pysyvä entsyymi- 288 11 654^ 892,8 x 10^ ^ tiiviste (a) arvo on saatu erotuksena tai se on arvioitu.

(b) arvo on kuiva-ainetta kohti laskettu.

(c ) kokonaisaktiivisuus kirkkaassa hydrolysaatissa määrättiin arvioimalla kirk- is 5851 3 kaan hydrolysaatin paino ja mittaamalla isomeraasiaktiivisuus siinä (todellinen kokonaispaino on korkeampi kuin arvioitu, sillä talteenotetun pysyvän entsyymi-tiivisteen määrä oli suurempi kuin se mikä määrättiin kirkkaalle hydrolysaatilie).

Taulukko VII

Stabiloidun glukoosi-isomeraasientsyymitiivisteen analyysi

Erä n;o 11-336

Isomeraasiaktiivisuus 11 65** IGIU/g (k.a.)

Qminai saktii visuus 15,5 IGIU/mg, proteiinia

Kuiva-ainetta, % 26,6

Kosteus, Karl Fischer, % 56,9

Proteiini, Kjeldahl, % (k.a.) 75,0

Tuhka oksidina, % (k.a.) 11,3

Liukenematonta ainetta % (k.a.) 0,53

Nfe++, mg /ml 5,99

Mg++, mol/1 0,25

Mg++/proteiini-osamäärä 0,032 2-propanoli, % (erotuksena) 16,5 talteenotetun entsyymin loppupaino, kg (k.a.) 287,6

Varastointikelpoisuuden määritys

Esimerkeissä 1-3 saatujen glukoosi-isomeraasientsyymitiivis-teiden pysyvyys eri lämpötiloissa määritettiin seuraavalla tavalla. Entsyymi-valmisteiden näytteitä säilytettiin neljässä eri lämpötilassa, **°C, 18°C, 26°C ja 37 C, ja ne analysoitiin glukoosi-lsomeraasiaktiivisuuden suhteen k, 8 ja 12 kuukauden kuluttua.

Seuraava taulukko esittää tämän tutkimuksen tulokset: 19 5851 3 νο ο νο ι o o ft I icni ro ro CM I ^ ™ ^

4_i —' I

CJ -μ ° 2 ococooftinroftftoovo r-

en χ oo | rH (N cn ^(NrH

P

d ror'-o'iiHm^cNLnLnooro ft *3· | ^rr^m *3· vo mroro

CO

^ VO VO Oftvor^ftOOOVO I 1Π

(M| OvOOOVOOOCTvOr-VOCO CO

(¾ cc) «H I I—I ft1 e U ft rö °co3 voroooooovooo^vocoo •H CMIT) 00| (JvOOOCOCJVCTiCrvOOCOCOCO (Ti ft -¾ •h· P cNvovo^voftcnrorovonvo t> «—- x rr| CTCrr-'COCOCTiCOCOCOCOCO 00 •H t) ft — ’e a) 1 p-ift- oor'ftCNftOr^CNICNft I o ,.£>“) c\j I σνοοοοοσνοσνοοοοοο en M ft -ö ^ ft ft -Η M C 3 <-> ft > a; p O ft co : co P r-rooavftcncooocrvr^o cm 0£'> ftcO oo| CT>OOOOOCT\cri<TiCOCOCOas CTs

Pd ·>-3 ·Η ft P ft ft pcjftft 3 oo en oo vo m vo ?ft^ ft <3-| i i I oo i i icocoooco co ft ft _ H CO CO -Τ'

•h cd U

s a g -

IDLOftCNr^int^-CNrHOI O

>0C f\j| OOOOOOOCOChCTi o EH O ^ ft ft ft ft ft ft . ft Ή ft ft co ft ft ft ft S se) 2 ftcNOLnroooftLnvom σν coft J !" ool ooooooocticti —σν —σν σν •Hco^ft »-η ft ft ft ft ft ft υ u <0 <U ft " " -S.“ 5 ftO’d’Ovocnmftoocovo g!aj ft | οσσνοσνσνσνοοσνοο erv G ft ft ft ft ft G 1 -r*· O ft : ^ n C X * X) *- • h ft ci ^ r-' r-ovvo coed «υ co cor'^rr-ovcninvomo X G2 »o»»*»*»·*» Λ S ‘d3 rsicnoftrooooin-vrroti· VOOOft^CMVOCNftOftcn ö > to ft(MC7VTrcoav(N<Ninftvo (¾ Ή · *' pftgcfl oorncNLor-cTior' cr>ft

' ft £ Ο >5 ftft Ή rH

, < d H —'

O

> u

CO

:π3 Ο -H

ά a £ O *-| Q) iHCMfO^invDr^oocnr-H^y; 5851 3 20 (a) Tämä on aktiivisuus pysyvyystutkimuksen alussa, eikä se arvo, joka saatiin välittömästi entsyymin valmistuksen jälkeen.

^^Käillä näytteillä oli epätavallisen alhaiset alkuaktiivisuusarvot johtuen virheellisistä prosessiolosuhteista.

(c ) . .....

Matalat arvot johtuvat protennipitoisen materiaalin kiteytymisestä entsyymin valmistuksen aikana.

;Isomeraasiaktiivisuuden määritystarkkuus oli noin 10 %t mikä selittää yli 100 %\n aktiivisuusarvot.

Tulokset taulukossa VIII osoittavat, että tämän keksinnön mukaisesti valmistetut entsyymitiivisteet säilyttävät yli 80 - 10 % (ja yleensä yli 90 - 10 %) aktiivisuudesta jopa 12 kk ajan säilytettäessä ^-l80C:ssa, ja ne säilyttävät jopa 80 - 10 % aktiivisuudesta jopa 8 kk ajan säilytettäessä 26°C:ssa, eli näiden entsyymitiivisteiden säilyvyys on yli 95 % ^Cissä ja yli 85 % l8-26°C:ssa.

Esimerkki 6k l:n erä liuosta, jossa oli esimerkissä l(a) esitetyn menetelmän mukaan valmistettua solunsisäistä glukoosi-isomeraasia (saatu kahdesta 38 l:n käymis-erästä, joiden aktiivisuus oli 18,0 IGIU/ml vast. 16,8 IGIU/ml), laimennettiin vedellä ja sentrifugoitiin, jolloin muodostui solupasta.Solupasta sijoitettiin 7,5 litraan astiaan ja laimennettiin vedellä kokonaistilavuuteen Π,5 1. Liuos säilytettiin U°C:ssä 2 päivää, ja käsiteltiin sitten 77 ml:11a lysotsyymientsyymi-valmistetta (valmistettu munanvalkuaisesta, aktiivisuus noin 8000 lysotsyymi-yksikköä/mg, ja 1930 ml:11a 2-propanolia. Lietettä sekoitettiin 1* tuntia, minkä jälkeen lisättiin 500 mg lysotsyymientsyymivalmistetta, ja sekoitettiin yli yön 20-30°C:ssa (lämpötila nousi noin 35~^0°C:ksi toisen lysotsyymientsyymilisäyksen jälkeen, mikä mahdollisesti aiheutti lievää entsyymin deaktivointia). Tämän jälkeen 500 ml:n erä raakaa hydrolysaattia laimennettiin 500 ml:11a vettä. Otettiin 123 ml:n näytteitä laimennetusta hydrolysaatista ja lisättiin 2-propanolia pitoisuuteen 50 til-#. Yhtä hydrolysaattinäytettä käytettiin vertailunäytteenä. Jokaiseen hydrolysaattinäytteeseen lisättiin taulukossa IX mainitut määrät nat-riumkloridia (vertailuaine)ja magnesiumsulfaattiheptahydraattia (MgSO^.TH^O). Suolalisäyksen jälkeen sentrifugoitiin suspensiot ja vertailunäyte ja määritettiin glukoosi-isomeraasiaktiivisuus ja proteiinipitoisuus (viimeksi mainittu määritettiin optisen tiheyden perusteella 2βθ ja 280 nmrssä käyttäen E. Adamsin monogram-mia (California Corp. for Biochem, Research 3625 Medford St., Los Angeles, 63, Kalifornia; menetelmä perustuu enolaasin ja nukleiinihappojen ekstintiokertoi-raiin, ks. Warburg ja Christian, Biochem. Z. 310, 38L (19^2)). Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

21 5 851 3

Taulukko IX

(a)

Suola Suolan määrä Optinen tiheys pHv Liuoksen aktiivisuus _260 nm 280 nm_(lGIU/ml)

Vertailu - 1,5 1,19 6,5 2,79

NaCl 1,0 1,53 1,06 6,1+0 3,33

NaCl 2,0 1,55 1,08 6,38 3,lU

NaCl 5,09 1,82 1,30 6,35 2,76

MgSO^ 0,25 1,50 1,03 6,1+5 2,87

MgSO^ 0,50 1,1+8 0,995 6,1+5 2,36

MgSO^ 1,0 1,65 1,12 6,30 1,17

MgSOj^ 2,0 1,68 1,11 6,25 0,20 (a) .

Näissä kokeissa pH oli suhteellisen alhainen, mikä voi olla syynä alhaiseen isomeraasiaktiivisuuteen. Tämä ei kuitenkaan selitä miksi viimeisen liuoksen (MgS0^:n määrä 2,0 g) aktiivisuus oli melkein nolla. Todennäköisesti lämpötilan nousu 35°-l+0°C:een toisen lysotsyymilisäyksen jälkeen aiheutti entsyymin deakti-y.oinnista tässä kokeessa.

Taulukosta IX ilmenee, että magnesiumsulfaatin lisäys alkoholivesihydrolyr saattiin aiheuttaa isomeraasiaktiiviauuden alenemisen supematantissa alentamatta juuri lainkaan nukleiinihappopitoisuutta (nukleiinihapot absorboivat valoa 260 nm:ssä). Tämä vaikutus ei esiintynyt lisättäessä natriumkloridisuolaa. Siten lisäämällä alkoholivesihydrolysaattiin magnesiumsulfaattia voidaan glukoosi-isomeraasi erottaa nukleiinihapoista. Havaittu ilmiö ei liene tyypillinen "ulossuolaus"-ilmiö, koska magnesiumsulfaattipitoisuus oli melko alhainen ja tulos natriumkloridilla toinen.

Esimerkki 5 l+,5 litraan esimerkin k mukaan saatua raakaa hydrolysaattia (jossa oli solubilisoitua glukoosi-isameraasia), lisättiin suodatusapuainetta ja niin paljon 2-propanolia, että liuos oli 50-tilavuusprosenttinen 2-propanolin suhteen. Liete suodatettiin hitaasti, jotta glukoosi-isaneraasiliuos kirkastuisi. Suodoksen omi-naisaktiivisuus oli 65,2 IGIU/ml. Otettiin 335 ml:n näyte (kokonaisaktiivisuus 21 81+2 (IGIU), ja tähän näytteeseen lisättiin 16,5 ml 2-propanolia ja 16,5 ml 1-m magnesiumsulfaattia pH 8:ssa. (Tällöin hydrolysaatti sisälsi 1 % MgS0^:ää, ja vesifaasissa oli 2 % MgSO^+ää). Öljymäinen saostuma muodostui heti suolan lisäyksen jälkeen. Seos sentrifugoitiin ja saostuma erotettiin. Saostuma liuotettiin veteen (kokonaistilavuus 10,5 ml), ja lisättiin sitten vielä 1+02 osaa vettä ja mitattiin laimennetun liuoksen valonläpäisykyky 260 ja 280 nm:ssä; tulos oli 0,231+ ja 0,350, eli liuoksen proteiinipitoisuus oli 0,33 mg/ml (kokonaismäärä 133 mg). Liuoksen ominaisakti.ivisuus oli 201+0 IGIU/ml, eli kokonais aktiivisuu s 22 5851 3 21 400 IGIU (98 % alkuperäisen kirkkaan hydrolysaatin aktiivisuudesta). Stabiloidun glukoosi-iscmeraasientsyymivalmisteen ominaisaktiivisuus oli 15,3 IGIU/mg proteiinia. Nämä tulokset yhdessä taulukon IX tulosten kanssa todistavat, että magnesiumsulfaatti selektiivisesti saostaa ja puhdistaa isomeraasientsyymia.

Esimerkki 6 67 ml:aan solubilisoitua, soluvapaata glukoosi-isomeraasientsyymiä sisältävää alkoholiliuosta lisättiin 67 ml 2-propanoliliuosta. Saostumaa ei muodostunut. Tämän jälkeen lisättiin 2 ml 1-m magnesiumsulfaattiliuosta ja 2 ml 2-propanoliliuosta, jolloin heti muodostui harmaanvalkoinen kiinteä saostuma, joka sitten erotettiin ja liuotettiin veteen (kokonaistilavuus 13,0 ml). Saatu stabiloitu entsyymivalmiste sentrifugoitiin ja laimennettiin sitten 100 osalla vettä määritystä varten. Laimennetun liuoksen valonläpäisykyky 260 ja 280 nm:ssä olivat 0,288 ja 0,^37, eli sen proteiinipitoisuus oli 0,46 mg/ml. Stabiloitu entsyymi-valmiste sisälsi siis 46,5 mg/ml proteiinia; sen aktiivisuus oli 482 IGIU/ml liuosta eli 10,4 IGIU/ml proteiinia. Kokonaisaktiviteetti 13,0 ml:ssa stabiloitua ent-syymitiivistettä oli 6 266 IGIU. Emäliuos sisälsi vain 150 IGIU.

Esimerkki 7 3250 ml:aan kirkasta, solubilisoitua glukoosi-isomeraasia sisältävää hydro-lysaattia, jonka aktiivisuus oli 109 IGIU/ml (pääosa esimerkissä 4 saadusta 4,5 l:n erästä) lisättiin 162 ml 2-propanolia ja 162 ml 1-m magnesiumsulfaattiliuosta. Heti muodostui öljymäinen saostuma, joka otettiin talteen sentrifugoi-malla. Saostuman tilavuus oli 69 ml ja sen aktiivisuus oli 4θ4θ IGIU/ml (kokonais-aktiivisuus 278760 IGIU). Pieni näyte stabiloidusta entsyymitiivisteestä laimennettiin vedellä suhteessa 1/1000 määritystä varten. Laimennetun liuoksen valo-transmittanssi 260 ja 280 nm:ssä oli 0,315 ja 0,345 eli proteiinipitoisuus oli 0,299 mg/ml ja ominaisaktiivisuus 13,5 IGIU/mg proteiinia. Stabiloidun entsyymi-valmisteen annettiin seistä 48 tuntia, jolloin muodostui 3 kerrosta. Kerrokset erotettiin sentrifugoimalla ja analysoitiin. Ylinmän (lipidisen) kerroksen tilavuus oli 18,2 ml ja sen aktiivisuus oli 565 IGIU/ml, keskikerroksen tilavuus oli 39 ml ja sen aktiivisuus oli 1970 IGIU/ml, ja pohjakerroksen tilavuus oli 36 ml ja sen aktiivisuus oli 50,80 IGIU/ml. Pohjakerroksella oli alhaisin valonläpäi-sykykylukema 260 nm:ssä ja korkein 280 nm:ssä. Ylimmällä kerroksella oli korkein valonläpäisykyky lukema 260 nm: ssä.

Esimerkki 8 104 l:n erä käymisliuosta, jossa oli 7,5 IGIU/ml esimerkin 1(a) mukaisesti valmistettua solunsisäistä glukoosi-isomeraasia, sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa vettä ja sentrifugoitiin kiinteäksi kakuksi. Kakku sekoitettiin veden kanssa tilavuuteen 26 1 pH:ssa 7,45. Tähän lietteeseen lisättiin 0,250 g lysotsyymiä ja 11,5 1 2-propanolia lämpötilassa 27°C. Pieni määrä vaahdonesto-ainetta lisättiin ja lietettä sekoitettiin. Saadun lietteen tilavuus oli 37 i5 1 23 5 851 3 ja se sisälsi noin Uo IGIU/ml. 20,5 tunnin jälkeen otettiin kaksi 8 l:n näytettä, minkä jälkeen lisättiin sellainen määrä 2-propanolia, että sen pitoisuudeksi tuli 50 tilavuus-#. "Sil-Fro"-suodatusapuainetta (3 g/g soluja) lisättiin lietteisiin, jonka jälkeen suodatettiin ja pestiin 2 1:11a 50-# 2-propanolia. Suodoksen aktiivisuus oli 15 IGIU/ml. Lisättiin vielä 1 g lysotsyymiä. Suodoksen tilavuus oli nyt 21,5 1 ja sen aktiivisuus oli 2l+,3 IGIU/ml. Suodoksessa oleva entsyymi saos-tettiin välittömästi lisäämällä 1,1 1 1-m magnesiumsulfaattiliuosta ja 1,1 1 2-propanolia. Saostuma, joka sisälsi pysyvää entsyymiä, otettiin talteen suodattamalla, ja liuotettiin pieneen määrään vettä (kokonaistilavuus 200 ml). Saadun entsyymivalmisteen aktiivisuus oli noin 3^50 IGIU/ml (kokonaisaktiivisuus 690 000 IGIU, ja ominaisaktiivisuus noin 12,5 IGIU/ml proteiinia).

Saadusta pysyvästä entsyymivalmisteesta otettiin kaksi näytettä. Toiseen lisättiin propanoliparaseptiä säilöntäaineeksi. Tutkittiin varastointipysy-vyys huoneen lämpötilassa (noin 26°C). Kokeen alussa näytteiden aktiivisuus oli noin 3300 IGIU/ml. Näytteet analysoitiin määräajoin ja 31 päivän kuluttua sen näytteen aktiivisuus,;johon oli lisätty säilöntä-ainetta, oli 3 165 IGIU/ml, ja toisen näytteen (johon ei ollut lisätty säilöntäainetta) oli 31^0 IGIU/ml. Tämä koe osoittaa, että tämän keksinnön mukaan valmistetuilla entsyymivalmisteilla on hyvä pysyvyys, eli yli 95 # alkuperäisestä aktiivisuudesta on jäljellä 30 päivän säilytyksen jälkeen huoneen lämpötilassa.

Vertailevat kokeet Näitten kokeitten tarkoituksena on osoittaa eri liukenevien magnesiumsuo-lojen käyttötehokkuutta muihin suoloihin kuten ammoniumsulfaattiin, natrium-sulfaattiin ja natriumkloridiin verrattuna, jotka tunnetaan proteiineja saosta-vasta kyvystään. Muita kaksiarvoisia suoloja käytettiin myöskin tässä vertailussa.

Suuri näyte hydrolysaattia (alkoholi-vesi-glukoosi-isomeraasiliuosta) erästä 6 (kuvattu esimerkissä 2 ja taulukossa IV) sentrifugoitiin laboratorio-lingossa (18 000 kierr/min) 10 minuuttia. Alkoholipitoisuus oli klt6 paino-# (^9,3 tilavuus-#). Otettiin 30 ml:n näytteitä kirkasta hydrolysaattia (huoneen lämpötilassa) ja lisättiin taulukossa X mainitut määrät 1-m suolaliuosta, sekä yhtä suuri tilavuus 2-propanolia. Sitten näytteitä sekoitettiin ja sentrifugoitiin (l8 000 kierr./min) 10 minuutin ajan. Saostumat irrotettiin lingosta ja liuotet- +4. O— tiin 25 ml:aan kobolttifosfaattipuskuria (10 -m Co , pH 7,5, 0,05-mPO^ ) glukoosi-isomeraasiaktiviteetin ja proteiinipitoisuuden määritystä varten. Tulokset on esitetty taulukossa X.

2,1 5 851 3

Taulukko X

Eri suolojen ja niiden väkevyyksien vaikutus isomeraasientsyymin saostamiseen.

Käytetty suola Talteenotettu entsyymi (%) ja sen ominaisaktiivi- (b) suus (a)

Lisätyn 1-m suolaliuoksen määrä (til.-ί)

Magnesiumsuolat 1 2,5 5 10 20

MgSO^.THgO 1 9T 100 100 95 2,1* 15,7 15,8 13,6 11,0

MgCl 15 100 103 103 105 _9,5 15,·k 15,6 16,U 16,9

Mg( CH^COO)0 3 9b 100 99 98 3,7 15,1 15,·b 15,3 15,9

Yksiarvoisten kationien suolat

Na„S0, 0 0 0 1 16

0 0 0 2,6 8,U

(NH,)oS0, 0 0 0 1 1 b 2 b 0 0 0 2,6 2,9

NaCl '0 0 0 1 1 0 0 0 1,8 1,9

Kaksiarvoisten kationien suolat (muut kuin magnesium-suolat )

BaCl_ - 93 76 18 d - 11,9 8,8 8,1*

SrClp - 10l* 9b 28 11*,3 12,7 12,7 -

CaCl_ - 65 57 19 _ 8,9 7,9 6,2 -__

CoCl - 61 18 1 9,1 5,6 0,8 -

MnCl · - 21 29 8 - 2,8 3,9 2,6 - (a) Vastaavat molaariset väkevyydet ovat 0,01, 0,025, 0,0U8, 0,09 ja 0,17- (b) Proteiinipitoisuus määrättiin optisen tiheyden avulla 280 ja 260 nm:ssä, ja ilmoitettiin IGIU/mg proteiinia.

25 5851 3

Taulukosta X ilmenee, että natriumsulfaatti ja ammoniumsulfaatti eivät saosta glukoosi-isomeraasientsyymiä hydrolysaatista yhtä tehokkaasti ja yhtä alhaisessa väkevyydessä kuin magnesiumsuolat. Ammoniumsulfaatti ei saostanut yhtään entsyymiä ja natriumsulfaatti aiheutti vain 19~% glukoosi-isomeraasientsyymin talteenoton. Tämä talteenotto (vaikkakin pieni) ei välttämättä johtunut saostamises-ta vaan voi johtua faasierotuksesta (alkoholi-vesi ja suola-vesifaasi). Proteiini liukenee paremnin suola-vesifaasiin kuin alkoholivesifaasiin. Suola-vesifaasi uuttaa ei-spesifisesti proteiinia alkoholi-vesifaasista. Myöskin, toinen kokeiltu yksiarvoinen suola, natriumkloridi, ei saostanut glukoosi-isomeraasientsyymiä.

Muutkin kaksiarvoiset suolat kuin magnesiumsuolat saostivat glukoosi-isane-raasientsyymiä, mutta saannot ja puhtaudet eivät olleet niin hyviä kuin magnesium-suoloilla. Barium- ja strontiumsuolat olivat melko hyviä saostusaineita, mutta ne ovat myrkyllisiä.

Kokeilluista suoloista vain magnesiumsuolat saostivat entsyymiä tehokkaasti suurella ominaisaktiviteetillä. Käytetty magnesiumsuolaväkevyys on pieni osa siitä mitä tarvitaan saostamaan proteiineja vesipitoisesta liuoksesta käyttäen klassillisia ulossuolausmenetelmiä, ts. käyttäen ammonium- ja natriumsulfaattia. Tämä ilmiö on päinvastainen kuin kirjallisuudessa ilmoitettu, esim Advances in Protein Chemistry, volyymi XI, sivut l+l6-4l8 ,/1956/ ja Advances in Protein Chemistry, volyymi l6, sivu 2l6 /Ϊ96ΐ/ mukaan natriumsulfaatti ja ammoniumsulfaatti ovat tehokkaampia kuin magnesiumsulfaatti proteiinien ulossuolauksessa.

Taulukosta X ilmenee myös, että kun magnesiumsulfaatin pitoisuus kasvaa (yli 0,08-molaariseksi), ominaisaktiivisuus pienenee, mikä johtunee ei-selektiivi-sestä proteiinisaostuksesta. Havaittiin, että faasien erottuminen tapahtui magnesiumsulfaatilla, ja että oninaisaktiviteetin aleneminen ilmeisesti seuraa proteiinin lisääntyvää liukenemista suola-vesi-faasiin. Magnesiumkloridilla ja magnesium-asetaatilla ei tapahtunut faasien erottumista ja ominaisaktiivisuudet pysyivät muuttumattomina, tai jopa nousivat, kuten magnesiumkloridilla.

Esimerkki 9

Muitakin liuottimia kuin esimerkeissä 1-8 esitettyä 2-propanolia voidaan käyttää stabiloituja entsyymivalmisteita valmistettaessa, kuten seuraavassa osoite-t aan.

Solunsisäinen glukoosi-isomeraasientsyymiliuos, jossa oli 18,1 IGIU/g liuosta, valmistettiin niinkuin esimerkissä l(a) on kuvattu. Tämä liuos suodatettiin jotta saataisiin solupasta jossa oli 120 IGIU/g. Solupasta käsiteltiin lysotoyyrai-entsyymivalmisteella solunsisäisen glukoosi-isomeraasin vapauttamiseksi. Saadun seoksen aktiivisuus oli 123 IGIU/g. Seos laimennettiin sellaisella vesimäärällä, että sen isomeraasiaktiviteetti oli 110 IGIU/ml. 50 ml näytteisiin tätä seosta lisättiin hitaasti veteen sekoittuva orgaaninen liuotin kuten taulukossa XIV esitetään. Lisättiin sellainen liuotinmäärä, että isomeraasiproteiini juuri alkoi saastua. Sekoitettiin 5_10 minuuttia ja tämän jälkeen liukenematon aines (solujäänteet 26 5 851 3 ja nukleiinihappoja) poistettiin sentrifugoimalla. 20 ml näytteisiin lisättiin sekoittaen 1 ml 1-m magnesiumsulfaattia ja riittävästi liuotinta, jotta magnesium-sulfaattiliuoksen lisäyksestä liuottimen laimentuminen kompensoituisi. Saadun,solu-vapaata glukoosi-isomeraasientsyymiä, veteen sekoittuvaa orgaanista liuotinta, ja magnesiumsulfaattia sisältävän seoksen annettiin seistä 15 minuuttia sekoittaen silloin tällöin. Seokset sentrifugoitiin, jolloin saostunut stabiloitu entsyymitiivis-te otettiin talteen. Tämän kokeen tulokset on esitettu taulukossa XIV.

Taulukko XIV

Liuotin Yhteen tilavuuteen lysaattia # IGIU Qminaisaktiivisuus lisätty liuotintilavuus (c) talteenotettu IGIU/mg proteiinia 2-propanoli 1 100 11,8 asetoni 0,8 92 10,0 metanoli 2,b 8? 12,0 etanoli 1,3 98 11,6 1-propanoli 0,8 82 10,5

tert-butanoli 0,65 95 6,U

p-di oksaani^13 ^ 0,7 25 5,7 (a) ....

Proteiini määrättiin optisen tiheyden avulla (28Ο/26Ο nm).

^^Käytettiin 10 tilavuus-# 1-m magnesiumsulfaattiliuosta saostamiseen; kaikki muut saostukset suoritettiin lisäämällä 5 tilavuus-# 1-m magnesiumsulfaattiliuosta.

^Lysaatin ominaisaktiivisuus oli noin 2 IGIU/mg proteiinia.

Yllä olevista tuloksista nähdään, että erilaisia veteen sekoittuvia orgaanisia liuottimia voidaan tehokkaasti käyttää tämän keksinnön soveltamisessa. Alkoholit ja ketonit, joissa on 3 hiiliatomia, olivat tehokkaimmat liuottimet isomeraa-sientsyymin selektiivisessä talteenotossa. Niinpä selektiiviseen talteenottoon tarvittava metanolipitoisuus on noin 67 paino-# seoksesta (2-propanolia tarvitaan h2 paino-#).

Claims (2)

27 5851 3 Pat entt ivaat imukset:

1. Menetelmä pysyvän glukoosi-isomeraasientsyymitiivisteen valmistamiseksi, jonka kosteuspitoisuus on noin 50 - noin 80 #, kuiva-ainepitoisuus noin 5_ noin 30 paino-#, entsyymipitoisuus vähintään noin 0012,5 IGIU/g kuiva-ainetta ja ominaisisomeraasiaktiivisuus noin 15»1 - noin 28 IGIU/mg proteiinia ja jonka pysyvyys on niin hyvä, että ainakin noin 80 - 10 % sen alkuperäisestä isomeraasi-aktiivisuudesta säilyy sitä varastoitaessa l8°C:ssa jopa vuoden ajan, glukoosi-isomeraasin ollessa peräisin Streptomyces-suvun mikro-organismista, tunnet-t u siitä, että a) sekoitetaan vesipitoista seosta, joka sisältää solunsisäistä glukoosi-isomeraasientsyymiä sisältäviä soluja, jotka on saatu kannoista Streptomyces olivochromogenes ATCC n:o 21 713, tai ATCC n:o 21 715» veteen sekoittuvaan orgaaniseen liuottimeen, nimittäin 2-propanoliin, asetoniin, metanoliin, etanoliin, 1-propanoliin, tert-butanoliin tai dioksaaniin, niin että sekoituksen jälkeen orgaanisen veteen sekoittuvan liuottimen pitoisuus on noin h0- noin h5 paino-#, b) käsitellään veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja veden seoksessa olevia soluja lysotsyymi-entsyymivalmisteella, jolloin muodostuu liukeneva solu-vapaa glukoosi-isomeraasientsyymi, joka ei sisällä käytännöllisesti katsoen lainkaan nukleiinihappoja, c) poistetaan liukenemattomat aineet ja otetaan taiteen vesiliuos, joka sisältää soluvapaan glukoosi-isomeraasientsyymin, veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen ja veden, d) käsitellään mainittua vesiliuosta, joka sisältää soluvapaan glukoosi-isomeraasientsyymin ja veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen, magnesiumsulfaat-tiheptahydraatilla tai magnesiumsulfaatilla niin, että raagnesiumsulfaattiheptahyd-raatin tai magnesiumsulfaatin pitoisuus syntyneessä seoksessa on noin 0,023 -0,125 mol/1, jolloin saadaan pysyvä väkevä entsyymivalmiste, joka käsittää entsyymin ja magnesiumin muodostaman saostuman, johon sisältyy väkevä soluvapaa glukoosi-isomeraasientsyymi, veteen sekoittuva orgaaninen liuotin, vesi ja magnesium, ja e) otetaan talteen pysyvä glukoosi-isomeraasientsyymitiiviste, joka sisältää glukoosi-isomeraasientsyymin, noin 0,16 - 0,77 mol/1 magnesiumia määritettynä 2+ Mg - pitoisuutena, ja veden seka veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että veteen sekoittuva orgaaninen liuotin on 2-propanoli, jota lisätään sellainen määrä, että sen pitoisuudeksi tulee noin k2 - 1 paino-#, laskettuna seoksesta.